JP6962914B2 - チップ、検出器、ならびにそれらの製造方法および使用方法 - Google Patents

チップ、検出器、ならびにそれらの製造方法および使用方法 Download PDF

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Description

〔背景〕
本願は、２０１５年７月２０日に提出された特許シリアル番号６２／１９４，５０５の米国仮出願に対し、優先権を主張し、そのすべての内容が、参照によって本明細書に組み込まれる。
生体分子アレイ―ＤＮＡ、タンパク質、および炭水化物―における超高感度検出に向けて増加している技術的な後押しは、高いＳＮＲが獲得できるように、同様に極度に低いバックグラウンドシグナルを必要とする。しかしながら、市販の化学的表面修飾のほとんどにおいては、通常、高い自己蛍光、または試薬および検体の非特異的結合が含まれる。一般的に使用されるマイクロアレイのスポットのサイズがより小さくなり、サブミクロンの長さスケールにまで小さくなる場合、この問題がますます重要になる。現在の表面修飾技術のいくつかは、マイクロアレイにおいて上手く働くが、マイクロアレイおよびナノアレイを生体分子のためにルーチン使用することは、生体分子の非特異的吸着がｐｇ／ｃｍ２のレベルにまで低減し、および精巧かつ高価な増幅技術なしに、検体を直接検出することができる検出システムを設計するという、相当な課題をもたらす。
感染症（ＩＤ）のためのスクリーニングの現在の方法は、高い費用、アッセイの複雑さ、アッセイを実施するために必要な時間、およびアッセイの感度を含む、いくつかの欠点に苦しむ。
費用
単一の感染症マーカーの最も正確な免疫測定法に基づく試験は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）と呼ばれ、約１６ＵＳドルの費用がかかり、かつ試験するマーカー毎に、技術者の時間が平均６時間必要である。多重化を可能にした最近の改善は、今や４つの感染媒介物のアッセイを約１４ＵＳドルの費用で試験することを可能とし、平均約４．５時間の技術者の時間を必要とする。ただし、これらの試験においては、約＄１１０，０００〜＄１６０，０００ＵＳドルに値する実験装置の使用が必要となる。また、各試験において、静脈血採取により患者から得られた全血のサンプルから分離することのできる約２００μＬの血清または血漿が必要であった。この血液採取は、一般的にポイント‐オブ‐ケア（point-of-care:ＰＯＣ）で行われ、およびそれから実際の試験のために集中型研究室に輸送される。
当業において、サンプルの収集、処理、および試験の主な側面を能率化することによって、費用を大幅に削減する装置の必要性が残されている。理想的には、そのような装置は、以下を提供する：（１）指スティックから得られた全血の原液を直接試験することによって、すべての前処理を排除すること；（２）試薬―捕捉剤としてスポットされたタンパク質抗原および検出抗体―の量を減らすための試験の小型化；および（３）一工程、オンサイトの処理。さらに、試験は、多重化することができ、かつ単一のＩＤのための試験にかかる費用を著しく増加させることなく、一団のＩＤを標的化できる。これらの改善は、サンプル前処理を使用せず、または検体の溶液から細胞を分離するためにマイクロ流体技術を使用せず、完遂される。
多重化された試験は、さらなる利点を有する。たとえばＨＩＶといった、もっとも注目されているＩＤに、多くが集中しており、結果的に、他のＩＤのために一般大衆を試験するという願望または緊急性の一般的な欠如につながる。この問題に対する適切な解決は、単一のＩＤ試験が要求されるたびに、一団のＩＤすべての試験を提供することであり、これにより結果として、単一のＩＤ向けの試験と比較して、増分のみの費用にすることができる。この問題に対する適切な解決は、単一のＩＤ試験が要求されるたびに、一団のＩＤすべての試験を提供することであり、これにより結果として、単一のＩＤ向けの試験と比較して、増分のみの費用にすることができる。装置の小型化により、装置内の捕捉試薬および検出抗体の使用をピコリットル量にすることによって、費用を削減できる。多重化は、ＨＩＶといった非難される病気のための特定の試験を要求する場合にいくらかの人々が経験する不快感を、そのような病気がチップ上で発見されるいくつかのＩＤの１つであることによって、救うこともできる。食品および風媒の ＩＤを含む多数のＩＤをカバーする多重化試験を有することにより、個人は試験を要求することに対し、より不安を感じずにすむ。さらに、捕捉剤の必要量を減らすための装置の小型化は、プレートベースのＥＬＩＳＡなどの、標準的な研究所のＩＤスクリーニング試験における最も重要な費用の１つを、効果的に排除する。さらに、インクジェット印刷の最近開発された技術を用いることによって、使い捨て、多重化センサチップを、チップあたり数セント程度の費用で製造することができる。
さらなる費用の削減は、高度先進医療のインフラへの依存を減らすことによって獲得され得る。たとえば、発展途上国の移動診療所においては、時間および人員が限られており、および単一工程、オンサイト処理の多重化試験は、患者の処理量、および検出される感染の数を著しく増加させる。さらに、小型化された、多重化アッセイを作成することにより、膨大な量の材料を排除し、かつ貯蔵および輸送の負担が著しく削減される。
アッセイの単純性および読み出し速度
ＩＤ試験を経験している人は、結果通知に至る心配な待ち期間（多くの場合、数日から数週間）が不快であり、かつ将来の試験を避ける理由であると特に言及する。もし結果を受け取るために２回目の訪問が必要であれば、患者の５０％以上は、戻らない。研究により、待機時間が１００分であれば、５０％までの患者が試験の結果を受け取る前に去り、待機時間が５０分であれば、約２０％の患者が去ることが示された。試験およびその結果を一回の訪問の間に提供することを確実にするために、速い試験が必要であり、それにより、患者が結果通知のために問合せ先（この情報は患者のプライバシーの懸念につながり、試験を避ける他の理由である）を提供する必要性を排除する。
静脈穿刺により採取された全血サンプルが必要な試験では、多大な労力、時間、および高度熟練労働者の利用可能性を必要とする。血液サンプルの実際の採取に加え、多くの診断は、血液が細胞と血漿とに分離することを必要とする。このことは、追加の機器および専門知識を必要とし、アッセイ費用および読み出し時間を増加させ、かつポイント‐オブ‐ケア 診断を提供する能力を制限する。その上、静脈穿刺の処理自体が患者の医学的合併症につながり得、かつ多くの人々が針と静脈穿刺とに対して感じる強い嫌悪感につながり得る。これらの懸念のすべては、指スティックを介して簡単に得ることができる、たった数マイクロリットルの血液によって一団のＩＤを検出することが可能な試験を作成することにより、減らすことができる。さらに、たった数マイクロリットルの血液から複数の標的を検出することのできる試験を作成することによって、より多くの量の血液を採取することに問題がなり、かつしばしば必要な血液の量が原因で血液採取の時に輸血が必要となる、新生児の試験に対するアクセスの向上が可能である。
高価または複雑なマイクロ流体の必要性を排除する装置が必要となり、それによりチップ前の費用を削減し、かつ実際に臨床サンプルで実地試験をした場合に、最も現代的な「ラボ−オン−チップ」デザインにおいてごく一般的な障害の主要な原因を排除する。
必要な材料を減らすことによって、ＩＤ試験のより高い処理量を実現できる（たとえば、針と血液収集バイアル、およびそれらの適切な処分の懸念の排除）。さらに、本開示の装置および方法において作成した使い捨てのアイテムは、指スティックランセット以外では、アッセイにおける血液接触表面として機能する、ガラスまたはプラスチックの小片だけである。これらの数千を１リットルの漂白液によって消毒でき、かつこれら表面は、通常のゴミとして廃棄し得る。その上、低資源の環境における試験は、しばしば隔離された地域において起こる。これらの地域に対し試験をもたらすことはアクセスを増加させるものの、いかなる型の追跡調査も、存在しないか、長い期間の後に起こるのみであることがよくある。さらに、郵便、電話、またはＥメールなどの他の方法は、利用できないか、または信頼性が低いため、しばしば対面でのコミュニケーションが唯一のオプションである。これらの理由から、速い結果が不可欠である。上述したように、これらの状況において、ラテラルフローストリップに基づく試験などのオプションが利用できるが、その感度は限られており、かつこの形式の多重化試験の可能性もまた限られている。
感度
上述した問題に取り組む新しい装置は、ラテラルフローストリップアッセイの、安価、手のひらに乗る大きさ、および速い結果が得られるという利点を有しながら、プレートベースのＥＬＩＳＡアッセイなどの、標準的な研究室の試験においてみられる感度もまた提供する。好ましくは、このような新規の装置は、タンパク質の偶発的な吸着により生じたバイオアッセイのバックグラウンドノイズの除去による、以前に達成できなかったレベルの感度を実現する。
通常、最も感度の高いアッセイは、技術的に洗練されたサポートかつ資本集約的な医療インフラを必要とする。現在の方法の下では、ポイント‐オブ‐ケアにおいて採取された患者サンプルは、実際の試験を実施するために必要な機器および職員を維持する研究所に輸送することができる。低資源の環境においては、単純にそのような機能へのアクセスが持てず、これらの地域における最も感度の高い診断へのアクセスを妨げる。新規の装置は、オンサイト分析を提供し、これにより医療インフラがあまり開発されていない環境において高感度の診断を利用することができる。
インフラが整っていない国でも、携帯電話はますます普及しつつある。これは、携帯電話技術を利用して新規の診断装置を提供する機会を提供する。携帯電話に基づく診断装置は、２つの理由からＰＯＣ環境において有用であろう：第１に、形態電話に基づく診断装置は、携帯電話が蛍光画像検出器として再利用されることを可能にし、かつ第２に、形態電話に基づく診断装置は、データが携帯電話によって診療所または病院などの遠隔地の健康管理専門家に対して伝達されることを可能にする。十分な専門知識がＰＯＣに存在する場合であれば、携帯電話は単純に診断装置によって生み出されたデータの画像を取得するため、およびデータが検体濃度に達するように処理し、それらが提供者によって解釈され得、診断に至るようにするために、使用することができる。しかしながら、検査が患者によって自己管理される例、または検査を執行する人が健康管理提供者でない例において、データは携帯電話を介して他の場所にいる医療提供者に送信することができ、それによって健康管理提供者は診断に至り、治療を処方することができる。これは、離れた場所にいる軍事職員にとって特に有用である。
これらの需要および他の需要は、本発明によって満たされる。本発明は、全血からのフェムトモラーまでの最小検出限界を有する蛍光免疫アッセイを実施することを可能にする、特有のタンパク質および細胞耐性ポリマーブラシを利用するチップを提供する。ポリマーブラシは、生体分子および細胞の非特異的吸着を排除することができる、安価な表面被覆を提供する。さらに、本開示のタンパク質安定化特性は、外気温におけるチップの輸送および貯蔵を可能にし、高価な気候制御貯蔵および輸送の必要性を回避する。サンプルの必要な容積が少ないことによって、本願に記載したアッセイの迅速な実行につながり、５分間以内で結果を出すことが可能となる。さらに、本明細書に記載の装置および方法は、母親の病歴が利用できない場合（たとえば、戦争、飢饉、および紛争の地域）にたびたび必要とされる、新生児のＩＤスクリーニングに著しく影響する可能性もあり、または既知のＩＤの母親から新生児への潜在的伝達を調べることができる。最後に、拡散に依拠して、２つの空間的に分離された試薬のセットをまとめることによってシグナルを生成することによって、本願に記載の装置および方法は、洗浄工程または液体移動工程の必要性を排除する。
〔概要〕
本概要において提供される本発明の実施形態は、説明のみを目的とし、かつ本明細書に開示される選択的実施形態の概観を提供することを目的とする。概要は例示的かつ選択的であり、いかなる請求項の範囲も限定するものではなく、本明細書において開示または熟慮された発明の実施形態の全範囲を提供するものではなく、本開示または請求項に記載した本発明の実施形態の範囲を、限定または束縛すると解釈されるべきではない。
本明細書においては、チップ内を通るチャネルと、チャネル内に包含される非汚染性ポリマー層とを含み、チャネルがチップ内に実質的に囲まれている（ｅｎｃｌｏｓｅｄ）チップが提供される。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは、第１の基板と、第１の基板に接続された第２の基板とを含むことができ、第１の基板と第２の基板との間に移動したチャネルを有している。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、チップは、第１の基板を第２の基板に接着するための手段をさらに備えることができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、第１の基板または第２の基板を、実質的にガラスで構成することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、第１の基板または第２の基板を、実質的にプラスチックで構成することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは、非汚染性ポリマー層に隣接して位置し、かつ共有結合的に結合した、連結ポリマー層をさらに含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、連結ポリマー層は、連結することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは実質的に透明にできる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは、チップ内に組み込まれた電子部品を含まない。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは、個別の、隔離されたウェルを含まない。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは、血漿抽出成分を含まない。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップはたった一つのチャネルを有することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは２以上のチャネルを有することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チャネルは直線状である。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは、チャネルのいずれかの端部からサンプルを導入できるように構成することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップはチャネルを通してサンプルを移動させる活性化のための手段を含まない。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップはチャネルを通してサンプルを移動させる活性化のための装置を含まない。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップはバーコード付きにできる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップはバーコードなしにできる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、非汚染性ポリマー層は、ボトルブラシポリマー（bottle brush polymer）を含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、ボトルブラシポリマーは、コスモトロープ頭部基（kosmotrope head group）を含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、ボトルブラシポリマーは、ヒドロキシ末端重合オリゴエチレングリコールメチルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ）のホモポリマー、またはメトキシ末端ＯＥＧＭＡとヒドロキシ末端ＯＥＧＭＡとのコポリマーを含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、非汚染性ポリマー層は約１０ｎｍから約１５０ｎｍの厚さにできる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、非汚染性ポリマー層は、非汚染性ポリマー層に直接、非共有結合した捕捉剤を含む、少なくとも１つの捕捉領域を含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、少なくとも１つの捕捉領域の位置を画定することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、捕捉剤は優先的に検体に結合することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、検体は、表面抗原、溶液媒介抗原、または結合した抗原であることができる、又は含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、検体は、ヒトＢ型血液型抗原、ヒトＡ型血液型抗原、ヒトＲｈ因子抗原、またはそれらの任意の組み合わせであることができる又は含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、捕捉剤は高分子であり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、捕捉剤は、抗体またはその断片であり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、捕捉剤は、ポリヌクレオチド抗原、ＲＮＡ抗原、ＤＮＡ抗原、タンパク質抗原、ペプチド抗原、炭水化物抗原、アプタマー抗原抗体抗原(an aptamer antigen an