KR20000070821A - 특이적 결합의 전기화학적 검출 - Google Patents

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폴크스다나엠.
토프에이치.홀든
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프란시스 제이 메이어
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젠손 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 전기화학 분석을 실시하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 발명은 전기화학적 매개체 존재하에서, 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재 사이의 특이적 결합을 검출하기 위한 전위차 분석을 실시하기 위한 전기화학적 장치를 제공한다. 결합및 경쟁 결합 분석을 실시하기 위한 본 발명의 장치를 사용하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 약물 개발, 생화학적 분석 및 단백질 정제 분석에 사용하기 위하여, 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적 결합의 억제를 검출하기 위한 고처리량 스크린 분석법을 실시하기 위한 방법을 제공한다.

Description

분자 상호작용 및 약제 검출용 전기화학적 탐침{Electrochemical probes for detection of molecular interactions and drug discovery}
1999년 7월 9일에 등록된 브리케 등의 미국 특허 제5,534,132호에는 친화성 반응을 검출하는데 사용되는 전극이 개시되어 있다.
1993년 11월 16일에 등록된 그래그 등의 미국 특허 제5,262,035호에는 레독스 효소를 사용한 바이오센서 전극이 개시되어 있다.
보그트 등의 논문(1965, Inorg. Chem. 4: 1157-1163)에는 루테늄-황 이산화물의 배위 화합물을 개시하고 있다.
포드 등의 논문(1968, J.Amer. Chem. Soc. 90: 1187-1194)에는 방향족 질소 헤테로고리의 펜타아민루테늄 복합물 합성에 대하여 개시하고 있다.
요컴 등의 논문(1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7052-7055)에는 말 심장의 펜타아민루테늄 유도체인 페리시토크롬 c를 제조하는 방법을 개시하고 있다.
노세라 등의 논문(1984, J.Amer. Chem. Soc. 106: 5145-5150)에는 루테늄-변성 시토크롬 c 내에서 RuII에서 FeIII로의 분자내 전자전달 동력학을 개시하고 있다.
데블린 등의 논문(1990, Science 249: 404-406)에는 랜덤 펩티드 라이브러리를 개시하고 있다.
히라이 및 바머스의 논문(1990, Molec. Cell. Biol. 10: 1307-1318)에는 src 상동성 도메인 3의 돌연변이 유발부위를 개시하고 있다.
램 등의 논문(1991, Nature(London) 354: 82-84)에는 랜덤 펩티드 라이브러리를 개시하고 있다.
뷰로우스 등의 논문(1991, Eur. J. Biochem. 202: 543-549)에는 단백질의 다이렉트 전기화학을 개시하고 있다.
와나타베-후쿠나가 등의 논문(1992, Nature(London) 356: 314-317)에는 아폽토틱 인자로 파스(fas)를 개시하고 있다.
살라몬 등의 논문(1992, Arch .Biochem. Biophys. 299: 193-198)에는 티오레독신 및 글루타티온의 다이렉트 전기화학을 개시하고 있다.
올덴버그 등의 논문(1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5393-5397)에는 랜덤 펩티드 라이브러리를 개시하고 있다.
스코트 등의 논문(1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5398-5402)에는 랜덤 펩티드 라이브러리를 개시하고 있다.
햄머 등의 논문(1992, J. Exp. Med. 176: 1007-1013)에는 랜덤 펩티드 라이브러리를 개시하고 있다.
트사이 및 웨버의 논문(1992, Anal. Chem. 64: 2897-2903)에는 구리-단백질 복합물 검출에 있어서 티로신의 영향을 개시하고 있다.
오닐 등의 논문(1992, Proteins: Structure, Function & Genetics 14: 509-515)에는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 얻은 GPIIb/IIIa 길항제를 개시하고 있다.
유 등의 논문(1992, Science 258: 1665-1668)에는 src 상동성 도메인 3를 개시하고 있다.
데드만 등의 논문(1993, J. Biol. Chem. 268: 23025-23030)에는 랜덤 펩티드 라이브러리를 개시하고 있다.
첸 등의 논문(1993, J. Amer. Chem. Soc. 115: 12591-12592)에는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 얻은 src 상동성 도메인 3-결합 리간드를 개시하고 있다.
카이 등의 논문(1993, Gene 128: 59-65)에는 랜덤 펩티드 라이브러리를 개시하고 있다.
함머 등의 논문(1993, Cell 74: 197-203)에는 MHC-결합 펩티드를 개시하고 있다.
로차키스-아드콕 등의 논문(1993, Nature(London) 363: 83-85)에는 src SH3 도메인을 개시하고 있다.
살라몬 등의 논문(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6420-6423)에는 인공액정 복층 및 인테그랄막 단백질을 포함하는 전극을 사용한 싸이클릭 전류-전압 응답의 직접 측정법을 개시하고 있다.
쿠레쉬 등의 논문(1993, Biomed. Chromatog. 7: 251-255)에는 생물학적 활성 펩티드를 포함하는 고속액체크로마토그래피(HPLC) 단편을 검출하는 방법을 개시하고 있다.
오카다 등의 논문(1993, J. Biol. Chem. 268: 18070-18075)에는 SH3가 제거된 src 돌연변이체를 개시하고 있다.
코이뷰넨 등의 논문(1993, J. Biol. Chem. 268: 20205-20210)에는 파지 디스플레이 라이브러리를 개시하고 있다.
코이뷰넨 등의 논문(1993, J. Cell. Biol. 124: 373-380)에는 파지 디스플레이 라이브러리를 개시하고 있다.
히라마츠 등의 논문(1994, J. Biochem. 115: 584-589)에는 폴리아민의 전기화학적 검출을 개시하고 있다.
존스톤 등의 논문(1994, Inorg. Chem. 33: 6388-6390)에는 용액내 DNA 분열의 전압전류 검출을 위한 방법으로써 인듐 주석-산화물 전극에서 DNA의 레늄이 매개된 전기촉매 산화를 개시하고 있다.
픽슬리 등의 논문(1994, Oncogene 9: 2523-2529)에는 p53과 MDM2 사이의 결합을 개시하고 있다.
퐁 등의 논문(1994, Drug. Develop. Res 33: 64-70)에는 파지 디스플레이 라이브러리를 갖는 전체 세포 스캐닝을 개시하고 있다.
유 등의 논문(1994, Cell 76: 933-945)에는 src 상동성 도메인 3의 단편을 개시하고 있다.
우치다 및 카와키시의 논문(1994, J. Biol. Chem. 269: 2405-2410)에는 구리, 아연 슈퍼산화물 디스무타제의 활성사이트에서 산화 히스티딘의 동정을 개시하고 있다.
비아치니 및 윌드의 논문(1994, Toxicol.Lett. 72: 175-184)에는 7-메틸디옥시구아노신의 전기화학적 검출법을 개시하고 있다.
커밍스 등의 논문(1994, J. Chromatog. B 653: 192-203)에는 뉴로펩티드 성장 요인인 길항제의 전기화학적 검출을 개시하고 있다.
미톤 및 트레비딕의 논문(1994, Methods Enzymos. 233: 523-539)에는 척추동물의 렌즈에서 산화방지 화합물을 검출하기 위한 고속액체크로마토그래피(HPLC) 단편의 전기화학적 검출을 개시하고 있다.
다니엘 및 레인의 논문(1994, Molec. Biol. 243: 639-652)에는 랜덤 펩티드 라이브러리를 개시하고 있다.
스파크스 등의 논문(1994, J. Biol. Chem. 269: 23853-23856)에는 src 상동성 도메인 3의 단편을 개시하고 있다.
치들 등의 논문(1994, J. Biol. Chem. 269: 24034-24039)에는 src 상동성 도메인 3의 단편을 개시하고 있다.
리클 등의 논문(1994, EMBO J. 13: 5598-5604)에는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한 src 상동성 도메인 3-결합 리간드의 단편을 개시하고 있다.
이와부치 등의 논문(1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6098-6102)에는 p53 결합 단백질을 개시하고 있다.
타카하시 등의 논문(1994, Cell 76: 969-976)에는 아폽토틱 인자로 파스(fas)를 개시하고 있다.
굿슨 등의 논문(1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7129-7133)에는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 얻은 유로키나아제 수용체인 길항제를 개시하고 있다.
샤펫 등의 논문(1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 209: 1018-1025)에는 바이오센서를 사용한 질산염 환원효소에 대한 전기화학적 고찰을 개시하고 있다.
아브람스 및 차오의 논문(1995, J. Biol. Chem. 270: 333-339)에는 src 상동성 도메인 3을 개시하고 있다.
이바넨코프 등의 논문(1995, J. Biol. Chem. 270: 14651-14658)에는 랜덤 펩티드 라이브러리를 개시하고 있다.
타케나카 등의 논문(1995, J. Biol. Chem. 270: 19839-19844)에는 파지 디스플레이 라이브러리를 개시하고 있다.
마르텐스 등의 논문(1995, J. Biol. Chem. 270: 21129-21136)에는 랜덤 펩티드 라이브러리를 개시하고 있다.
다이슨 및 머레이의 논문(1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2194-2198)에는 랜덤 펩티드 라이브러리를 개시하고 있다.
첸 및 서돌의 논문(1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7819-7823)에는 src 상동성 도메인 3을 개시하고 있다.
나가타 및 골스타인의 논문(1995, Science 267: 1449-1456)에는 아폽토틱 인자로 파스(fas)를 개시하고 있다.
삭셀라 등의 논문(1995, EMBO J. 14: 484-491)에는 src 상동성 도메인 3을 개시하고 있다.
서돌 등의 논문(1995, FEBS Lett. 369: 67-71)에는 src 상동성 도메인 3을 개시하고 있다.
웬그 등의 논문(1995, Molec. Cell. Biol. 15: 5627-5634)에는 src 상동성 도메인 3을 개시하고 있다.
릭클 등의 논문(1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10909-10913)에는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용한 src 상동성 도메인 3-결합 리간드를 개시하고 있다.
펜그 등의 논문(1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 12408-12415)에는 src 상동성 도메인3을 개시하고 있다.
골드 등의 논문(1995, Ann. Rev.Biochem. 64: 763-797)에는 엡타머를 개시하고 있다.
피치키 및 필즈의 논문(1995, Microbiol. Rev. 59: 94-123)에는 단백질-단백질간의 상호작용을 검출하고 분석하는 방법을 개시하고 있다.
아데이 및 케이의 논문(1996, Gene 169: 133-134)에는 랜덤 펩티드 라이브러리를 개시하고 있다.
스팍스 등의 논문(1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1540-1543)에는 src 상동성 도메인 3 단편을 개시하고 있다.
야노프스키 등의 논문(1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7381-7386)에는 조합물 펩티드 라이브러리를 사용하여 얻은 고친화성 인터류킨 I형(high affinity interleukin type I) 길항제를 개시하고 있다.
링스톤 등의 논문(1996, Science 273: 458-463)에는 에리트로포이에틴용 모방제로서 랜덤 펩티드 라이브러리로부터 분리된 작은 펩티드를 개시하고 있다.
홈즈 등의 논문(1996, Science 274: 2089-2091)에는 src SH3 도메인을 개시하고 있다.
팡 등의 논문(1996, Biochem. Biophys. Res. Commun. 220: 53-56)에는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 얻어진 트립신 억제제를 개시하고 있다.
한 등의 논문(1996, Science 274: 1363-1366)에는 아폽토틱 인자로서 파스(fas)를 개시하고 있다.
찬 등의 논문(1996, EMBO J. 15: 1045-1054)에는 기능적으로 src SH3 도메인을 닮은 도메인을 갖는 결합 단백질 형성을 개시하고 있다.
본 발명은 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적인 결합에 근거한 전기화학적 분석을 실행하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 전기화학적 매개체의 존재하에서, 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재와 전극상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재 사이의 특이적인 결합을 검출하기 위하여 전위차 분석을 실시하기 위한 전기화학적 분석장치를 제공한다. 한편, 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 전기화학적 매개체 및 전기화학적 촉매에 대한 기질의 존재하에서, 전기화학적 촉매, 바람직하게는 효소, 더욱 바람직하게는 레독스 효소에 결합된다. 특히, 본 발명은 전기화학적으로 라벨링된 생물학적으로 활성인 결합종의 존재하에서 인가된 전압영역에 대하여 생성된 전류의 싸이클릭 전압전류 분석을 실행하기 위한 장치를 제공한다. 또한, 생물학적으로 활성인 화학종의 복합 혼합물을 사용하여 결합 및 경쟁 결합 분석, 특히 경쟁 결합 분석을 실행하기 위한 본 발명의 장치를 이용하는 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 약제 개발, 생화학적 분석 및 단백질 정제 분석용으로 생물학적 결합쌍 부재들 사이의 특이적인 결합의 억제를 검출하기 위한 고처리량 스크린 분석을 실행하기 위한 방법을 제공한다.
도 1은 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하며 전기화학적으로 라벨링된 펩티드와 상호작용하는 생물학적 결합쌍의 제1 부재인 단백질 타겟이 고정되는 활성 고분자 또는 자기결합 단층(self-assembled monolayer)으로 도포되며, 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 본 발명에 따른 제1 전극의 구성요소 배열을 설명한다.
도 2는 GST-Src SH3 도메인 융합 단백질(domain fusion protein) 및 전기화학적으로 라벨링된 SH3 도메인 특이결합 펩티드를 사용한 전기화학적 분석 프로토콜을 설명한다.
도 3은 도 2에 나타난 프로토콜을 사용한 싸이클릭 전압전류법의 결과를 나타낸다.
도 4는 도 3에 나타난 실험결과의 싸이클릭 전압전류법의 적분 및 데이터 처리 결과를 나타낸다.
도 5는 전극에 고정된 GST-Src SH3 도메인 융합 단백질을 갖는 전극을 사용하여 실시한, 도 2 나타난 전기화학적 반응과, 전극에 고정된 GST만을 갖는 전극을 사용하여 실시한 반응을 비교하여 나타난, 적분 전류 아웃풋(output)의 차이를 보여주는 그래프이다.
도 6은 전기화학적으로 단백질을 라벨링하기 위한 화학반응 개략도 및 전기화학적 매개체와 라벨링된 단백질과의 레독스 상호작용을 나타낸다. 도 7은 싸이클릭 전압전류법의 특징을 설명한다.
도 8은 양고추냉이 퍼옥시다아제에 콘쥬게이트된 대위 리간드와 src 타겟 단백질의 결합으로 생성된 전류를 설명한다. 이 도면은 또한 결합되지 않는 대위 리간드의 부가로 생성된 전류를 나타낸다. 과산화수소는 600초에 첨가되고, 이어서 600초에 대위 리간드가 첨가된다.
도 9는 도 8과 동일한 조건하에서 티로신 RNA 합성효소에 대한 대위 리간드의 결합에 대하여 측정된 전류를 나타낸다.
도 10은 알려진 억제제가 티로신 RNA 합성효소로부터 대위 리간드를 치환할 때 관찰되는 전류손실을 나타낸다.
도 11은 대위 리간드 및 알려진 경쟁자인 티로신 RNA 합성효소를 동시에 첨가하므로써 얻은 전류응답을 나타낸다.
도 12는 억제제로 미리 인큐베이트한 티로신 RNA 합성효소에 대위 리간드를 첨가하므로써 얻은 전류응답을 나타낸다.
도 13은 티로신 RNA 합성효소 경쟁 억제제의 농도를 증가시키며 대위 리간드를 사용할 때 전류응답이 감소하는 것을 나타낸다.
도 14는 티로신 RNA 합성효소 경쟁억제제의 농도와 실시예 11에 기재된 경쟁 억제제를 사용한 전류응답의 감소 사이의 관계에 대한 그래프를 나타낸다.
본 발명은 생물학적 결합쌍 사이의 결합을 검출하기 위하여 전기화학적 분석을 실행하기 위한 방법 및 장치들을 제공한다. 이 방법 및 장치들은 생물학적 결합쌍 사이의 결합을 억제할 수 있는 화합물을 검출 및 분석하여, 생물학적 결합쌍을 포함하는 종의 생물학적 활성 부분과 상호작용할 수 있는 화합물을 동정하기 위한 직접 결합 및 경쟁 결합 실험을 실행하는데 유용하다. 본 발명의 방법은 생물학적 결합쌍의 부재들중 하나와 상호작용하여 그 생물학적 기능을 저해하거나 영향을 주는 약제로서 사용하기 위한 생물학적 활성 화합물에 대하여 고속 및 고용량으로 스크린 분석을 실행하는데 유용하다.
첫째로, 본 발명은 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 결합을 검출하기 위하여 전기화학적 분석을 실행하기 위한 장치를 제공한다. 본 발명에 따른 장치는
1. 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하며, 생물학적 결합쌍의 제1 부재가 고정되는 다공성 및 친수성 고분자층으로 도포된 표면을 가진 제1 전극,
2. 전해질 수용액과 접촉하는 도전성 금속을 포함하는 제2 레퍼런스 전극,
3. 도전성 금속을 포함하는 제3 보조 전극을 포함하며,
상기 전극 각각은 일정 전위기에 전기적으로 연결되고, 상기 장치는 또한,
4. 전해질 용액을 포함하며 상기 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하는 반응 챔버를 더 포함하고, 상기 용액은
5. 전위가 상기 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전극 특히, 상기 제1 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 전기화학적 매개체 및
6. 전위가 상기 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전기화학적 매개체와의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종으로 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 더 포함한다.
이러한 장치의 사용에 있어서, 생물학적 결합쌍의 제2 부재가 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 결합되는 조건하에서 전위가 상기 전극에 인가될 때 전류가 생성된다.
전기화학적 분석은 싸이클릭 전압전류법 또는 대시간 전류법이 바람직하다.
생물학적 결합쌍의 제1 부재는 수용체 단백질 또는 그 리간드 결합 단편인 것이 바람직하다. 다른 실시예에 있어서, 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 항체 단백질 또는 그 항원 결합 단편인 것이 바람직하다. 또 다른 실시예에 있어서, 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 제1 단백질 또는 제2 단백질에 특이하게 결합하는 제1 단백질의 단편인 것이 바람직하다.
생물학적 결합쌍의 제2 부재는 본 발명에 따른 장치의 제1 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 결합하는 리간드와 항원 또는 단백질인 것이 바람직하다. 당업자는 예를 들어 수용체/리간드, 항원/항체, 등과 같이 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 제2 부재를 적절히 선택할 수 있음을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시예에 있어서, 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 위한 대위 리간드이며, 바람직하게는 약 50피코몰(pM) 내지 약 0.5mM, 더욱 바람직하게는 약 1나노몰(nM) 내지 약 100마이크로몰, 가장 바람직하게는 약 10nM 내지 10마이크로몰의 결합 친화도를 갖는다. 상기 대위 리간드는 전기화학적으로 라벨링되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 루테늄 화합물로 라벨링되는 겻이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 장치에 따른 실시예에는 본 발명에 따른 다수의 전극과 반응 챔버를 더 포함하는 장치가 포함될 수 있는데, 각각의 반응 챔버는 전해질을 포함하며 상기 장치내의 상기 다수의 전극중 상기 3개의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고, 반응 챔버들 각각과 전기화학적으로 접촉하는 전극들 각각은 전기적으로 일정전위기와 연결된다.
