CN109932408A - 基于辅酶a适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
基于辅酶a适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109932408A CN109932408A CN201910096691.2A CN201910096691A CN109932408A CN 109932408 A CN109932408 A CN 109932408A CN 201910096691 A CN201910096691 A CN 201910096691A CN 109932408 A CN109932408 A CN 109932408A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- electrode
- coa
- aptamers
- preparation
- hat
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 238000003950 stripping voltammetry Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims abstract description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical group O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 10
- KAOMOVYHGLSFHQ-UTOQUPLUSA-N anacardic acid Chemical compound CCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC1=CC=CC(O)=C1C(O)=O KAOMOVYHGLSFHQ-UTOQUPLUSA-N 0.000 claims description 6
- 235000014398 anacardic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- ADFWQBGTDJIESE-UHFFFAOYSA-N anacardic acid 15:0 Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC1=CC=CC(O)=C1C(O)=O ADFWQBGTDJIESE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001548 drop coating Methods 0.000 claims description 6
- ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N hexan-1-ol Chemical compound CCCCCCO ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 4
- 241001481789 Rupicapra Species 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 claims description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 239000010985 leather Substances 0.000 claims description 3
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005498 polishing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 claims description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 claims 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims 1
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 abstract 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 abstract 1
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 abstract 1
- 101000882390 Homo sapiens Histone acetyltransferase p300 Proteins 0.000 description 47
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 102100038885 Histone acetyltransferase p300 Human genes 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 6
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 6
- 108090000246 Histone acetyltransferases Proteins 0.000 description 6
- 102000003893 Histone acetyltransferases Human genes 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 6
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 6
- 101000978776 Mus musculus Neurogenic locus notch homolog protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 6
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 6
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 6
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 6