anitibodyantigen)、それらの断片、それらの任意の組み合わせであることができる、または含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは、非汚染性ポリマー層に直接的に、非共有結合した、ヒトＡ血液型抗原に結合する第１の捕捉剤と、ヒトＢ血液型抗原に結合する第２の捕捉剤と、およびヒトＲｈ因子抗原に結合する第３の捕捉剤とを含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、第１、第２、および第３の捕捉剤は、非汚染性ポリマー層の離れた、画定された位置を占めることができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、第１、第２、および第３の捕捉剤は、独立して、抗体、またはその断片であり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、第１、第２、および第３の捕捉剤の少なくとも一つは、独立して、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体、またはＩｇＧ抗体であり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは、非汚染性ポリマー層上に、さらに抗凝固剤を含み得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、非汚染性ポリマー層は、抗凝固剤を含み得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、抗凝固剤は、直接的に、非汚染性ポリマー層に非共有結合されることができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、抗凝固剤は、非汚染性ポリマー層の一つ以上の離れた、画定された位置を占めることができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、抗凝固剤は、ヘパリン、低分子量ヘパリン、またはそれらの組み合わせであり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは、約１００ｆｇ／ｍｌの検体の検出限界（ＬＯＤ）を有することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、非汚染性ポリマー層はさらに、検出剤を含む少なくとも一つの不安定領域を含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、少なくとも一つの不安定領域の位置を画定することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、検出剤は、間接的に、非汚染性ポリマー層に非共有結合することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、少なくとも１つの検出剤は、サンプルとの接触後に、サンプル中に少なくとも部分的に溶解または分散することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、サンプルは、少なくとも１つの検体を含む液体であり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、液体は、血液であり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、液体は、血漿、血清、尿、汗または唾液であり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、検出剤は高分子であり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、検出剤は、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、その断片、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、検出剤は標識され得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、検出剤は、標識された抗体、またはその断片であり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、検出剤は、フルオロフォア、発色団、放射性標識、ポリヌクレオチド、小分子、酵素、ナノ粒子、微粒子、または量子ドットで標識され得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、ナノ粒子は、貴金属ナノ粒子であり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、非汚染性ポリマー層は、賦形剤を含み得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、賦形剤は、水溶性塩、炭水化物、乳化剤、水溶性ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、炭水化物は、グルコース、フルクトース、キシロース、マンノース、トレハロース、ガラクトース、スクロース、またはラクトースであり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは、Ａ型血液型抗原に結合する第１の検出剤、Ｂ型血液型抗原に結合する第２の検出剤、およびＲｈ因子抗原に結合する第３の捕捉剤を含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、第１、第２、および第３の検出剤は、非汚染性ポリマー層の分離した、画定された位置を占めることができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チャネルは、チップ内の中央に位置することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チャネルは、約０．０１μＬから約５００μＬの容積を有することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、検出剤は、検体のチップへの侵入点に対して捕捉剤の下流に位置することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、捕捉剤および検出剤は、同じ検体に結合することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、非汚染性ポリマー層がバルク水ではなく水和水を含むようにして、チップが保管される場合、捕捉剤および／または検出剤は、約２５℃の温度において少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約５０％の結合活性を保持することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは円筒形状であり得る。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、毛細管作用は、チャネルを通してサンプルを引き出すことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップは、検出器内に収容され、かつ検出器によって完全に取り囲まれるように構成することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、非汚染性ポリマー層は、チャネルの長さに及んで延びることができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、チップはダムを含み得る。本明細書においては、検出器もまた提供される。本明細書においては、チップを含む検出器もまた提供される。本明細書においては、チップを作成する方法もまた提供される。本明細書においては、検体の存在または非存在を検出する方法もまた提供される。
いくつかの実施形態においては、本発明は、検体を検出するためのシステムを提供する。典型的には、システムは、チップ、検出器、および携帯電話を含み得る。本発明のシステムで使用するためのチップは、非汚染性ポリマー層を含む。チップはさらに、非汚染性ポリマー層上に配置された、捕捉剤および検出剤の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態においては、捕捉剤は、非汚染性ポリマー層に非共有結合的に付着している。システムの発明は、任意の検体を検出するために用い得る。好適な検体の例は、検体が、ヒトＡ型血液型抗原；ヒトＢ型血液型抗原；ヒトＡＢ血液型抗原；ヒトＯ型血液型抗原；ヒトＲｈ因子抗原；グリコホリン；生物脅威病原体；感染性病原体に由来する抗原；癌抗原；心臓血管疾患に関連する抗原；代謝性疾患に関連する抗原；上記の抗原の任意の組み合わせ；または上記の抗原のいずれかを認識する抗体であるか、またはそれらを含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態においては、検出剤は、フルオロフォア、およびフルオロフォアを励起する光の波長を放射する光源を含む検出器を含む。本発明のシステムは、本明細書に記載されている任意のチップを、本明細書に記載の任意の検出器と組み合わせて含むことができる。
本明細書においては、被験者における疾患または障害をスクリーニングする方法もまた提供される。本明細書においては、被験体における疾患、障害または生物学的状態を決定するための診断アッセイもまた提供される。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、アッセイは、ポイント‐オブ‐ケアッセイであり得る。本明細書においては、キットもまた提供される。
〔参照による組み込み〕
本明細書中の全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により組み込まれる。本明細書の用語と組み込まれた参照の用語との間に矛盾が生じた場合、本明細書の用語が支配する。本明細書中に参照により組み込まれる特許および特許出願は、少なくとも、ＵＳ７，７１３，６８９、ＵＳ８，３６７，３１４、ＵＳ２００６００５７１８０、ＵＳ２００９０２４７４２４、ＵＳ２０１３０１５７８８９、およびＵＳ２０１３０１４３７７１を含む。
〔詳細な説明〕
１つ以上の発明の実施形態の詳細を、添付の図面、特許請求の範囲、および本明細書の説明において明らかにする。本明細書中で開示および熟考される本発明の実施形態の他の特徴、目的、および利点は、明示的に除外されない限り、任意の他の実施形態と組み合わせることができる。
本明細書中で使用される場合、他に示されない限り、「含有する」、「含有している」、「含む」、「含んでいる」等のようなオープンタームは、「含む」を意味する。
本明細書中で使用される場合、他に示されない限り、本明細書のいくつかの実施形態は、数値範囲を熟慮する。数値範囲が指定されている場合、範囲には範囲の端点が含まれる。数値範囲には、明示的に書かれているかのように、すべての値および部分範囲が含まれる。
用語「約」は、参照数字表示のプラスまたはマイナス１０−１５％を意味することができる。
冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。
本明細書で使用される「および／または」という用語は、関連するフレーズ内に列挙された任意の単一の要素、ならびにすべての要素を含む２以上の要素の任意の組み合わせを含むと理解すべきである。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、検体は、ヒトＡ型血液型抗原、ヒトＢ型血液型抗原、ヒトＡＢ型血液型抗原、ヒトＯ型血液型抗原、ヒトＲｈ因子抗原、ヒトＭＮＳ血液型抗原、ヒトＰ型血液型抗原、ヒトＰ１ＰＫ血液型抗原、ヒトルテラン（Ｌｕｔｈｅｒａｎ）血液型抗原、ヒトケル（Ｋｅｌｌ）血液型抗原、ヒトルイス（Ｌｅｗｉｓ）血液型抗原、ヒトダフィー（Ｄｕｆｆｙ）血液型抗原、ヒトキド（Ｋｉｄｄ）血液型抗原、ヒトデエゴ（Ｄｉｅｇｏ）血液型抗原、ヒトＹｔまたはカートライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）血液型抗原、ヒトＸｇ血液型抗原、ヒトシャンナ（Ｓｃｉａｎｎａ）血液型抗原、ヒトドンブロック（Ｄｏｍｂｒｏｃｋ）血液型抗原、ヒトコルトン（Ｃｏｌｔｏｎ）血液型抗原、ヒトランドシュタイナー‐ウィーナー（Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ−Ｗｉｅｎｅｒ）血液型抗原、ヒトチド・ロジャース（Ｃｈｉｄｏ／Ｒｏｄｇｅｒｓ）血液型抗原、ヒトＨ血液型抗原、ヒトＨｈ／Ｂｏｍｂａｙ（ボンベイ）血液型抗原、ヒトＫｘ血液型抗原、ヒトガービッチ（Ｇｅｒｂｉｃｈ）血液型抗原、ヒトクロマー（Ｃｒｏｍｅｒ）血液型抗原、 ヒトノップス（Ｋｎｏｐｓ）血液型抗原、ヒトインディアン（Ｉｎｄｉａｎ）血液型抗原、ヒトＯｋ血液型抗原、ヒトラフ（Ｒａｐｈ）血液型抗原、ヒト ジョンミルトンハーゲン（Ｊｏｈｎ Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｇｅｎ）血液型抗原、ヒト Ｉ血液型抗原、ヒトリー（ｌｉ）血液型抗原、ヒトグロボシド（Ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ）血液型抗原、ヒトジル（Ｇｉｌｌ）血液型抗原、ヒトＲｈ関連糖タンパク質血液型抗原、ヒトフォルスマン（Ｆｏｒｓｓｍａｎ）血液型抗原、ヒトランゲライス（Ｌａｎｇｅｒｅｉｓ）血液型抗原、ヒトジュニア（Ｊｕｎｉｏｒ）血液型抗原であるか、またはそれらの任意の組み合わせであるか、またはそれらを含む。
本明細書で使用される場合、用語「サンプル」または「生物学的サンプル」は、任意の望ましい操作またはさらなる処理および／または修飾を容易にするために、天然または天然の状態から採取される任意の材料に関する。サンプルまたは生物学的サンプルは、細胞、組織、流体（たとえば、生物学的流体）、タンパク質（たとえば、抗体、酵素、可溶性タンパク質、不溶性タンパク質）、ポリヌクレオチド（たとえば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）、膜調製物、その他同類のものを含むことができ、これらは任意にその天然または天然の状態からさらに単離および／または精製することができる。「生物学的流体」は、生物に由来する任意の流体を指す。例示的な生物学的流体は、血液、血清、血漿、リンパ液、胆汁液、尿、唾液、粘液、痰、涙、脳脊髄液（ＣＳＦ）、気管支肺胞上皮洗浄、鼻咽頭洗浄、直腸洗浄、膣洗浄、結腸洗浄、鼻洗浄、咽喉洗浄、滑液、精液、腹水、膿、母乳、耳液、汗、および羊水を包含し得るが、それらに限定されない。生物学的流体は、その天然の状態、または、試薬などの成分の添加、または１以上の天然成分（たとえば、血漿）の除去によって、修飾された状態であり得る。サンプルまたは生物学的サンプルは、たとえば、血液、血漿、リンパ、ウイルス、細菌、ヒトサンプル、罹患したヒトサンプル、動物サンプル、罹患した動物サンプル、唾液、粘液、脳脊髄液、滑液、胃液、腸液、細胞質液、または他の種類のサンプルであり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「バイオマーカー」は、生物学的状態または生物学的プロセス、たとえば、疾患状態または疾患もしくは障害の診断的または予後的指標（たとえば、疾患または障害の存在または後の発症の可能性を同定する指標）と関連する物質を指す。バイオマーカーの存在または非存在、またはバイオマーカーの濃度の増加または減少は、特定の状態またはプロセスと関連、および／または、特定の状態またはプロセスを示し得る。バイオマーカーは、細胞、または細胞成分（たとえば、ウイルス細胞、細菌細胞、真菌細胞、癌細胞など）、小分子、脂質、炭水化物、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素、抗原、および抗体を包含し得るが、それらに限定されない。バイオマーカーは、細菌、真菌もしくはウイルスのような感染性病原体に由来し得るか、または疾患もしくは障害に罹患している被験体において、健康な個体と比較して、多かれ少なかれ豊富に存在する内在性分子であり得る（たとえば、遺伝子または遺伝子産物の発現の増加または減少）。
本明細書中で使用される場合、用語「検出部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、電気化学的、放射能的、および他の物理的手段を含むがそれらに限定されない方法によって検出可能な、任意の部分または化合物である。検出部分は、間接的に検出可能であり得る；たとえば、検出部分は、特異的結合対のメンバーである部分または化合物であり得、結合対の第２のメンバーは、直接検出され得る検出部分を包含し得る。そのような検出部分の非限定的かつ知られた例は、フルオロフォアなどの検出部分を含むアビジンまたはストレプトアビジンに結合することができる、ビオチンである。例示的な検出部分は、フルオロフォア、発色団、放射性標識、ポリヌクレオチド、小分子、酵素、ナノ粒子、およびアップコンバーターを包含し得るが、それらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、「感染症」（本明細書ではＩＤと略記する）という用語は、たとえば、ウイルス、細菌、古細菌、プラナリア、アメーバおよび真菌などの微生物を含むがそれらに限定されない感染性病原体によって引き起こされる疾患を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ポリマー」は、当技術分野で使用されるその通常の意味、すなわち、共有結合によって接続された１つ以上の繰り返し単位（モノマー）を特徴とする分子構造を指す。繰り返し単位は全て同一であり得、または場合によっては、ポリマー内に繰り返し単位が２種類以上存在し得る。ポリマーという用語は、ホモポリマー、コポリマー（たとえば、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、グラフトコポリマーなど）、およびそれらのブレンド、組み合わせおよび混合物を含む、任意の種類のポリマーを包含することが意図される。ポリマーは、直鎖状、分枝状、星型などであり得る。
本明細書で使用する「領域」という用語は、材料の表面上の画定された領域を指す。領域は、異なる組成を有する２つの材料の間の明確な境界面によって識別され、かつ境界を定めることができる。
本明細書で使用される「特異的結合対」は、互いに特異的な結合を示すか、または他の分子と比べて互いに結合が増加した、２つの分子を指す。特異的結合対は、たとえば、受容体およびリガンド（薬剤、タンパク質、または炭水化物など）、抗体および抗原、などの機能的結合活性；またはたとえば、タンパク質／ペプチドおよびタンパク質／ペプチド；タンパク質／ペプチドおよび核酸；ならびにヌクレオチドおよびヌクレオチドなどの構造的結合活性を示すことができる。典型的には、結合対の１つのメンバーは、本明細書に記載の装置において捕捉剤として働くことができ、かつ捕捉剤は、生物学的流体などのサンプル内に検体として存在し得る、結合対の第２のメンバーに結合することができる。本明細書で用いられる場合、「検体」は、上記のような特異的結合対の任意の第２のメンバーであり得る。典型的には、検体は、生物学的流体などのサンプルの成分であるか、またはそれらの中から見つかる。検体は、上記のバイオマーカーであり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」および「患者」は互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。「非ヒト動物」という用語は、たとえば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類およびその他の同類のものを包含するがそれらに限定されない、哺乳類および非哺乳類のすべての脊椎動物を包含することができる。特定の実施形態では、被験体はヒト患者である。
本明細書で用いられる場合、ｔＲＮＡはトランスファーＲＮＡを意味する。
本明細書で用いられる場合、ｒＲＮＡはリボソームＲＮＡを意味する。
本明細書で用いられる場合、ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを意味する。
本明細書で用いられる場合、ｓｉＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡを意味する。