상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 루테늄으로 전기화학적으로 라벨링되는 것이 바람직하다. 전기화학적 매개체는 루테늄 화합물인 것이 바람직하다. 전기화학적 매개체나 전기화학적 라벨로서 사용되는 루테늄 화합물은 {Ru(NH3)5Cl}Cl, Ru(NH3)6 3+또는 Ru(NH3)5(H2O)2+와 같은 펜타아민루테늄 화합물인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명은 또한 생물학적 결합쌍의 제1 부재가 고정되는 다공성 및 친수성 고분자층으로 도포된 표면을 가지며 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극을 제공한다. 이 전극은 본 발명의 장치 또는 다른 어떠한 전기화학적 분석을 실행하는데 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 장치의 제1전극을 제조하기 위한 키트(kit)를 제공한다. 본 발명에서 제공되는 상기 키트는 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극, 생물학적 결합쌍의 제1 부재, 상기 전극의 표면상에 다공성 및 친수성 고분자층을 형성하기 위한 리전트(reagent) 및 상기 전극 표면상에 형성된 다공성 및 친수성 고분자층 내에 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 고정시키기 위한 리전트를 포함한다.
이어서, 본 발명은 또한 여기 제공된 키트나 그 외의 기재를 사용하여 본 발명에 다른 장치의 제1전극을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은
a) 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극을 제조하는 단계;
b) 상기 전극의 표면상에 다공성 및 친수성 고분자층을 형성하는 단계; 및
c) 상기 전극의 표면상에 형성된 다공성 및 친수성 고분자층 내에 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 고정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 생물학적 결합쌍의 제1 부재로서 여기에 기술한 바와 같은 고정된 단백질로 도포된 제1전극을 포함하는 키트, 또는 상기 전극을 제조하기 위한 것으로서, 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재, 바람직하게는 단백질을 포함하는 리전트를 구비하는 키트를 제공하며, 이러한 키트는 전기화학적 타겟을 포함하게 된다. 또한 본 발명의 키트에 따른 실시예의 구성요소에 있어서, 하나 이상의 생물학적 결합쌍의 제2 부재가 제공되는데, 상기 생물학적 결합쌍의 제2부재는 바람직하게는 약 50피코몰(pM) 내지 약 0.5mM, 더욱 바람직하게는 약 1나노몰(nM) 내지 약 100마이크로몰, 가장 바람직하게는 약 10nM 내지 10마이크로몰의 분해상수(Kd)로 특정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 위한 결합 특이성을 갖는 대위 리간드를 포함하므로 전기화학적 탐침을 포함하게 된다. 본 발명에 따른 키트의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 전기화학적으로 라벨링된다. 본 발명에 따른 키트의 다른 실시예에서는, 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 사용자가 전기화학적으로 라벨링 할 수 있도록 전기화학적 라벨을 포함하는 리전트로 제공된다. 키트는 또한 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 전기화학적 매개체를 제공한다.
상기 키트는 또한 전기화학적으로 라벨링된 탐침과 함께 본 발명의 방법에 따라 사용되도록 전기화학적으로 맞추어진, 다량의 전기화학적 매개체를 선택적으로 유리하도록 구비한다. 본 발명에 따른 키트는 경우에 따라 여기에 기술한 바와 같이 버퍼, 리전트 및 전극을 부가적으로 포함한다.
본 발명에 따른 장치를 사용하는 방법이 또한 제공된다. 첫번째 실시예에서는, 본 발명의 일 태양에 따른 장치를 사용하여, 전극상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제2 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합을 검출하기 위한 방법이 제공된다. 이 실시예에서 상기 방법은,
a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제1 반응 챔버와, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
상기 제1 반응챔버는 본 발명에 따른 장치의 전기화학적 매개체 및 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는, 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 본 발명에 따른 장치의 전기화학적 매개체 및 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합되지 않는 전기화학적으로 라벨링된 종을 포함한다; 다른 실시예에 있어서, 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 제1 반응챔버 및 제2 반응챔버에 모두 존재하나, 제2 반응챔버 내의 전극상에 고정된 제1 부재는 전기화학적으로 라벨링된 제 2 부재와 특이하게 결합하지는 않는다. 상기 방법은,
b) 본 발명에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합은 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 검출된다. 생물학적 결합쌍들 사이의 특이적인 상호작용은 전위가 각 챔버내의 전극들 사이에 인가될 때 반응챔버 각각에서 생성되는 전기적 전류를 비교함으로써 검출된다. 생물학적 결합쌍의 제1 및 제2 부재의 특이적인 결합은 제2 반응챔버보다도 제1 반응챔버 내에서 더 높은 전류를 생성시키는데, 챔버내에서 생물학적 결합쌍의 제2 부재와 전극에 고정된 관련없는 종들 사이에, 또는 제 2 반응챔버 내의 전극에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 제2 반응챔버 내에 포함된 전기화학적으로 라벨링된 관계없는 종들 사이에는 특이적인 상호작용이 일어나지 않는다. 본 발명에 따른 방법의 두번째 실시예에는 본 발명의 일태양에 따른 장치를 사용하여 전극상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 동정하기 위한 방법이 제공된다. 이 실시예에서, 상기 방법은
a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제1 반응 챔버와, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
상기 반응챔버 각각은 본 발명에 따른 장치의 전기화학적 매개체 및 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는, 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 포함하는 단계;
b) 본 발명의 장치에 따른 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제는 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 동정된다. 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적인 상호작용은 전위가 반응 챔버내의 전극들 사이에 인가될 때 반응챔버 각각에서 생성하는 전기적 전류를 비교함으로써 검출된다. 반응 챔버 내에서 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 제2 부재의 특이적인 결합에 의해 생성되는 전류레벨 및 전류량은 특이적인 결합에 대한 억제제의 존재하에서 챔버에서 생성되는 전류레벨 및 전류량과, 농도에 따른 차이점 및/또는 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대한 억제제의 결합 친화성과 비교된다.
본 발명의 세번째 실시예에서 본 발명의 일 측면에 따른 장치를 사용하여 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 위한 복합 화학 혼합물을 스크린하는 방법이 제공된다. 상기 방법은
a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제1 반응 챔버와, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
상기 반응챔버 각각은 본 발명의 장치에 따른 전기화학적 매개체 및 상기 고정된 1 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는, 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 복합 혼합물 성분을 더 포함하는 단계;
b) 본 발명에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 복합 혼합물은 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 동정된다. 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적인 상호작용은 전위가 반응 챔버내의 전극들 사이에 인가될 때 반응챔버 각각에서 생성되는 전기적 전류를 비교함으로써 검출된다. 반응 챔버 내에서 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 제2 부재의 특이적인 결합에 의해 생성되는 전류레벨 및 전류량은 특이적인 결합에 대한 억제제를 포함하는 복합 화학 혼합물의 존재하에서 챔버에서 생성되는 전류 레벨 및 전류량과 대비된다.
본 발명의 부가적인 실시예에 있어서, 상기 방법은 본 발명에 따른 장치의 제1 전극상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대한 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 분리하고 동정하는데 사용된다. 이 실시예에서, 본 발명은
d) 분별된 서브혼합물을 얻기 위하여, 상기 제1 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대한 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 상기 복합 혼합물을 화학적으로 분별하는 단계; 및
e) 생물학적 결합쌍의 결합 억제제를 함유하는 상기 서브혼합물을 동정하기 위하여 상기 분별된 서브혼합물 각각에 대하여 상기 방법의 a)단계 내지 c)단계를 실행하는 부가적인 단계를 더 포함한다.
이러한 측면에서, 서브혼합물이 점차 정제된 억제제를 함유할 수 있도록, 화학적으로 분별된 서브혼합물에 대해 상기 a)단계에서 e)단계를 반복적으로 실행할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 바람직하게는, 상기 화학적 분별은 억제제의 생물학적 또는 생화학적 종을 분별하기 위한 화학적, 생화학적, 물리적 및 면역학적 방법을 포함한다.
본 발명에 따른 방법 각각의 바람직한 실시예에서, 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 위한 분해상수(Kd)가 바람직하게는 약 50피코몰(pM) 내지 약 0.5mM, 더욱 바람직하게는 약 1나노몰(nM) 내지 약 100마이크로몰, 가장 바람직하게는 약 10nM 내지 10마이크로몰로 특정되는, 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드이다.
본 발명의 두번째 측면에서, 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 결합을 검출하기 위한 전기화학적 분석을 실행하기 위하여 다른 장치가 제공된다. 본 발명의 이러한 측면에서, 상기 장치는
1. 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하며, 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전기화학적 매개체가 각각 고정되는 다공성 및 친수성 고분자층으로 도포된 표면을 갖는 제1 전극;
2. 전해질 수용액과 접촉하는 도전성 금속을 포함하는 제2 레퍼런스 전극;
3. 도전성 금속을 포함하는 제3 보조전극을 포함하며,
상기 전극 각각은 일정 전위기에 전기적으로 연결되고, 상기 장치는 또한,
4. 전해질 용액을 포함하며, 상기 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하는 반응 챔버를 포함하고, 상기 용액은
5. 전위가 상기 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전기화학적 매개체와의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종으로 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함한다.
이러한 장치의 사용에 있어서, 생물학적 결합쌍의 제2 부재가 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 결합되는 조건하에서 전위가 전극에 인가될 때 전류가 생성된다.
전기화학적 분석은 사이클릭 전압전류법 또는 대시간 전류법이 바람직하다.
생물학적 결합쌍의 제1 부재는 수용체 단백질 또는 그 리간드 결합 단편인 것이 바람직하고, 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 항체 단백질 또는 그 항원 결합 단편인 것이 바람직하다. 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 제2 단백질에 특이하게 결합하는 제1 단백질 또는 그 단편인 것이 더욱 바람직하다.
생물학적 결합쌍의 제2 부재는 본 발명에 따른 장치의 제1 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 결합하는 리간드와 항원 또는 단백질인 것이 바람직하다. 당업자는 예를 들어 수용체/리간드, 항원/항체, 등과 같이 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 제2 부재를 적절히 선택할 수 있음을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시예에 있어서, 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 위한 대위 리간드로서, 바람직하게는 약 50피코몰(pM) 내지 약 0.5mM, 더욱 바람직하게는 약 1나노몰(nM) 내지 약 100마이크로몰, 가장 바람직하게는 약 10nM 내지 10마이크로몰의 결합 친화도를 갖는다. 상기 대위 리간드는 전기화학적으로 라벨링되는 것이 바람직하며, 루테늄 화합물로 라벨링된 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 장치에 따른 실시예에는 본 발명에 따른 다수의 전극과 반응 챔버를 더 포함하는 장치가 포함될 수 있는데, 각각의 반응 챔버는 전해질을 포함하며 상기 장치내의 상기 다수의 전극중 상기 3개의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고, 반응 챔버들 각각과 전기화학적으로 접촉하는 전극들 각각은 전기적으로 일정 전위기와 연결된다.
상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 루테늄으로 전기화학적으로 라벨링되는 것이 바람직하다. 전기화학적 매개체는 루테늄 화합물 또는 오스뮴 화합물인 것이 바람직하다. 전기화학적 매개체나 전기화학적 라벨로서 사용되는 루테늄 화합물은 {Ru(NH3)5Cl}Cl, Ru(NH3)6 3+또는 Ru(NH3)5(H2O)2+와 같은 펜타아민루테늄 화합물인 것이 더욱 바람직하다.
바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 장치의 제1 전극상에 고정된 전기화학적 매개체는 오스뮴 비피리딘 화합물이다.
본 발명의 이러한 바람직한 실시예에서, 생물학적 결합쌍 부재들 사이의 특이적인 결합 상호작용은 전기적 전류를 관찰하므로써 검출된다. 상기 전기적 전류는 고정된 전기화학적 매개체와 생물학적 결합쌍의 제2 부재에 부착된 전기화학적 라벨을 활성화(산화 또는 환원)시키기에 충분한 전극 포텐셜에서 생성된다. 상기 적절한 전극 포텐셜에서, 산화(또는 환원)된 전기화학적 매개체는 전기화학적 라벨에 의해 환원(산화)된다. 전극 포텐셜에 의해 전기화학적 매개체/전기화학적 라벨쌍의 산화/환원 싸이클이 이루어지므로써 전류가 생성된다. 본 발명의 실시에 있어서, 생물학적 결합쌍의 부재들의 특이적 결합에 의해 생성되는 전류량은 생물학적 결합쌍의 제2 부재가 부가되기 전에 생성되는 전류량 또는 알려진 비결합 부재(네가티브 콘트롤을 제공하는)를 부가하여 생성되는 전류량과 비교된다. 결합의 특이성은 알려진 결합 억제제의 존재하에서 생성되는 전류와 상기 전류를 비교하므로써 결정된다. 부가적인 비교로서, 결합억제, 활성화 또는 경쟁의 능력 또는 속도는 추정 억제제, 경쟁자, 활성제 또는 약물 선향자의 존재하에서 생성되는 전류량을 분석하므로써 결정될 수 있으며, 이러한 비교를 실행하는 자세한 내용은 아래에 자세히 기재되며, 당업자는 이로부터 충분히 이해할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 전기화학적 매개체 및 생물학적 결합쌍의 제1 부재가 각각 고정되는 다공성 및 친수성 고분자층으로 도포된 표면을 가지며, 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극을 제공한다.
이 전극은 본 발명의 장치 또는 다른 어떠한 전기화학적 분석을 실행하는데 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 장치의 제1 전극을 제조하는 키트(kit)를 제공한다. 본 발명에서 제공되는 상기 키트는 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극, 전기화학적 매개체, 생물학적 결합쌍의 제1 부재, 상기 전극의 표면상에 다공성 및 친수성 고분자층을 형성하기 위한 리전트(reagent) 및 상기 전극 표면상에 형성된 다공성 및 친수성 고분자층내에 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 상기 전기화학적 매개체를 고정하기 위한 리전트를 포함한다.
이어서, 본 발명은 또한 여기 제공된 키트나 그 외의 기재를 사용하여 본 발명에 따른 장치의 제1전극을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은
a) 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극을 제조하는 단계;
b) 상기 전극의 표면상에 다공성 및 친수성 고분자 층을 형성하는 단계; 및
c) 상기 전극의 표면상에 형성된 다공성 및 친수성 고분자 층 내에 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 상기 전기화학적 매개체를 고정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 생물학적 결합쌍의 제1 부재로서 여기에 기술한 바와 같은 고정된 단백질 및 전기화학적 매개체로 도포된 제1 전극을 포함하는 키트, 또는 상기 전극을 제조하기 위한 것으로서, 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재, 바람직하게는 단백질을 포함하는 리전트를 구비하는 키트를 제공하며, 이러한 키트는 전기화학적 타겟 및 전기화학적 매개체를 포함하게 된다. 또한 본 발명에 따른 키트의 실시예의 구성요소에 있어서, 하나 이상의 생물학적 결합쌍의 제2 부재가 제공되는데, 상기 생물학적 결합쌍의 제2부재는 바람직하게는 약 50피코몰(pM) 내지 약 0.5mM, 더욱 바람직하게는 약 1나노몰(nM) 내지 약 100마이크로몰, 가장 바람직하게는 약 10nM 내지 10마이크로몰의 분해상수(Kd)로 특정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 위한 결합 특이성을 갖는 대위 리간드를 포함하므로, 전기화학적 탐침을 포함하게 된다. 본 발명에 따른 키트의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 전기화학적으로 라벨링된다. 본 발명에 따른 키트의 다른 실시예에서는, 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 사용자가 전기화학적으로 라벨링 할 수 있도록 전기화학적 라벨을 포함하는 리전트로 제공된다.
상기 키트는 또한 전기화학적으로 라벨링된 탐침과 함께 본 발명의 방법에 따라 사용되도록 전기화학적으로 맞추어진, 다량의 전기화학적 매개체를 선택적으로 유리하도록 구비한다. 본 발명에 따른 키트는 경우에 따라 여기에 기술한 바와 같이 버퍼, 리전트 및 전극을 부가적으로 포함한다.
본 발명에 따른 장치를 사용하는 방법이 또한 제공된다. 첫번째 실시예에서는, 본 발명의 이러한 측면에 따른 장치를 사용하여, 전극상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합을 검출하는 방법이 제공된다. 이 실시예에서 상기 방법은
a) 장치의 전극들 각각은 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 본 발명에 따른 장치의 전극들의 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극은 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 전기화학적 매개체를 포함하는 제1 반응챔버와, 본 발명에 따른 장치의 전극들의 각각과 전기화학적으로 접촉하며, 제1 전극은 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 전기화학적 매개체를 포함하는 제2 반응챔버를 제공하는 단계를 포함하며,
제1 반응챔버는 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합된 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합되지 않은 전기화학적으로 라벨링된 종을 포함하는데, 다른 실시예에서는 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재가 제1 반응챔버 및 제2 반응챔버에 존재하나, 제2 반응챔버내의 전극상에 고정된 제1 부재는 전기화학적으로 라벨링된 제2 부재와 특유하게 결합되지는 않는다. 상기 방법은
b) 본 발명에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들의 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 본 장치의 전극들에서 전류를 생성하는 단계; 및
c) 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 더 포함한다.
여기에서, 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합은 제2 반응챔버에서 생성된 전류보다 큰, 제1 반응챔버에서 생성된 전류에 의하여 검출되어진다. 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적인 상호작용은 전위가 각 챔버내의 전극들 사이에 인가될 때 반응챔버 각각에서 생성된 전기적 전류를 비교함으로써 검출된다. 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 제2 부재의 특이적인 결합은 제2 반응챔버보다도 제1 반응챔버내에서 더 높은 전류를 생성하는데, 챔버내의 생물학적 결합쌍의 제2 부재와 전극에 고정된 관련없는 종들 사이에 또는 제 2 반응챔버내에 포함되는 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 관계없는 종들 사이에는 특이적인 상호작용이 존재하지 않는다.
본 발명의 이러한 측면에 따른 방법의 두번째 실시예에는 본 발명에 따른 장치를 사용하여 전극상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재와의 결합 억제제를 동정하기 위한 방법이 제공된다. 이 실시예에서, 상기 방법은
a) 장치의 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 함유하는 전기화학적 매개체를 포함하는 제1 반응 챔버와, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 전기화학적 매개체를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
상기 반응챔버 각각은 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 특이하게 결합하는 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 더 포함하는 단계:
b) 본 발명에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제는 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 동정된다. 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적인 상호작용은 전위가 챔버내의 전극들 사이에 인가될 때 반응챔버 각각에서 생성된 전기적 전류를 비교함으로써 검출된다. 반응 챔버 내에서 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 제2 부재의 특이적인 결합에 의해 생성된 전류레벨 및 전류량은 특이적인 결합에 대한 억제제의 존재하에서 챔버에서 생성된 전류레벨 및 전류량 및, 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대한 억제제의 결합 친화성 및/또는 농도에 따른 차이점과 비교된다.