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 6
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 6
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 5
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 5
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 5
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 5
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 4
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000004365 square wave voltammetry Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000004506 ultrasonic cleaning Methods 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000189799 Asimina triloba Species 0.000 description 1
- 235000006264 Asimina triloba Nutrition 0.000 description 1
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 244000044283 Toxicodendron succedaneum Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001726 chromosome structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012398 clinical drug development Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005245 sintering Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用。首先，将CoA适配体(CoA‑aptamer)通过Au‑S作用修饰到电极表面，当乙酰化反应溶液加入到电极表面后，由于生成的CoA与其适配体的特异性结合作用，阻碍了核酸外切酶(Exo I)水解，再通过末端转移酶(TdT)延长形成富C DNA链并制备银纳米簇(AgNCs)，进而通过Ag的溶出伏安信号间接实现HAT p300活性检测。如果乙酰化反应没有发生，CoA‑aptamer保持单链状态，且能够被ExoI水解，不产生电化学信号。该传感器可以用来检测HATp300活性并筛选其小分子抑制剂。由此发明出一种操作简单、方便快捷、超灵敏准确的HATp300活性检测的电化学分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学生物传感器，尤其是涉及一种基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。
背景技术
蛋白质乙酰化在真核细胞中是一个重要的过程。其中，组蛋白乙酰转移酶(HAT)是一类具有催化活性的酶，它通过将乙酰辅酶A上的乙酰基转移至底物组蛋白或非组蛋白底物多肽的特定赖氨酸残基上，达到调节染色体结构进而调控基因的表达的目的。研究表明HAT表达异常经常导致肿瘤疾病发生。p300是最常见的HAT，其具有广泛的生物学功能，比如参与细胞的周期调控，基因转录的调控，维持某些蛋白质的功能及稳定性。此外，p300在病毒癌蛋白的转录翻译、胚胎的发育等方面也具有重要作用。因此，检测HAT p300的活性有很重要的生化研究意义，也有利于制药业发展。
目前，关于HAT p300的检测方法主要基于乙酰化抗体，如基于多肽连接量子点以及乙酰基特异性抗体的荧光检测方法和抗体介导的金纳米粒子比色分析方法等。然而，这些方法都存在抗体固有的缺点，比如高成本、低稳定性、较大差异性等。近年来，一些免抗体的测定HAT p300活性的新方法已经引起极大关注，主要是基于乙酰化产物辅酶A(CoA)的电化学及荧光方法，但仍然是冰山一角，存在较大研究空间。因此，开发一种简便、灵敏、低成本、选择性好的HAT p300检测手段势在必行。核酸适配体(aptamer)是指利用指数富集配体系统进化技术，从人工合成的寡核苷酸文库中筛选得到的能够与靶分子特异结合的寡核苷酸链。与靶分子相互作用时，可以通过自适应的诱导契合变化和折叠，与靶分子形成稳定的复合物。核酸适配体与靶分子的识别结合作用包含了构象形状的互补作用、芳香化合物的堆砌作用、带电基团的静电作用及氢键作用等核酸适配体的特异结合功能与抗体蛋白质相似，但与抗体相比，核酸适配体具有许多独特优势，如化学稳定性强、能够体外筛选与化学合成、可以进行化学基团的修饰、不存在免疫源性等。分析检测领域，由于核酸适配体与靶分子的高特异性与高亲和力，使其非常适合作为识别元件来构成生物传感器，进行目标分子的特异识别。
本发明基于CoA适配体(CoA-aptamer)与CoA特异性结合作用设计了HAT p300电化学生物传感器制备方法及应用。首先，将CoA适配体通过Au-S作用修饰到电极表面，当乙酰化反应溶液加入到电极表面后，由于生成的CoA与其适配体的特异性结合作用，阻碍了核酸外切酶(Exo I)水解，再通过末端转移酶(TdT)延长形成富C DNA链并制备银纳米簇(AgNCs)，进而通过Ag的溶出伏安信号间接实现HAT活性检测。如果乙酰化反应没有发生，CoA-aptamer保持单链状态，且能够被核酸外切酶(Exo I)水解，不能产生电化学信号。该传感器可以用来检测HAT p300活性并筛选其小分子抑制剂。基于CoA-aptamer构建的电化学生物传感器特异性好、灵敏度高、结果准确可靠、成本低、快速，且制备过程极其简单。目前，国内外还没有公开任何基于CoA-aptamer及Ag溶出伏安法构建的电化学生物传感器用于检测HAT p300及其小分子抑制剂的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提出一种基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用。此方法首次将基于CoA-aptamer及Ag溶出伏安法构建的电化学生物传感器用于HATp300的活性检测。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，具体步骤如下：