本明細書で用いられる場合、ｍｉＲＮＡはマイクロＲＮＡを意味する。
本明細書で用いられる場合、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む一本鎖ポリヌクレオチドである。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、たとえばポリヌクレオチドプローブにアニールすることができる。
本明細書で用いられる場合、選択的プローブは、２以上の標的ＲＮＡに結合し得るが、複数の標的ＲＮＡに等しくは結合しない。
本明細書で用いられる場合、特異的ポリヌクレオチドプローブは、一つの標的ＲＮＡにのみ結合する。
本明細書に開示されるのは、標的ＲＮＡを検出する方法であって：
ａ）標的ＲＮＡをポリヌクレオチドプローブにアニーリングさせる工程と；
ｂ）アニールされた標的ＲＮＡを少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸で伸長してＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成する工程と；
ｃ）ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸で伸長して、伸長したＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成する工程と；および
ｄ）伸長したＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの存在を検出することによって、標的ＲＮＡの存在を検出する工程とを含む。
この方法は、固体支持体であり得る支持体上で行うことができる。この方法は、ポリヌクレオチドプローブと結合した固体支持体の層または部分上で行うことができる。
この方法は、疾患または状態に関連する標的ＲＮＡの存在が検出されたときに、疾患または状態を診断するために使用することができる。これらに限定しないが、疾患または状態は、たとえば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ−１６）、ヒトパピローマウイルス−１８（ＨＰＶ−１８）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＶＡ）、サイトメガロウイルス、結核、クラミジア、淋菌、梅毒、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、流行性耳下腺炎、麻しん、コレラ、腸チフス（typhoid fever）、リウマチ熱、癌、脳卒中、虚血性疾患、心臓血管疾患、ライム病、狂犬病、インフルエンザ、エボラ、妊娠、真菌感染症、細菌感染症、ポリオ、天然痘、糖尿病、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ウイルス感染、自己免疫疾患、神経変性疾患、およびそれらの任意の組み合わせであり得る。
標的ＲＮＡの量は定量することができる。
この方法は、アレイまたはマイクロアレイ上で行うことができる。
この方法は、アレイまたはマイクロアレイを含むことができる医療機器上で行うことができる。
複数の標的ＲＮＡを同時に検出することができる。対照は、アレイまたはマイクロアレイに包含させることができる。複数の標的ＲＮＡを検出する場合、２つ以上のポリヌクレオチドプローブが異なり得る。固体支持体または医療機器またはアレイまたはマイクロアレイは、たとえば、約５、約１０、約５０、約１００、約５００、約１０００、約５０００、約１０，０００、約２０，０００、約５０，０００、または約１から約１００，０００、または少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００のポリヌクレオチドプローブを含むことができる。ポリヌクレオチドプローブは、たとえば、ポリヌクレオチドプローブがアレイまたはマイクロアレイ上の画定された位置を占めるように、マイクロアレイ上に印刷することができる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、支持体、固体支持体および医療機器は、基層および非汚染性層（たとえば、ボトルブラシポリマーを含む）を含むことができ、ポリヌクレオチドプローブは、非汚染性層に結びついている。ポリヌクレオチドプローブは、共有結合的にまたは非共有結合的に結びつくことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、非汚染性層はアンカーと非共有結合的または共有結合的に結びつくことができ、アンカーは、ポリヌクレオチドプローブと共有結合で結合したテザーと、共有結合または非共有結合している。スペーサーは、テザーとポリヌクレオチドプローブとの間に挿入され得る。スペーサーは、たとえば、アミノ酸である。アミノ酸は、たとえば、テザーおよびポリヌクレオチドプローブの両方に、共有結合的に結合することができる。このようにして、スペーサーの存在の有無にかかわらず、ポリヌクレオチドプローブは、非汚染性ポリマー層に固着することができるが、ポリヌクレオチドプローブは非汚染層と、共有結合的に結びついておらず、かつ間接的に非共有結合的にも結びついていない。そのような結びつきは、たとえば、間接的、非共有結合的な結びつきであり得る。
検体の検出結果は、データとして獲得することができ、たとえば、画像を獲得することができ、かつデータを、たとえば電話回線、インターネット、イントラネット、ファックス、テキスト、電子メール、または手紙などの、通信媒体を介して送信することができる。
たとえばデータは、たとえばスマートフォンなどの携帯電話に組み込むことができるデジタルカメラなどを用いて獲得することができる、デジタル画像とすることができる。
本発明者らは、驚くべきことに、ポリヌクレオチドプローブにアニールされた標的ＲＮＡを酵素的に伸長させることができ（たとえば、ＤＮＡ塩基（デオキシリボヌクレオチド）を付加することができる）、および得られたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを検出できることを見出した。検出は、たとえば、ＲＮＡをＤＮＡへと逆転写することなしに、ＤＮＡの増幅なしに、およびＤＮＡまたは標的ＲＮＡの配列決定をせずに、起こすことができる。
デオキシリボヌクレオチドは、たとえば、標的ＲＮＡの突出した（たとえば、アニールされていない）３’末端に付加することができ、標的ＲＮＡの一部をポリヌクレオチドプローブにアニールすることができる。
標的ＲＮＡは、生物学的サンプルに由来し得るか、または取得され得る。生物学的サンプルは、溶解することができる。
標的ＲＮＡは、合成であってもよく、および天然に見出される配列であっても、または天然には見出されない配列であってもよく、またはそれらの断片であってもよい。
標識は、蛍光色素であり得る。蛍光色素は、高分解能でリアルタイムに液滴で検出することができ、および別個の励起波長および発光波長を有する多くの蛍光色素が利用可能であるので、１回の実験で多数の標識を監視することが可能になる。蛍光染料のセットは、同じ反応において２つ以上の染料を同時に検出できるように選択することができる。同時に検出できる蛍光染料のセットは、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ｄＲ１１０、ｄＲ６Ｇ、ｄＴＡＭＲＡ、ｄＲＯＸ、またはこれらの任意の混合物を包含することができるが、それらに限定されない。それらの染料は、本明細書の実施形態を実施するために、個々にまたは任意の組み合わせで使用することができる。染料は、一分子の検出を可能とすることができる。多数の蛍光染料が合成されており、かつ様々な形式で市販されている。これは、ジアルデヒド基との反応においてＲＮＡへのカップリングを可能にするリンカー領域およびヒドラジン基を有する蛍光色素を包含することができる。このような化合物の例は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのカタログを参照されたい。本開示は、特定の蛍光色素の使用に限定されないが、異なる色素を同じ効果に適用することができる。リンカー領域は、炭素骨格からなり得、硫黄原子、ケトン基、またはジエチレングリコール基、またはドデカエチレングリコール基を含むことができる。リンカーの長さは、骨格が１〜２０原子の直鎖分子である場合に変化し得る。リンカーは、たとえば、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００３／０４８３８７号に開示されているように、化学反応における標識の選択的除去を可能にする原子群を含むことができる。
標識の非限定的な例は、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセインとも呼ばれる；またスピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン）−５−カルボン酸,３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−６−カルボキシフルオレセイン）とも呼ばれる；５−ヘキサクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイル−フルオレセイニル）−６−カルボン酸）］；６−ヘキサクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；５−テトラクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，７’−テトラ−クロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；６−テトラクロロ−フルオレセイン；（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）；キサンチリウム、９−（２，４−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチル−アミノ）；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）；９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）；ＥＤＡＮＳ（５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；ＩＡＥＤＡＮＳ（５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；Ｃｙ５（インドジカルボシアニン−５）；Ｃｙ３（インド−ジカルボシアニン−３）；およびＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（２，６−ジブロモ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ｐｒ−プロピオン酸）；Ｑｕａｓａｒ（登録商標）−６７０染料（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＣａｌＦｌｕｏｒ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｒｏｘダイ；Ｍａｘダイ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、４，７，２’−トリクロロ−７’−フェニル−６−カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、テトラメチルローダミン、ＲＯＸ、 およびＪＯＥならびにその好適な誘導体を含むが、それらに限定されない。標識は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、 ５９４、６３３、６４７、６６０、６８０、７００、および７５０などのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ染料であり得る。標識は、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ、 Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８−Ｘ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄｏｌ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ−Ｘ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−ＸおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ−Ｘであり得る。標識は、プローブの５’末端、プローブの３’末端、およびプローブの５’末端および３’末端の両方、またはプローブの内部であり得る。たとえばｍＲＮＡなどの標的ポリヌクレオチドの２つの末端といった、異なるそれぞれの位置を実験において検出するために、特有の標識を用いることができる。
標識化に用いることができる染料‐ヒドラジドの非限定的な例は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）−ヒドラジドおよびその塩、１−ピレンブタン酸−ヒドラジド、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸−ヒドラジド（ＤＣＣＨ）Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）ヒドラジドおよびその塩、ビオシチン−ヒドラジド、２−アセトアミド−４−メルカプトブタン酸−ヒドラジド（ＡＭＢＨ）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−ヒドラジド、ビオチン−ヒドラジド、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）−ヒドラジド、ビオシチン−ヒドラジド、ルミノール（３−アミノフタルヒドラジド）、およびＭａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（登録商標）ヒドラジドを包含し得る。標識化に用いることのできる染料‐エチレンジアミンの非限定的な例は、５−ジメチルアミノナフタレン−１−（Ｎ−（２−アミノエチル））スルホンアミド（ダンシルエチレンジアミン）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）エチレンジアミンおよびその塩、Ｎ−（２−アミノエチル）−４−アミノ−３，６−ジスルホ−１，８−ナフタルイミド（ルシファーイエローエチレンジアミン）およびその塩、Ｎ−（ビオチノイル）−Ｎ’−（ヨードアセチル）エチレンジアミン、Ｎ−（２−アミノエチル）ビオチンアミド、ハイドロブロマイド（ビオチンエチレンジアミン）、４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアサ−ｓ−インダセン−３−プロピオニルエチレンジアミンおよびその塩（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ ＥＤＡ）、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）ローダミンＢエチレンジアミン、およびＤＳＢ−Ｘ（商標）ビオチンエチレンジアミン（デスチオビオチン−Ｘ エチレンジアミン、塩酸塩）を包含し得る。
標識化に用いることのできる染料‐カダベリンの非限定的な例は、５−ジメチルアミノナフタレン−１−（Ｎ−（５−アミノペンチル））スルホンアミド（ダンシルカダベリン）、５−（アンド−６）−（（Ｎ−（５アミノペンチル）アミノ）カルボニル）テトラメチルローダミン（テトラメチルローダミンカダベリン）、Ｎ−（５−アミノペンチル）−４−アミノ−３，６−ジスルホ−１，８−ナフタルイミドおよびその塩（ルシファーイエローカダベリン）、Ｎ−（５−アミノペンチル）ビオチンアミドおよびその塩（ビオチンカダベリン）、ビオチン−Ｘカダベリン（５−（（（Ｎ−（ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ペンチルアミンおよびその塩、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）カダベリン（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）Ｃ５）、５−（（（４−（４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ｙｌ）フェノキシ）アセチル）アミノ）ペンチルアミンおよびその塩（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ カダベリン）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）カダベリン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）カダベリン、および５−（（５−アミノペンチル）チオウレジル）フルオレセインおよびその塩（フルオレセインカダベリン）を包含し得る。
本明細書において、マイクロアレイ形式におけるＲＮＡ検出のための表面開始酵素重合（ＳＩＥＰ）の使用も開示する。この方法は、たとえば酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰａＰ）によって触媒される、標的ＲＮＡ分子の３’−ＯＨにデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）を組み込むための、連続的かつ相補的な反応と、その後に続く、たとえば末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によって触媒される、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド（たとえば、伸長したＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）の３’−ＯＨにおける天然デオキシヌクレオチドおよび蛍光デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の混合物の連続的な添加とを用いて、多数のフルオロフォアをＲＮＡ鎖に組み込むことができる。酵母ＰａＰを用いたｄＡＴＰの重合により、ＲＮＡの３’末端を効率的にＤＮＡに変換することができ（約５０％の変換）、かつＰａＰによりＲＮＡの末端に付加された短いＤＮＡ鎖は、１ＫｂのＤＮＡあたり約４５個のＣｙ３フルオロフォアを含む、天然および蛍光ｄＮＴＰの混合物から、ＴｄＴにより触媒される、より長いＤＮＡ鎖の重合の開始剤として作用する。短い２１塩基長のＲＮＡ標的と固定化されたペプチド核酸プローブとのハイブリダイゼーションにおいて、約２ｐＭの検出限界（ＬＯＤ）および３ｌｏｇの線形ダイナミックレンジが得られたが、４つの異なる完全長ｍＲＮＡ転写産物からのｍＲＮＡ断片は、マイクロアレイ形式で同様のダイナミックレンジにおいて、約１０ｐＭのＬＯＤを生じた。
ジオキシリボヌクレオチド三リン酸は、たとえば、アデニン、チミン、グアニン、またはシトシンであり得る窒素塩を含む。