본 발명의 일 측면에 따른 세번째 실시예에서 본 발명에 따른 장치를 사용하여 전극상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제용 복합 화학 혼합물을 스크린하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은
a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 함유하는 전기화학적 매개체를 포함하는 제1 반응 챔버와, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 함유하는 전기화학적 매개체를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
상기 반응챔버 각각은 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 복합 혼합물 성분을 더 포함하는 단계;
b) 본 발명에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
여기에서, 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 복합 혼합물은 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 동정된다. 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적인 상호작용은 전위가 반응 챔버내의 전극들 사이에 인가될 때 반응챔버 각각에서 생성된 전기적 전류를 비교함으로써 검출된다. 반응 챔버 내에서 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 제2 부재의 특이적인 결합에 의해 생성된 전류레벨 및 전류량은 특이적인 결합에 대한 억제제를 포함하는 복합 화학 혼합물의 존재하에서 챔버에서 생성된 전류 레벨 및 전류량과 대비된다.
본 발명의 부가적인 실시예에 있어서, 상기 방법은 본 발명에 따른 장치의 제1 전극상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대한 제2 생물학적 결합쌍의 결합 억제제를 분리하고 동정하는데 사용된다. 이 실시예에서, 본 발명은
d) 분별된 서브혼합물을 얻기 위하여, 상기 제1 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대한 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 상기 복합 혼합물을 화학적으로 분별하는 단계; 및
e) 생물학적 결합쌍의 결합 억제제를 함유하는 상기 서브혼합물을 동정하기 위하여 상기 분별된 서브혼합물 각각에 대하여 상기 방법의 a)단계 내지 c)단계를 실행하는 부가적인 단계를 더 포함한다.
이러한 측면에서, 서브혼합물이 점차 정제된 억제제를 함유할 수 있도록, 화학적으로 분별된 서브혼합물에 대해 a)단계에서 e)단계를 반복적으로 실행할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 바람직하게는, 상기 화학적 분별은 억제제의 생물학적 또는 생화학적 종을 분별하기 위한 화학적, 생화학적, 물리적 및 면역학적 방법을 포함한다.
본 발명에 따른 방법 각각의 바람직한 실시예에서, 생물학적 결합쌍의 제2 부재는, 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 위한 분해상수(Kd)가 바람직하게는 약 50피코몰(pM) 내지 약 0.5mM, 더욱 바람직하게는 약 1나노몰(nM) 내지 약 100마이크로몰, 가장 바람직하게는 약 10nM 내지 10마이크로몰로 특정되는, 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드이다.
본 발명의 세번째 측면에서, 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 결합을 검출하기 위하여 전기화학적 분석을 수행하기 위한 다른 장치가 제공된다. 본 발명의 이러한 측면에서, 상기 장치는
1. 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하며, 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전기화학적 매개체가 각각 고정되는 다공성 및 친수성 고분자층으로 도포된 표면을 갖는 제1 전극;
2. 전해질 수용액과 접촉하는 도전성 금속을 포함하는 제2 레퍼런스 전극;
3. 도전성 금속을 포함하는 제3 보조전극을 포함하며,
상기 전극 각각은 일정 전위기에 전기적으로 연결되고, 상기 장치는 또한,
4. 전해질 용액을 포함하며, 상기 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하는 반응 챔버를 포함하고, 상기 용액은
5. 전위가 상기 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전기화학적 매개체와의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 전기화학적 촉매에 결합된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 상기 반응챔버 내의 전해질은 전기화학적 촉매를 위한 기질을 포함한다.
이러한 장치를 사용하는데 있어서, 생물학적 결합쌍의 제2 부재에 결합된 전기화학적 촉매를 위한 기질의 존재하에 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 생물학적 결합쌍의 제2 부재가 결합되는 조건하에서 전위가 상기 전극에 인가될 때 상기 장치 내에서 전류가 생성된다.
전기화학적 분석은 사이클릭 전압전류법 또는 대시간 전류법이 바람직하다.
생물학적 결합쌍의 제1 부재는 수용체 단백질 또는 그 리간드 결합 단편인 것이 바람직하고, 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 항체 단백질 또는 그 항원 결합 단편인 것이 바람직하다. 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 제2 단백질에 특이하게 결합하는 제1 단백질 또는 그 단편인 것이 더욱 바람직하다.
생물학적 결합쌍의 제2 부재는 본 발명에 따른 장치의 제1 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 결합하는 리간드와 항원 또는 단백질인 것이 바람직하다. 당업자는 예를 들어 수용체/리간드, 항원/항체, 등과 같이 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 제2 부재를 적절히 선택할 수 있음을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 실시예에 있어서, 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 위한 대위 리간드로서, 바람직하게는 약 50피코몰(pM) 내지 약 0.5mM, 더욱 바람직하게는 약 1나노몰(nM) 내지 약 100마이크로몰, 가장 바람직하게는 약 10nM 내지 10마이크로몰의 결합 친화도를 갖는다. 상기 대위 리간드는 전기화학적 촉매, 특히 양고추냉이 퍼옥시다아제와 같은 레독스 효소로 라벨링되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 장치에 따른 실시예에는 본 발명에 따른 다수의 전극과 반응 챔버를 더 포함하는 장치가 포함될 수 있는데, 각각의 반응 챔버는 전해질을 포함하며 상기 장치내의 상기 다수의 전극중 상기 3개의 전극과 전기화학적으로 접촉하고, 반응 챔버들 각각과 전기화학적으로 접촉하는 전극들 각각은 전기적으로 일정전위기와 연결된다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 전기화학적 촉매로 라벨링된다. 상기 전기화학적 촉매는 산화/환원 메카니즘에 의한 생성물에 대하여 기질의 촉매작용을 할 수 있는 효소, 특히 레독스 촉매인 것이 바람직한데, 여기서, 결합 보조인자의 효소상의 관능성기가 산화/환원 사이클에 포함된다. 상기 전기화학적 촉매는 퍼옥시다아제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다아제인 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 장치의 제1 전극상에 고정된 전기화학적 매개체는 오스뮴 화합물이 바람직하고, 오스뮴 비피리딘 화합물이 더욱 바람직하다.
본 발명의 이러한 바람직한 실시예에서, 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적인 결합 상호작용은 전기적 전류를 관찰하므로써 검출된다. 본 발명의 장치는 전극을 포함하는데, 전기화학적 매개체 및 생물학적 결합쌍의 제1 부재가 모두 전극에 도포된 고분자층 내에 고정된다. 상기 장치는 또한 고정된 매개체에 의해 산화 또는 환원될 수 있고 또한 용액내에 존재하는 제3 종(실시예에서 전기화학적 촉매는 효소이고 제3 종은 효소용 기질임)을 촉매작용으로 산화 또는 환원시킬 수 있는 종(바람직하게는 효소)과 화학적으로 결합된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함한다. 그러나, 이 제3 종은 전극상에 존재하는 고정된 매개체 종에 의해서 직접적으로 산화 또는 환원될 수 없다. 본 발명의 실시예에 있어서, 생물학적 결합쌍 부재들 사이의 특이적인 결합 상호작용은 전기적 전류를 관찰하므로써 검출된다.
상기 전기적 전류는 고정된 전기화학적 매개체와 전기적 촉매가 생물학적 결합쌍의 제2 부재에 부착될 수 있도록 활성화(산화 또는 환원)되기에 충분한 전극 포텐셜에서 생성된다. 상기 적절한 전극 포텐셜에서, 산화(또는 환원)된 전기화학적 매개체는 전기화학적 촉매에 의해 환원(산화)되므로써, 그 기질용 촉매를 활성화시킨다. 상기 기질이 소비됨에 따라, 전극 포텐셜에 의해 전기화학적 매개체/전기화학적 촉매쌍의 산화/환원 싸이클이 이루어지므로써 전기화학적 촉매에 의한 기질의 촉매작용으로 전류가 생성된다. 본 발명의 실시에 있어서, 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적인 결합에 의해 생성되는 전류량은 생물학적 전자쌍의 제2 부재가 부가되기 전에 생성되는 전류량이나 또는 알려진 비결합 부재(네가티브 콘트롤을 제공하는)를 부가하여 생성되는 전류량과 대비된다. 결합의 특이성은 상기 전류를 알려진 결합 억제제 존재하에서 생성되는 전류에 대비하므로써 결정된다. 또한, 결합억제, 활성화 또는 경쟁의 능력이나 속도는 추정 억제제, 경쟁자, 활성제 또는 약물 선향자의 존재하에서 생성된 전류량을 분석하므로써 결정될 수 있으며, 이러한 대비 방법은 아래에 자세히 기재되며, 당업자는 이로부터 충분히 이해할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 전기화학적 매개체 및 생물학적 결합쌍의 제1 부재가 각각 고정되는 다공성 및 친수성 고분자층으로 도포된 표면을 가지며, 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극을 제공한다.
이 전극은 본 발명의 장치 또는 다른 어떠한 전기화학적 분석을 실행하는데 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 장치의 제1 전극을 제조하는 키트(kit)를 제공한다. 본 발명에서 제공되는 상기 키트는 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극, 전기화학적 매개체, 생물학적 결합쌍의 제1 부재, 상기 전극의 표면상에 다공성 및 친수성 고분자층을 형성하기 위한 리전트(reagent) 및 상기 전극 표면상에 형성된 다공성 및 친수성 고분자층내에 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 상기 전기화학적 매개체를 고정하기 위한 리전트를 포함한다.
이어서, 본 발명은 또한 여기 제공된 키트나 그 외의 기재를 사용하여 본 발명에 따른 장치의 제1 전극을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은
a) 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극을 제조하는 단계;
b) 상기 전극의 표면상에 다공성 및 친수성 고분자 층을 형성하는 단계; 및
c) 상기 전극의 표면상에 형성된 다공성 및 친수성 고분자 층 내에 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 상기 전기화학적 매개체를 고정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 생물학적 결합쌍의 제1 부재로서 여기에 기술한 바와 같은 고정된 단백질 및 전기화학적 매개체로 도포된 제1전극을 포함하는 키트, 또는 상기 전극을 제조하기 위한 것으로서, 전극상에 고정되는, 생물학적 결합쌍의 제1 부재, 바람직하게는 단백질을 포함하는 리전트를 구비하는 키트를 제공하며, 이러한 키트는 전기화학적 타겟 및 전기화학적 매개체를 포함하게 된다. 또한 본 발명에 따른 키트의 실시예의 구성요소에 있어서, 하나 이상의 생물학적 결합쌍의 제2 부재가 제공되는데, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 바람직하게는 약 50피코몰(pM) 내지 약 0.5mM, 더욱 바람직하게는 약 1나노몰(nM) 내지 약 100마이크로몰, 가장 바람직하게는 약 10nM 내지 10마이크로몰의 분해상수(Kd)로 특정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 위한 결합 특이성을 갖는 대위 리간드를 포함하므로, 전기화학적 탐침을 포함하게 된다. 본 발명에 따른 키트의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 전기화학적 촉매에 결합되어 제공된다. 본 발명에 따른 키트의 다른 실시예에서, 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 사용자가 전기화학적 촉매와 결합된 제2 부재를 제조할 수 있도록 전기화학적 촉매를 포함하는 리전트로 제공된다.
상기 키트는 또한 전기화학적 촉매와 함께 본 발명의 방법에 따라 사용되도록 전기화학적으로 맞추어진, 다량의 전기화학적 매개체를 선택적으로 유리하도록 구비한다. 본 발명에 따른 키트는 경우에 따라 여기에 기술한 바와 같이 버퍼, 리전트 및 전극을 부가적으로 포함한다.
본 발명에 따른 장치를 사용하는 방법이 또한 제공된다. 첫번째 실시예에서는, 본 발명의 이러한 측면에 따른 장치를 사용하여, 전극상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합을 검출하는 방법이 제공된다. 이 실시예에서 상기 방법은
a) 장치의 전극들 각각은 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 본 발명에 따른 장치의 전극들의 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극은 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 전기화학적 매개체를 포함하는 제1 반응챔버와, 본 발명에 따른 장치의 전극들의 각각과 전기화학적으로 접촉하며, 제1 전극은 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 전기화학적 매개체를 포함하는 제2 반응챔버를 제공하는 단계를 포함하며,
제1 반응챔버는 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하며 전기화학적 촉매에 결합되는 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제 2 반응챔버는 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합되지 않은 전기화학적 촉매에 결합된 종을 포함하며, 반응 챔버 각각은 전기화학적 촉매용 기질을 더 포함하고; 다른 실시예에서는 전기화학적 촉매에 결합되며 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재 모두 제1 반응챔버 및 제2 반응챔버에 존재하나, 제2 반응챔버내의 전극상에 고정된 제1 부재는 전기화학적 촉매와 결합된 제2 부재와 특유하게 결합되지는 않는다. 상기 방법은,
b) 본 발명에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들의 각각에 전기화학적 분석을 수행하여 본 장치의 전극들에서 전류를 생성하는 단계; 및
c) 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 더 포함한다.
여기에서, 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합은 제2 반응챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응챔버에서 생성되는 전류에 의하여 검출되어진다. 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적인 상호작용은 전위가 각 챔버내의 전극들 사이에 인가될 때 반응챔버 각각에서 생성된 전기적 전류를 비교함으로써 검출된다. 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 제2 부재의 특이적인 결합은 제2 반응챔버보다도 제1 반응챔버내에서 더 높은 전류를 생성하는데, 챔버내의 생물학적 결합쌍의 제2 부재와 전극에 고정된 관련없는 종들 사이에 또는 제 2 반응챔버내에 포함되는 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 관계없는 종들 사이에는 특이적인 상호작용이 존재하지 않는다.
본 발명의 이러한 측면에 따른 방법의 두번째 실시예에는 본 발명에 따른 장치를 사용하여 전극상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재와의 결합 억제제를 동정하기 위한 방법이 제공된다. 이 실시예에서, 상기 방법은
a) 장치의 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 함유하는 전기화학적 매개체를 포함하는 제1 반응 챔버와, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 전기화학적 매개체를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
반응 챔버 각각은 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하며 전기화학적 촉매에 결합된 생물학적 결합쌍의 제2 부재 및 전기화학적 촉매용 기질을 포함하고, 제2 반응챔버는 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 제2 생물학적 결합쌍의 결합 억제제를 포함하는 단계;
b) 본 발명에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제는 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 동정된다. 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적인 상호작용은 전위가 챔버내의 전극들 사이에 인가될 때 반응챔버 각각에서 생성된 전기적 전류를 비교함으로써 검출된다. 반응 챔버 내에서 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 제2 부재의 특이적인 결합에 의해 생성된 전류레벨 및 전류량은 특이적인 결합에 대한 억제제의 존재하에서 챔버에서 생성된 전류레벨과 비교된다.
본 발명의 일 측면에 따른 세번째 실시예에서 본 발명에 따른 장치를 사용하여 전극상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제용 복합 화학 혼합물을 스크린하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은
a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 함유하는 전기화학적 매개체를 포함하는 제1 반응 챔버와, 본 발명에 따른 장치의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 함유하는 전기화학적 매개체를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
반응 챔버 각각은 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하며 전기화학적 촉매에 결합된 생물학적 결합쌍의 제2 부재 및 전기화학적 촉매용 기질을 포함하고, 제2 반응챔버는 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 포함하는 단계;
b) 본 발명에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 복합 혼합물은 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 동정된다. 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적인 상호작용은 전위가 반응 챔버내의 전극들 사이에 인가될 때 반응챔버 각각에서 생성된 전기적 전류를 비교함으로써 검출된다. 반응 챔버 내에서 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 제2 부재의 특이적인 결합에 의해 생성된 전류레벨 및 전류량은 특이적인 결합에 대한 억제제를 포함하는 복합 화학 혼합물의 존재하에서 챔버에서 생성된 전류 레벨 및 전류량과 대비된다.
본 발명의 부가적인 실시예에 있어서, 상기 방법은 본 발명에 따른 장치의 제1 전극상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대한 제2 생물학적 결합쌍의 결합 억제제를 분리하고 동정하는데 사용된다. 이 실시예에서, 본 발명은
d) 분별된 서브혼합물을 얻기 위하여, 상기 제1 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대한 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 상기 복합 혼합물을 화학적으로 분별하는 단계; 및
e) 생물학적 결합쌍의 결합 억제제를 함유하는 상기 서브혼합물을 동정하기 위하여 상기 분별된 서브혼합물 각각에 대하여 상기 방법의 a)단계 내지 c)단계를 실행하는 부가적인 단계를 더 포함한다.
이러한 측면에서, 서브혼합물이 점차 정제된 억제제를 함유할 수 있도록, 화학적으로 분별된 서브혼합물에 대해 a)단계에서 e)단계를 반복적으로 실행할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 바람직하게는, 상기 화학적 분별은 억제제의 생물학적 또는 생화학적 종을 분별하기 위한 화학적, 생화학적, 물리적 및 면역학적 방법을 포함한다.
본 발명에 따른 방법 각각의 바람직한 실시예에서, 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대한 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드로서, 바람직하게는 약 50피코몰(pM) 내지 약 0.5mM, 더욱 바람직하게는 약 1나노몰(nM) 내지 약 100마이크로몰, 가장 바람직하게는 약 10nM 내지 10마이크로몰의 결합친화도를 갖는다.
본 발명 특유의 바람직한 실시예는 아래 자세히 기술된 실시예와 청구범위로부터 증명될 것이다.
본 발명은 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적인 상호작용(특히, 결합을 포함하는)을 검출하기 위한 장치 및 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 목적을 위하여, "생물학적 결합쌍"이라는 용어는 분해상수가 50mM 이상으로 측정되는 화학 친화성으로 특유하게 결합하는, 생물학적으로 유도되거나 분리된 두개의 모든 분자 또는 특이하게 서로 상호작용하는 화학종을 포함한다. 이러한 생물학적 결합쌍의 정의에 특히 포함되는 것으로는, 단백질의 단편을 포함하는 다른 단백질과 상호작용하는 단백질; 단백질 및 펩티드; 단백질 및 리간드; 단백질 및 보조인자; 단백질 및 알로스테릭 또는 합동 레귤레이터; 단백질 및 핵산; 단백질 및 탄수화물; 항원 및 항체; 지방산과 트리글리세라이드를 포함하는 지질 및 단백질이나 펩티드와 상호작용하는 극성 지질; 수용체 및 리간드(특히 시토킨); 바이러스-수용체쌍; 효소 및 기질; 및 효소 및 억제제가 있다. 또한, 하나 이상의 생물학적 결합쌍의 부재와 상호작용하는 모든 화합물 또는 혼합물도 이러한 정의에 포함된다. 본 발명의 생물학적 결합쌍의 부재들은 자연적으로 생성하거나, 합성되거나 재조합 유전자 수단 또는 생화학적 분리 및 추출 수단으로 제조된 분자들을 포함한다. 생물학적 결합쌍의 한 부재를 합성하는 실시예들은 자연발생적인 유사체의 일 부분과 구조적으로 유사하다는 것을 보여주는 것으로 이해될 것이다. 이러한 정의는 배타적이지 않으며 제한도 없으며, 정의된 화학적 친화성으로 특이하게 상호작용할 수 있는, 모든 두개의 생물학적 또는 화학적 종을 포함한다.