(1)基于CoA适配体的电化学生物传感器的制备：
Electrode 1的制备：
将金电极(直径为2mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末抛光2～5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2～5min，然后用N2吹干，取CoA-aptamer溶液(2～5μL，0.1～0.5μM)，80～90℃下加热5～10min，然后逐渐冷却至室温，滴涂于电极表面，在4℃冰箱孵育过夜，蒸馏水缓缓冲洗电极，采用巯基己醇(MCH，2～5μL，0.5～1.0mM)处理30～60min，置换电极表面非Au-S键固定的CoA-aptamer，蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 1。
Electrode 2的制备：
依次取Ac-CoA(0.1～1μL，0.1～1mM)，多肽(0.1～1μL，0.1～1mM)，HAT p300(0.1～1μL，0.01～500nM)，加H2O至总体积2～5μL。搅拌器上剧烈搅拌2～5min至混合均匀，然后移至温度为32～40℃的水浴锅中孵育1～3h，稀释10倍备用。取2～5μL乙酰化反应液滴涂于Electrode 1表面，在32～40℃孵育30～60min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 2。
Electrode 3的制备：
取Exo I溶液(2～5μL，0.5～1.0U/μL)滴涂于Electrode 2表面，在室温下孵育30～120min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极。再滴加2～10μL TdT反应液(组成为：1～5μL 5×TdT缓冲液，dCTP(1～3μL，5～10mM)，TdT(1～3μL，5～10U/mL)，加H2O至总体积为2～10μL)，在32～40℃下放置1～3h，蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 3。
Electrode 4的制备：
向Electrode 3电极表面滴加Ag+(2～5μL，1～3μM)，室温孵育15～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极，再向电极表面滴加硼氢化钠溶液(NaBH4，2～5μL，1～3μM)，室温下避光反应15～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 4。
(2)基于CoA适配体的电化学生物传感器的应用
在Electrode 2制备过程中，改变HAT p300浓度，用于传感器制备，然后如以上步骤(1)制备一系列传感器，用来检测不同浓度HAT p300的电化学响应。
本发明用到的CoA-aptamer序列为(5’-3’)：GGGCACGAGCGAAGGGCATAAGCTGACGAAAGTCAGACAAGACATGGTGCCC。
利用上述基于CoA-aptamer的电化学生物传感器，检测HAT p300浓度。通过方波伏安法，设置电位范围为0.05～0.25V，振幅为25mV，检测所制备电化学生物传感器在磷酸缓冲溶液(PBS，0.1M，pH 7.0)中对HAT p300的电化学溶出伏安响应，获得HAT p300对应的电化学溶出伏安响应电流大小，建立响应电流与HAT p300浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中HAT p300含量。
发明原理：本发明基于CoA-aptamer与CoA特异性结合作用设计了HAT p300电化学生物传感器制备方法及应用。首先，将CoA-aptamer通过Au-S作用修饰到电极表面，当乙酰化反应溶液加入到电极表面后，由于生成的CoA与其适配体的特异性结合作用，阻碍了ExoI水解，再通过TdT延长形成富C DNA链并制备AgNCs，进而通过Ag的溶出伏安信号间接实现HAT p300活性检测。如果乙酰化反应没有发生，CoA-aptamer保持单链状态，能够被Exo I水解，不能产生电化学信号。
相对于现有技术，本发明所述的一种基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用具有以下优势：
(1)高灵敏度。实验得出传感器的电流响应对HAT p300对数的线性范围为0.01～100nM，线性相关方程为y＝4.48x+9.92，R2＝0.9973，检测限为0.005nM，可实现对HAT p300的高灵敏检测。
(2)高特异性和强抗干扰能力。其他常见的酶如辣根过氧化物酶(HRP)、胰凝乳蛋白酶(CHY)、溶菌酶(LZM)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、蛋白激酶(PKA)和木瓜蛋白酶(Papain)等对本检测体系均无干扰。
(3)结果准确。回收率均在90％～110％之间。
(4)传感器可以用于HAT p300小分子抑制剂漆树酸和C646的筛选，IC50分别为28.50μM、3.62μM，对临床诊断及药物开发意义重大。
综上所述，本发明是基于CoA-aptamer构建的电化学生物传感器，通过Ag溶出伏安来实现HAT p300活性检测其抑制剂的筛选，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度HAT p300检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器的可行性实验图；
图2为本发明传感器对有无HAT p300的对比图；
图3为本发明传感器对HAT p300的电流响应对浓度对数的校准曲线图；
图4为本发明传感器对HAT p300的选择性实验图；
图5为本发明传感器对HAT p300的抗干扰实验图；
图6为本发明传感器对HAT p300的抑制剂漆树酸的校准曲线图；
图7为本发明传感器对HAT p300的抑制剂C646的校准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1传感器的制备
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，具体步骤如下：