また、本明細書に開示されるのは、表面を有する基板；表面上の非汚染性ポリマー層；少なくとも一つの捕捉剤を含む、ポリマー層上の少なくとも一つの捕捉領域；および少なくとも一つの検出剤および賦形剤を含む、ポリマー層上の少なくとも一つの不安定領域を含む装置であり；捕捉領域および不安定領域は、空間的に分離されている。本開示は、また方法、アッセイ、および装置を含むキットを提供する。非汚染性ポリマー層は、サンプル成分と、基板および／またはポリマー層との間の非特異的結合の減少をもたらし得る。ポリマー層上の不安定領域は、たとえば、単に装置の表面にサンプルを接触させる工程、およびその後、捕捉領域からのシグナルを検出する工程などの、典型的なアッセイに含まれる必要な工程を減らすことによって、高感度の検出限界をもたらしながら、単純化された方法およびアッセイを可能とする。装置および関連する方法は、研究および臨床検査室ならびに大規模なポイント‐オブ‐ケア アッセイを包含する、多くの環境に高度に適応可能である。
基板
本開示にしたがって、さまざまな異なる型の基板を用いることができる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、基板は、ポリマー層の適用を可能にする表面を含むことができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、基板は、標識されていない光学的または質量の検出器（たとえば、表面プラズモン共鳴エネルギー検出器、光導波路、エリプソメトリ検出器など）であり得、かつ基板の表面は、検出表面（たとえば、生物学的流体と接触しているだろう表面部分）である。そのような装置の例は、米国特許番号６，５７９，７２１；６，５７３，１０７；６，５７０，６５７；６，４２３，０５５；５，９９１，０４８；５，８２２，０７３；５，８１５，２７８；５，６２５，４５５；５，４８５，２７７；５，４１５，８４２；４，８４４，６１３；および４，８２２，１３５に記載されたものを包含するが、それらに限定されない。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、基板は、バイオセンサ、アッセイプレートその他同類のものであり得る。たとえば、基板は、米国特許第５，３１３，２６４号明細書、米国特許第５，８４６，８４２号明細書、米国特許第５，４９６，７０１号明細書などに記載されたものなどの、光学的バイオセンサであり得る。基板は、米国特許第５，４１３，６９０号明細書または国際公開ＷＯ９８／３５２３２号に記載されているような、電位差測定バイオセンサ、または電気化学的バイオセンサであり得る。基板は、米国特許第５，７７７，３７２号明細書に記載されているような、ダイアモンドフィルムバイオセンサであり得る。したがって、基板は、有機または無機でありえる；金属（たとえば、銅または銀）または非金属であり得；ポリマーまたは非ポリマーであり得；導電性、非導電性、または非導電性（絶縁性）であり得；反射性または非反射性であり得；多孔質または非多孔質であり得る；など。たとえば、基板は、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、金、シリコン、酸化ケイ素、酸窒化シリコン、インジウム、酸化タンタル、酸化ニオブ、チタン、酸化チタン、白金、イリジウム、インジウム錫酸化物、ダイヤモンドまたはダイヤモンド様フィルムなどを含むことができる。
基材は、「チップベース」および「ピンベース」のコンビナトリアル化学技術に適した基材であり得る。すべて、公知の技術にしたがって用意することができる。たとえば、米国特許第５，４４５，９３４号明細書、米国特許第５，２８８，５１４号明細書および米国特許第５，６２４，７１１号明細書を参照されたい。
上記の基板は、金属、金属酸化物、合金、半導体、ポリマー（織布、不織布、成形、押出、鋳造などの任意の好適な形態の有機ポリマーなど）、シリコン、酸化ケイ素、セラミック、ガラス、およびそれらの複合物からなる群から選ばれる材料を包含するがそれらに限定されない任意の好適な材料により、形成することができる。
本明細書に記載の基板を形成するために用いられるポリマーは、任意の好適なポリマーであり、以下を含むが、それらに限定されない：ポリ（エチレン）（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリ（ブタジエン）（ＰＢ）のシスおよびトランス異性体、ポリイソプレンのシスおよびトランス異性体、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＥＣＬまたはＰＣＬ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）およびその同族体、ポリ（メチルアクリレート）およびその同族体、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）、ポリオルトエステル、ポリ（無水物）、ナイロン、ポリイミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリブタジエン（ＰＢ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリルアミドおよびたとえばポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）などのその同族体、フッ素化ポリアクリレート（ＰＦＯＡ）、ポリ（エチレン−ブチレン）（ＰＥＢ）、ポリスチレン−アクリロニトリル）（ＳＡＮ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）およびその誘導体、ポリオレフィンプラストマー、ならびにそれらの組み合わせおよびこれらのコポリマーなど。
基板は、たとえば、以下でさらに説明するように、たとえば、ポリマー層または連結層の堆積を容易にするために、基板の表面に形成された金または酸化物層などの追加の層を任意に有することができる。
チップ
本発明において使用するための基板は、チップの形態であり得る。典型的には、本発明のチップは、少なくとも部分的にチップの内部に延びるチャネルを画定する。チャネルは、１つ以上のチャネル表面上に配置された１つ以上の非汚染性ポリマー層を有し得る。チャネルは、一方または両方の端部が開いていてもよく、かつチップを貫通して延びるチューブを形成するように全体的に覆われていてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のチップは、チャネルにサンプル（たとえば、血液などの生物学的流体）を引き込むために毛細管作用に依存することができる。したがって、チャネルは、毛細管作用を支える寸法を有することができる。他の実施形態において、本発明のチップは、オープンウェルを画定し得る。一実施形態において、チップは毛細管作用を介して指採血から血液を受け入れるためのチャネルを有するように設計されている。そのような実施形態において、チャネルは数マイクロリットルの容積、たとえば、約０．５マイクロリットルから約１００マイクロリットル、約０．５マイクロリットルから約７５マイクロリットル、約０．５マイクロリットルから約５０マイクロリットル、約０．５マイクロリットルから約２５マイクロリットル、約０．５マイクロリットルから約１０マイクロリットル、約０．５マイクロリットルから約５マイクロリットル、約１マイクロリットルから約１００ マイクロリットル、約１マイクロリットルから約７５マイクロリットル、約１マイクロリットルから約５０マイクロリットル、約１マイクロリットルから約２５マイクロリットル、約１マイクロリットルから約１０マイクロリットル、約１マイクロリットルから約５マイクロリットル、約２．５マイクロリットルから約１００マイクロリットル、約２．５マイクロリットルから約７５マイクロリットル、約２．５マイクロリットルから約５０マイクロリットル、約２．５マイクロリットル約２５マイクロリットル、約２．５マイクロリットルから約１０マイクロリットル、または約２．５マイクロリットルから約５マイクロリットルを有するように設計し得る。一実施形態では、本発明のチップは、幅約４ｍｍ、長さ約９ｍｍ、高さ約０．１ｍｍの寸法（３．６マイクロリットル）を有するチャネルを画定することができる。典型的には、チャネルの１つ以上の表面は、１つ以上のマイクロスポットまたはナノスポットを含む。スポットは、本発明のアッセイの実施において使用される１つ以上の試薬を含み得る。一実施形態では、直径約１００ミクロンのスポットを使用することができる。
一実施形態では、本発明のチップは、上に列挙した寸法を有するチャネルを画定する。チャネルの底面には、直径１００ミクロンのスポットが配置されている。スポットの中心から中心への間隔は、２００ミクロンであり得る。この種類の実施形態において、４ｍｍｘ９ｍｍチャネルは、１００ミクロンの直径のスポットを、概略で９００個有することができる。チャネルの寸法、スポットサイズ、および／またはスポット間隔は、所望の数のスポットを収容するように調整することができる。スポットの適切な数は、約１００から約１００００スポット、約１００から約７５００スポット、約１００から約５０００スポット、約１００から約２５００スポット、約１００から約１０００スポット、５００から約１００００スポット、約５００から約７５００スポット、約５００から約５０００スポット、約５００から約２５００スポット、または約５００から約１０００スポットであり得る。再現性のためにまったく同じスポットが一般的に望ましいが、各スポットは異なる材料であってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のチップは、一つ以上のダムを含み得る。１つ以上のスポットを１つ以上の他のスポットから分離するために、ダムを設けてもよい。ダムは、水溶性であってもよく、および当業者に知られている任意の材料から作られる。ダムは、捕捉剤と検出剤との間のチップ上に配置されてもよい。ダムは、水溶性塩、水溶性糖、水溶性ポリマー、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ダムを構成する材料の好適な例は、リン酸塩、クエン酸塩、トレハロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、またはそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。
ダムは、チップのチャンネル上の任意の位置に配置することができる。たとえば、チャネルの流体の入口、チャネル内の点、またはチャネルの流体の入口と反対側のチャネルの端部に、ダムを配置することができる。ダムは、チャネルの幅の全部または一部にわたって配置されてもよい。いくつかの実施形態では、複数のスポットを含み、かつチャネルの幅にわたってダムも含むチャネルを、チップ上に画定することができる。
本発明のチップは、両面テープで分離された２つのガラスカバースリップを使用して作製され得、チップ間に空間を形成し、それによりチャネルが画定される。光学検出法、たとえば蛍光検出を用いる本発明のアッセイにおいて、プラスチックを含む任意の光学的に透明な材料を、基板として使用することができる。
結合層
基板およびポリマーの選択に依存して、基板およびポリマー層の間に、任意に結合層を含めることができる。たとえば、結合層は、開始剤（たとえば、直接的にカップリング、または中間連結基を介してカップリングされている）にカップリング（たとえば、共有結合的にカップル）されたアンカー基を含む化合物から形成することができる。アンカー基の選択は、その上で結合層が形成される基板に依存し得、かつ開始剤の選択は、下記でより詳細に説明するように、非汚染性ポリマーを形成するために用いられる特定の反応に依存し得る。
アンカリング基は、共有結合的、または非共有結合的に、化合物または結合層を、基板の表面にカップルすることができる。非共有結合的カップリングは、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、イオン結合、金属−リガンド相互作用などを含むが、それらに限定されない、任意の好適な二次的相互作用によることができる。
基板材料および対応するアンカリング基の例は、たとえば、金、銀、銅、カドミウム、亜鉛、パラジウム、白金、水銀、鉛、鉄、クロム、マンガン、タングステン、およびそれらのチオール、スルフィド、ジスルフィド（たとえば、ＲがＨである−ＳＲまたは−ＳＳＲ、低級アルキルなどのアルキル、またはアリール）などの硫黄含有官能基との任意の合金およびその他同類のもの；シランおよびクロロシラン（たとえば、ＲがＨである−ＳｉＲ２Ｃｌ、低級アルキルなどのアルキル、またはアリール）でドープされたまたはドープされていないシリコン；アンカリング基としてカルボン酸を有する、シリカ、アルミナ、石英、ガラスおよびその他同類のものの金属酸化物など；亜硝酸塩およびイソニトリルを有する白金およびパラジウム；およびヒドロキサム酸を含む銅を含むことができる。アンカリング基として追加の好適な官能基は、ベンゾフェノン、酸塩化物、無水物、エポキシド、スルホニル基、ホスホリル基、ヒドロキシル基、ホスホネート、ホスホン酸、アミノ酸基、アミドおよびその他同類のものを含み得る。米国特許第６，４１３，５８７号明細書を参照されたい。
任意の開始剤が、開始剤の活性にとって重要でない位置に共有結合を導入することによって、アンカリング基に組み込まれ得る。そのような開始剤の例は、ブロムイソ酪酸塩、ポリメチルメタクリレート−Ｃ１、ポリスチレン−Ｃ１、ＡＩＢＮ、２−ブロモイソ酪酸塩、クロロベンゼン、ヘキサブロモメチルベンゼン、ヘキサクロロメチルベンゼン、ジブロモキシレン、メチルブロモプロピオネートを包含し得るが、それらに限定されない。開始剤の追加の例は、米国特許番号６，４１３，５８７（たとえばそのカラム１０〜１１）に記載されている開始剤、および米国特許第６，５４１，５８０号明細書に記載されている開始剤を包含し得る。
上記のように、アンカリング基と開始剤との間に、連結基または「スペーサー」を挿入することができる。リンカーは、極性、非極性、正帯電、負帯電、または非帯電であり得、およびたとえば、飽和または不飽和、直鎖または分枝アルキレン、ヘテロアルキレン、アラルキレン、アルカリーレン、または他のヒドロカルビレン、たとえばハロゲン化ヒドロカルビレン、特にフッ素化ヒドロカルビレンであり得る。好適なリンカーは、３から２０の炭素原子の飽和アルキレン基、すなわち-（ＣＨ２）ｎ-であり得、ここで、ｎは３から２０をすべて包含した整数である。米国特許番号６，４１３，５８７を参照されたい。リンカーの他の好適な実施形態は、３から２０ユニットのオリゴエチレングリコール、すなわち、-（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ-であり、ここで、ｎは３から２０をすべて含んだ整数である。
アンカリング層は、任意の好適な技術によって堆積（ｄｅｐｏｓｉｔ）できる。アンカリング層は、自己組織化単分子層として堆積することができる。アンカリング層は、化学反応による基板の修飾によって（たとえば米国特許番号６，４４４，２５４を参照されたい）、または反応性プラズマエッチングまたはコロナ放電処理によって作り出すことができる。アンカリング層は、プラズマ堆積処理によって堆積することができる。アンカリング層は、スピンコーティングまたはディップコーティングによって堆積することができる。アンカリング層は、スプレー塗装によって堆積することができる。アンカリング層は、成膜、印刷、スタンピングなどによって堆積することができる。アンカリング層は、連続的な層として、または非連続的な（たとえば、パターン化された）層として、堆積することができる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、基板は、ガラス、シリコン酸化物または他の無機または半導体材料（たとえば、シリコン酸化物、シリコン窒化物）、またはマイクロアレイの製造に一般に使用される化合物半導体（たとえば、ヒ化ガリウム、およびヒ化インジウムガリウム）である。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、基板はマイクロタイター（マイクロウェル）プレートであり得る。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、アンカリング基は、シランまたはクロロシラン（たとえば、ＲがＨである−ＳｉＲ２Ｃｌ、低級アルキルのようなアルキル、またはアリール）であり得る。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、結合層は、２つの分離した工程により、基板上に形成される。たとえば、第１の工程において、アルキルシランまたはアルカンチオールのアンカリング層は、二酸化ケイ素またはガラスまたは金などの表面上に堆積され得、かつ末端反応性官能基（たとえば、アミン）を提示する。その後、第１の連結層によって提示される末端基に対して反応性のある第１の官能基を含む二官能性分子は、第１の工程において堆積された第１の連結層と反応することができる。二官能性分子の第２の官能基は、ポリマー層の重合のための開始剤として作用する部分基、たとえばＡＴＲＰ開始剤を含む。
ポリマー層
本明細書に記載した装置のポリマー層は、非汚染性の性質を呈する。ポリマー層に関して本明細書で使用される非汚染性は、生物の増殖、および、ポリマーと、生物または生体分子（たとえば、細胞、タンパク質、ヌクレオチドなど）との間の非特異的または不定の結合相互作用の阻害（たとえば、低減または予防）に関連する。ポリマーの非汚染性の性質は、たとえば、非汚染（または代替的に、防汚）剤の組み込み、またはポリマー自体の構造／構造によるものなど、任意の好適な方法によって導入することができる。非汚染剤は、当該技術分野において公知であり、かつ装置の特定の用途に応じて、または非汚染剤の利用可能性に応じて、当業者によって選択され得る。非限定的な例は、殺生物活性を有する有機および無機化合物、ならびに、ポリマー層に組み込まれ得るかまたは結合され得、生体分子（たとえば、細胞、タンパク質、ヌクレオチド、炭水化物／脂質など）とポリマーとが接触したときの非特異的結合相互作用を低減または阻害する化合物を包含し得る。
いくつかの実施形態において、非汚染性を提供する構造（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）または構成（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を有するポリマー層を提供する。本明細書に記載されている実施形態のいくつかでは、ポリマーは、一般に、そこにカップルされた生体分子（たとえば、細胞、タンパク質、ヌクレオチド、炭水化物／脂質）の結合を阻害するように機能する１つ以上の基を有するモノマーコア基の重合によって形成される、ブラシポリマーを好適に含む。好適には、モノマーコア基は、タンパク質耐性頭部基(Protein-resistant head group)にカップルされ得る。
ポリマー層は、触媒連鎖移動重合、イニファーター媒介重合（たとえば、光イニファーター媒介重合）、フリーラジカル重合、安定フリーラジカル媒介重合（ＳＦＲＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、および可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合などのラジカル重合技術を用いて好適に形成され得る。
たとえば、ブラシポリマーを形成するためのモノマーのフリーラジカル重合は、米国特許第６，４２３，４６５号明細書、米国特許第６，４１３，５８７号明細書および米国特許第６，６４９，１３８号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１０８８７９号明細書に記載の公知の技術、および当業者にとって明白なそれらの変形などにしたがって実行することができる。