본 발명의 장치는 다공성 및 친수성 고분자 물질로 도포된 도전성 또는 반도전성 제1 전극을 포함한다. 본 발명의 도전성 또는 반도전성 전극을 제조하는데 사용되는 물질에는 예를 들어, 주석-도핑 인듐 산화물 또는 플루오린-도핑 주석 산화물 유리와 같은 금속-함유 유리, 금, 탄소 또는 백금이 포함되며, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 제1 전극을 도포하는데 사용되는 물질은 예를 들어, 한천, 아가로즈, 덱스트란 및 변형 덱스트란, 아크릴아미드, 피롤 및 피롤-카르복실레이트, 폴리스티렌, 나일론, 니트로셀룰로즈, 마일라, 나피온(Nafion), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리피롤, 폴리티오펜 및 폴리아닐린을 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 도포물과 전도성 또는 반전도성 전극물질의 화학적 성질을 고려한 방법을 사용하여 본 발명의 제1 전극을 도포한다. 예를 들면, 전극 표면은 피롤을 사용하여 전기중합법으로 도포할 수 있고, 또는 폴리스티렌, 마이어 또는 나피온과 같은 용액 지지체를 사용하여 스핀-캐스팅, 증발 또는 in situ 중합으로 도포될 수 있다. 이들 도포층은 불순물을 첨가하기 위하여, 예를 들어 그 두께를 조절하여 최적화 된다. 단백질과 같은 생물학적 결합쌍의 부재들은 전극의 도포물질의 성질에 따른 다양한 화학적 접합 기술을 사용하여 전극에 부착된다. 예를 들면, 금속 산화물, 탄소 또는 금 위의 산화 마이어, 탄소 또는 금 위의 산화 폴리스티렌, 금 위의 알칸티올-카르복실레이트 자기결합 단층(alkanethiol-carboxylate self-assembled monolayer, SAMS), 금속 산화물 위의 카르복실레이트 SAMS 또는 전기중합된 카르복실레이트 함유 단량체를 전극이 포함할 때 카보디이미드 가교가 사용될 수 있다. 또한, 아비딘 또는 스트렙타비딘은 상기 어떤 수단이나 고분자 도포층에 대한 패시브(passive) 흡착에 의해 전극에 부착될 수 있고, 비오틴-컨쥬게이트 타겟 단백질은 아비딘 또는 스트렙타비딘과의 상호작용을 통하여 결합된다. 또한, 폴리-히스티딘 라벨링 타겟은 2가 니켈 이온(Ni2+)과 결합할 수 있는 도포층을 갖는 전극에 결합될 수 있다. 이러한 방법은 단백질, 온도 안정성, 결합된 리간드의 용제 수용성 및 리간드의 결합효율에 따라 선택되고 최적화된다.
본 발명의 장치는 또한 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 제공한다. 전기화학적 라벨은 화학종으로 정의되는데, 이러한 화학종에는 대표적으로 루테늄, 오스뮴 또는 코발트를 포함하는 양이온을 함유하는 양이온 종이 있으며, 본 발명에 따른 장치의 반응챔버 내의 전극 사이에 전위가 인가될 때 전기화학적 매개체 및 본 장치의 제1 전극과의 산화/환원(레독스) 반응에 관여할 수 있다. 펩티드, Ru2+/3+-아민 복합체와 같은 무기 복합체, 페로센 및 오스뮴-폴리피리딜 또는 코발트-폴리피리딜 복합체를 포함하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 히스티딘이나 시스테인 잔기를 통하여 또는 아미노 말단에서 펩티드에 부착된다. 패러콰트(paraquat) 유도체 및 퀴논과 같은 레독스-활성 유기분자는 리신이나 시스테인 잔기를 통하여 또는 아미노 말단에서 레독스-활성 유기성분을 결합시키므로써 펩티드에 부착된다.
이러한 레독스-활성 유기 및 무기 분자들은 또한 본 발명에 따른 장치의 반응 챔버의 전해질 용액 내에서 전기화학적 매개체로 사용되므로, 상기 매개체는 사용되는 전기화학적 라벨과의 전기화학적인 상용성을 고려하여 결정된다. 전기화학적 라벨과 매개체의 조합을 선택하는 것은 전류 민감성, 라벨 특이성 및 반도전성 전극 도포층의 고분자 매트릭스 내에서의 확산 능력을 고려하여 선택한다.
본 발명의 실시에 있어서, 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하는 바람직한 화합물은 특이적인 결합쌍의 제1 부재에 대한 "대위" 리간드이다. 이러한 발명의 목적을 위하여, "대위"이라는 용어는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 모든 타겟에 특이하게 결합하는 생물학적 활성 화합물의 세트로 정의된다. 이러한 정의가 타겟의 다양한 리간드, 특히 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 천연 리간드를 포함하는 타겟 단백질을 포함하고 있지만, 본 발명의 대위 리간드는 분해 상수(Kd)가 바람직하게는 약 50피코몰(pM) 내지 약 0.5mM, 더욱 바람직하게는 약 1나노몰(nM) 내지 약 100마이크로몰, 가장 바람직하게는 약 10nM 내지 10마이크로몰로 측정되는 화학적 친화도로 타겟 단백질에 특이하게 결합하는 리간드를 포함하는 것이 바람직하다.
이러한 대위 리간드가 바람직한 이유는 본 발명에 따른 장치의 제1 전극 표면에서의 전기화학적 라벨 농도가 실험적으로 검출되기에 충분한 전류를 생성하는 충분한 친화성으로 결합하는 반면, 동시에 실험적으로 달성될 수 있고 경제적인 화합물 농도에서 경쟁자 및 억제제로 치환될 수 있을 정도로 결합친화성이 충분히 약하기 때문이다.
따라서, 대위 리간드는 요구되는 특이성 및 용이한 분해성을 모두 제공하므로, 본 발명에 따른 방법 및 장치가 경쟁자 종에 의하여 결합 억제를 검출할 수 있도록 한다. 결합 펩티드를 동정하기 위한 몇몇 타겟을 표 1에 나타냈다.
본 발명에 따른 방법의 실시에 있어서, 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드인 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 단백질, 핵산, 탄수화물 및 작은 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 생물학적 결합쌍의 제2 부재로서 단백질을 사용한 본 발명에 따른 방법의 일실시예에 있어서, 단백질은 핀 또는 비드상에서 합성 펩티드를 제조하는 것과 같은 방법 외에도, 파지-디스플레이 조합물 펩티드 라이브러리(1996년 10월 21일에 출원된 일련번호 08/740,671의 공동 미국특허출원 참조)로부터 얻는 것이 바람직하다. 자연적으로 생성되는 아미노산만을 포함하는 이러한 펩티드는 전기화학적으로 라벨링되어야 하는데, 그 이유는 이들이 전극에 고정된 타겟인 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 의해 인가되는 전압조건하에서 충분한 레독스 포텐셜이 부족하기 때문이다.
본 발명에 따른 장치와 방법의 전기화학적 탐침 및 타겟을 포함하는 펩티드와 단백질은 고상 펩티드 합성법, 부분분해를 포함하는 생화학적 분리법 및 변형 기술을 포함하는 합성법이나 당업자가 아는 유전자 재조합법(샴부룩 등의 논문; 1990, Molecular Cloning, 2d ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.)으로 제조될 수 있다.
전기화학적 라벨링 방법의 예로서, 펩티드 시이퀀스 내의 히스티딘 잔기에 루테늄 그룹(Ru(NH3)5(OH)2 2+)을 부가하는 방법이 유용하다. 또한, 전기화학적 라벨은 포스트-합성으로 아미노 말단 또는 카르복실 말단에 부가되거나 또는 시스테인 잔기의 반응성 측쇄 티올기, 세리신이나 트레오닌 잔기의 히드록시기에(또는 탄수화물 성분 상에) 또는 펩티드의 리신 잔기의 아미노기에 부가될 수 있다. 또한, 펩티드의 합성중 결합될 수 있는 "천연이 아닌" 아미노산(D-아미노산 또는 ε-아미노카프로산과 같은 아미노산 유사물과 같은)의 Fmoc 유도체가 사용될 수 있다.
또한, 다양한 비펩티드 대위 리간드가 전극 시스템에 적용될 수 있다. 예를 들면, 타겟 분자에 특이하게 결합한 핵산(즉, 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드을 포함하는 RNA 및 DNA종)은 조합물(combinatorial) 핵산 라이브러리로부터 얻어진다: 이 분자들을 "엡타머(aptamers)"라 칭한다(골드 등의 논문 참조, 1995, ANN.Rev. Biochem. 64:763). 이러한 엡타머는 3' 또는 5' 말단 중의 하나에서 라벨링 그룹으로 전기화학적으로 라벨링될 수 있다. 또는 전기화학적 라벨링 그룹과 결합하는 변형 뉴클레오티드 트리포스페이트는 생체내에서 엡타머가 생성되는 동안 무차별적인 RNA 또는 DNA 폴리머라아제에 의해서 올리고뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 결국, 어떤 작은 분자는 그 결합 활성도를 파괴시키지 않는 방법으로 전기화학적으로 라벨링될 수 있다. 예를 들면, 싸이클릭 AMP(cAMP)는 단백질 키나나제 A에 대한 결합을 감소시키지 않고 전기화학적으로 라벨링될 수 있으므로, 단백질 키나나제 A에 대한 cAMP 결합에 영향을 미치는 화합물의 전기화학적 분석을 위한 생물학적 결합쌍을 제공한다.
본 발명에 따른 장치에 유용한 전해액은 생리학적으로 적절한 이온 강도(약 0.15M NaCl에 평형) 및 중성 pH를 갖는 모든 전해액을 포함한다. 본 발명의 장치에 유용한 전해액에는 예를 들어, 포스페이트 버퍼 살린(PBS), HEPES 버퍼 용액 및 소듐 비카보네이트 버퍼 용액이 포함되며, 이에 한정되지 않는다. 하기 표 1은 조합물 라이브러리로부터 동정된 결합 펩티드를 위한 타겟을 나타내고 있다.
타겟 참조 논문
스트렙타비딘 1,2,3
HLA-DR 4,5
콘카나발린 A 6,7
칼모둘린 8,9
S100 10
p53 11
SH3 도메인 12-18
유로키나아제 수용체 19
bFGF-R
인테그린 IIb/IIIa?avB1 20-23
Hsc70 24
조직 인자 VIIa
심방 나투리유레틱 단백질 A 수용체
피므로넥틴 25
E-셀렉틴 26
CD1-B2M 복합체 27
조직형 플라스미노겐 활성제 28
헤파티티스 B 바이러스의 코아 항체 29
HIV-1 뉴클레오캡시드 단백질 NCp7 30
에리트로포이에틴 수용체 31
트립신 32
키모트립신 33
인터류킨-1 수용체 34
참조 논문: 1. Devlin et al. 1990, Science 249: 404;2. Lam et al., 1991, Nature 354: 82; 3. Fowlkes, 1993, Gene 128: 59; 4. Hammer et al., 1992, J. Exp. Med. 176: 1007;5. Hammer et al., 1993. Cell 74: 197; 6. Scott et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 5398; 7. Oldenburg et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 5393; 8. Dedman et al., 1993, J. Biol.Chem. 268: 23025; 9. Adey et al. 1996, Gene 169: 133; 10. Ivanenkov et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 14651; 11. Daniels et al., 1994, J.Mol.Biol 243: 639; 12. Sparks et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1540; 13. Sparks et al., 1994, J.Biol.Chem. 269: 23853; 14. Cheadle et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 24034; 15. Rickles et al., 1994, EMBO J. 13: 5598; 16. Rickles et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10909; 17. Chen et al., 1993, J. Amer. Chem. Soc. 115: 12591; 18. Yu et al., 1994, Cell 76: 933; 19. Goodson et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7129; 20. O'Neill et al., 1992, Proteins 14: 509; 21. Fong et al., 1994, Drug Dev. Res. 33: 64; 22. Kolvunen et al., 1993, J.Biol.Chem. 268: 20205; 23. Kolvunen et al., 1993, J. Cell Biol. 124: 373; 24. Takenaka et al., 1995, J. Biol. Chem. 19839; 25.J.Cell Biol. 130: 1189; 26. Martens et al., 1995,J.Biol.Chem. 270: 21129; 27. Science 269: 223; 28.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 7627; 29. Dyson et al., 1995, Proc.NatlAcad.Sci. USA 92: 2194; 30. FEBS Lett. 361: 85; 31. Wrighton et al., 1996, Science 273: 458; 32. Fang et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Commun. 220: 53; 33. J.Chromatography 711: 119; 34. Yanofsky et al., 1996, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7381.
본 발명의 방법의 실시에 있어서, 전류가 전극에 흐를 때 전자는 반응 성분들의 일련의 산화환원 작용에 의해 전기화학적 라벨로부터 매개체로 이동되고 다시 전극으로 이동된다. 그러나, 산화환원에 의한 전자이동은, 전기화학적 라벨이 전극 표면에 높게 농축되어 있을 때 최대이고 검출가능한 전류가 생성된다. 이것은, 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재가 타겟 단백질로서 전극 상에 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 결합될 때에만 생성한다. 이것에 대한 개략도는 도 1에 나타냈다.
본 발명의 방법의 일적용예에서는, 단백질-단백질 상호작용의 길항제를 위한천연물과 화학적 조합물 라이브러리의 매우 철저한 스크린 방법이 제공된다. 이러한 특이적인 단백질-단백질 상호작용의 저분자량의 화학적 길항제는 치료제로 개발될 수 있는 잠재성을 가진 약으로서 제약 산업에 가치가 있다. 본 발명의 이러한 방법의 실시에 있어서, 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 타겟 단백질은 전극 표면에 고정된다. 이 첫번째 전극은 본 발명의 장치의 반응 챔버, 바람직하게는 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드 및 대위 리간드와 타겟 단백질의 결합을 방해하는 능력 여부가 시험되는 화합물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 반응 챔버, 즉 미세역가 샘플 웰에 위치한다(특이적 결합 특성을 보유하는 생물학적으로 능동성 단백질의 단편 역시 본 발명의 전극인 타겟 단백질에 포함되는 것으로 이해될 것이다). 예를 들어, 본 발명의 대표적인 실시예에 있어서, 반응 챔버 또는 미세역가 샘플 웰 각각은 조합물과 순수 천연물(폴리케타이드 또는 발효 스프 성분)을 따로따로 함유할 수 있다. 전극의 존재 하에서 상기 화합물들을 인큐베이트한 후, 반응 챔버에서 생성되는 전류의 전위차 분석을 실시하며; 바람직하게는 이 분석은 싸이클릭 전압전류법에 의한 분석이다. 시험되는 화합물 또는 이들의 혼합물의 존재 및 부존재 하에서 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드를 포함하는 웰에 대한 이러한 분석 결과를 비교한다. 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드와 전극 표면에 고정된 타겟 단백질과의 결합을 억제하는 성분은, 타겟 단백질과 결합하지 않으며 대위 리간드 결합에는 영향을 미치지않는 성분에 비하여 적은 양의 전류를 생성한다. 본 발명의 실시에 있어서, 타겟 단백질의 변성에 의해 야기되는 관측된 전류의 감소를 검출하기 위한 적절한 조절과정은 각각의 측정단계에 포함된다. 이러한 조정과정은 시험되는 화합물의 부존재 하에서 전기화학적 매개체와 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드를 포함하는 용액으로 금방 제조된 실험 전극을 반응 챔버에서 시험하는 것을 포함하는데, 이 시험은 무관한 타겟 단백질로 도포된 전극을 사용하여 이 화합물들을 시험하는 것이다. 본 발명의 방법은 96개의 전극이 동시에 이용되는 형태의 96-웰 미세역가 플레이트에서 실시되는 것이 바람직하다. 다른 실시예에서는 전극 위에 고정된 다른 타겟 단백질을 포함하는 다중 전극이 각각의 웰과 전기적으로 접촉되어 있고, 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 일련의 타겟 단백질과 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하는 다양한 다른 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드와의 결합에 대한 단일 화합물의 억제 능력을 평가하는데 사용된다.
다르게는, 경쟁 결합 분석이 타겟 단백질의 형태를 변화시켜 타겟 단백질과 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드 사이의 결합에 영향을 미치는 화합물을 검출하기 위해 실시된다. 이러한 본 발명의 실시예에 있어서, 먼저 전극을 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드와 인큐베이트한 후 세척하고, 다음으로 시험되어질 화합물 또는 화합물들을 포함하는 반응 챔버에 전극을 위치시킨다. 타겟 단백질의 결합가능한 사이트에 결합하여 타겟 단백질을 형태상의 변화 또는 알로스테릭한 변화를 야기하는 화합물은 전기화학적으로 라벨링된 리간드를 방출시키고, 예를 들어 싸이클릭 전압전류 분석(cyclic voltammetric analysis)에 의해 검출되는 것처럼 반응 챔버에서 전류량의 감소에 의해 검출된다.
또한, 본 발명은 단백질-펩티드 및 단백질-단백질 상호작용과 같은 생물학적 결합쌍 사이의 상호작용의 결합 친화성을 측정하는 방법을 제공한다. 이러한 측정방법은 생물학적 결합쌍 사이의 상호작용의 분해상수(Kd)를 측정하는데 유용하다. 이러한 방법은 표면 플라스몬 공명 장치(즉, 파마시아에서 제조한 상표명 BIAcore)과 같은 종래의 결합 친화성 및 분해상수의 측정 방법을 대체하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 이전에 개시된 방법들보다 더 빠르고, 경제적이고, 생물학적 물질의 양을 감소시킨다는 점에서 효과적이다. 또한, 본 발명의 방법은 300달톤 또는 그 이상의 분자량을 가진 전기탐침 및 전기화학적 리간드를 사용하여 실시될 수 있다. 이에 비하여, 선행기술로서 알려진 방법들은 크기가 적어도 약 5킬로달톤인 리간드를 필요를 하는데, 그 이유는 선행기술의 방법에 사용되는 신호 강도가 결합하는 리간드의 크기와 비례하기 때문이다. 이러한 한계 때문에 컷오프 역치인 500KD 이하의 분자량을 가진 분자의 결합 상호작용 특성은 분석할 수 없다. 약물로 개발 가능한 화합물 내에 많은 비율이 저분자량 화합물이기 때문에 이러한 한계는 중요하다. 또한, 유기 용매의 존재 하에 탐침 농도, 염 농도 및 분석 실시의 조건에 제한되지 않으나 포함하는 본 발명의 장치와 방법을 사용하는데 필요한 분석 조건은 선행기술의 방법의 사용에 요구되는 분석 조건보다 더 허용가능하다.