Electrode 1的制备：
将金电极(直径为2mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末抛光5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗5min，然后用N2吹干，取CoA-aptamer溶液(5μL，0.1μM)，90℃下加热5min，然后逐渐冷却至室温，滴涂于电极表面，在4℃冰箱孵育过夜，蒸馏水缓缓冲洗电极，采用巯基己醇(MCH，5μL，1.0mM)处理30min，置换电极表面非Au-S键固定的CoA-aptamer，蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 1。
Electrode 2的制备：
依次取Ac-CoA(1μL，1mM)，多肽(0.4μL，1mM)，HAT p300(0.4μL，500nM)，加H2O至总体积2μL。搅拌器上剧烈搅拌2min至混合均匀，然后移至温度为37℃的水浴锅中孵育3h，稀释10倍备用。取5μL乙酰化反应液滴涂于Electrode 1表面，在37℃孵育30min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 2。
Electrode 3的制备：
取Exo I溶液(5μL，0.5U/μL)滴涂于Electrode 2表面，在室温下孵育30min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极。再滴加5μL TdT反应液(组成为：1μL 5×TdT缓冲液，dCTP(1μL，10mM)，TdT(1μL，10U/mL)，加H2O至总体积为5μL)，在37℃下放置1h，蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 3。
Electrode 4的制备：
向Electrode 3电极表面滴加Ag+(5μL，1μM)，室温孵育15min，蒸馏水缓缓冲洗电极，再向电极表面滴加NaBH4溶液(5μL，1μM)，室温下避光反应15min，蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 4。
实施例2可行性实验
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，具体步骤如下：
(1)如实施例1制备Electrode 1～Electrode 4，并检测其在PBS(0.1M，pH 7.0)溶液的电化学溶出伏安响应。利用方波伏安法，设置电位范围为0.05～0.25V，振幅为25mV。从图1可以看出：Electrode 4在PBS(0.1M，pH 7.0)中有明显的电化学响应信号，其它电极的电化学响应信号几乎可以忽略。由此证明了基于CoA适配体构建的电化学生物传感器成功制备和乙酰化反应发生，说明其在理论上和技术上是可行的。
(2)利用方波伏安法，设置电位范围为0.05～0.25V，振幅为25mV，研究了有无HATp300存在时，制备的电化学生物传感器在PBS(0.1M，pH 7.0)中的电化学响应。从图2可以看出：无HAT p300存在时，传感器在PBS(0.1M，pH 7.0)中几乎无响应；有HAT p300存在时，传感器在PBS(0.1M，pH 7.0)中有明显的电化学响应。证明该传感器可用于HAT p300活性的检测。
实施例3 HAT p300活性的检测
在实施例1 Electrode 2的制备过程中，改变HAT p300浓度，控制HAT p300终浓度分别为：0，0.01，0.012，0.014，0.016，0.018，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10，50，100，200，500nM，如实施例1制备一系列电化学生物传感器。实验结果如图3所示，传感器的电流响应对HAT p300浓度对数值的线性相关方程为y＝4.48x+9.92，R2＝0.9973，线性范围为0.01～100nM，检测限为0.005nM，说明传感器对HAT p300活性可实现高灵敏检测。
实施例4选择性及抗干扰实验
(1)选择性实验：在实施例1 Electrode 2的制备过程中，将HAT p300替换为其它酶(辣根过氧化物酶(HRP)、胰凝乳蛋白酶(CHY)、溶菌酶(LZM)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、木瓜蛋白酶(Papain)和蛋白激酶(PKA))，如实施例1步骤制备一系列电化学传感器，浓度均为100nM，blank为空白信号。结果如图4所示，与HAT p300对比，传感器对其他酶的电化学响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对于HAT p300的检测有很好的选择性。
(2)抗干扰实验：在实施例1 Electrode 2的制备过程中，将其它酶(辣根过氧化物酶(HRP)、胰凝乳蛋白酶(CHY)、溶菌酶(LZM)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、木瓜蛋白酶(Papain)和蛋白激酶(PKA))添加到HAT p300反应液中，如实施例1步骤制备一系列电化学传感器，浓度均为100nM，Mixture为所有酶的混合物。结果如图5所示，峰电流的大小与仅有HAT p300存在时的峰电流基本没有差异，说明该传感器的抗干扰能力较好。
实施例5抑制剂筛选
(1)小分子抑制剂漆树酸的检测：在实施例1 Electrode 2的制备过程中，将不同浓度的漆树酸(终浓度分别为：0，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，40，80，100，150，200，500，1000μM)加入到乙酰化反应液中，如实施例1步骤制备一系列电化学传感器。根据实验结果得知(如图6)，随着抑制剂漆树酸浓度的增大，电流响应随之减弱，说明漆树酸对p300活性有良好的抑制作用，半抑制浓度为28.50μM。
(2)小分子抑制剂C646的检测：在实施例1 Electrode 2的制备过程中，将不同浓度的C646(终浓度分别为：0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，40，80，120，200μM)加入到乙酰化反应液中，如实施例1步骤制备一系列电化学传感器。根据实验结果得知(如图7)，随着抑制剂C646浓度的增大，相对应的电流响应越弱，说明C646对p300活性的抑制作用越强，半抑制浓度为3.62μM。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。