ブラシポリマーを形成するためのモノマーの原子移動ラジカル重合は、米国特許第６，５４１，５８０号明細書および米国特許第６，５１２，０６０号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１８５７４１号明細書に記載の公知の技術、および当業者にとって明白なそれらの変形などにしたがって実行することもできる。
スチレン、アクリロニトリル、アセテート、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルアルコール、ビニル酸、およびそれらの組合せを含むが、それらに限定されない、上記のプロセスによって重合可能な任意の好適なコアビニルモノマーとして使用することができる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ポリ（ＯＥＧＭＡ）（ＰＯＥＧＭＡ）膜を形成するために、オリゴ（エチレングリコール）メチルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ）の表面開始ＡＴＲＰ（ＳＩ−ＡＴＲＰ）によって、ポリマー層を形成することができる。一実施形態において、ポリマー層は、メタクリレートとメトキシ末端化ＯＥＧＭＡとの共重合によって調製された官能化ＰＯＥＧＭＡフィルムである。好適には、ＰＯＥＧＭＡポリマーは、単一の工程で形成され得る。
一般に、本明細書に記載の処理（または当技術分野で知られているか、または当業者にとって明らかである他の処理）によって形成されたブラシ分子は、２または５から１００または２００ナノメートルまでの長さ、またはそれ以上であり得、メートル当たり、１０，２０または４０から１００、２００または５００ミリグラムまで、またはそれ以上の密度で表面部分に堆積することができる。
タンパク質耐性基は、親水性頭部基またはコスモトロープであり得る。例は、オリゴ糖、トリ（プロピルスルホキシド）、ヒドロキシル、グリセロール、ホスホリルコリン、トリ（サルコシン）（Ｓａｒｃ）、Ｎ−アセチルピペラジン、ベタイン、カルボキシベタイン、スルホベタイン、ペルメチル化ソルビトール、ヘキサメチルホスホラミド、分子内両性イオン（たとえば、−ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３ −）（ＺＷ）、およびマンニトールを包含し得るが、それらに限定されない。
コスモトロープタンパク質抵抗性頭部基のさらなる例としては、以下を包含し得るが、それらに限定されない：
-（ＯＣＨ２ＣＨ２）６ＯＨ；
-Ｏ（マンニトール）；
-Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２（ＣＨ（ＯＣＨ３））４ＣＨ２ＯＣＨ３；
-Ｎ（ＣＨ３）３ ＋Ｃｌ-／-ＳＯ３ -Ｎａ＋（１：１）；
-Ｎ（ＣＨ３）２ ＋ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３ -；
-Ｃ（Ｏ）Ｐｉｐ（ＮＡｃ）（Ｐｉｐ＝ピペラジニル）
-Ｎ（ＣＨ３）２ ＋ＣＨ２ＣＯ２ -；
-Ｏ（［Ｇｌｃ−α（１，４）−Ｇｌｃ−β（１）-］）；
-Ｃ（Ｏ）（Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｃ（Ｏ））３Ｎ（ＣＨ３）２；
-Ｎ（ＣＨ３）２ ＋ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３ -；
-Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）Ｐ（Ｏ）（Ｎ（ＣＨ３）２）２ -；および
-（Ｓ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）３Ｓ（Ｏ）ＣＨ３
本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、適切なタンパク質耐性頭部基は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、たとえば、３から２０のモノマー単位のＰＥＧを含み得る。
ポリマー層上へのさらなる成分の堆積に先立って、任意の連結層およびポリマー層を有する基板は、乾燥していてもよく、少なくともマイクロキャピラリが乾燥していてもよい（すなわち、触って乾燥している、または目視検査で乾燥しているが、ポリマー層中に、結合水または水和水を含む）。たとえば、捕捉剤の固定化を促進するために、ポリマー層は、結合水または水和水を適切に保持することができるが、バルク表面水は保持しない。連結層およびポリマー層を有する基板が乾燥形態で保存されている場合、結合水または水和水は、ポリマー層を水に迅速に曝露し（たとえば、水に浸漬することによって）、かつ表面を風乾させることによって（たとえば、窒素またはアルゴンジェットを用いて）、再導入することができる。あるいは、結合水または水和水は、大気水がポリマー層に結合するのに十分な時間、ポリマー層を周囲の空気に曝すことによって再導入することができる。
捕捉領域
装置は、ポリマー層に非共有結合することができる、少なくとも１つの捕捉剤を含む少なくとも１つの捕捉領域を含む。捕捉領域の数は広範囲に変化し得、かつ基板の大きさおよび形状、装置の意図された用途（たとえば、ポイント‐オブ‐ケア 診断、パネルアレイ（たとえば、ＤＮＡをスクリーニングするためマイクロアレイ、ＭＭＣｈｉｐ（マイクロＲＮＡ）、タンパク質、組織、細胞、化学的化合物、抗体、炭水化物など）その他同類のものを含むいくつかの要因に依存し得る。捕捉領域を含む捕捉剤は、一般的に、特異的結合対の１つのメンバーである。適切な捕捉剤の例は、抗原、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸、核酸またはペプチドアプタマー、リガンド、受容体その他同類のものを包含するが、それらに限定されない。実施形態は、たとえば診断パネルアレイのような複数の異なる捕捉剤を含むことができる複数の捕捉領域を含む装置に関する。
いくつかの実施形態において、捕捉剤は、目的の任意の疾患、障害、または生物学的状態に関連するバイオマーカーを含むことができる。したがって、捕捉剤の選択は、本明細書に記載の装置および方法の意図された使用もしくは適用によって引き起こされ得、かつ疾患、障害もしくは生物学的状態に関連することが知られている任意の分子、または、疾患、障害、もしくは生物学的状態と関連している疑いのある任意の分子を含み得る。したがって、捕捉剤の選択は、技術分野で利用可能な知識に基づき、当業者の能力の範囲内である。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、捕捉剤は目的の微生物感染と関連するバイオマーカーを含むことができ、微生物感染の例は、以下を包含するが、これらに限定されない：炭疽病、鳥インフルエンザ、ボツリヌス中毒、バッファローポックス、チクングニア、コレラ、コクシジオイデス症、クロイツフェルト・ヤコブ病、クリミア・コンゴ出血熱、デング熱、デング熱出血熱、ジフテリア、エボラ出血熱、Ｅｈｅｃ（大腸菌Ｏ１５７）、脳炎、セントルイス、腸管出血性大腸菌感染エンテロウイルス、食品媒介性疾患、腎症候性出血熱、ハンタウイルス肺症候群、肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザ、日本脳炎、ラッサ熱、レジオネラ症、リーシュマニア症、レプトスピラ症、リステリア症、発疹チフス(Louseborne typhus)、マラリア、マールブルグ出血熱、麻疹、髄膜炎菌病、モンキーポックス、心筋炎ニパウイルス、オニョンニョン熱、百日咳、ペスト、急性灰白髄炎、狂犬病、再発熱、リフトバレー熱、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、赤痢菌症、天然痘ワクチン−偶発的な曝露、ブドウ球菌食中毒、梅毒、野兎病、腸チフス(typhoid fever)、ウエストナイルウイルス、黄熱病など。
捕捉剤は、圧電または他の形態の非接触印刷および直接接触式クイル印刷を包含する、マイクロプリントまたはマイクロスタンピングなどの任意の好適な技術によって、ポリマー層上に堆積することができる。捕捉剤がポリマー層上に印刷される場合、捕捉剤は、装置が生物学的流体などの流体に曝されたときに結合したままであるように、ポリマー層に適切に吸収され得る。ブラシポリマーはまた、装置が保管されたときに捕捉剤が安定したままであるような保護環境を提供することができる。たとえば、捕捉剤が抗原性タンパク質または抗体などのペプチドまたはタンパク質である実施形態では、ブラシポリマー層は捕捉剤を分解から保護することで、装置を周囲条件下で保存できるようにすることができる。
アレイが、ポリマー層上の別個の位置に複数の捕捉剤を堆積させることによって形成される場合、１ｃｍ２あたり１、３、５、１０、１００または１０００までのプローブ位置のプローブ密度を作製することができる。１ｃｍ２当たり最大１，０００，０００個のプローブ位置を有するアレイを製造するために、現代の非接触アレイ装置を、堆積工程において使用することができる。たとえば、ディップペンナノリソグラフィーを使用して、１ｃｍ２あたり１０億個までの別個のプローブ位置を有するアレイを調製することができる。本明細書に記載の特定の用途に応じて、各捕捉スポットにおける特定の分子種が異なり得るか、またはいくつかが同じであり得る（たとえば、いくらかの冗長性または対照を提供する）ことが理解される。
捕捉剤は、捕捉領域を形成するために、ポリマー層上に印刷し得る。捕捉領域は、任意の特定の方法で配列することができ、およびたとえば（たとえば、任意の一般的な幾何学的形状の）スポット、線、または他の好適なパターンなどの、任意の望ましい形状またはパターンを含むことができ、それはポリマーおよび基板の表面上の捕捉領域の同定を可能とする。いくつかの実施形態において、複数の捕捉剤は、捕捉剤の独自性が基材上の特定の位置に関連するように、所定のパターンで配列することができる。
不安定領域
装置は、少なくとも１つの検出剤および賦形剤を含む少なくとも１つの不安定領域をさらに含む。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、生物学的流体、バッファーまたは水性溶媒などの流体との接触に際して、捕捉剤は、ポリマー層（たとえば、ポリマーブラシ）に非共有結合したままであり得るが、不安定領域に存在する賦形剤は、ポリマーブラシに吸収され、かつ検出剤の吸収を妨害することができる。したがって、たとえば生物学的流体を含むサンプルのような水性流体に曝された場合、検出剤は可溶化されかつ流体に放出され、かつ関心のある検体に結合することができる。また、賦形剤は保存中に検出剤をさらに安定化させることができる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、検出剤は、特異的結合対の第２のメンバーに結合することが可能な化合物を含み得る。サンプル（たとえば、生物学的流体）に可溶化されて放出されるとき、特異的結合対の第２のメンバーが流体中に存在する場合、第２のメンバーは検出剤に結合することができる。第２のメンバーは、装置の捕捉領域中の捕捉剤に結合できる。あるいは、検出剤は、捕捉剤に既に結合されているときに、特異的結合対の第２のメンバーに遭遇することができる。たとえば、捕捉剤が抗原性タンパク質であり、かつ検体が、抗原性タンパク質に特異的に結合することができる、患者が生成した抗体である場合、検出剤は抗ヒト抗体を含むことができる。
本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、不安定領域は、「サンドイッチ」型アッセイを形成するために２つの異なる薬剤を含むことができる。そのような実施形態では、第１の薬剤が検体に結合することができ、他方の薬剤が第１の薬剤に結合することによって「サンドイッチ」を形成し、それからそれが捕捉剤に結合することができる。たとえば、検出試薬は、検出部分によって官能化されたアビジンまたはストレプトアビジンに結合することができるビオチンを含み得る。
検出剤は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供する検出可能な部分をさらに含む。例示的な検出部分は、フルオロフォア、発色団、放射性標識、ポリヌクレオチド、小分子、酵素、ナノ粒子、およびアップコンバーターを包含することができるが、これらに限定されない。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、検出部分は、シアニン（たとえば、Ｃｙ３またはＣｙ５などのＣｙＤｙｅ）、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、蛍光タンパク質またはその機能的断片などのフルオロフォアであり得、またはビオチンなどの小分子を含むことができ、または金、銀またはラテックス粒子を含むことができる。
本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、賦形剤は、検出剤とポリマーとの間の安定ではあるが非永続的な結びつきを可能にするように選択される分子または分子の組み合わせであり得る。実施形態において、賦形剤は、水溶液（たとえば、バッファー、水、サンプル、生物学的流体など）に部分的に可溶性、実質的に可溶性、または可溶性であり得る。そのような実施形態において、賦形剤は、塩、炭水化物（たとえば、グルコース、フコース、フルクトース、マルトースおよびトレハロースなどの糖）、ポリオール（たとえば、マンニトール、グリセロール、エチレングリコール）、乳化剤、水溶性ポリマーの非限定的な例、およびそれらの任意の組み合わせから選ばれ得る。そのような賦形剤は当該技術分野において周知であり、かつ賦形剤と検出剤、活性型剤とポリマーとの相互作用、特定の媒体中での賦形剤の溶解度、およびそのような要因の任意の組み合わせに基づいて選択することができる。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、賦形剤はＰＥＧを含むことができる。
検出剤および賦形剤は、圧電または他の形態の非接触印刷および直接接触式クイル印刷を含む、マイクロプリンティングまたはマイクロスタンピングなどの任意の好適な技術によってポリマー層上に堆積させることができる。検出剤と活性剤との混合物は同時に堆積させることができ、または検出剤の前に賦形剤を堆積させることができる。
アレイが、ポリマー層上の別個の位置に複数の検出剤を堆積させることによって形成される場合、１ｃｍ２当たり１、３、５、１０、１００または１０００までのプローブ位置のプローブ密度を作製することができる。１ｃｍ２当たり最大１，０００，０００個のプローブ位置を有するアレイを製造するために、現代の非接触アレイ装置を、堆積工程において使用することができる。たとえば、ディップペンナノリソグラフィーを使用して、１ｃｍ２当たり１０億個までの別個のプローブ位置を有するアレイを調製することができる。特定の用途に依存して、各捕捉スポットにおける特定の分子種が異なり得るか、またはいくつかが同じであり得る（たとえば、いくつかの重複性または制御を提供する）ことが理解される。
他の要素
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、装置は、流体（たとえば、生物学的流体）が捕捉領域および不安定領域に接触するようポリマー層上の特定の領域に閉じ込められたままとなるように、ポリマー層上のパターン形成された領域を区画する薬剤をさらに含むことができる。そのような薬剤は、たとえば、捕捉剤と不安定領域の成分との堆積の前にポリマー層にインク印刷された疎水性インクであり得る。あるいは、薬剤はワックスであってもよい。他の実施形態では、基板の適切な幾何学的形状および／または構成を選択することを通して、たとえば、サンプルが、捕捉剤および不安定なスポットの成分を含む領域へと拡散することを可能にする幾何学的形状を選択することを通して、サンプルを装置に含有させる、または装置に向かわせることができる。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、基板はウェルまたは一連の相互接続されたウェルを含むことができる。
本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、たとえば、生物学的流体が血液サンプルである場合、不安定領域は、血液が凝固することを防ぐために抗凝固剤を含むことができる。例示的な抗凝固剤は、クマジン、ヘパリン、および低分子量ヘパリンなどのビタミンＫ拮抗薬を含み得るが、これらに限定されない。
本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、装置は、さらに対照剤で印刷された領域を含むことができる。たとえば、検出試薬が抗ヒト抗体を含む場合、抗ヒト検出抗体の活性を検証し、蛍光強度などの検出部分からのシグナルを標準化するために、ヒトＩｇＧの対照の捕捉領域を捕捉領域の横に印刷することができる。
装置の保存
捕捉剤、検出剤、賦形剤および他の任意成分を堆積させた後、装置を、上記のように物品が乾燥するかまたは少なくともマイクロキャピラリが乾燥するために十分な時間、たとえば、穏やかな乾燥、風乾、凍結乾燥、または周囲温度において周囲空気に曝露することによって、任意に乾燥させる。一旦装置が乾燥しているか、または少なくともマイクロキャピラリが乾燥していると、装置は、容器（たとえば、不浸透性または半透過性のポリマー容器など）に封入することができ、その中で、装置を保管することができ、ユーザへと出荷することができる。一旦容器に封入されると、本装置は、本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、２５℃の温度で保存された場合、少なくとも２ヶ月から４ヶ月、または最大６ヶ月以上の貯蔵寿命を有することができる（たとえば、２０％、３０％または５０％より大きい結合活性の損失なしに）。
検出
本明細書に記載の装置を生物学的サンプル（たとえば、生物学的流体）に曝露した後、当該技術分野で公知の任意の好適な方法を用いて、検出剤からのシグナルを検出することができる。例示的な方法には、視覚検出、蛍光検出（たとえば蛍光顕微鏡法）、シンチレーション計数、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリ、原子間力顕微鏡法、表面弾性波装置検出、オートラジオグラフィーおよび化学発光が含まれ得るが、これらに限定されない。当業者には理解されるように、検出方法の選択は採用される特定の検出剤に依存する。
検出器
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の方法において用いる検出器を提供する。検出器は、通常、チップを保持するように構成され、かつ１つ以上の光源を備えている。光源は、チップを照射するように構成されている。光源は、光がチップを通過するように、チップを照射することができる。光源は、光がチップの表面と約０度から約９０度の角度で接触するように、チップを照射することができる。一実施形態では、光がチップの一つの表面と、他方の表面上でチャネルに堆積された非汚染性ポリマー層とを照射するように、光源を配置することができる。この型の実施形態では、光はチップの表面を通過し得るが、チップ全体を通過し得ない。