또한, 본 발명은 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 상호작용의 결합 친화성 및 화학적 "강도"를 검출하기 위한 방법 및 장치를 제공한다. 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 상호작용의 강도를 알아내는 것은, 이러한 상호작용이 약물 개발을 위한 우수한 타겟으로서 잠재성을 가지는지의 여부를 결정하는데 중요하다. 이러한 상호작용을 빠르고, 경제적이고, 편리하게 분석하여 검출하는 능력은 타겟을 최적화하고 선별하는 것을 더욱 촉진할 수 있다. 본 발명의 방법은 특이적 결합 능력 또는 특이적 상호작용 능력에 관하여 생물학적 결합쌍의 임의의 두 부재를 선별할 수 있는 능력을 제공한다. 또한, 본 발명은 다양하게 끝이 잘리거나 변형된 형태의 하나 또는 두개의 생물학적 결합쌍의 부재를 사용하여 결합쌍의 상호작용 부분을 지도화하기 위한 방법을 제공한다. 약물 개발에 있어서 현재 큰 관심대상인 단백질-단백질 상호작용에 대해서는 표 2에 목록화하였다.
본 발명의 또다른 실시예에서는, 화학적 및 생화학적인 분자의 복합 혼합물에서 생물학적 결합쌍의 부재 사이의 특이적 결합 및 다른 상호작용을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 일실시예에서는 단백질:단백질 상호작용의 검출방법을 제공한다. 그러한 상호작용은 종래의 방법을 이용하여 검출하거나 특징화하기가 곤란하다. 본 발명의 방법에서 사용되는 특정 타겟 단백질로 도포된 전극은, 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드를 함유하는 전해액 및 전극 상의 타겟 단백질과 특이적으로 상호작용하는 단백질(들)을 포함하는 세포 추출물과 함께 인큐베이트된다. 본 발명의 방법을 사용하는 경쟁 결합 실험의 다른 실시예에서 기재한 것과 마찬가지로 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드 대신에 상호작용하는 단백질이 결합한다는 것은 전기화학적 분석 즉, 싸이클릭 전압전류법에 의한 분석 동안에 생성되는 전류량의 감소를 초래한다.
단백질 정제과정 동안에 컬럼 단편을 분석하는 현재의 방법과의 비교하여 설명되는 바와 같이 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 본 발명의 방법은 현재 이용가능한 방법에 비하여 장점이 있다. 현재 이용가능한 방법은, 방사성 물질을 생산하고 효소 작용이 알려져 있는 단백질을 단지 적용하는 크로마토그래프 컬럼 단편의 효소 분석을 포함한다. 알려져 있지 않은 효소 작용을 가진 단백질에 대해서는, 방사성물질로 라벨링된 타겟 또는 공동-면역침전법(방사성물질로 라벨링된 타겟에 대한 항체가 필요한)을 사용하여 밴드 이동을 분석하는 엘리사 분석법을 사용한다. 각각의 이러한 방법들은 시간을 많이 소모하여 지루하고, 안전성과 사용규제의 문제에 있어서 단점을 가지고 있는 방사화학적 검출 방법의 사용이 자주 요구된다.
이에 비하여, 본 발명의 방법은 빠르고, 특이적이고, 경제적이다. 본 발명의 전기화학적 선별 방법의 다른 장점은 종래의 방법으로는 검출될 수 없는 미세한 단백질-단백질 상호작용에 대해서도 검출가능하다는 것이다. 또한, 크로마토그래프 단편의 분석, 종양조직 샘플 내의 타겟 결합 단백질의 존재 여부에 대한 조직 분포 조사 및 예를 들어 동시 발생된 세포의 추출물을 사용하여 세포 주기 특이적 상호작용에 대한 분석을 포함하는 본 발명의 방법은 단백질 정제 방법의 다양한 대안적 실시예에 적용할 수 있다. 하기 표 2에 흥미있는 상호작용을 갖는 분자들을 나타냈다.
분자1 분자2
피브로넥틴 인테그린
항원 항체
칼모둘린 ~20 이펙터 분자
튜불린 미세소관 관련 단백질
액틴 액틴 결합 단백질, DNA 중합효소 Ⅰ
p53 MDM2
cdk 싸이클린, p21
ras raf
fos jun
TBP RNA 중합효소
Sos Grb2
p53 p53BP2
K-채널 src
다양한 단백질 WW 도메인 함유 단백질
ptyr 단백질 SH2도PTB도메인, 포스파타제
UGI UDG
규제작용 서브유니트 PKA 촉매작용 서브유니트 PKA
인핸서 인자 인핸서 결합 단백질
DNA 전사 인자
RNA RNA 결합 단백질
콘카나발린 A 렉틴
지질 지방단백질
지방산(FA) 지방산 결합 단백질
스테로이드 스테로이드 호르몬 수용체
사이토메갈로바이러스 DNA중합효소 중합효소 부수적 인자
BPTI 트립신
Rb E2F, E1A, SV40T항원
참조 논문: Iwabuchi et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6098; Holmes et al., 1996, Science 274:2089; Rozakis-Adcock et al., 1993, Nature 363:83; Phizicky et al., 1995, Microbiol. Rev. 59:94; Chan et al., 1996, EMBO J. 15:1045; Chen et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7819; Sudol et al., 1995, FEBS Lett. 369:67.
본 발명의 방법과 장치는 다음과 같은 이유에서 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 분석방법과 장치보다 장점이 있다. 첫째, 생물학적 결합쌍의 부재 사이의 특이적 결합 상호작용을 검출하는데 있어서의 본 발명의 방법의 민감도는 종래의 방법의 최대 농도보다 10에 4 내지 5승 배(즉, 10,000 내지 100,000 배)이다. 본 발명은, 방사화학에 기초한 방법에 수반되는 건강, 안전성, 규제의 문제없이 방사화학적 검출 방법과 같은 정도의 민감도를 제공한다. 또한, 본 발명은 생물학적 결합 상호작용의 검출을 광범위한 결합 친화도에 걸쳐 고도의 민감도에서 할 수 있도록 한다. 둘째, 본 발명의 분석 방법은 빠르고 경제적이며, 시험관 내에서 실시된다. 셋째, 본 발명의 실시에 사용되는 시약(즉, 전극과 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드)은 예를 들어 방사화학적 시약에 비해 안정적이고 상대적으로 긴 반감기를 가진다. 넷째, 예를 들어, 싸이클릭 전압전류법을 사용하여 관측되는 약물 결합 동력학의 변화에 기초되는 구조-활성 상호관계가 정량적으로 검출될 수 있다. 다섯째, 본 발명의 방법은 다중적으로 즉, 고정된 타겟 단백질 함유 전극의 하나 이상을 포함하는 반응 챔버에서 실시될 수 있어서, 잠재적 타겟에 대한 결합에 관해 약물로 개발될 잠재성을 가진 화합물 또는 이들의 혼합물을 분석할 수 있다. 여섯째, 본 발명의 방법과 장치는, 멀티웰(96-웰 미세역가) 분석 플레이트의 사용 및 멀티웰 분석 플레이트의 반응 챔버의 전기화학적 성분과 전극을 로보트에 의한 통제에 한정되지 않으나 포함하여 자동화될 수 있다. 일곱째, 본 발명의 전기화학적 분석의 민감도는 대위 리간드 및 억제 화합물 중의 하나 또는 모두의 적은 양(타겟에 결합되는 전기화학적 라벨 약 50,000)의 검출을 가능하게 하여, 약물 선별과 같은 분석을 실시하는데 효과를 증진시킬 수 있다. 여덟째, 효과에 있어서 이러한 증진은 약물 개발의 장애물을 매우 절처하게 제거할 수 있게 한다. 아홉째, 본 발명은 종래의 방법(예를 들어, 평형 투석장치, 분석 초원심여과장치, 분석 미세색도계 및 상표명 BIAcore 분석장치를 포함하는)보다 더욱 빠르고 경제적이고 샘플양이 덜 요구되는 분해 상수 측정방법을 제공한다. 열째, 본 발명에 의해 제공되는 분석방법은 임의의 타겟 단백질 또는 대위 리간드에 대한 결합 파트너의 동일성에 관한 정보의 부재 하에서도 실시될 수 있다. 이러한 장점은 단백질을 특징화할 수 있기 전에 타겟 단백질의 생물학적 활성을 알아야할 필요가 없게 만든다. 열한번째, 본 발명의 분석방법은 유연하고, 임의의 생물학적 결합쌍에 대한 결합 또는 경쟁 결합의 분석이 가능하다. 더더욱, 결합쌍의 하나를 전기화학적으로 라벨링할 수 있고, 적정한 분석 조건 하에서는 생물학적 결합쌍의 부재 모두를 반응 챔버의 전해질 용액 내에 있게 할 수 있다.
또한, 본 발명의 장치는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 함유하는, 바람직하게는 단백질을 함유하는, 더욱 바람직하게는 단백질의 수용체 또는 단편을 함유하는 친수성 폴리머 변형 전극, 및 고정된 전기화학적 매개체를 제공한다. 단백질과 같은 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적 매개체는 반응기 사이의 공유결합의 형성을 통해 직접적으로 또는 상호작용하는 화학적 결합체를 통해 화학적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 몇개의 아미노산으로 된 사이드 체인은, 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜에테르 내에 에폭시 기능단이 부가될수 있는 친핵성 헤테로원자를 함유한다. 다르게는, 폴리리신과 같은 폴리머에 존재하는 친핵성기는 디싸이클로헥실카보디이미드-, N-하이드록시석신이미드- 또는 하이드록시벤조트리아졸-활성화 디카복실레이트와 같은 양기능성으로 활성화된 친전자성기를 통해 단백질과 결합될 수 있다. 전기화학적 매개체를 결합시키는 방법에는 폴리머 상의 친핵성 원자와 전이금속 복합체와의 배위, 유기 매개체 또는 금속-복합 리간드 내로의 반응기의 통합, 또는 폴리머 중추을 따라 전이금속-결합 사이트의 통합이 포함된다. 예를 들어, 비스비피리딘클로로오스뮴(Ⅱ)에 폴리비닐이미다졸의 배위는 Os(Ⅱ)와 Os(Ⅲ)이 적절하게 적용되는 전위에서 상호 전환될 수 있는 매우 안정한 폴리머를 만든다. 비피리딘 리간드의 화학적 변형은, 자동적인 생폴리머 합성과 관련된 복합체의 직접적 통합을 가능하게 하는 친핵성기와 다른 기능기의 결합을 위한 활성화된 카복실레이트 성분을 함유하는 금속 복합체를 형성시킨다.
또한, 본 발명의 장치의 이 실시예에서는 생물학적 결합쌍의 제2 부재, 바람직하게는 본 명세서에서 한정하는 것과 같은 전기화학적으로 활성화된 촉매를 포함하는 전기화학적 촉매와 결합된 펩티드 또는 핵산 대위 리간드를 포함한다. 이러한 전기화학적 촉매의 예는 기질을 산화 또는 환원시키고, 기질의 직접 전기화학에 영향을 미치기에 불충분한 전위에서 전기화학적으로 재활성화시키는 글루코스 옥시다제와 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소이다. 본 발명의 기술분야에서 이러한 효소는, 전극 전위의 적정한 선택을 통해 전극의 근처에서 효소의 촉매작용의 선택적인 전기화학적 검출이 가능하도록 기질의 산화환원 화학에서의 전기화학적 장벽을 낮춤으로써 촉매작용을 달성하는 것으로 이해된다. 또한, 옥소루테늄(Ⅳ), 옥소오스뮴(Ⅳ), 옥소몰리브데늄(Ⅳ), 디옥소몰리브데늄(Ⅵ) 및 디옥소루테늄 (Ⅵ)의 복합체와 같은 몇몇의 합성 전이금속 복합체는 직접 전기화학에서 불가능한 전위에서 기질의 다양한 유기 기능기의 산화 또는 환원이 가능하다.(예를 들어, Stultz et al., 1995, J.Am Chem.Soc.117:2520; Cheng et al., 1995, J.Am Chem.Soc.117:2970; Stultz et al., 1993, J.Am Chem.Soc.115:4244; Thorp et al.,1989,Inorg.Chem.28:889).
본 발명의 이 실시예의 장치의 사용에 있어서, 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합은 전극과 전극 위에 고정된 매개체의 부근에 전기촉매를 농축시킨다. 전기촉매, 기질 및 전기화학적 매개체 사이의 산화환원 반응은 전극에 전류가 흐르도록 하는데, 이것은 기질의 산화환원 당량의 변화에 의해 야기된다. 전극에 충분한 전류가 공급될 때, 고정된 매개체는 완전히 산화되거나 완전히 환원된다. 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 대위 리간드를 사용하여 전극 표면에서 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 대위 리간드를 결합시키면, 전극 위의 환원된 전기화학적 매개체에 충분히 인접한 부근에서 양고추냉이 퍼옥시다아제는 그 스스로 환원된다. 이러한 환원된 형태의 효소는 활성화된 형태이어서, 산소와 물이 생성되도록 전자를 용액 내의 하이드로겐 퍼옥시다아제에게로 이동시키는 촉매적 작용을 할 수 있다. 효소는, 개별적인 촉매 순환 후에 전극을 포함하는 폴리머 내의 전기화학적 매개체에 의해 체계적으로 환원되고, 전체 과정이 반복될 때, 대위 리간드의 결합은 용액 내의 전극을 통한 전류의 흐름으로서 검출되고 정량된다. 그러므로, 전극에 적용되는 전위와 기질 농도의 적절한 상태 하에서, 생성되는 전류의 양은 전극 표면에 생물학적 결합쌍의 부재의 결합 정도와 양에 비례한다.
본 발명의 일적용예는 본 명세서에서 생물학적 결합쌍의 결합 동력학을 측정할 수 있는 방법을 제공한다. 대위 리간드-효소 결합의 부존재(또는 비결합 부류와 연결된 효소의 존재) 하에서는 매우 적은 양의 전류가 폴리머-변형 전극에서 효소 기질로 흐른다. 전기화학적 촉매와 생물학적 결합쌍의 고정된 제1 부재에 대한 결합 특이성을 가진 대위 리간드 사이의 부가적 결합이 존재하고 전기화학적 촉매에 대한 기질이 충분한 농도로 존재하는 경우에는 전류양이 안정적이고 지속적인 상태로 극적이고 획기적으로 증가된다. 효소를 즉각적으로 재활성화시키도록 전극 전위를 선택하고 기질이 용액 내에 과량으로 존재하기 때문에, 결합된 대위 리간드 수의 증가의 반영인 전류의 증가는 결합 가능한 결합 사이트가 모두 결합될 때까지 계속된다. 일반적으로 전류 증가의 속도 상수는 결합 반응의 속도 상수이다; 그러므로, 본 발명은 상기 속도 상수의 효과적인 측정방법을 제공한다. 역으로, 분해 속도 상수는 컨쥬게이트가 없는 용액에 컨쥬게이트 포화 전극을 넣고 생성된 전류의 감소 속도의 측정에 의해 측정될 수 있다. 이러한 결합 속도와 강도를 안다는 것은 단백질-단백질, 단백질-약물 및 단백질-핵 약물의 결합 현상에 한정되지 않지만 포함하는 생분자 사이의 상호작용을 이해하는데 필수적이다.
본 발명의 다른 적용예에 있어서, 컨쥬게이트의 결합 또는 결합의 결핍은 전기화학적으로 불활성인 부류가 이용가능한 결합 사이트의 차지를 얼마나 차지하는 가를 측정하는데 사용된다. 일반적으로, 이러한 부류는 천연물 또는 합성 분자 조합물의 거대 라이브러리로부터 유일한 약물 후보자일 것이다. 약물 후보자의 결합은 적어도 관련 기술 3가지에 의해 확인될 수 있다. 첫번째 실시예에서는, 대위 리간드 컨쥬게이트를 가하기 전에 약물 후보자와 전극-생물학적 결합쌍의 고정된 제1 부재 사이의 가능한 모든 결합 상호작용이 발생하도록 전극을 약물 후보자와 함께 미리 인큐베이트할 수 있다. 약물 후보자의 부존재시에 생성되는 전류와 비교되는 컨쥬게이트 부가에 의한 전류 감소를 측정하여 약물이 전극-생물학적 결합쌍의 고정된 제1 부재의 결합가능한 결합 사이트를 얼마나 차지하는가를 측정한다. 두번째 실시예에서는, 다양한 농도에서 약물 후보자를 대위 리간드 컨쥬게이트와 동시에 부가하고, 약물 후보자의 존재의 효과로서 생성되는 전류를 측정하여 대위 리간드 결합에 대한 약물의 억제 상수를 결정한다. 세번째 실시예에서는, 약물 부가 전에 전극을 컨쥬게이트에 의해 포화시키고, 이에 의한 전류의 손실을 관측하여 대위 리간드 결합을 대체하는 약물 후보자의 능력을 측정한다. 통상의 기술에 의한 방법들은, 임의의 관심있는 생물학적 결합쌍에 대한 약물의 결합 및 억제 특성을 특징화하기 위한 이러한 방법들의 유용성을 인식시켜 준다.
본 발명의 또다른 형태는 다음의 실시예에서 더욱 충실하게 설명된다. 이러한 실시예는 상술한 방법과 유리한 결과의 특정 측면을 설명한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이지 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
전기화학적으로 라벨링된 단백질의 제조
전기화학적으로 라벨링된 단백질은 아트-레커그나이즈드 테크닉(art-recognized techniques, 요컴 등의 논문, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7052-7055 참조; 노세라 등의 논문, 1984, J. Amer. Chem. Soc. 106: 5145-5150 참조)을 사용하여 제조하였다. 일 실시예에 있어서, 아미노산 시이퀀스:Gly-His-Gly-Ser-Gly-Arg-Ala-Leu-Pro-Pro-Leu-Pro-Arg-Tyr-NH2(SEQ ID.:1)를 갖는 유도 단백질 NPDF-1은 다음과 같이 라벨링된다. 전기화학적 라벨 Ru(NH3)5(H2O)2+은 통상적인 기술(포드 등의 논문, 1968, J. Amer. Chem. Soc. 90: 1187-1194 참조; 보그트 등의 논문, 1965, Inorg. Chem. 4:1157-1163 참조)을 사용하여 아연/수은 아말감에 대하여 {Ru(NH3)5Cl}Cl2을 환원에 의해서 제조하였다. 50mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.0)내, 실온 및 아르곤 분위기하에서 48시간동안 약 0.2mM의 농도를 갖는 단백질(약 5mg)을 50배 이상의 과농도(~10mM)를 갖는Ru(NH3)5(H2O)2+와 반응시켰다(도 6). 50mM 버퍼로 평형화된 세파덱스 G-25 컬럼(파머시아사, 웁살라, 스웨덴)에 용액을 가하여 반응을 중단시켰다. 이 컬럼으로부터 나온 펩티드를 포함하는 단편을 모아 산화시키고 농축하였다. 이어서, 4℃에서 50mM 포스페이트 버퍼(pH 7.0)로 평형화된 와트만 CM-셀룰로오즈(CM52) 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피로 산화된 혼합물의 성분을 분리하였다. 전기화학적으로 라벨링된 단백질 함유 단편을 모아서 사용시까지 4℃로 유지하였다.