Claims (5)
1.基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于，机理如下：将CoA适配体(CoA-aptamer)通过Au-S作用修饰到电极表面，当乙酰化反应溶液加入到电极表面后，由于生成的CoA与其适配体的特异性结合用，阻碍了核酸外切酶(Exo I)水解，再通过末端转移酶(TdT)延长形成富C DNA链并制备银纳米簇(AgNCs)，进而通过Ag的溶出伏安信号间接实现HAT活性检测。如果乙酰化反应没有发生，CoA-aptamer保持单链状态，且能够被核酸外切酶(Exo I)水解，不产生电化学信号。HAT p300浓度变化会影响电化学传感器的电化学响应。
2.基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
Electrode 1的制备：
将金电极(直径为2mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末抛光2～5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2～5min，然后用N2吹干，取CoA-aptamer溶液(2～5μL，0.1～0.5μM)，80～90℃下加热5～10min，然后逐渐冷却至室温，滴涂于电极表面，在4℃冰箱孵育过夜，蒸馏水缓缓冲洗电极，采用巯基己醇(MCH，2～5μL，0.5～1.0mM)处理30～60min，置换电极表面非Au-S键固定的CoA-aptamer，蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 1。
Electrode 2的制备：
依次取Ac-CoA(0.1～1μL，0.1～1mM)，多肽(0.1～1μL，0.1～1mM)，HAT p300(0.1～1μL，0.01～500nM)，加H2O至总体积2～5μL。搅拌器上剧烈搅拌2～5min至混合均匀，然后移至温度为32～40℃的水浴锅中孵育1～3h，稀释10倍备用。取2～5μL乙酰化反应液滴涂于Electrode 1表面，在32～40℃孵育30～60min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 2。
Electrode 3的制备：
取Exo I溶液(2～5μL，0.5～1.0U/μL)滴涂于Electrode 2表面，在室温下孵育30～120min，而后蒸馏水缓缓冲洗电极。再滴加2～10μL TdT反应液(组成为：1～5μL 5×TdT缓冲液，dCTP(1～3μL，5～10mM)，TdT(1～3μL，5～10U/mL)，标记为Electrode 3。
Electrode 4的制备：
向Electrode 3电极表面滴加Ag+(2～5μL，1～3μM)，室温孵育15～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极，再向电极表面滴加硼氢化钠溶液(NaBH4，2～5μL，1～3μM)，室温下避光反应15～30min，蒸馏水缓缓冲洗电极，标记为Electrode 4。
3.根据权利要求1和权利要求2所述的基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于：所用CoA-aptamer序列结构为(5’-3’)：GGGCACGAGCGAAGGGCATAAGCTGACGAAAGTCAGACAAGACATGGTGCCC。
4.根据权利要求1和权利要求2所述的基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于：用来检测HAT p300的电化学方法为Ag溶出伏安法，电位范围为0.05～0.25V，振幅为25mV。
5.根据权利要求1和权利要求2所述的基于辅酶A适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用，其特征在于：本发明传感器，可以实现不同浓度HAT p300检测及其小分子抑制剂的筛选，检测限为0.005nM，其小分子抑制剂漆树酸的半抑制浓度为28.50μM，C646的半抑制浓度为3.62μM。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910096691.2A CN109932408B (zh) | 2019-01-21 | 2019-01-21 | 基于辅酶a适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910096691.2A CN109932408B (zh) | 2019-01-21 | 2019-01-21 | 基于辅酶a适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109932408A true CN109932408A (zh) | 2019-06-25 |
| CN109932408B CN109932408B (zh) | 2021-07-13 |
Family
ID=66985383
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910096691.2A Active CN109932408B (zh) | 2019-01-21 | 2019-01-21 | 基于辅酶a适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109932408B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110763742A (zh) * | 2019-10-14 | 2020-02-07 | 宁波大学 | 基于高阶g4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用 |
| CN112458152A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-03-09 | 南京大学 | 基于球形核酸的级联信号放大高灵敏检测外泌体 |