光源は任意の型であり得、たとえば、ＬＥＤライトであり得る。本発明に使用される光源の好適な一例は、Ｔｈｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによって製造されたＬＥＤ３７０Ｆである。いくつかの実施形態では、検出器は、２つ以上の光源を含むことができ、たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の光源を含むことができる。光源は、同一であってもよく、または異なっていてもよい。各光源は、別の光源によって生成された光と同じまたは異なる波長の光を生成することができる。各光源は、同じ強度の光を生成することができる。一実施形態では、それぞれ２ｍＷの順方向光強度を有する４つの光源が使用される。本発明の検出器はまた、典型的にはレンズを含む。レンズは、光を集めるように構成されており、たとえば、フルオロフォアによって放出された光を、スマートフォンのカメラに送る。
図２５Ａ〜図２５Ｅを参照して、本発明の検出器は、概して円筒形であり得、かつ中心軸に沿って検出器を通って伸長し得る中央空洞を備えることができる。本発明の検出器は、代わりに、検出器の長軸に沿って垂直に二等分された場合に、正方形または長方形の断面を有するように成形されてもよい。空洞は、チップ、フィルタおよびレンズを収容するために、様々な形状および大きさにおいて、様々な工程で成形することができる。本発明の検出器は、１つまたは複数のＬＥＤチャネル１００を有する。そのようなＬＥＤチャネルは、上述のＬＥＤライトを収容するように大きさが決められている。本発明の検出器は、１つ以上の電源を１つ以上のＬＥＤライトに接続するために使用され得る、１つ以上の配線チャネル１０５を備えることもできる。本発明の検出器は、本発明の１つまたは複数のチップを収容するように構成された１つ以上のチップスロット１１０を備えることができる。チップスロットは、検出器の側面から内部に延びてもよく、かつ検出器を完全に貫通していても、していなくてもよい。図２５Ａにおいて、チップスロット１１０は、一方の側面から内部に延びているが、検出器を完全には貫通していない。上述したように、本発明の検出器は、検出器の中心軸に沿って延びる中央空洞を備えていてもよい。図２５Ａにおいて描画するように、空洞は、チップから放射された光が光路を下って携帯電話カメラへと進み、カメラによって記録され得るように、光路１１５を提供し得る。図２５Ａはまた、フィルタ空洞１２０を示す。フィルタ空洞１２０は、ある波長の光をフィルタリングし、かつ別の波長の光を通過させるように設計された光フィルタを収容するための大きさである。たとえば、フィルタは、上述したＬＥＤ光によって放射された波長の光をフィルタリングし、かつ検出剤によって放射された光の波長を通過させることができる。フィルタは、典型的には、中央の光路に配置される。図２５Ａはまた、レンズ空間１２５を示す。レンズ空間は、本発明で使用するためのレンズを収容する大きさである。本発明で使用されるレンズは、検出剤から放出された光を集中させ、かつ集中させた光を、光を記録し得る携帯電話カメラに向ける。図２５Ａは、電池室１３０も示している。電池空洞１３０は、上述した１つ以上のＬＥＤライトに電力を供給することができる電池を収容できる大きさである。典型的には、電池空洞は、フィルタおよびレンズとは反対側のチップスロットの側にある。バッテリは、検出器の蓋に取り付けられてもよく、または検出器と一体となった部分であってもよく、およびそのような実施形態では、電池空洞は蓋を収容するように働くことができる。本発明の検出器は、典型的には、光源に電力を供給するように光源に電気的に接続された電池を含む。図２５Ｂ、２５Ｃ、および２５Ｄは、本発明の検出器の上面斜視図、側面図および底面斜視図のＣＡＤ図をそれぞれ示す。図２５Ｅは、検出器の垂直軸を通る平面に沿った本発明の検出器の断面図を示す。
本発明の検出器は、検出器を携帯電話に磁気的に取り付けるように設計された磁気部分を含むことができる。
キット
本明細書における本発明の実施形態は、キットを含むことができる。
キットは、本明細書の支持体、固体支持体、および医療機器を含むことができる。キットには、その中の材料をどのように使用するかに関する指示書、たとえば書面による指示書を含めることができる。材料は、たとえば、本明細書、または参考として組み込まれる任意の特許、特許出願公開公報、参考文献、または記事の、任意の物質、組成物、ポリヌクレオチド、溶液などであり得る。
キットは、本明細書に記載されている装置、および任意で、バッファー、試薬、および本明細書に記載の方法を実施するための説明書などの追加の成分を含むことができる。バッファーおよび試薬の選択は、たとえば、アッセイの環境（ポイント‐オブ‐ケア、研究、臨床）、アッセイされる検体、使用される検出部分などの、特定の用途に依存する。たとえば、捕捉剤がポリヌクレオチドであり、かつ目的の検体が相補的なポリヌクレオチドである場合、サンプルからのポリヌクレオチドを結合できるようにするために、キットは生物学的流体のサンプルに添加される溶解バッファーを含み得る。
キットはまた、本明細書に記載される方法および／または本明細書に記載の方法のための装置の使用に関する、記述的、教示的、商業的、または他の資料であり得る、情報資料を含み得る。実施形態では、情報資料は、装置の製造、装置の物理的特性、有効期限、バッチまたは製造現場情報などに関する情報を含むことができる。
例示的なアッセイの設計
以下の段落においては、本開示の１つの非限定的な実施形態をより詳細に記載する。
本開示は、目的の１つ以上のＩＤについて生物学的流体を試験することができる、小型化された多重化アッセイを可能にする使い捨てチップを提供する。本明細書に記載される実施形態のいくつかでは、アッセイは一工程で行うことができる。特定の実施形態において、アッセイは、前処理またはマイクロ流体の必要性なしに行うことができる。目的のバイオマーカーに結合する安定的な捕捉スポットに加えて、装置は、捕捉剤の横に第２の検出剤を印刷することを可能とする、不安定なマイクロスポットを包含することもできる。生物学的流体の液滴と接触すると、不安定なスポット内のこれらの二次試薬は、溶液中に溶解し、かつサンプル中に存在する標的を標識することができる。
この技術の一実施形態では、本明細書において開発されたＤ４ポイント‐オブ‐ケア 試験（ＰＯＣＴ）は、全血の一滴から作動する（図２）。Ｄ４ ＰＯＣＴは、厚さ３０ｎｍの「非汚染性」―タンパク質および細胞抵抗性―ポリ（オリゴエチレングリコールメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）ブラシ被覆ガラスチップ（図２Ａ）からなり、中央チャネル内に含有される、以下の２種類のインクジェット印刷されたマイクロスポットを含む：捕捉抗体の「安定的な」スポット、および血液との接触時にそれらが溶解するように賦形剤を用いて印刷された、検出抗体の「可溶性」スポット。毛細管作用を用いて指採血からチップの中央チャネル内に血液を引き込み（図２Ｂ〜Ｅ）、および血液中のタンパク質検体が非汚染性ＰＯＥＧＭＡブラシを横切って拡散し、および捕捉抗体の安定したスポットに結合する（図１参照）。
同時に、血液は、可溶性マイクロスポットからの蛍光標識された検出抗体を溶解し、検出抗体は拡散し、かつそれぞれの検体捕捉抗体スポットに結合し、それにより検出複合体を完成させ、かつ捕捉抗体スポットから定量化可能な蛍光シグナルを生成する（図１）。この光学的シグナルは、スマートフォンに磁気的に付着する小さな装置（図２Ｋ）にチップを置くことによって、スマートフォンカメラで画像化される（図２Ｆ〜Ｉ）。図２Ｊは、全血の存在下で、チップの中央チャネル内に印刷された試験マイクロアレイから得られたスマートフォンカメラ画像である（全血をチャネルに添加した後に得られた画像）。裏側からの光照射および検出は、血液液滴を分析のために除去する必要がなく、またいかなる型の洗浄も分析に必要ないように、血液からの光学干渉を排除する（図２Ｋ）。
この技術の一実施形態では、本開示にかかるアッセイは、ＰＯＥＧＭＡによって被覆され、かつそれからＰＯＥＧＭＡのパターン化された領域を画定する疎水性インクで印刷された使い捨てチップを含む、上記使い捨てチップからなる、または本質的に上記使い捨てチップからなる。パターン領域は、個々の捕捉剤のスポットを含む。ＰＯＥＧＭＡブラシの親水性の性質は、ＰＯＥＧＭＡ表面全体に一滴の血液を拡散させる一方、疎水性インクは、血液液滴を分析領域に閉じ込めることができる「囲い」を生成する。ＰＯＥＧＭＡのパターン化された領域はまた、蛍光標識された検出抗体および可溶性ポリエチレングリコールを含み得る「不安定なスポット」を含む。
本明細書中に記載されているいくつかの実施形態では、捕捉スポット中の捕捉剤は、目的のＩＤの診断に役立つ抗原であってもよい。患者からの流体（たとえば、血液）のサンプルがチップに適用されると、サンプル中の患者によって生成された抗体が、抗原に結合することができる。そのような実施形態では、不安定なスポットは、固定化された、患者によって生成された抗体に結合することができる蛍光標識抗ヒト抗体を含むことができる。
他の実施形態では、捕捉スポット中の捕捉剤は、目的のＩＤの診断に役立つ抗原に対する抗体であり得る。患者からの流体（たとえば、血液）のサンプルがチップに適用されるとき、サンプル中の患者によって生成された抗原が抗体に結合することができる。そのような実施形態では、不安定なスポットは、同じ抗原上の異なるエピトープに特異的であり、固定化された患者によって生成された抗原に結合することができる蛍光標識抗体を含むことができる。
特定の実施形態において、捕捉剤として使用される抗原性タンパク質または抗体は、独立した複製物を提供し、かつそれによりアッセイのロバストネスを改善するために、各抗原の個々のスポットの列としてＰＯＥＧＭＡ表面上にスポットされる。たとえば、様々な捕捉抗体密度のマイクロスポットを含むマイクロアレイは、既知の検出器のダイナミックレンジ内に、より広い範囲の検体濃度が入ることを可能にし、かつそれによって、通常は単一のサンプルを貫いている試験の希釈系列を排除することができる。低い濃度の検体は、高い捕捉抗体密度の領域において検出することができ、一方で高い検体濃度は、低い捕捉抗体密度の領域において検出することができる。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、検出抗体スポットが血液サンプルとの接触時に確実に溶解するように、アレイの形式を定めることができる。たとえば、１２個の別々の捕捉領域がスポットとして印刷され、３個の異なる捕捉剤のそれぞれについて４個のスポットを印刷する。Ｃｙ５標識抗ヒト抗体を包含する不安定領域を、捕捉スポットの周囲に印刷する。
可溶性のＰＥＧもまた、不安定なスポットに含めることができる。可溶性ＰＥＧは、ＰＯＥＧＭＡブラシに優先的に吸収され、かつ検出抗体のブラシへの吸着を妨害することができる。したがって、検出抗体は、ピエゾインクジェット印刷およびマイクロキャピラリ乾燥処理によってスポットに閉じ込められているが、水溶液に接触した際に容易に溶解して血液滴に放出することができるという点で、実際には「不安定」状態にある。過剰の可溶性ＰＥＧの添加はまた、保存の間、蛍光標識検出抗体を安定化させることができ、かつ試験血液液滴が導入されたときに検出抗体を再可溶化する助けとなる賦形剤として働くことができる。
１滴の血液と接触すると、標識された検出抗体が溶液に溶解する。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、検出抗体は、血液サンプル中に存在するすべてのヒト抗体に結合でき、かつそれによって標識することができる、抗ヒト抗体であり得る。同時に、存在する場合、血液中に存在する検体（すなわち、抗原に対する患者によって生成された抗体）は、安定的に印刷された抗原スポットに結合することができる。他の実施形態においては、検出抗体は、目的の抗原のための特異的な抗体であり得る。血液サンプルと接触すると、抗原がサンプル中に存在する場合、検出抗体は抗原に結合することができ、抗原は今度は捕捉剤抗体に結合することができる。
陽性対照として、ヒトＩｇＧのスポットを抗原スポットの横に印刷することができる。これらは、抗ヒト検出抗体の活性を検証するのに役立ち、またアッセイ間の変動を減少させるために、アッセイにわたって蛍光強度を標準化するために使用することもできる。
血液凝固を防止するために、酵素ヘパリンは、不安定なスポット中のＰＯＥＧＭＡブラシ上にも印刷することができる。ヘパリンは、印刷前にＰＥＧと混合することができ、または単独で別の工程において印刷することができる。
実施形態では、指採血を患者に対して執行することができ、かつ得られた血液の滴をチップ表面に適用する。チップの表面に印刷された疎水性インキによって、標的検出領域のみにわたって血液の液滴が広がり、検出領域内に印刷された、可溶性の検出剤およびヘパリン（血液の凝固を防止する）に溶解する。
可溶化されると、蛍光標識された検出抗体は、血液液滴によって印刷されたスポットから溶解し、３つの連続した事象が起こり、陽性シグナルが生成される。これらの事象には、以下が含まれ得る：（１）に、血液中に存在する検体が、個々の捕捉剤の固定化され、かつ非蛍光のスポットに結合し、サンドイッチの前半を作り出す；（２）ポリマーブラシを横切って血液が拡散することによって、結果的に可溶性検出抗体がその印刷されたスポットから移動する；（３）捕捉剤と検体との複合体（サンドイッチの前半）に入るに際し、蛍光標識された検出抗体は、それらのそれぞれの検体‐捕捉剤スポットに結合し、サンドイッチを完成し、かつ結果的に、標識されていない薬剤が印刷されていた位置に蛍光スポットを形成する。
この実施形態において、アッセイは、「不安定なスポット」として印刷された蛍光標識された検出抗体が、印刷され、かつ安定的に固定化された、捕捉剤の隣接する列へと、検体を含む溶液の拡散によって運ばれるという、サポートされたデータに基づく。したがって、異なる捕捉剤で印刷されたスポットからの蛍光の出現を視覚化することにより、異なる検体（陽性）の明白な同定がもたらされる。異なる検体の濃度の定量は、全血に対して添加された検体の希釈系列を使用して装置を予め較正することにより、従来の蛍光免疫アッセイと同じように実施する。
本実施形態に係るアッセイは、ＰＯＣ試験における重要な需要のそれぞれに以下のように対処する：（１）小型化、多重化、一工程、オンサイトの処理によって、かつ指採血から得られた希釈していない全血中で前処理またはマイクロ流体を用いずに直接試験することによって、ＩＤ試験の費用を低減する；（２）ＩＤスクリーニング処理を単純化するために、二次元における拡散によって、空間的に局所化した試薬を一か所に集めることによって、機能的アッセイを作成し、かつそれによって、液体移動工程、サンプルまたは試薬のマイクロ流体操作、および洗浄工程の必要性を排除する。（３）この多重化プラットフォームは、サンプルの前処理を行わずに一滴の血液で一団のＩＤマーカーをスクリーニングすることができる；（４）アッセイは速く、これはしばしばＩＤ検査の結果を伝えることに関連する困難を緩和する；および（５）開示された設計の実際の検出スキームは、現在実地で利用可能な最高の感度を提供する、サンドイッチ型蛍光免疫アッセイである。
この規模のＩＤスクリーニングの改善は、全人口の健康に相当な影響を及ぼす可能性がある。感染症を制御するために、処理の一部は、空気、食物、水、または物理的接触を介して伝達される様々な病原体を同定するための定期的なスクリーニングであり、かつ提案したスクリーニングプラットフォームを開発することは、定期的な、および包括的なＩＤスクリーニングを、はるかに多くの人口の割合に、はるかに利用しやすくすると考えられる。最後に、高度に適応可能かつモジュール式の設計は、臨床試験におけるバイオマーカーのモニタリング、パンデミックスクリーニング、バイオディフェンス、および新たに発見されたバイオマーカーの大規模な検証を包含する、必要のある他の多くの地域のための診断としての開発のためにもまた有用である。
以下の非限定的な実施例は、完全に例示的であり、および本開示に従って実施された特定の実験を示すことが意図されている。
実施例
実施例１．ＰＯＥＧＭＡブラシを、ガラスおよびプラスチック上に伸長させることができる
高い化学的安定性を有するポリ（オリゴエチレングリコールメタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）のタンパク質および細胞耐性コーティングを開発した。ＰＯＥＧＭＡブラシは、図３に示すように、表面開始原子移動ラジカル重合（ＳＩ−ＡＴＲＰ）によってガラス上に合成される：まず、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）によって、ガラス表面にアミン末端シランの単分子層を形成し（工程１）、続いてＡＰＴＥＳ単分子層によって提示されたアミン基に、ＡＴＲＰ開始剤―ブロモイソブチリルブロミド―を付着させ（工程２）、およびそれから、ＣｕＢｒ、ビピリジンおよびＯＥＧＭＡモノマーを含有する溶液からＡＴＲＰを付着させる（工程３）。この手順は、免疫アッセイのためにＡｂおよび他のタンパク質を印刷するために有用であり得る、厚さ約１００ｎｍのブラシの簡便な合成を可能にする。また、Ｄ４アッセイのための基板材料としても適している透明な熱可塑性プラスチックの範囲でＰＯＥＧＭＡブラシの伸長を可能にする、補完的な技術のセットも開発した（データは示していない）。これらの結果は、材料上にＰＯＥＧＭＡブラシを伸長させるために、多くの相補的アプローチが使用できることを示し、相補的アプローチによって臨床的な免疫アッセイのための有用な基板が提供される。これらのタンパク質耐性および細胞耐性のＰＯＥＧＭＡブラシは、チップへの細胞の結合およびタンパク質の表面への非特異的吸着を防止するので、Ｄ４ ＰＯＣＴの基礎を形成することができる。
ガラススライドの例示的なコーティング。スライドガラスを５％（ｖ／ｖ）ＡＰＴＥＳを含むエタノールで室温で一晩処理する。次いで、これらのスライドを、２％トリエチルアミン（ｖ／ｖ）を含むジクロロメタン中の２％ブロモイソブチリルブロミド（ＢＩＢ）で処理し、次いでＮ２下で１００ｍＬフラスコに入れる。次に、ＣｕＢｒ（１４３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ビピリジン（３１２ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１５ｍＬ）およびＯＥＧＭＡ（８ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）を５０ｍＬフラスコ中で混合し、および暗赤色溶液をＮ２ガスで３０分間通気した。混合物をスライドを含有するフラスコに添加することによって重合を開始し、および窒素置換下で１時間継続した。スライドを溶液から取り出すことで重合を停止し、ジクロロメタンおよびメタノールですすぎ、および室温において１０分間Ｎ２ガスを流しながら乾燥させた。
実施例２．抗体は、ピエゾインクジェットプリンタによってＰＯＥＧＭＡブラシ上に直接印刷することができる。