실시예 2
단백질 고정 전극의 제조
2㎠ 유리 슬라이드의 주석-도핑 인듐 산화물 전극을 구입(델타 테크놀로지사)하여 다음과 같이 제조하였다. 실험용 음파처리기로 알코녹스, 순수한 이소프로필 알코올, 증류 및 탈이온화 물, 및 요구되는 버퍼로 순차적으로 음파 처리(3번)하여 전극을 세정하였다; 10분동안 각각 음파처리를 실시하였다. 이어서, 세정한 전극을 1,12-도데카디카르복실산 5mM 용액에 침지시키고 48-72시간동안 실온에서 인큐베이트한 후, 헥산(분석등급)으로 전극을 세척하였다.
제조한 전극에 가교된 단백질을 다음과 같이 실행하였다.
1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드의 5mM 용액을 50㎕씩 나누어 전극의 일면위에 처리하고 실온에서 건조시켰다. 인산 완충염(PBS)/0.1% 트윈 20 내에 4mg/mL의 융합(fusion) 단백질 20mL를 카르보디이미드로 전처리한 건조된 전극의 표면위에 처리하고 가교가 진행되도록 하루동안 4℃에서 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후, 100mM 트리스-염산(pH 8.0)/100mM 염화나트륨의 용액으로 5분동안 세척하여 사용시까지 4℃의 PBS내에서 보관하였다.
실시예 3
싸이클릭 전압전류법
변형 주석-도핑 인듐 산화물(ITO) 작동 전극(면적=0.32㎠), 백금(Pt)-와이어 카운터 전극 및 은/염화은(Ag/AgCl) 레퍼런스 전극이 구비된 단독구획 전압전류 셀을 갖는 EG&GPAR 273A 일정 전위기/글라바노스타트(glavanostat)를 사용하여 싸이클릭 볼트암모그램을 수집하였다(존스톤 등의 논문, 1994, Inorg. Chem. 33: 6388-6390 참조). 이러한 볼트암모그램의 일예를 도 7에 나티냈으며, 볼트암모그램은 하기 조건하에서 형성되었다. 50mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8)/700mM NaCl(총 780mM의 나트륨 이온농도를 갖는)을 포함하는 완충 수용액에 용해된 50mM Ru(NH3)6 3+및 20mM-Ru(NH3)5 3+로 라벨링된 펩티드를 포함하는 샘플을 15mV/s의 속도로 스캔하였다. 전기화학적으로 라벨링된 펩티드를 스캔한 후, 동일한 50mM 인산나트륨 완충용액으로 전극을 세척하였고 이어서, 50mM Ru(NH3)6 3+를 함유하는 라벨링되지 않은 펩티드 용액 또는 50mM Ru(NH3)6 3+으로 세척하였다. 50mM Ru(NH3)6 3+로 세척 후 싸이클릭 볼트암모그램을 얻었다. 전기화학적 매개체가 존재하지 않는 상태에서 Ru(NH3)5 3+-라벨링 펩티드를 스캔하면 Ag/AgCl에 대하여 -0.2V정도의 감지할 만한 전류의 감소가 나타나지 않았다. 새로 전극을 제조하여 각 실험에 사용하였고, 각 전극에 대하여 완충액의 백그라운드 주사만을 수집하여 이어지는 주사로부터 공제하였다.
실시예 4
특이적 결합을 검출하기 위한 전기화학적 분석
Src SH3 도메인과 특이적 결합 SH3 펩티드 사이의 특이적 결합 상호작용을 검출하고 분석하기 위하여 본 발명의 전기화학적 분석장치 및 방법을 아래와 같이 사용하였다. 상기 실시예 2에 기술한 바와 같이 제조한 전극을 글루타티온 황 트랜스퍼라아제(GST)-Src SH3 융합 단백질(파머시아사로부터 구입한 GST Gene Fusion system을 사용하여 제조함) 또는 그 GST로 도포하였다. 실시예 1에 기술하고 도 6에 나타난 바와 같이, NPDF-1 펩티드(GHGSGRALPPLPRY;SES ID No.: 1)를 루테늄으로 라벨링하였다. 라벨링된 펩티드 및 루테늄 매개체(헥사아민루테늄(III) 용액으로 전극을 2시간 동안 반응시켰다. 상기 전극을 완충액으로 세척하고 실시예 3에 기술한 바와 같이 싸이클릭 전압전류법을 실시하였다. 또한, 루테늄 전기화학적 매개체가 존재하고 루테늄-라벨링된 펩티드가 없는 상태에서도 이러한 분석을 실시하였다. 싸이클릭 전압전류 곡선(도 3 참조)을 적분하고, 전기화학적 매개체만이 존재하는 상태(도 4 참조)에서의 인큐베이션 및 싸이클릭 전압전류법으로 생성된 백그라운드 신호를 공제하여 자료 분석을 실시하였다. 적분 프로그램을 이용하여 볼트암모그램 곡선의 아래부분 면적을 적분하였고, 전기화학적으로 라벨링된 탐침의 존재하에서 GST만으로 및 GST-Src-SH3 융합 단백질로 도포된 전극에 대하여 얻은 데이터로부터, 오직 매개체만 존재하는 상태에서 얻은 전류 적분 데이터를 공제하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, GST-Src- SH3 도포된 전극과 펩티드의 상호작용에 의해 발생된 신호가 매우 높게 나타났다. 이 결과로부터 본 발명의 전기화학적 분석법이 단백질-펩티드간 특이적인 상호작용을 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 전기화학적 분석법을 사용하여, 전기화학적으로 라벨링된 SH3-결합 펩티드의 시간에 따른 상호작용을 나타냈다. 이러한 시간에 대한 의존성을 설명하기 위하여, 실시예 1에 기재한 바와 같이 제조한 GST-Src-SH3 융합 단백질 또는 GST로 도포된 전극을, 전기화학적으로 라벨링된 과량의 SH3 결합 펩티드와 반응시켰다. 4시간 이상동안 30분 간격으로 싸이클릭 전압전류법을 사용하여 전기화학적 측정을 실시하였다. 전기화학적으로 라벨링된 특이적 결합 펩티드의 농도가 안정적으로 포화될 때까지, GST-Src-SH3 융합 단백질-고정 전극을 사용한 실험 시간 내내 전압전류 신호(전기화학적으로 라벨링된 펩티드 존재 하에서의 적분 전류와 전기화학적으로 라벨링된 펩티드의 부존재하에서의 적분 전류사이의 차를 포함하는)가 증가하는 것으로 나타났다.
본 발명의 전기화학적으로 라벨링된 펩티드의 농도에 대한 전기화학적 신호 의존성은 GST-Src SH3-SH3 결합 펩티드 결합쌍을 시용하므로써 설명된다. 이 실험에서, 실시예 2에 기술한 바와 같이 다양한 양의 GST-Src-SH3 융합 단백질을 전극에 고정시켰다. 각각의 GST-Src-SH3 고정 전극에 대하여, 특정한 인큐베이션 시간 후에 전기화학적 신호의 생성에 대해 분석된, 전기화학적으로 라벨링된 SH3 결합 펩티드 농도영역을 사용하여 싸이클릭 전압전류법을 수행하였다. 고정된 GST-Src SH3의 각각의 농도에 대한 신호는 펩티드 농도가 증가함에 따라 증가하고, 평형 펩티드 농도에 대하여 전압전류 신호는 전극상에 고정된 타겟 융합 단백질의 양이 증가함에 따라 증가하였다. 이러한 결과는 전기화학적 신호의 크기가 용액내의 전기화학적으로 라벨링된 펩티드의 농도뿐만 아니라 전극상에 고정된 단백질의 농도에 비례한다는 것을 설명해 주고 있다.
특이적인 단백질-펩티드의 상호작용은 또한 비오틴 결합 사이트에 결합하는 펩티드와 스트렙타비딘간의 전기화학적 상호작용 분석으로 설명할 수 있다. 상기 기술한 GST-Src SH3 융합 프로테인으로 도포하거나 또는 실시예 2에서 기술한 방법을 사용하여 스트렙타비딘으로 도포하여 전극을 제조하였다. 이어서, 상기 도포된 전극은 전술한 바와 같이 적절한 전기화학적 매개체 및 전기화학적으로 라벨링된 Src SH3 결합 펩티드 종의 존재하에서, 또는 스트렙타비딘 상의 비오틴 결합 사이트에 결합하는 하기의 아미노산 시이퀀스를 갖는 전기화학적으로 라벨링된 펩티드종과 인큐베이트하였다;
His-Gly-Ser-Gly-Ser-Phe-Ser-His-Pro-Gln-Asn-Thr (SEQ ID No.:2)
이러한 인큐베이션 후에 상기 전극을 세척하고 실시예 3에 기술한 바와 같이 싸이클릭 전압전류법을 실시하였다. 전압전류법 데이터를 적분하였고, 전기화학적 매개체 존재하에서 및 전기화학적으로 라벨링된 특이 펩티드가 없는 상태에서 이러한 전극을 사용하여 얻은 백그라운드 적분 전류를 전술한 바와 같이 공제하였다. 전기화학적으로 라벨링된 스트렙타비딘 결합 당백질의 존재하에서 고정된 스트렙타비딘을 갖는 전극뿐만 아니라, 전기화학적으로 라벨링된 SH3 결합 펩티드의 존재하에서 고정된 GST-Src SH3를 갖는 전극에 대하여 특이적 신호를 검출하고 분석하였다. 그러나, 전기화학적으로 라벨링된 SH3 결합 펩티드의 존재하에서 고정된 GST-Src SH3를 갖는 전극이나, 전기화학적으로 라벨링된 스트렙타비딘 결합 단백질의 존재하에서 고정된 스트렙타비딘을 갖는 전극에 대해서는 어떤 특이적 신호도 검출되지 않았고 따라서 분석되지 않았다.
종양 억제 유전자 p53의 단편에 상응하는 전기화학적으로 라벨링된 펩티드 와 고정된 타겟 단백질 MDM2를 갖는 전극 사이의 특이적인 상호작용을 검출하는데 본 발명의 다른 전기화학적 분석법이 이용될 수 있다. 실시예 2에 기술한 바와 같이 타겟 단백질 MDM2로 도포된 전극은 하기 p53의 천연적인 아미노산 시이퀀스로부터 추출한 아미노산 시이퀀스를 갖는 포착 대위 리간드가 사용되었다:
biotin-His-His-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gln-Thr-Phe-Ser-Asp-Leu-Trp-Lys-Leu (SEQ ID NO.:3). 상기 아미노산 시이퀀스는 MDM2에 특이하게 결합하는 것으로 알려져 있다(픽슬리 등의 논문, 1994, Oncogene 9: 2523 참조). GST-Src SH3 융합 단백질 또는 스트렙타비딘으로 도포된 전극이 특이하지 않은 신호의 콘트롤로 사용되었다. MDM2-고정 전극은 전기화학적으로 라벨링된 p53 펩티드 존재하에서 반응시켰다. 이어서, 상기 전극을 세척하고 전술한 바와 같이 전기화학적 매개체 존재하에서 싸이클릭 전압전류법을 실시하였다. 전압전류법 데이터를 적분하였고, 전기화학적 매개체 존재하에서 및 전기화학적으로 라벨링된 특이 펩티드가 없는 상태에서 이러한 전극을 사용하여 얻은 백그라운드 적분 전류를 전술한 바와 같이 공제하였다. 전기화학적으로 라벨링된 p53 펩티드 및 매개체의 존재하에서 MDM2-고정 전극을 사용한 전압전류법 실험에서는 특이 신호가 검출되었는데, 이것은 p53 펩티드와 MDM2 사이에 특이적인 상호작용을 나타낸다. 전기화학적으로 라벨링된 p53 펩티드 및 고정된 GST-Src SH3나 스트렙타비딘을 갖는 전극을 사용한 전압전류법 실험에서는 어떠한 특이적인 상호작용도 검출되지 않았다.
이러한 결과는 본 발명에 따른 고정 전극이 단백질을 포함하는 생물학적 결합쌍과 전기화학적으로 라벨링된 특이적 결합 펩티드 사이의 특이적인 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다는 것을 보여주고 있다.
실시예 5
조합물 라이브러리를 스크린하기 위한 전기화학적 분석
싸이클릭 전압전류법으로 GST-Src-SH3 융합 단백질과 전기화학적으로 라벨링된 SH3 결합 펩티드 사이의 상호작용으로부터 얻은 전기화학적 신호를 교란하는 샘플을 검출하기 위한 화학적 조합물 라이브러리(combitorial chemical libraries)를 스크린 하기 위해 본 발명의 전기화학적 분석을 사용하였다. 타겟:펩티드 상호작용을 교란시키는 화합물에 대한 화학 화합물의 라이브러리를 스크린하기에 유용한 전기화학적 분석을 위하여, 스크린의 상태가 쉽게 교란되거나 그로 안해 싸이클릭 전압전류 출력이 줄어들지 않아야 한다. 바람직하게는, 이러한 스크린은 넓은 영역의 pH 및 염농도에서 그 기능을 수행해야 하며, 화학적 조합물 라이브러리에서 자주 접할 수 있는 통상적인 불순물(커플링제와 같은)에 민감하지 않아야 한다.
다양한 조건하에서 조합물 라이브러리를 스크린하기 위한 전기화학적 분석법의 정확도를 평가하기 위하여 전술한 바와 같이, 본 발명의 GST-Src SH3-고정 전극을 전기화학적으로 라벨링된 SH3 결합 펩티드와 인큐베이트하였다. 산, 염기, 염과 같은 화학 약품이나 알데히드, 케톤, 및 알코올과 같은 관능기를 갖는 화학약품의 존재하에서 싸이클릭 전압전류법을 실시하였다. 이 실험에서, 대부분의 이러한 화학약품의 존재는 전기화학적 신호에 아무런 영향을 미치지 않았다.
실시예 6
알려진 단백질:펩티드 상호작용에 대한 Kd를 결정하기 위한 전기화학적 분석
Src-SH3 도메인과 짧고 프롤린이 많은 다수의 특이적인 결합 펩티드 사이의 상호작용에 대한 Kd를 결정하기 위하여 본 발명의 전기화학적 분석 방법을 이용하였다. Src-SH3 도메인과 Arg-Pro--Leu-Pro-Pro-Leu-Pro(SEQ ID No.:4) 및 Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Pro-Arg (SEQ ID No.:시이퀀스 번호:5)과 같은 짧고 프롤린이 많은 펩티드의 상호작용을 자세히 고찰하였고, Kd값은 상표명 BIAcore(Pharmacia사)와 같은 공인된 수단으로 결정하였다. 평균적으로, 이들 펩티드는 Src-SH3 도메인에 5μM의 Kd값으로 결합하고 있다. 이러한 데이터는 동일한 상호작용에 대한 정확한 Kd값을 제공할 수 있도록, 전기화학적 분석 능력을 비교하는 유력한 기초자료가 된다.
약리학적으로 공인된 방법을 비교하기 위하여, 본 발명의 전기화학적 분석 방법을 사용하여 GST-Src SH3과 SH3 결합 펩티드간의 상호작용에 대한 Kd값을 결정하였다. 전술한 바와 같이, GST-Src SH3 융합 단백질로 도포된 전극을, 프롤린이 많은 SH3 도메인 특이적 결합 펩티드의 전기화학적으로 라벨링된 종과 인큐베이트하였다. 전술한 바와 같이, 싸이클릭 전압전류법을 이용하여 전기화학적 신호를 발생시켰고, 상기 실시예 5에 기술한 바와 같은 시간에 대하여 상기 신호를 모니터링 하였다. 여러 펩티드 농도에서 전기화학적 신호 데이터를 수집하였으며, 이러한 전기화학적 신호를 이용하여 펩티드에 대한 Kd값을 계산하였다. 또한, Kd값은 내부 콘트롤로서 상표명 BIAcore 방법을 이용하여 결정하였고, 두 분석방법간의 결과를 비교하므로써 본발명의 전기화학적 분석법을 이용하여 얻은 상기 값을 확인하는데 사용하였다.
실시예 7
복합 혼합물 내의 단백질:펩티드 상호작용을 검출하기 위한 전기화학적 분석
복합 혼합물 내의 단백질:펩티드 상호작용을 검출하기 위하여 본 발명의 전기화학적 방법 및 장치를 이용하였다. 이 실험에서는 여러가지 다양한 타겟 분자 및 특이적 결합 펩티드의 소스를 사용하였다.
통상적으로 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하거나 조합물 라이브러리를 스크린하므로써 단백질에 대한 대위 리간드를 발견하는 것이 가능하지만(참조문헌에 기재한 미국공동출원 Serial No. 08/740,671,10. 31, 1996 참조), 프로테인에 대한 천연 리간드는 동정하기가 매우 어렵다. 본 발명의 전기화학적 스크린 분석은 천연 리간드를 동정하는데 상대적으로 간편한 수단을 제공한다. 본 발명의 전기화학적 분석방법의 이러한 측면을 증명하기 위하여 세포 추출물 내의 Src SH3 도메인에 대한 천연 리간드를 검출하였다. GST-Src SH3 도메인 융합 단백질로 도포된 전극은 전기화학적으로 라벨링된 펩티드로 SH3 도메인을 특이적으로 "로드"하기 위하여 전기화학적으로 라벨링된 Src-SH3 결합 펩티드와 인큐베이트하였다. 이어서, 상기 전극을 약 107-108 HeLa 셀에서의 전체 셀 추출물과 인큐베이트하고 싸이클릭 전압전류법을 실시하였다. HeLa 셀 추출물에 존재하는 화합물로 전기화학적으로 라벨링된 펩티드를 치환하므로써 얻어지는 전기화학적 신호의 감소도를 결정하기 위해서 데이터 분석을 실시하였다. 그런 다음, 상기 셀 추출물은 다양한 크로마토그래피 방법(DEAE 세파로제를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피, 카르복시메틸 세파로제를 사용한 양이온 크로마토그래피 및 세파덱스 및 세파로제를 사용한 크기 배제 크로마토그래피와 같은)을 포함하는 통상적인 생화학적 분별기술을 사용하여 분별하였다. 분별 후, 전기화학적으로 라벨링된 특이적 결합 펩티드의 결합을 치환할 수 있는 화합물의 존재를 검출하기 위하여 분별된 유분(fraction)을 싸이클릭 전압전류법으로 분석하였다. 상기 활성도를 갖는 유분에 대해서만 이어지는 생화학적인 분별 단계를 실시하였다. 상기 여러가지 생화학적 정제 단계를 거친 후, 프랙션의 상대적인 순수도를 결정하기 위하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기이동법으로 활성 프랙션을 분석하였다. 이어서, 특이적인 펩티드 치환 활성도를 갖는 유분을 포함하는 활성 단백질을 분리하고 동정하기 위해 균질의 단백질 함유 "밴드"의 마이크로시이퀀싱(microsequencing)을 이용하였다. 이러한 방법을 통하여 본 발명에 따른 방법은 생물학적 화합물의 균질 혼합물로부터 단백질-펩티드 상호작용을 검출하기 위한 민감한 분석법을 제공한다.