| CN112945954A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-06-11 | 山东省分析测试中心 | 一种利用酶催化诱导适配体释放筛选酶抑制剂的高通量液晶检测平台制备方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007089731A3 (en) * | 2006-01-27 | 2008-04-24 | Univ George Mason | Ocular fluid markers |
| CN103003426A (zh) * | 2010-05-03 | 2013-03-27 | 于利奇研究中心有限公司 | 用于胞内代谢物检测的传感器 |
| CN104880424A (zh) * | 2015-05-13 | 2015-09-02 | 福州市传染病医院 | 一种用于检测amacr的双功能纳米探针、试剂盒及方法 |
| WO2015169973A3 (de) * | 2014-05-09 | 2016-02-25 | Protagen Ag | Markersequenzen zur diagnose und stratifizierung von systemische sklerose patienten |
| CN107101997A (zh) * | 2017-04-25 | 2017-08-29 | 青岛大学 | 一种用于乙酰转移酶活性检测的电化学发光传感器的构建 |
| CN108593751A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-09-28 | 宁波大学 | 一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的电化学法拉第笼免疫传感器的构建方法及应用 |
| CN109187708A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-11 | 苏州健雄职业技术学院 | 一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法 |
-
2019
- 2019-01-21 CN CN201910096691.2A patent/CN109932408B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007089731A3 (en) * | 2006-01-27 | 2008-04-24 | Univ George Mason | Ocular fluid markers |
| CN103003426A (zh) * | 2010-05-03 | 2013-03-27 | 于利奇研究中心有限公司 | 用于胞内代谢物检测的传感器 |
| WO2015169973A3 (de) * | 2014-05-09 | 2016-02-25 | Protagen Ag | Markersequenzen zur diagnose und stratifizierung von systemische sklerose patienten |
| CN104880424A (zh) * | 2015-05-13 | 2015-09-02 | 福州市传染病医院 | 一种用于检测amacr的双功能纳米探针、试剂盒及方法 |
| CN107101997A (zh) * | 2017-04-25 | 2017-08-29 | 青岛大学 | 一种用于乙酰转移酶活性检测的电化学发光传感器的构建 |
| CN108593751A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-09-28 | 宁波大学 | 一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的电化学法拉第笼免疫传感器的构建方法及应用 |
| CN109187708A (zh) * | 2018-09-18 | 2019-01-11 | 苏州健雄职业技术学院 | 一种检测蛋白质乙酰转移酶活性的电化学方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZHEN ZHEN等: "Enzymatic Immuno-Assembly of Gold Nanoparticles for Visualized Activity Screening of Histone-Modifying Enzymes", 《ANAL. CHEM.》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110763742A (zh) * | 2019-10-14 | 2020-02-07 | 宁波大学 | 基于高阶g4和乙酰基抗体检测乙酰转移酶活性的电化学传感器制备及应用 |
| CN110763742B (zh) * | 2019-10-14 | 2022-07-26 | 宁波大学 | 基于高阶g4和乙酰基抗体的电化学传感器制备方法及应用 |
| CN112458152A (zh) * | 2021-01-13 | 2021-03-09 | 南京大学 | 基于球形核酸的级联信号放大高灵敏检测外泌体 |
| CN112458152B (zh) * | 2021-01-13 | 2024-05-24 | 南京大学 | 基于球形核酸的级联信号放大高灵敏检测外泌体 |
| CN112945954A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-06-11 | 山东省分析测试中心 | 一种利用酶催化诱导适配体释放筛选酶抑制剂的高通量液晶检测平台制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109932408B (zh) | 2021-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107101997B (zh) | 一种用于乙酰转移酶活性检测的电化学发光传感器的构建 | |
| Gau et al. | Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification | |
| WO2016062101A1 (zh) | 检测ndm-1的修饰电极及其制备方法和应用 | |
| KR20000070821A (ko) | 특이적 결합의 전기화학적 검출 | |
| CN109932408A (zh) | 基于辅酶a适配体的电化学生物传感器的制备方法及其应用 | |
| US7892414B1 (en) | Electrochemical biosensors, applications and methods of making biosensors | |