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｐｉｅｚｏｒｒａｙ（商標）非接触プリンタを用いて、室温および室内湿度で厚さ〜１００ｎｍのＰＯＥＧＭＡブラシ上に、〜１５０μｍの直径のスポットとして捕捉抗体（Ａｂｃ）を印刷し（図４Ａ）、かつ厚さ１００ｎｍのポリマーの中へ非共有結合的に吸収できるようにした。水和状態においてはタンパク質吸着に対して優れた耐性を提供するが、乾燥状態においてはインク貯蔵器として働くことから、厚さ約１００ｎｍのＰＯＥＧＭＡブラシを選択した：圧電的に印刷された抗体「インク」はブラシに熱心に吸着され、それによって、マイクロプレートアッセイで使用するために、Ａｂｃの十分に高い充填密度がもたらされる。印刷後、スライドを真空デシケーター中で室温において一晩乾燥させて、Ａｂｃのポリマーブラシへの吸収をさらに促進した。この工程は、タンパク質が溶液からポリマーブラシに吸着しないので必要となり得る。ＰＯＥＧＭＡ被覆ガラススライドは、ポリマーブラシ上に印刷された抗体アレイの性能に悪影響を及ぼさずに、密封容器に保管し、かつ最長２ヶ月間卓上に放置することができた。インクジェットプリンタは低費用で、かつ至るところにあるため、共有結合的なカップリング工程を用いない直接インクジェット印刷は、最小の処理工程で抗体アレイを製造する単純な方法を提供することができる。これにより、ＬＭＩＣ環境に容易に配備できる、Ｄ４チップのための単純で大きさの変更が可能な製造技術を提供することができる。
抗体マイクロアレイの例示的なスポッティング：
以下の検体のための全ての捕捉抗体およびビオチン化検出抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得た：ＩＬ−６、ヒトインターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、ヒトインターロイキン−８（ＩＬ−８）、およびＯＰＧ。室温および室内湿度で、非接触式ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｐｉｅｚｏｒｒａｙを用いて、ガラス上のＰＯＥＧＭＡブラシ上に全ての捕捉抗体（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）をスポットし、および室温で一晩、真空乾燥（３０ＫＰａ）下で、厚さ１００ｎｍのポリマーブラシに非共有結合的に吸収させた。
実施例３． ＰＯＥＧＭＡブラシ上の抗体アレイは高感度である。
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αおよびオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）に特異的な抗体アレイを、Ｐｉｅｚｏｒｒａｙインクジェットプリンタによって、（１）ガラス上のＳＩ−ＡＴＲＰによって伸長された厚さ１００ｎｍのＰＯＥＧＭＡブラシ、および（２）未修飾ニトロセルロース基板（陽性対照）上に、直接印刷した。図４Ａに示した、ガラス上のＰＯＥＧＭＡ上にスポットされたＩＬ−６アッセイのマイクロアレイスポットの蛍光画像は、検体濃度の増加に伴う蛍光強度の増加を示す。注目すべきことに、スポットは、０．１ｐｇ／ｍＬ（５ｆＭ）のＩＬ−６濃度においてさえ、バックグラウンドから視覚的に識別することができた。図４Ａはまた、手順が完了した際に、アッセイ前に測定されたスポットを囲むバックグラウンド領域の蛍光強度が増加しなかったことから、ＰＯＥＧＭＡマトリックスがアレイ製造およびその後のサンドイッチ免疫蛍光アッセイを通して、非特異的なタンパク質吸着に抵抗する能力を保持していることを示す；実際、ＰＯＥＧＭＡ基板上で検出された唯一のバックグラウンド蛍光は、ガラススライドの自己蛍光によるものであった。ＰＯＥＧＭＡ上のこの非常に低いバックグラウンドシグナルは、試験された５人の検体すべてについて、血清中のフェムトモル濃度の検出限界（ＬＯＤ）、および５桁の大きさの検体濃度に及ぶダイナミックレンジ（図４Ｂ〜Ｄ）へと変換される。
ＰＯＥＧＭＡ上にスポットされたＯＰＧ特異的抗体についてのバッファーおよび血清中のＯＰＧ用量反応曲線（図４Ｂ）は、ＬＯＤがバッファーおよび血清中で事実上同一であることを示すため、タンパク質耐性基板の使用の別の重要な結果を示す。これらの結果は、バッファー内における同じアッセイのＬＯＤと比較して、高濃度の外来タンパク質を含む複雑な生理学的溶液中では、典型的にはＬＯＤが桁違いにより大きいという、大部分の他の蛍光免疫アッセイとは対照的である。ＰＯＥＧＭＡ上にスポットされたアレイからの絶対シグナルは、ニトロセルロース上にスポットされたアレイから得られたシグナルよりも低かったが（生データは示していない）、ＰＯＥＧＭＡブラシから得られたバックグラウンドシグナル（ガラス基板の自己蛍光レベルに近づいた）は、ニトロセルロースのものより著しく低かった。ニトロセルロースおよびＰＯＥＧＭＡ上にスポットされたＩＬ−６特異的抗体アレイの蛍光応答を、血清中のＩＬ−６濃度の関数として図４Ｃに示す。ＰＯＥＧＭＡブラシ上にスポットされたアレイの血清中のＬＯＤは、ニトロセルロース上の同じ抗体マイクロアレイよりも１００倍低かった。このことは、ニトロセルロースに比べて、ＰＯＥＧＭＡブラシ上にスポットされた抗体アレイからの絶対シグナルがより低いにもかかわらず、ＰＯＥＧＭＡブラシ上のバックグラウンド蛍光がより低いことにより、スポットからのより低い絶対シグナルを補ってあまりあることを実証した。ガラス上のＰＯＥＧＭＡブラシ上にスポットされたＩＬ−６に対する抗体は、〜約１５ｆＭのＬＯＤで、希釈されていない血液から、ＩＬ−６を直接検出できることが観察された（図４Ｄ）。
これらの結果は、非特異的なタンパク質吸着を減少させることが、これらのアッセイの用量応答曲線におけるノイズの閾値を、フェムトモルの範囲の濃度へと低下させることによって、ＬＯＤを減少させる強力な方法であることを実証する。これらのマイクロアレイはＰＯＥＧＭＡ上に物理的にスポットされ、かつ基板に対する捕捉抗体のいかなる共有結合的カップリングも伴わなかったので、それらは表面の化学的活性化および不活性化の必要性を排除することにより、アッセイの製造を大幅に単純化する可能性を有する。これらのマイクロアレイが溶液からのタンパク質および細胞の吸着に抵抗できることにより、全血から直接検体を検出することが可能となる。これらの特徴は、高感度で血液中において作用するＤ４ ＰＯＣＴの設計にとって極めて重要である。
実施例４．水と接触して溶解し、かつ「オンチップ」のサンドイッチ検出に必要な二次試薬を提供する、検出試薬の可溶性マイクロスポットを印刷することができる。
蛍光標識された検出抗体の不安定なマイクロスポットは、十分な可溶性の賦形剤と混合された場合、同じ表面上に印刷することができる。一滴の血液との接触に際して、これらの二次試薬スポットは、溶液に溶解し、かつ血液サンプル中に存在する標的を標識する。同時に、サンプル内に含有された標識された標的は、固定化された、不安定な捕捉スポットに結合する。このアプローチの実現可能性を説明するための原理証明の初期の実験として、ビオチン化Ａｂの５つのスポットをＰＯＥＧＭＡ表面上に印刷して、捕捉剤の「安定的な」固定化したスポットを形成した（図５）；蛍光性ではないため、図５の左のパネルの上部では、安定的なスポットが見られない。さらに、ストレプトアビジン−Ｃｙ５および可溶性ＰＥＧの溶液を、事前に印刷した可溶性ＰＥＧのスポットの上にスポットして、検出試薬の「不安定な」スポットの８×２アレイを作製した（図５の下段、左パネル）。１週間の保存後、指採血から得られた容積と同様の容積である、５０μＬのＰＢＳを、ピペットを用いて表面に供給した。図５（右のパネル）に見られるように、不安定なスポットからのＣｙ５−ストレプトアビジンは溶液に溶解し、かつ５つのビオチン化Ａｂスポットによって捕捉されて、検出可能なシグナルを生成した（図５の右パネルの一番上の列）。
「不安定な」マイクロスポットの開発は、Ｄ４ ＰＯＣＴの設計における重要な開発であり得る。なぜなら、それによってこのアッセイは、流体サンプルを扱う工程を排除する、オンチップの第２の試薬を含有することができるからである。したがって、この特徴は、その先駆であるＦｅｍｔｏａｒｒａｙ（商標）で必要とされた、多数の洗浄および液体移動工程を排除することによって、サンドイッチアッセイ処理を大幅に単純化する。
実施例５．血液中のＤ４ ＰＯＣＴの概念証明
血液中のＤ４ ＰＯＣＴの概念証明を、ヒトＩｇＧおよびＩｇＭの検出において示した；健康なドナーの血液をこの目的のために用いることができることから、これらの検体が選択された。図６は、プロトタイプアッセイの製造を示す。はじめに、厚さ〜３０ｎｍのＰＯＥＧＭＡブラシを、ＳＩ−ＡＴＲＰによりガラススライド上で伸長させた。次いで、サンプルをチップの活性領域に閉じ込めるために、スライドインプリンタを使用してガラススライドにワックスを格子状にスタンプした（図６Ａ）。スライドインプリンタは、囲いの完全な格子を生成するが、我々にとって利用可能でかつ簡便であることから、スライドインプリンタを、疎水性の囲いを作製するために使用した。次に、抗体アレイを単一のワックスの囲いの中央にインクジェット印刷した；各スポットは〜１５０μｍの直径である。内側の４×４アレイは、「安定的な」捕捉スポットを含む捕捉抗体（Ａｂｃ）のスポットを含む―第１列および第４列は抗ネズミＡｂｃ（陽性対照）であり；行２：抗ヒトＩｇＧ Ａｂｃ；行３：抗ヒトＩｇＭ Ａｂｃ。次に、検出カクテルを「不安定な」スポットの３つの外側リングとして印刷した（図６Ｂ）。これらのスポットは、マウスＣｙ５抗ヒトＩｇＧおよび／またはネズミＣｙ５抗ヒトＩｇＭ（ヒトＩｇＧおよびＩｇＭに対するＡｂｃとは異なるエピトープを有する検出抗体）、ヘパリン、および１０倍モル過剰のＰＥＧ５０００を含有する。図６Ａの画像をデジタルカメラで取得し、一方で図６Ｂを蛍光マイクロアレイスライドスキャナで取得した。したがって、内側の４×４抗体アレイは、内在的な蛍光を有さず、および印刷されたＡｂｃ溶液が表面上で乾燥した後に形成される塩析出物の光散乱のために、図６Ｂではほとんど見えない。外側スポットは、それらが検出器を飽和させ、したがって白色に見えるほど十分に高い濃度でＣｙ５標識Ａｂｄを含有するために可視である。
図７は、Ｄ４アッセイの初期プロトタイプの写真を示す。指採血からの一滴の血液（〜５−１０μＬ）（図７Ａ）をマイクロアレイに直接適用し、かつ疎水性の囲いに入れる（図７Ｂ）。５分後、表面をスクイズボトルからの〜１ｍｌですすぎ、緩く結合した血液細胞およびタンパク質を置換する。興味深いことに、縁の周囲の赤色から見てとれるように（図７Ｃ）、血液は縁に向かって流れ、かつ疎水性の囲いに結合するが、非汚染性ＰＯＥＧＭＡ表面から完全に除去される。
図８は、Ｄ４ ＰＯＣＴの出力を示す。図８Ｂにおいて、ヒトＩｇＧおよびＩｇＭのＡｂｄは不安定な検出スポットとして（ＰＥＧ＋ヘパリンを伴って）共に印刷されているので、血液中でのインキュベーションの際に完全なサンドイッチが作製され、列２および３の両方に現れる蛍光スポットをもたらす。図８Ｂ〜Ｆの赤い縁は、単に、すすぎ工程によってＰＯＥＧＭＡブラシから置換された後の、疎水性の囲いに結合した血液（および過剰のＡｂｄ）からの拡散による。全血では、ＩｇＧの濃度は概略で５ｍｇ／ｍＬ（３３μＭ）であり、かつＩｇＭの濃度は１．５ｍｇ／ｍＬ（１．６μＭ）であり、初期の実験においてさえも、このレベルの原液からのタンパク質検体を容易に検出できることが示唆される。図８Ｅおよび８Ｆは、陰性対照実験を示し、チップをニワトリ血液（Ｅ）またはＰＢＳ（Ｆ）のいずれか一方とともにインキュベートした。そのため、陽性対照の列１および４のみがシグナルを生成し、一方で行２および３は蛍光を示さない。図８Ｃおよび図８Ｄは、他の２つの対照である；図８Ｃでは、Ｃｙ５抗ＩｇＭｂ Ａｂｄのみが不安定なスポットに印刷されたので、２列目は点灯するが３列目は点灯せず、これに対しパネル４Ｄでは、Ｃｙ５抗ＩｇＭ Ａｂｄのみが不安定なスポットに印刷されたので、行３は点灯し、行２は点灯しない。Ｃｙ５−Ａｂｄは、不安定なスポットの外周に高濃度で印刷されており、および血液との接触に際して部分的にしか溶解せず、これによってその残留蛍光が依然として検出器を飽和させることに留意されたい。
ＩｇＧおよびＩｇＭは血液中でマイクロモル濃度を有するため、次にヒトＰＳＡおよびＩＬ−６に対する多重化アッセイによるアッセイの感度を試験した。図９の用量反応曲線は、ヒトＩＬ−６および／またはＰＳＡを添加したニワトリの全血を分析することによって得られた―１０マイクロリットルの各濃度の血液をチップに添加し、および２０分間インキュベートし、続いて１ｍＬによってすすいだ。この多重化Ｄ４ ＰＯＣＴの検出限界（空白＋３ＳＤ）は、ＰＳＡについては１５ｐｇ／ｍＬであり、かつＩＬ−６については２ｐｇ／ｍＬである。対照的に、これらの同じ抗体対を用いた最適化されたＥＬＩＳＡでは、１００μＬの血清を必要とし、かつ完了するまでに５時間を要し、ＰＳＡについては３０ｐｇ／ｍＬ、およびＩＬ−６については０．７ｐｇ／ｍＬの検出限界を生ずる。追加のインキュベーション時間が２０分続くと、ＩＬ−６アッセイのＬＯＤが改善され、４時間のインキュベーションで０．３ｐｇ／ｍＬを検出することができる。
これらの予備的結果は、Ｄ４ ＰＯＣＴが、多重化され、２０分で全血のたった１０μＬからＥＬＩＳＡ様またはより高い感受性を提供する力を有することを示している。
実施例６．ＰＯＥＧＭＡ上の抗体アレイは非常にロバストである。
ＰＯＥＧＭＡ上に印刷されたマイクロアレイの保存安定性を調べるために、室温で１日および２３日保存した後に、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を検出するためのＤ４ ＰＯＣＴの用量応答を測定した（図１０）。用量応答曲線は、８ｐｇ／ｍｌのＬＯＤをもたらした。重要なことに、３週間周囲保存した後のアッセイにおいて、ＬＯＤまたはダイナミックレンジには差がなかった。これらの結果はまた、ＰＥＧが周囲条件下でタンパク質を安定化させることができるという、他の研究者の以前の観察と一致している。周囲条件下での長い保存寿命は、ポイント‐オブ‐ケア装置にとって重要な属性である―これらの印刷された診断装置は、４℃でバッファー内に保存する必要はないため、室温での輸送、保管、および使用が可能である。
実施例７．Ｄ４ ＰＯＣＴの最適化
第２世代のＤ４チップは、第１世代のチップと同様に、中央領域に、検出試薬の不安定なスポットに取り囲まれた捕捉スポットが印刷されたカバースリップからなる。接着剤を塗布し、および第２のカバースリップを用いて捕捉抗体および検出抗体の印刷されたスポットを覆い、その結果そのときスポットは両端に露出した中央チャネル内に含有され、Ｄ４アッセイの分析コアはチャネルの中央に含有される（図１１Ａ）。チャネルの幅は、接着剤で覆われたチップの領域およびチャネルの高さを制御する接着剤の量によって制御することができる。これにより、指採血から得られる量と一致して、５〜５０μＬの範囲の血液の容積を有するチャネルを作製することができる。チャネルの寸法は、一滴の血液がチャネルの２つの端部のうちの一方の端部に保持される場合、毛細管作用によってチャネルに運ばれるように十分な毛細管力も提供するように、注意深く選択した（図１１Ｂ〜Ｃ）。さらに、血液の界面張力はまたチップ内に血液を含有させた状態を保持する（図１１Ｄ）。この自己充填および自己密閉設計により、血液はチップ内部に完全に含有される。
実施例８．視覚的バックアップを有する細胞適合性の光検出器の設計
光検出器は、以下の要件を考慮して設計された：
（１）検出器は、使用者のポケット内で容易に持ち運ぶことができるように、小型かつ軽量でなければならず、それによって患者を検出器から解放する。これは、現在のＰＯＣＴ（たとえば、ｉＳＴＡＴおよびＢｉｏｓｉｔｅ）の設計が、顕著に大きく、患者よりも介護者により適していることとは全く対照的である。
（２）光検出器は、幅広く入手可能かつ低費用の製造技術を使用して、低費用かつ大容量での製造が容易でなければならない
（３）検出器はスマートフォンの範囲に適合している必要がある。
（４）光学系は、いかなる整列または調整も必要としない。
（５）検出器は、血液の存在下で蛍光シグナルを定量化することができる。
（６）スマートフォンが利用できない場合、定性的な結果を読み出すことを可能とするために、検出器は視覚的なバックアップを持っている。
検出器の設計を図１２に示す。検出器のケーシングは、２つの別個の部品：すなわち蓋および本体として、ＡＢＳ熱可塑性プラスチックのＳｔｒａｔａｓｙｓ ３−Ｄプリンタを用いて製作した。蓋は、電池のための挿入口を含み、および蓋は、検出器の本体にねじ込まれることを可能にするためのねじ山を有する。本体には、ＬＥＤを挿入して、かつ４５度の角度で照明することができる４つの空洞があり、かつバンドパスフィルタを挿入することができるフレームがある。検出器の組み立ては単純である：２枚の印刷された部品を製作した後、バンドパスフィルタをホルダに挿入し、かつ４本のＬＥＤを事前に製作した穴に挿入し、かつ検出器にねじ止めしたときに蓋に触れるように配線する。１０×倍率レンズを追加し、電池を蓋に挿入し、かつ蓋を検出器の本体にねじ込んだ後、組み立ては完了する。最後に、同心の磁気リングを検出器のレンズの縁に接着する。
検出器の使用も同様に単純である。蓋をゆるめて、スロットをあらわにして血液を充填したチップを置き、その結果、印刷された抗体を含むカバースリップが底部にくる（蓋から離れている）。チップをこの構成に配置すると、Ｄ４アレイ内の蛍光スポットがＬＥＤによって下方から照射される。放射された蛍光のみが、チップと検出器のレンズとの間に配置されたバンドパスフィルタを通過する。スポットはレンズによって１０倍に拡大され、かつアレイの画像はスマートフォンカメラによってデジタル方式で獲得される。検出器およびスマートフォンの光学系には、磁気的自己整列が組み込まれている：同心の磁気リングが、検出器のレンズ上と、スマートフォンのレンズの周囲との両方に接着されており、これにより２つの装置の光学系が磁気的に整列される。
実施例９．癌の検出および診断
ＰＯＣ環境における癌検出のための複数の検体を試験するための主な障壁は以下の通りである：（１）費用；（２）応答時間；ならびに（３）採血および検体の取り扱い。Ｄ４ ＰＯＣＴの設計は、Ｄ４ ＰＯＣＴの中核をなす一連の可能な技術を用いて、以下のようにこれらの問題に対処している：第１に、小型化、多重化、および前処理またはマイクロ流体なしで指採血（たとえば、〜１０μＬ）から得られた希釈されていない全血で試験を直接行うことにより、試験費用および応答時間を低減する。アッセイの小型化は試薬の消費（かつ、それゆえ費用）を減少させ、拡散距離（かつ、それゆえ時間）を最小限に抑え、多重化（複数の検体を同時に試験する）は費用および時間の両方を節約する。単一の統合されたアッセイにおいて全血から直接的に試験することにより、サンプルの一工程、オンサイト処理が可能になる。第２に、単純かつ自己完結型のＰＯＣアッセイを作製するために、オンチップ拡散を利用して空間的に分離した試薬を一か所に集めることで機能アッセイを作製し、かつそれによって液体移動工程およびサンプルまたは試薬のマイクロ流体操作の必要性を排除した。第３に、アッセイは、統合され、かつ小型化され、多重化された形式で、かつ洗浄工程を伴わずに全血で直接的に実施されるため、アッセイは速く、見積もられた読出し時間は、たとえば２０分より短い。第４に、この多重化されたプラットフォームにおいては、サンプルの前処理を行わずに、一滴の血液で一団のバイオマーカーを定量することが可能である。対照的に、最新のＰＯＣ診断のほとんどは、単一の検体アッセイである。第５に、Ｄ４アッセイは、抗体対が利用可能な任意のタンパク質マイクロアレイに使用することができ、およびしたがって、すべての異種免疫アッセイに広く適用することができる。
実施例１０．Ｄ４チップの次世代の設計
その分析的ロバストネスおよび性能を向上させ得る、現在のＤ４チップに対する例示的な修正を、以下の段落で説明する。