본 발명의 전기화학적 분석법은 또한 유전자 재조합 방법으로 분리되고 동정되는 오펀(orphan) 수용체의 기능을 결정하기 위하여 사용된다. DNA 시이퀀스는 수용체 코딩 도메인을 닯은 인코딩 영역에서 자주 발견된다. 이러한 시이퀀스가 발견될 때, 인코딩 수용체나 이러한 수용체의 자연적인 리간드의 생물학적 기능 또는 활성도를 결정하기란 쉽지 않다. 미지의 수용체 시이퀀스를 위하여, 대위 리간드를 동정하기 위한 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리를 스크린하기 위한 타겟으로, 수용체의 세포외 도메인을 사용하였다. 대위 리간드는 다양한 방법으로 사용되었다. 길항제를 동정하기 위하여 조합물 라이브러리의 전기화학적 스크린을 실시하였다. 수용체의 생물학적 역할을 해독하기 위하여 바이오시스템에 이들 화합물을 사용하였다. 또한 천연 리간드를 동정하기 위한 전기화학적 스크린 분석에 대위 리간드를 사용하였다. 전극에 결합된 타겟으로부터 라벨링된 대위 리간드를 치환하는 분자를 함유하는 유분을 동정하기 위하여, 세포 용해질이나 상청액를 분별하여 본 발명의 전기화학적 스크린 분석법으로 분석하였다. 이렇게 분리한 단백질 또는 리간드는 시이퀀싱으로 동정할 수 있다. 작은 분자 리간드는 질량 스펙트럼 분석법이나 다른 분석시스템으로 동정할 수 있다.
예를 들면, 이러한 본 발명의 전기화학적 분석법은 파스(fas) 수용체에 대한 리간드를 동정하는데 사용된다(한 등의 논문, 1996, Science 274: 1363; 나가타 등의 논문, 1995, Science 267: 1449; 타카하시 등의 논문, 1994, Cell 76: 969; 와나타베-후쿠나가 등의 논문, 1992, Nature 356:314 참조). 상기 파스 수용체는 거의 모든 형태의 세포에 나타나는데, 리간드에 의해 결합될 때 아폽토틱 경로를 유발한다. 파스 수용체에 대한 리간드의 발현은 많이 제한된다. 아폽토시스는 한 세포상의 리간드가 다른 세포상의 수용체와 상호작용할 때 나타난다. 이것은 치료적으로 유용한 타겟인데, 다흑색종 세포 표면상의 파스 리간드의 발현으로 몸의 면역세포내에서 아폽토시스를 유발하여, 암세포가 호스트 면역 반응을 피할 수 있도록 한다는 사실이 최근에 증명되었기 때문이다.
대위 리간드를 동정하기 위하여, 파스의 세포외 도메인을 파지 디스플레이내 타겟으로 사용될 수 있다(예를 들면, 참조문헌에 기재한 미국공동출원 Serial No. 08/740,671,10. 31, 1996의 문헌에 개시된 방법을 사용하여). 전기화학적으로 라벨링되고 파스 세포외 도메인으로 도포된 전극위에 이렇게 동정한 대위 리간드를 가했다. 전극으로부터 라벨링된 대위 리간드를 치환할 수 있는 활성도를 가진 유분을 검출하기 위하여, 플라즈마 세포 상청액을 분별하고, 전술한 싸이클릭 전압전류법 및 전기화학적 스크린으로 상기 유분을 분석하였다. 통상적인 크로마토그래피 기술을 사용하여 분별한 후에, 분별 시리즈로부터 파스 수용체 리간드를 검출하였다.
또한, 본 발명의 전기화학적 분석방법을 사용하여 파스 수용체의 기능을 동정하였다. 이러한 분석에 있어서, 전술한 바와 같이 파지 디스플레이를 통하여 대위 리간드를 얻기 위해 파스 수용체의 세포외 도메인을 사용하였다. 이어서, 파스로 도포된 전극으로부터 라벨링된 리간드와 치환되거나 경쟁하는 화학적 조합물 라이브러리로부터 혼합물을 동정하기 위한 전기화학적 스크린에 라벨링된 대위 리간드를 사용하였다. 동정된 화합물은 파스 활성도의 축진제나 길항제일 수 있다. 수용체의 기능을 연구하기 위하여, 이러한 스크린에서 동정된 화합물을 다음과 같이 생물학적 시스템 모델에서 테스트하였다. 예를 들면, 파스를 발현하는 배양액내에서 세포에 상기 화합물을 첨가하고 세포의 생물학적 응답을 관찰하였다. 수용체 길항제는 파스 리간드 존재하에서 아폽토틱 경로를 막으며, 반면에 수용체 축진제는 파스 리간드를 모방하여 아폽토틱 경로를 강화시킨다. 이와 같이, 아폽토시스의 검출은 파스 수용체의 기능을 분석하기 위한 본 발명의 전기 화학적 분석법과 관련하여 사용될 수 있는 민감한 분석을 제공한다.
실시예 8
대시간 전류법 및 하이드로겔을 이용한 전기화학적 분석
생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 특이적 결합에 대한 전기화학적 분석은 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 그 상부에 고정된 전기화학적 매개체를 포함하는 하이드로겔로 도포된 전극을 이용하여 수행하였다.
A. 하이드로겔과 전극의 제조
브리케 등의 논문(1995,Anal.Chem.67: 3030-306)에 개시된 방법에 의해 하이드로겔을 제조하였다. 글래시 카본 볼트암메트리 전극(직경이 3㎜)은 바이오어낼리티컬 시스템사(웨스트 라파예테, IN)로부터 구입하였으며, 브랜슨 1210 음파처리기(피셔 사이언티픽, 레이라이, NC) 내에서 음파처리에 의한 분해로 얻어지는 알루미나로 연마함으로써 사용에 적합하도록 제조하였다. 상기 전극을 메탄올로 세척한 후 공기중에서 건조시켰다. 폴리(에틸렌 글리콜 400 디글리시딜 에테르)(PEGDGE)는 폴리사이언스사(웨링턴, PA)로부터 구입하였다. Os 비피리딘 레독스 센터(PVI-Os)로 변형된 레독스 폴리머 폴리(1-비닐이미다졸)은, 오하라 등의 논문(1993,Anal.Chem.65:3512-3517)에 개시된 내용에 따라 합성하였다. 특히, 하이드로겔은 통상 4 내지 6 ㎎/㎖ 농도에서 수용체 단백질 또는 단편을 통상적으로 포함하는, 생물학적 결합쌍의 제1 부재 용액; 10㎎/㎖의 PVI-Os 및 2.5㎎/㎖의 PEGDGE의 각각의 용액을 5μL씩 혼합함으로써 제조하였다. 상기 혼합물을 1μL씩 나누어서 글래시 카본 전극의 표면에 살포하였다. 하이드로겔이 도포된 전극은 사용전에 실온에서 하룻동안 큐어링하였다.
B. 하이드로겔을 이용하여 src SH3에 결합된 대위 리간드의 전기화학적 검출
상기 src SH3 도메인은 섹션 A에서 전술한 바와 같이 하이드로겔 내에 고정되었다. 이어서, 상기 전극은 다음과 같이 제조된 대위 리간드를 이용한 대위 리간드 결합의 전기화학적 검출용으로 이용되었다.
스트렙트아비딘(SA) 복합체(시그마 케미컬사, 세인트루이스, MO), 비오틴화된 양고추냉이 퍼옥시다아제(B-HRP)(시그마사) 및 비오틴화된 src SH3 대위 리간드(His-Gly-Ser-Gly-Ser-Phe-Ser-His-Pro-Gln-Asn-Thr; SEQ ID No.2)는 다음에 따라 제조하였다. 비오틴화된 src SH3 대위 리간드(120 μM(4㎎/㎖) 용액 4μL, 400p몰)는 B-HRP(4μM(1㎎/㎖) 용액 4μL, 100p몰)과 혼합하였으며, 상기 혼합물을 16㎍의 SA(16μM(1㎎/㎖) 용액 17μL)을 포함하는 튜브에 운반하였다. 상기 혼합물은 실온에서 20분 동안 안정적으로 인큐베이트하였다. 이후, 비오틴(100μM 용액 25μL, 250p몰)을 첨가하였으며, 포스페이트 버퍼드 살린(PBS) 용액을 더 넣어 상기 용액의 부피를 100μL가 되도록 증가시켰다.
전기화학적 분석(대시간 전류법)은 BAS100B 전기화학적 분석기(BAS, 웨스트 라파예테, IN)를 이용하여 수행하였다. 전술한 상기 src SH3 하이드로겔이 도포된 전극, 은/염화은 레퍼런스 전극(BAS) 및 백금 보조 전극은 1%의 보빈 세륨 알부민을 포함하는 5㎖의 PBS 용액 내에 침지하였다. 상기 용액은 전기화학적 분석을 행하는 도중 내내 저어주었다. 상기 src SH3 하이드로겔이 도포된(동작중인) 전극과 상기 레퍼런스 전극 간의 포텐셜은 100㎷로 설정하였다. 시간 t=300초일때, 0.1M의 과산화수소 용액 5μL을 첨가함으로써 상기 용액에서 과산화수소(H2O2)의 최종 농도를 100μM가 되도록 하였다. 시간 t=600초일때, 상기 스트렙트아비딘/비이오틴화된 양고추냉이 퍼옥시다아제(SA/B-HRP)컨주게이트 대위 리간드를 31μL 첨가하여 상기 SA의 최종농도를 1㎍/㎖이 되도록 하였다.
상기 실험 결과는 도 8에 나타나 있으며, 도 8은 전기화학적 분석 용액에 상기 성분들을 순차적으로 첨가하면서 생성되는 전류(nA)를 나타낸 그래프이다. 도 8에 나타난 바와 같이, src SH3 대위 리간드의 첨가하는 시간 내내 전류의 증가가 검출되었다. 상기 SA/B-HRP 컨주게이트 대위 리간드를 첨가하면 즉각적으로 이러한 전류가 생성하며, 약 1500 내지 2000 초에서 안정기에 도달한다. 네가티브 콘트롤로서, 전술한 바와 같이 제조된 관련없는 대위 리간드가 대시간 전류법 실험에 이용되었다. 이러한 대위 리간드를 이용하면 어떠한 전류도 검출되지 않았다.
이상의 결과로부터 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 그 상부에 고정된 전기화학적 매개체를 포함하는 하이드로겔 전극은 대시간 전류법을 이용하여 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 결합을 검출하기 위하여 그 기질의 존재하에서 생물학적 결합쌍의 제2 부재와 레독스에 의존하는 효소 촉매의 컨주게이트와 함께 이용될 수 있음을 알 수 있다.
C. tyrRS에 결합하는 대위 리간드의 전기화학적 검출
티로신 아미노아실 tRNA 합성효소(tyrRS)는 섹션 A에서 기술한 바와 같이 하이드로겔내에 고정시켰다. 상기 tyrRS 대위 리간드를 포함하는 복합체는 상기 src SH3 대위 리간드를 위하여 섹션 B에 기술된 바에 따라 제조하였다. 섹션 B에 기술된 바와 같이 대시간 전류법을 실시하였으며, 그 실험 결과를 도 9에 도시하였다. 상기 tyrRS 대위 리간드는 다음과 같은 아미노산 시이퀀스를 가지고 있다.
Leu-Tyr-Ser-Trp-Pro-Asp-Glu-Gln-Tyr-Glu-Arg-Pro-Ser-Gly-Ser-Gly-Lys(SEQ ID No.:6).
상기 src SH3-SA/B-HRP 컨주게이트 대위 리간드 실험에서 알 수 있듯이, 상기 tyrRS-SA/B-HRP 컨주게이트 대위 리간드 결합쌍을 이용한 실험에서는 컨주게이트 대위 리간드가 전해액에 첨가되는 경우에만 전류가 검출되었다. 관계없는 대위 리간드의 SA/B-HRP 컨주게이트를 사용한 네가티브 콘트롤 실험은 상기와 같은 실험 조건에서는 검출될 수 있을 정도의 전류의 증가를 발생시키지 않았다.
이러한 결과는 전술한 섹션 B에서 기술하고 있는 결과를 확인시켰으며, 생물학적 결합쌍들 사이의 결합을 전기화학적인 방법으로 검출하기 위한 상기 실험적인 접근이 일반적이라는 것을 설명하고 있다.
실시예 9
생물학적 쌍의 결합 억제제에 대한 전기화학적 검출
생물학적 결합쌍의 부재들 사이에 특이적인 결합을 억제하는 능력을 갖는 화합물에 대한 전기화학적 분석을 실시예 8에서 기재한 전기화학적인 분석 장치와 방법을 이용하여 수행하였다.
상기 실시예 8에 기재한 바와 같이, 생물학적 쌍의 결합 억제제를 검출하기 위한 본 발명의 방법에 따른 3개의 선택적인 실시예가 있다. 제1 실시예에 있어서, 컨주게이트 대위 리간드가 하이드로겔 내에서 타켓에 결합된 후에 전해액에 억제제를 첨가하였다; 이것은 상기 컨주게이트 대위 리간드를 전해액에 첨가하는 단계, 안정성 전류에 도달할 때까지 전류 생성을 검출하는 단계, 추정 억제제를 첨가하는 단계 및 생성된 전류량의 감소를 검출하는 단계에 의해 달성되었다. 제2 실시예에 있어서, 상기 억제제와 컨주게이트 대위 리간드를 전해액에 동시에 첨가하였으며, 추정 억제제의 존재하에서 생성되는 전류량과 추정 억제제의 부재하에서 생성되는 전류량을 상호 비교하였다. 제3 실시예에서는, 컨주게이트 대위 리간드를 첨가하기 전에 억제제를 전해액에 첨가하였다.
도 10은 상기 제1 방법을 사용한 분석 결과를 나타낸 것이다. tyrRS 및 SA/B-HRP 컨주게이트 tyrRS 대위 리간드를 포함하는 하이드로겔 전극은 실시예 8에 기재된 바에 따라 준비하였다. 대시간 전류법은 시간 t=1300초일때, 전해액에 있어서, 1mM의 억제제 용액 100μL을 첨가함으로써 tyrRS의 특이적 억제제인 NL932의 최종 농도가 10μM이 되도록 하는 것만을 제외하고는 실시예 8에 기재된 바와 동일하게 진행하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, 억제제를 첨가하면 전류가 갑작스럽게 저하되었다(생성된 전류의 약 25%의 저하). 이러한 결과로부터 생물학적 결합쌍이 결합한 후까지도 본 발명에 따른 하이드로겔 전극을 이용하여 생물학적 결합쌍의 결합 억제제가 검출될 수 있다는 것을 알 수 있다.
도 11은 상기 제2 방법을 이용한 분석 결과를 나타내고 있다. tyrRS와 SA/B-HRP 컨주게이트 tyrRS 대위 리간드를 포함하는 하이드로겔은 실시예 8에 기재된 바에 따라 제조하였다.대시간 전류법은 10μM(상기 개시된바와 같이 첨가된 후 최종 농도)의 NL932이 상기 전해액에 상기 대위 리간드와 동시에(대략 t=0일때) 첨가되는 것을 제외하고는 상기 실시예 8에 기재된 바에 따라 진행하였다. 도 11에 나타난 바와 같이, 억제제와 함께 컨주게이트 대위 리간드를 동시에 첨가한 경우에는 전류 피크가 58% 감소되었다. 상기 방법을 이용하여 관찰된 감소량은 전술한 제1방법을 이용하여 관찰된 감소량보다 더 크게 나타났다.
도 12는 상기 제3 방법을 이용한 분석의 결과를 나타낸 것이다. tyrRS 및 상기 tyrRS 대위 리간드의 SA/B-HRP 컨주게이트는 실시예 8에 기재된 바에 따라 제조하였다. 대시간 전류법의 시작 전에 하이드로겔 전극을 15분 동안 10μM의 NL932를 포함하는 5㎖의 용액 내에서 저어지면서 인큐베이트한 것을 제외하고는 상기 실시예 8에 개시된 바에 따라 대시간 전류법를 진행하였다. 상기 대시간 전류법 실험은 컨주게이트 tyrRS 대위 리간드와 기질을 첨가함으로써 개시되었다; 상기 전극은 컨주게이트 대위 리간드를 첨가하기 전에 부가적으로 10분동안 억제제 용액내에서 방치하였다. 도 12에 나타난 바와 같이, 억제제로 하이드로겔을 사전 인큐베이트하므로써 억제제의 부재하에서 수행된 대시간 전류법와 비교했을 때, 피크 전류가 80% 감소하였다.
전술한 세개의 방법 모두 tyrRS 억제제를 검출할 수 있으며, 그 중에서도 가장 감도가 우수한 방법은 하이드로겔로 억제제를 사전 인큐베이트하는 전술한 제3 방법이다. 상기 억제제와 대위 리간드를 동시에 첨가하는 전술한 제2 방법은 감도에 있어서는 중간 정도이며, 상기 억제제를 첨가한 후에 상기 대위 리간드를 첨가하는 전술한 제1 방법은 가장 작은 감도를 가지고 있다. 이러한 결과는 생물학적 결합쌍의 결합을 억제하는 화합물을 민감하게 검출하기 위해 제공되는 본 발명에 따른 방법과 장치의 성능을 알려주므로써, 질병과 관련된, 부적합하거나 병리학적이고 생물학적인 결합쌍의 분해를 직접적으로 유도할 수 있는 약제를 위한 감도가 좋은 스크린 방법을 제공할 수 있다.
실시예 10
대위 리간드를 이용한 결합속도 상수의 전기화학적 측정
실시예 8의 섹션 C에 기재된 바와 같은 tyrRS와 그 대위 리간드 사이의 결합에 대한 대시간전류 분석 방법이 본 발명에 따른 전극상에 고정된 tyrRS에 대한 대위 리간드의 결합속도 상수를 결정하기 위해 이용되었다. 실시예 8의 섹션 A에 제조된 바에 따라 tyrRS를 포함하는 하이드로겔을 제조하였다. 실시예 8 내의 섹션 C에 개시된 바에 따라 tyrRS 대위 리간드를 포함하는 복합체를 제조하고, 대시간 전류법을 수행하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, 대위 리간드 복합체를 첨가하면 전류가 드라마틱하게 증가하는 것을 알 수 있다. 상기 전류는 싱글-익스포넨셜(single-exponential) 속도 동력학에 따라 포화-한계 값을 얻는다. 대위 리간드 복합체의 결합 또는 치환에 대한 제1차 속도 상수는 하기 식에 따라 계산할 수 있다.