| CN103175873B (zh) | 基于目标dna重复序列自身增强放大信号的dna电化学传感器 | |
| CN109211997B (zh) | 一种检测β-淀粉样蛋白的基于THMS的电化学发光适体传感器及其制备方法和应用 | |
| CN109613095A (zh) | 基于i-motif构型变化的末端转移酶电化学生物传感器制备方法及应用 | |
| Wang et al. | Modulated light-activated electrochemistry at silicon functionalized with metal-organic frameworks towards addressable DNA chips | |
| Deng et al. | Label-free electrochemical sensing platform for the detection of protease | |
| Huang et al. | A novel electrochemical immunosensor based on hydrogen evolution inhibition by enzymatic copper deposition on platinum nanoparticle-modified electrode | |
| CN110082403B (zh) | 基于金钯纳米花/石墨烯复合材料的组蛋白乙酰转移酶计时-电流传感器及其应用 | |
| Tang et al. | Electrochemical detection of hepatitis C virus with signal amplification using Bam HI endonuclease and horseradish peroxidase-encapsulated nanogold hollow spheres | |
| CN109856211A (zh) | 一种同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用 | |
| Zhang et al. | Peptide-modified nanochannel system for carboxypeptidase B activity detection | |
| CN109991297B (zh) | 基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法 | |
| Liao et al. | Zr4+-mediated DNAzyme-driven DNA walker amplification strategy for electrochemical assay of protein kinase a activity and inhibition | |
| CN109613096A (zh) | 基于dna-铜纳米簇构建的dna相关酶电化学生物传感器及其应用 | |
| Won et al. | Enzyme-catalyzed signal amplification for electrochemical DNA detection with a PNA-modified electrode | |
| CN105567808A (zh) | 滚环扩增产物为模板的铜纳米颗粒合成方法及其在电化学检测中的应用 | |
| CN114813871B (zh) | 一种基于银沉积信号放大的口岸猪流行性腹泻病毒电化学检测方法 | |
| Tkac et al. | Chapter Perspectives in Glycomics and Lectin Engineering | |
| CN111830109A (zh) | 一种高灵敏的检测黏蛋白的光电化学传感器的制备方法 | |
| Stasyuk et al. | Nanoparticles of noble metals for enzymatic sensors: An amperometric glucose biosensor for wine analysis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20221118 Address after: Room 402, Area A, 4th Floor, Building 2, Brocade Group Headquarters, No. 9 Gangxing Road, Jinan Area, China (Shandong) Pilot Free Trade Zone, Jinan City, Shandong Province, 250100 Patentee after: SHANDONG BIOBASE DIAGNOSIS TECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: Room 2202, 22 / F, Wantong building, No. 3002, Sungang East Road, Sungang street, Luohu District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee before: Shenzhen dragon totem technology achievement transformation Co.,Ltd. Effective date of registration: 20221118 Address after: Room 2202, 22 / F, Wantong building, No. 3002, Sungang East Road, Sungang street, Luohu District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee after: Shenzhen dragon totem technology achievement transformation Co.,Ltd. Address before: 315211 Ningbo University, 818 Fenghua Road, Jiangbei District, Ningbo, Zhejiang Patentee before: Ningbo University |
|
| TR01 | Transfer of patent right |