(Isat-I)=(Isat-Io)exp(-kt)
이때, I는 t 시간에서의 전류이고, k는 제1차 속도 상수이고, 첨자 "o"와 "sat"는 복합체의 첨가시간 및 결합의 포화시간에 각각 관찰된 값을 나타낸다. 상기 제1차 속도 상수는 하기 식을 이용하여 결정할 수 있다.
k=-{ln(I-Io)-ln(Isat-Io)}/t
상기 식은 0.0012s-1의 tyrRS-대위 리간드 결합 반응에 대한 결합 속도 상수를 결정하는데 사용되었다.
이와 유사하게, 상기 tyrRS-대위 리간드에 대한 결합 억제제를 첨가하면 도 10에 나타나고 실시예 9에 기재된 바와 같이 전류 감소를 초래한다. 또한, 상기 식을 이용하여, 억제제에 의해 대위 리간드의 치환에 대한 속도 상수를 결정하는데 사용될 수 있는 포화-한계값이 이러한 전류의 감소로부터 얻어진다. 대위 리간드의 치환에 대한 결합속도 상수는 경쟁적 억제제인 NL932의 경우 0.0035s-1로 결정되었다.
실시예 11
대위 리간드 복합체에 대한 경쟁적 억제제의 억제 상수의 결정
실시예 8의 섹션 C에 기재된 바와 같은 tyrRS와 그 대위 리간드 사이의 결합에 대한 대시간전류 분석 방법이 본 발명에 따른 전극상에 고정된 tyrRS에 결합한 대위 리간드의 경쟁적 억제제의 억제 상수를 결정하기 위해 이용되었다. 실시예 8의 섹션 A에 제조된 바에 따라 tyrRS를 포함하는 하이드로겔을 제조하였다. 실시예 8 내의 섹션 C에 개시된 바에 따라 tyrRS 대위 리간드를 포함하는 복합체를 제조하고, 대시간 전류법을 수행하였다. 도 13에 나타난 바와 같이, 전극에 고정된 tyrRS-대위 리간드 복합체에 대한 경쟁적 억제제인 NL932를, 농도를 증가시키면서 첨가하면 tyrRS에 대한 대위 리간드의 특이적 결합을 억제하였다. 도 14는 억제제 농도에 대한 억제된 유분을 나타내는 그래프로서, 하나의 경쟁적인 억제 작용의 개시가 약 50mM의 억제제 농도에서 발생되고 있음을 나타내고 있다. tyrRS-대위 리간드 복합체 결합에 관한 특이적 경쟁 상수를 결정하기 위해 다른 경쟁적 억제제에 대한 유사한 분석이 사용될 수 있다.
전술한 설명은 본 발명에 따른 특정한 실시예를 설명하기 위한 것이며, 전술한 실시예와 균등한 모든 변형 또는 대체 형태는 첨부된 특허청구범위에서 청구하고 있는 본 발명의 범위와 정신에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (60)

  1. 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 결합을 검출하기 위한 전기화학적 분석장치에 있어서, 상기 장치는,
    도전성 또는 반도전성 물질을 포함하며, 생물학적 결합쌍의 제1 부재가 고정되는 다공성 및 친수성 고분자층으로 도포된 표면을 가진 제1 전극,
    전해질 수용액과 접촉하는 도전성 금속을 포함하는 제2 레퍼런스 전극 및
    도전성 금속을 포함하는 제3 보조 전극을 포함하며,
    상기 전극 각각은 일정 전위기에 전기적으로 연결되고, 상기 장치는 또한,
    전해질 용액을 포함하며, 상기 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하는 반응 챔버를 포함하고, 상기 용액은,
    전위가 상기 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 전기화학적 매개체 및
    전위가 상기 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전기화학적 매개체와의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종으로 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고,
    생물학적 결합쌍의 제2 부재가 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 결합되는 조건하에서 전위가 전극에 인가될 때 상기 장치 내에서 전류가 생성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 전기화학적 분석이 싸이클릭 전압전류법인 것을 특징으로 하는 장치.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 장치는 다수의 전극 및 다수의 반응 챔버를 더 포함하고, 각각의 반응 챔버는 전해질을 포함하며 상기 장치내의 상기 다수의 전극중 상기 3개의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는 장치.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 루테늄으로 전기화학적으로 라벨링되는 것을 특징으로 하는 장치.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 전기화학적 매개체는 루테늄 화합물인 것을 특징으로 하는 장치.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 수용체 단백질 또는 그 리간드 결합 단편이고 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 상기 수용체 단백질에 특이하게 결합하는 리간드인 것을 특징으로 하는 장치.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 항체 단백질 또는 그 항원 결합 단편이고 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 상기 항체에 특이하게 결합하는 항원인 것을 특징으로 하는 장치.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 제1 단백질 또는 그 단편이고 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 상기 제1 단백질에 특이하게 결합하는 제2 단백질 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 장치.
  9. 생물학적 결합쌍의 제1 부재가 고정되는 다공성 및 친수성 고분자층으로 도포된 표면을 가지며 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 전극.
  10. 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극, 생물학적 결합쌍의 제1 부재, 상기 전극의 표면상에 다공성 및 친수성 고분자층을 형성하기 위한 리전트(reagent) 및 상기 전극 표면상에 형성된 다공성 및 친수성 고분자층 내에 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 고정시키기 위한 리전트를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 9항의 전극 제조용 키트.
  11. a) 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극을 제조하는 단계;
    b) 상기 전극의 표면상에 다공성 및 친수성 고분자층을 형성하는 단계; 및
    c) 상기 전극의 표면상에 형성된 다공성 및 친수성 고분자층 내에 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 고정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 9항의 전극을 제조하는 방법.
  12. 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대하여 약 1 나노몰(nm) 내지 약 100마이크로몰(μM)의 결합 친화성을 갖는 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드.
  13. 제 12항에 있어서, 루테늄 화합물로 라벨링된 것을 특징으로 하는 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드.
  14. 제 12항에 있어서, 하기 구조식 1의 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기화학적으로 라벨링된 대위 리간드.
    <구조식 1>
    Gly-His-Gly-Ser-Gly-Arg-Ala-Leu-Pro-Pro-Leu-Pro-Arg-Tyr-NH2(SEQ ID No.:1);
    His-Gly-Ser-Gly-Ser-Phe-Ser-His-Pro-Gln-Asn-Thr (SEQ ID No.:2);
    biotin-His-His-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gln-Thr-Phe-Ser-Asp-Leu-Trp-Lys-Leu (SEQ ID No.:3);
    Arg-Pro--Leu-Pro-Pro-Leu-Pro (SEQ ID No.:4);
    Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Pro-Arg (SEQ ID No.:5); 또는
    Leu-Tyr-Ser-Trp-Pro-Asp-Glu-Gln-Tyr-Glu-Arg-Pro-Ser-Gly-Ser-Gly-Lys (SEQ ID No.:6)
  15. 루테늄 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1항의 전기화학적 매개체.
  16. 제 1항의 장치를 사용하여 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 제 1항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제1 반응 챔버와, 제 1항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
    상기 제1 반응챔버는 제 1항의 전기화학적 매개체 및 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는, 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 제 1항의 전기화학적 매개체 및 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합되지 않는 전기화학적으로 라벨링된 종을 포함하는 단계;
    b) 제 1항에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
    c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
    상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합은 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항의 장치를 사용하여 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 동정하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 제 1항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제1 반응 챔버와, 제 1항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
    상기 반응챔버 각각은 제 1항의 전기화학적 매개체 및 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는, 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 더 포함하는 단계;
    b) 제 1항에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
    c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
    상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제는 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 동정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항의 장치를 사용하여 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제용 복합 화학 혼합물을 스크린하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 제 1항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제1 반응 챔버와, 제 1항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
    상기 반응챔버 각각은 제 1항의 전기화학적 매개체 및 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는, 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 복합 혼합물 성분을 포함하는 단계;
    b) 제 1항에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
    c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
    상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 복합 혼합물은 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 동정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 16항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 전기화학적으로 라벨링되는 대위 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 전기화학적으로 라벨링되는 대위 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 전기화학적으로 라벨링되는 대위 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 18항에 있어서,
    d) 분별된 서브혼합물을 얻기 위하여, 상기 제1 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대한 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 상기 복합 혼합물을 화학적으로 분별하는 단계; 및
    e) 생물학적 결합쌍의 결합 억제제를 함유하는 상기 서브혼합물을 동정하기 위하여 상기 분별된 서브혼합물 각각에 대하여 제 18항의 방법의 a)단계 내지 c)단계를 실행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 결합을 검출하기 위하여 전기화학적 분석을 실행하기 위한 장치에 있어서, 상기 장치는,
    도전성 또는 반도전성 물질을 포함하며, 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전기화학적 매개체가 각각 고정되는 다공성 및 친수성 고분자층으로 도포된 표면을 갖는 제1 전극;
    전해질 수용액과 접촉하는 도전성 금속을 포함하는 제2 레퍼런스 전극;
    도전성 금속을 포함하는 제3 보조전극을 포함하며,
    상기 전극 각각은 일정 전위기에 전기적으로 연결되고, 상기 장치는 또한,
    전해질 용액을 포함하며, 상기 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하는 반응 챔버를 포함하고, 상기 용액은
    전위가 상기 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전기화학적 매개체와의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종으로 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고,
    생물학적 결합쌍의 제2 부재가 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 결합되는 조건하에서 전위가 전극에 인가될 때 상기 장치 내에서 전류가 생성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 전기화학적 분석이 싸이클릭 전압전류법인 것을 특징으로 하는 장치.
  25. 제 23항에 있어서, 상기 장치는 다수의 전극 및 다수의 반응 챔버를 더 포함하고, 각각의 반응 챔버는 전해질을 포함하며 상기 장치내의 상기 다수의 전극중 상기 3개의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는 장치.
  26. 제 23항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 루테늄으로 전기화학적으로 라벨링되는 것을 특징으로 하는 장치.
  27. 제 23항에 있어서, 상기 전기화학적 매개체는 오스뮴 화합물인 것을 특징으로 하는 장치.
  28. 제 23항에 있어서, 상기 전기화학적 매개체는 루테늄 화합물인 것을 특징으로 하는 장치.
  29. 제 23항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 수용체 단백질 또는 그 리간드 결합 단편이고 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 상기 수용체 단백질에 특이하게 결합하는 리간드인 것을 특징으로 하는 장치.
  30. 제 23항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 항체 단백질 또는 그 항원 결합 단편이고 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 상기 항체에 특이하게 결합하는 항원인 것을 특징으로 하는 장치.
  31. 제 23항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 제1 단백질 또는 그 단편이고 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 상기 제1 단백질에 특이하게 결합하는 제2 단백질 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 장치.
  32. 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 전기화학적 매개체 및 생물학적 결합쌍의 제1 부재가 각각 고정되는 다공성 및 친수성 고분자층으로 도포된 표면을 갖고, 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 전극.
  33. 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극, 전기화학적 매개체, 생물학적 결합쌍의 제1 부재, 상기 전극의 표면상에 다공성 및 친수성 고분자층을 형성하기 위한 리전트(reagent) 및 상기 전극 표면상에 형성된 다공성 및 친수성 고분자층내에 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 상기 전기화학적 매개체를 고정하기 위한 리전트를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 32항의 전극 제조용 키트.
  34. a) 도전성 또는 반도전성 물질을 포함하는 전극을 제조하는 단계;
    b) 상기 전극의 표면상에 다공성 및 친수성 고분자 층을 형성하는 단계; 및
    c) 상기 전극의 표면상에 형성된 다공성 및 친수성 고분자 층 내에 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 상기 전기화학적 매개체를 고정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 32항의 전극을 제조하는 방법.
  35. 제 23항의 장치를 사용하여 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 제 23항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제1 반응 챔버와, 제 23항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
    상기 제1 반응챔버는 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 전기화학적으로 라벨링되는 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하지 않는 전기화학적으로 라벨링된 종을 포함하는 단계;
    b) 제 23항에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
    c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
    상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합은 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 23항의 장치를 사용하여 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 동정하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 제 23항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제1 반응 챔버와, 제 23항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
    상기 반응챔버 각각은 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 특이하게 결합하는 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 포함하는 단계;
    b) 제 23항에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
    c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
    상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제는 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 동정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 23항의 장치를 사용하여 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제용 복합 화학 혼합물을 스크린하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 제 23항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제1 반응 챔버와, 제 23항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
    상기 반응챔버 각각은 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 복합 혼합물 성분을 포함하는 단계;
    b) 제 23항에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
    c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
    상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 복합 혼합물은 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 동정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 35항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 전기화학적으로 라벨링되는 대위 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 36항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 전기화학적으로 라벨링되는 대위 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 37항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 전기화학적으로 라벨링되는 대위 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 37항에 있어서,
    d) 분별된 서브혼합물을 얻기 위하여, 상기 제1 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대한 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 상기 복합 혼합물을 화학적으로 분별하는 단계; 및
    e) 생물학적 결합쌍의 결합 억제제를 함유하는 상기 서브혼합물을 동정하기 위하여 상기 분별된 서브혼합물 각각에 대하여 제 37항의 방법의 a)단계 내지 c)단계를 실행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 생물학적 결합쌍의 부재들 사이의 결합을 검출하기 위하여 전기화학적 분석을 실행하기 위한 장치에 있어서, 상기 장치는,
    도전성 또는 반도전성 물질을 포함하며, 전위가 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전극과의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 화학종을 포함하는 생물학적 결합쌍의 제1 부재 및 전기화학적 매개체가 각각 고정되는 다공성 및 친수성 고분자층으로 도포된 표면을 갖는 제1 전극;
    전해질 수용액과 접촉하는 도전성 금속을 포함하는 제2 레퍼런스 전극;
    도전성 금속을 포함하는 제3 보조전극을 포함하며,
    상기 전극 각각은 일정 전위기에 전기적으로 연결되고, 상기 장치는 또한,
    전해질 용액을 포함하며 상기 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하는 반응 챔버를 포함하고, 상기 용액은
    전위가 상기 전극에 인가되는 조건하에서 상기 전기화학적 매개체와의 환원/산화 반응에 관여할 수 있는 전기화학적 촉매에 결합된 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 상기 반응챔버 내의 전해질은 전기화학적 촉매를 위한 기질을 포함하고,
    생물학적 결합쌍의 제2 부재에 결합된 전기화학적 촉매를 위한 기질의 존재하에 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 생물학적 결합쌍의 제2 부재가 결합되는 조건하에서 전위가 상기 전극에 인가될 때 상기 장치 내에서 전류가 생성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 전기화학적 분석은 대시간 전류법인 것을 특징으로 하는 장치.
  44. 제 42항에 있어서, 상기 장치는 다수의 전극 및 다수의 반응 챔버를 더 포함하고, 각각의 반응 챔버는 전해질을 포함하며 상기 장치내의 상기 다수의 전극중 상기 3개의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하는 것을 특징으로 하는 장치.
  45. 제 42항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재에 결합된 상기 전기화학적 촉매는 효소인 것을 특징으로 하는 장치.
  46. 제 45항에 있어서, 상기 효소는 양고추냉이 퍼옥시다아제인 것을 특징으로 하는 장치.
  47. 제 42항에 있어서, 상기 전기화학적 매개체는 오스뮴 화합물인 것을 특징으로 하는 장치.
  48. 제 42항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 수용체 단백질 또는 그 리간드 결합 단편이고 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 상기 수용체 단백질에 특이하게 결합하는 리간드인 것을 특징으로 하는 장치.
  49. 제 42항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 항체 단백질 또는 그 항원 결합 단편이고 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 상기 항체에 특이하게 결합하는 항원인 것을 특징으로 하는 장치.
  50. 제 42항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제1 부재는 제1 단백질 또는 그 단편이고 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 상기 제1 단백질에 특이하게 결합하는 제2 단백질 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 장치.
  51. 제 42항의 장치를 사용하여 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 제 42항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제1 반응 챔버와, 제 42항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
    상기 제1 반응챔버는 전기화학적 촉매에 결합되는, 상기 전기화학적 촉매를 위한 기질과 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 상기 제2 반응챔버는 전기화학적 촉매에 결합되는, 상기 전기화학적 촉매를 위한 기질과 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하지 않는 화학종을 포함하는 단계;
    b) 제 42항에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
    c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
    상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합은 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 42항의 장치를 사용하여 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 동정하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 제 42항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제1 반응 챔버와, 제 42항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
    상기 반응챔버 각각은 전기화학적 촉매에 결합되는, 상기 전기화학적 촉매를 위한 기질과 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제 및 전기화학적 촉매를 위한 기질을 포함하는 단계;
    b) 제 42항에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
    c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
    상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제는 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 동정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 42항의 장치를 사용하여 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 전기화학적으로 라벨링된 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제용 복합 화학 혼합물을 스크린하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    a) 전극 각각이 일정 전위기에 전기적으로 연결되며, 제 42항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제1 반응 챔버와, 제 42항의 전극 각각과 전기화학적으로 접촉하고 제1 전극이 상기 제1 전극에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재를 포함하는 제2 반응 챔버를 제공하는 단계로서,
    상기 반응챔버 각각은 전기화학적 촉매에 결합되는, 상기 전기화학적 촉매를 위한 기질과 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는 생물학적 결합쌍의 제2 부재를 포함하고, 제2 반응챔버는 상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 특이하게 결합하는, 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 복합 혼합물 성분 및 상기 전기화학적 촉매를 위한 기질을 더 포함하는 단계;
    b) 제 42항에 따른 장치의 제1 및 제2 반응챔버들 각각에서 전기화학적 분석을 수행하여 상기 장치의 전극에서 전류를 생성하는 단계; 및
    c) 상기 제2 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류에 제1 반응챔버에서 전기화학적 분석으로 생성된 전류를 대비하는 단계를 포함하며,
    상기 고정된 생물학적 결합쌍의 제1 부재와 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 복합 혼합물은 상기 제2 반응 챔버에서 생성되는 전류보다 큰, 제1 반응 챔버에서 생성되는 전류에 의해서 동정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 51항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 대위 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 52항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 대위 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 53항에 있어서, 상기 생물학적 결합쌍의 제2 부재는 대위 리간드인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 53항에 있어서,
    d) 분별된 서브혼합물을 얻기 위하여, 상기 제1 전극상에 고정되는 생물학적 결합쌍의 제1 부재에 대한 생물학적 결합쌍의 제2 부재의 결합 억제제를 함유하는 상기 복합 혼합물을 화학적으로 분별하는 단계; 및
    e) 생물학적 결합쌍의 결합 억제제를 함유하는 상기 서브혼합물을 동정하기 위하여 상기 분별된 서브혼합물 각각에 대하여 제 53항의 방법의 a)단계 내지 c)단계를 실행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 55항에 있어서, 상기 억제제는 상기 대위 리간드가 상기 제2 반응챔버에 첨가된 후에 상기 제2 반응챔버에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 55항에 있어서, 상기 억제제는 상기 대위 리간드가 상기 제2 반응챔버에 첨가되기 전에 상기 제2 반응챔버에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 55항에 있어서, 상기 억제제는 상기 제2반응 챔버에 첨가되는 대위 리간드와 함께 상기 제2 반응챔버에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
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