自己較正特性を有するＤ４チップを設計し、検証した。したがって、検体の希釈系列を、陽性対照捕捉スポットの列として、チップ上に印刷する。陽性対照のスポット強度は、各チップの内部較正として作用する用量応答曲線を提供する。これらの対照スポットでのシグナル生成は、検出試薬の活性および拡散を検証することによって、アッセイが実行可能であることを意味する。さらに、これらの対照スポット内の標的の濃度を変化させることによって、すべてのスポットにわたるシグナル勾配ができるので、これを蛍光強度を標準化し、かつアッセイ間の変動を減少させるために使用し得る。この対照勾配はまた、捕捉抗体スポットで生成されたシグナルと比較することができ、これは標的の量の定量化を助け、かつチップに添加された血液の容積、血液粘度、インキュベーション温度および測定時間などのサンプリング変数を減少させる、本質的には、陽性対照スポットのスポット強度勾配は、用量応答曲線と同様に、参照シグナルを提供し、各チップの内部較正として働く。
標的の検出のためのマイクロアレイは、図１３に示すようにチップの中央チャネル内に印刷される。ＡＦＰはサンプル標的として使用される。このマイクロアレイは、抗ＡＦＰ捕捉抗体の「安定的な」マイクロスポット、および標識された抗ＡＦＰ検出抗体の「不安定な」マイクロスポットを含む。さらに、ＡＦＰの「安定的な」マイクロスポットは、陽性対照および較正標準として働く。
印刷された検出抗体（Ａｂｄ）の不安定なスポットが血液との接触に際して確実に溶解するように、可溶性ＰＥＧを印刷溶液に添加する。可溶性ＰＥＧはＰＯＥＧＭＡブラシに優先的に吸着し、かつＡｂｄの吸着および固定化を妨害する。単にインクジェット印刷およびマイクロキャピラリの乾燥工程により、スポットに閉じ込められているものの、これらのＡｂｄは、「不安定な」状態のままであり、および予備的な研究に示すように、水溶液と接触した際に、容易に溶解し、かつ放出される。過剰の可溶性ＰＥＧをＡｂｄへ添加することは、保存の間、検出試薬を安定化させるため、極めて重要であり、かつ重要なことに、過剰の可溶性ＰＥＧは、試験血液液滴が導入された場合にＡｂｄを再可溶化する助けとなる賦形剤として働く。一滴の血液と接触すると、これらの標識された抗体は溶液に溶解し、かつ血液サンプル中に存在するすべての標的に結合し、それによって標的を標識する。
陽性対照として、ＡＦＰのスポットを捕捉抗体スポットの横に印刷する。これらは検出試薬の活性および拡散を検証する役割を果たし、かつこれらの対照スポットにおけるシグナル生成は、アッセイが実行可能であることを意味する。さらに、これらの対照スポット内のＡＦＰの濃度を変化させることにより、スポットにわたるシグナル勾配ができるので、これを蛍光強度を標準化し、かつアッセイ間の変動を減少させるために使用し得る。この対照勾配はまた、実験的なＡＦＰ捕捉スポットで生成されたシグナルと比較することができ、これは実験的なＡＦＰ量の定量化を助け、かつチップに加えられた血液の容積、血液粘度、インキュベーション温度および測定時間などのサンプリング変数を減少させることを助ける。
血液凝固を防止するために、不安定なヘパリンスポットもまた印刷する。本研究は、ヘパリン、ＰＥＧ、およびＡｂｄ濃縮物、ならびにＰＥＧ分子量が、不安定なスポットの溶解、Ａｂｄ活性の維持、およびスポットされたへパリンの凝固阻止能力に及ぼす効果を調べる。様々な濃度の検出スポット成分を有するアレイを図１３に示すようにスポットし、かつ周囲の実験室条件下で、１日、１週間、および１ヶ月間保存する。保存から取り出した後、１０μＬの血液を各チップに加え、かつ凝固が生じるまでインキュベートする。検出スポットの残留蛍光を用いて、これらのスポットの溶解性に対する添加剤の影響を定量化し、同時にＡＦＰの陽性対照スポットの蛍光を用いてＡｂｄ活性の維持を決定する。検出器のダイナミックレンジに完全におよぶために必要な最適な濃度勾配を決定し、かつ血液中のＡＦＰ濃度の生理学的範囲を取り囲むために、陽性対照スポット内のＡＦＰの濃度を体系的に変化させる。中央チャネル内において血液が凝固するために必要な時間は、へパリンの効果を決定するために用いられ、および経時的研究は、これらのチップの保存寿命の指標を提供する。
ＰＥＧ添加剤の濃度および分子量を含む、可溶性スポットを印刷するための最終的な処方の例は、１０，０００ＭＷのＰＥＧの１％溶液中での印刷であり得る。印刷されたヘパリンの量の決定は、チャネル内での血液サンプルの凝固を防止するために必要であり、一例においては、血液凝固を防止するために、各チップ上に１ｎｇのへパリンが印刷されることが必要である。アッセイ較正に有用なシグナル勾配を生成するための、陽性対照スポットにおけるＡＦＰの必要濃度は、一例においては、以下の濃度のＡＦＰから印刷されたスポットである：１μｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｐｇ／ｍＬおよび１ｐｇ／ｍＬ。
実施例１１．全血でＡＦＰを直接検出することができるＤ４アッセイの開発。さらなる例示的な修飾は、「不安定なスポット」として印刷された検出試薬の概念を組み込む、ＡＦＰの定量ＰＯＣアッセイの開発につながる。このアッセイの性能指数（ＦＯＭ）は、以下のさらなる実施例で記載する、アッセイ形式の変更のベンチマークとして使用される。
定量的Ｄ４アッセイ：実施例１１に記載された実験によって決定されるような検出剤の印刷条件は、（図１３に示すように）ＡＦＰを検出するためにアレイを印刷するために使用される。０ｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまでの濃度をカバーする用量反応曲線を、ＡＦＰ添加バッファーを使用して生成し、次に、検体を添加したＡＦＰ陰性ニワトリ血液（いかなるＡＦＰも含まず、しかしながら、全血を使用することの複雑性を依然として正確に反映することから、選ばれた）を用いた用量反応曲線を生成する。２０の別個の用量反応希釈物からの用量反応データは、５パラメータロジスティック（５−ＰＬ）曲線に適合する。パラメータ推定は、ＭＡＴＬＡＢを用いた大規模な信頼領域反映ニュートンアルゴリズムによって実施する。アッセイは、そのブランク上限（ＬＯＢ）、検出限界（ＬＯＤ）、線形較正範囲（ＬＣＲ）、定量化の上限および下限（ＬＯＱ）、および変動係数（ＣＯＶ）という観点から評価する。ＬＯＢを決定するために、２０のゼロ標準の複製物を使用する。ＬＯＢは、平均ブランク＋１．６４５（ＳＤブランク）に等しい。ＬＯＤは、測定されたＬＯＢと、ＬＯＢに近いシグナルを生成することが知られている低検体濃度の２０回の試験複製物とに基づいており、およびＬＯＢ＋１．６４５（ＳＤ低濃度サンプル）として計算される。ＬＣＲは、５−ＰＬとの適合度から決定され、および、勾配が線形のままであり、かつ線の相関係数が０．９９５以上である較正曲線の領域として定義される。この直線領域の上側の境界、および下側の境界は、ＬＯＱの上限および下限を定義する。ＣＯＶは、各濃度について決定されたＣＯＶを用いて、２０の別個のアッセイにおいて既知の濃度の３つのサンプル（ＬＣＲ内の、低い、中程度、および高い値を表す）を試験することによって、決定される。
市販の試験に対するベンチマーキング：ＡＦＰ用の市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、最終的なアッセイの有用性をベンチマークする。商業的ＥＬＩＳＡおよびＤ４ ＰＯＣＴ結果との間の性能指数を直接比較するために、サンプルを並行して分析する。これは、ＬＯＤ、ＬＯＱ、ＤＲ、ＣＯＶ、ならびにアッセイ間およびアッセイ内の精度を提供する検証済みの用量反応曲線を有する、全血からＡＦＰを検出するための定量的Ｄ４アッセイの開発につながる。Ｄ４ ＰＯＣＴのＦＯＭは、市販のＥＬＩＳＡキットと同様であるか、またはそれより優れている。
ＡＦＰの例示的な定量的Ｄ４アッセイは、２０分でＥＬＩＳＡのような、またはそれ以上の感度を提供することができ、かつ５ｐｇ／ｍＬのＬＯＤを有し、かつ臨床ＥＬＩＳＡと同等な他のＦＯＭを有する。
実施例１２．感度を最大化するためのチップの設計
最大化された感度を有するチップを、すべての抗原が捕捉スポットによって確実に捕捉されるように、捕捉スポットを血液流入点の近くに置き、一方で不安定なスポットを下流とすることによって設計した。この設計のＦＯＭを、実施例１２で評価した前世代のＤ４チップと比較する。
従来のラテラルフロー免疫アッセイ（ＬＦＡ）では、捕捉抗体の試験系に達する前に、検体溶液が可溶性検出試薬を溶解する。このことは、ＬＦＡのフローストリームが一方向のみであるために必要となり、およびしたがって、捕捉抗体に到達する前に、検出試薬を検体溶液に溶解することができる。この設計は、抗原捕捉抗体の結合に先立って、検出抗体が抗原に結合することを可能にし、およびしたがって、抗原検出抗体結合が、抗原捕捉抗体の結合を妨害する可能性が存在する。注意深くマッチングしたモノクローナル抗体の対を使用すると、この問題は最小限に抑えられるが、費用が大幅に増加し得る。
提案された形式は拡散に基づく設計であるため、検出抗体を上流に配置することを必要としない。いかなる理論にも束縛されるものではないが、捕捉スポットが検体溶液に曝露された後に起こる拡散によって、検出抗体が捕捉スポットに到達するのみであるので、もし検体溶液が検出スポットに先立って捕捉スポットに到達すると、チップの感度が上昇し、および検出抗体からのいかなる干渉なく、抗原がはじめに捕捉スポットに結合することが可能になると考えられる。この配置の一例は、図１４に示されており、チップの中央チャネル内において２つの別個のアレイの位置を交替することを含む：１）抗標的捕捉スポット（黄色）および標的較正スポット（青色）から構成されるアレイ、ならびに、２）可溶性の抗標的検出スポット（赤色）のアレイ。
これらの研究は、血液が捕捉スポットおよび検出スポットに接触する順序がアッセイ感度にどのように影響を及ぼすかを決定することにつながる。たとえば、検出スポットの上流に捕捉スポットを配置すると、アッセイ感度が５ｐｇ／ｍＬから０．５ｐｇ／ｍＬへとアッセイ感度が改善する。
実施例１３．Ｄ４アッセイにおける拡散距離の影響
Ｄ４アッセイにおける拡散距離のさらなる試験を行う。図１５に示されるようなアッセイ形式を構成し、各捕捉スポットは、近接する複数の可溶性の検出試薬スポットによって取り囲まれる。いかなる理論にも束縛されるものではないが、アッセイ反応時間は、近位に位置する複数の可溶性検出試薬スポットによって減少すると考えられ、かつこの幾何学的形状により、各捕捉スポットの周囲に溶解した検出試薬をより高い局所濃度とすることができ、かつそれによって、チップ上に印刷することのできる検出試薬の量を低減する。
この幾何学的形状により、より短い拡散距離がもたらされ、およびしたがって、標識された検出抗体の同心円環によって捕捉スポットが取り囲まれている、予備的な研究において用いた標準的な幾何学的形状よりも、捕捉した抗原をより速く標識できる可能性がある。図１５のアレイをさらに用量範囲の抗原に曝露し、かつアッセイＦＯＭを実施例１２に記載したように決定し、かつ予備的な研究において示した標準Ｄ４アッセイと比較する。ＦＯＭが標準的なＤ４アッセイと同等またはそれより良好であると仮定して、アッセイの経時的ビデオを、標準的なＤ４アッセイの性能測定基準を依然として保持しながらアッセイを短縮することができる程度を評価するために用いた。
アッセイを短縮することは有利であるが、この幾何学的形状がチップ上に印刷された検出抗体の量を減少させることによって、アッセイの費用をどのように低下させる可能性があるのかを決定することもまた有用である。この場合、各捕捉スポットの周囲の検出抗体の局所濃度は、検出スポットの溶解中に高くなければならない。いかなる理論に束縛されるものではないが、スポットが近接していることによる、このより高い局所濃度によって、印刷された検出抗体の量を減少させて、各捕捉スポットの周囲に、第１世代のＤ４形式で印刷されたより多くの量の検出抗体で達成されるのと同じ局所濃度を生み出すことができる。各検出スポットに印刷された検出試薬の量を体系的に減少させることにより、標準的なＤ４アッセイと同等のＦＯＭをもたらすために必要な検出試薬の最小量を決定する。
上述した可能性のある利点に加えて、この幾何学的形状は、各捕捉スポットが最も近い検出スポットから同じ距離に位置するので、検出スポット溶解中に、各捕捉スポットを検出抗体により均一に曝露することをもたらす。アッセイ時間、検出抗体の要件、および／またはアッセイの変動性の有用な低下が観察された場合、この幾何学的形状を、以下の実施例１５に記載される最終設計に組み込む。
これらの例示的な研究は、拡散距離がアッセイ時間およびチップ上に印刷された検出抗体の量にどのように影響を及ぼすかを決定することにつながる。たとえば、提案された幾何学的形状によって、５ｐｇ／ｍＬの感度を達成するために必要な時間を、２０分から１５分まで低減し得る。他の例においては、幾何学的形状によって、チップ上に印刷された検出抗体の合計を、２００ピコグラムから５０ピコグラムまで低減させることが可能である。
実施例１４．チップ設計の統合
実施例１１〜１４で検討した、すべての特徴および潜在的な印刷の幾何学的形状を、考慮に入れ、かつ単一のアッセイ形式に組み合わせ、および最終的な、最適化されたチップを、検体を添加したニワトリの血液を使用してそのＦＯＭについて検査する。ブランク上限（ＬＯＢ）、検出限界（ＬＯＤ）、線形較正範囲（ＬＣＲ）、定量化の上限および下限（ＬＯＱ）、および変動係数（ＣＯＶ）を、実施例１２に記載したように決定し、およびＡＦＰ用の市販のプレートベースのＥＬＩＳＡ試験キットの結果と比較した。
本明細書に記載のＡＦＰ検出の例示的なＤ４アッセイは、ＥＬＩＳＡのような、またはそれ以上の感度を依然として維持しつつ、改善された感度、短縮されたアッセイ時間、または減少した検出抗体要件を有する。
実施例１５．ＡＦＰ−Ｌ３アッセイの開発
実施例１０〜１４のＡＦＰアッセイ開発中に同定された設計的特徴を用いて、ＡＦＰ−Ｌ３アイソフォーム用の同等のＤ４アッセイを製造する。アッセイＦＯＭを実施例１２に記載のように決定し、かつ市販のプレートベースのＥＬＩＳＡ試験キットとの並列比較を用いて、ＡＦＰ−Ｌ３アッセイをベンチマークする。
本明細書に記載のＡＦＰ−Ｌ３検出の例示的なＤ４アッセイは、２０分でＥＬＩＳＡのような、またはそれ以上の感度を提供することができる。たとえば、アッセイは、５μｇ／ｍＬのＬＯＤおよび臨床ＥＬＩＳＡと同等な他のＦＯＭを有する。
実施例１６．ＡＦＰおよびＡＦＰ−Ｌ３のための二重化Ｄ４アッセイ
ＡＦＰおよびＡＦＰ−Ｌ３の両方を検出するように設計されたアレイを印刷するために、実施例１０〜１５に記載の実験によって決定された、最適化された印刷条件および幾何学的形状を使用する（この時点で新しい幾何学的形状が選択され得るが、図１６の二重化アレイは、元のＤ４アッセイ形式で表される。）。０ｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬまでの濃度をカバーする用量反応曲線は、検体を添加したバッファー、続いて検体を添加した検体陰性ニワトリの血液を用いた用量応答曲線を用いて生成する。各検体を二重化アレイで個別に試験し、かつＦＯＭを実施例１５および実施例１６で測定したものと比較する。多重化免疫アッセイでは、適合しない捕捉抗体および検出抗体またはそれらの標的の間の予期せぬ交差反応の可能性が存在する。単一マーカーを添付した血液へアレイを曝露することによって、任意の可能性のある交差反応性が明らかになり、かつ必要に応じてその後に抗体を選択するラウンドを使用する。アッセイは、実施例１２に記載されるように、そのＬＯＢ、ＬＯＤ、ＬＣＲ、ＬＯＱおよびＣＯＶという観点から評価する。
本明細書に記載のＡＦＰおよびＡＦＰ−Ｌ３の両方の検出のための例示的な二重化Ｄ４アッセイは、定量的であり、かつ実施例１５および１６で評価された単一の検体アッセイのＦＯＭを維持する。
実施例１７．検出器設計の最適化
費用、波長、分光幅、およびＬＥＤの電力出力、ならびにＬＥＤ照射の角度を含む、検出器のいくつかの側面を最適化する。いくつかの光学的フィルタの選択肢がまた存在し、かつこれらは、全体としての費用を可能な限り低くするという第一目標によって評価される。試験は、蛍光標識されたタンパク質の標準化されたアレイを含むＤ４チップを、各検出器の変形によって画像化することによって行い、および携帯電話のカメラに対して、十分に高いシグナル強度を送ることが可能な、もっとも費用の低い構成要素を選ぶ。
本明細書に記載されている例示的な検出器は、依然として試験アレイの十分な画像化を提供する最も安価な構成要素から構成される。一例においては、検出器は総計１０ドルの構成要素を含み、かつ試験アレイを画像化する場合に１，０００カウント／ピクセル／秒の平均強度を生成する。
実施例１８．スポット強度を定量化するための携帯電話アプリケーションの作成
画像解析には、以下の２つの選択肢が存在する：１）分析のために画像を中央サーバに送信する、および２）電話機上で分析を行う。電話機上で画像解析を実行する選択肢は、データシグナルをすぐに利用できないＬＭＩＣアプリケーションに適している。たとえば、ＪａｖａＣＶの画像処理技術ライブラリは、本明細書の需要を満たすために、適応することができる。アプリ開発の間、実施例１０〜１７によって生成された画像を、市販のマイクロアレイスキャナとセットになって売られた画像分析ソフトウェアから以前に得られた結果と比較して、電話機上での分析をベンチマークするために使用する。
本明細書に記載した例示的なアプリケーションは、それらの位置に基づいて試験スポットを識別でき、かつ平均ピクセル強度／スポット測定値を生成することができる、ＪａｖａＣＶに基づく画像分析ツールを含む。たとえば、アプリケーションはまた、オンチップでの較正標準に従って、参照用の用量反応曲線を参照することができ、かつ試験スポットの強度をオンチップでの較正標準に従って、測ることができる。
実施例１９．システム全体のベンチマーキング
最適化された検出器およびアプリケーションの完成に際して、新しいＦＯＭを生成し、かつ実施例１６の二重鎖アッセイで得られたものと比較する。中央研究所で実施されたＥＬＩＳＡと同等またはそれ以上の性能測定基準を有し、２０分以内にスマートフォンでアッセイ結果を提供する統合ＰＯＣＴを開発する。
例示的なシステムは、中央研究所で実施されるＥＬＩＳＡと同等またはそれ以上の性能測定基準で２０分以内にスマートフォンでアッセイ結果を提供する、統合ＰＯＣＴであり得る。
実施例２０．開発されたＰＯＣＴの臨床試験：模擬血液サンプルを用いた試験
統合Ｄ４アッセイは、０ｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌの範囲の検体添加ニワトリの血液において４ｌｏｇスケールまたは濃度にわたって実施されるアッセイによって最適化される。以下に記載する研究は、臨床技術者によって実施され、かつＤ４ ＰＯＣＴの開発者によって実施されない。実施例１〜２０に記載の実験は、Ｄ４アッセイの開発に深く関与する職員によって実施されるため、これは重要な差異である。アッセイは最終的には、アッセイ形式に以前にさらされたことのない職員―典型的には、ＬＭＩＣ環境における臨床技術者、および潜在的にはユーザによってさえも―によって実施されるため、研究室から実地での使用への移行において、アッセイを、アッセイ開発に密接に関わっていない個人へと譲り渡すために、研究室において決定されたＦＯＭが、ＬＭＩＣサイトに近い環境に適合することを検証することが重要である。
表１は、各種類の検証基準をまとめたものである。Ｄ４アッセイの結果が基本的に定量的（蛍光強度のデジタル読み出し）であるため、統計的推測を通知するために、これらの結果に対して精度を評価する。すべての試験ポイントは、特に明記されていない限り、３重に実行する。アッセイ精度を最初に評価する（表１）。標的実施パラメータを９５％の信頼度で分析できることを確実にするという最終目標のために、観察された精度に基づいて、後に続く試験のために、反復の数を調整することができる。単一検体ＡＦＰおよびＡＦＰ−Ｌ３に対する多重化ＡＦＰ＋ＡＦＰ−Ｌ３アッセイの定量的な方法の比較結果は、試験ケースとしてＤ４多重化アッセイを、および基準ケースとして単一検体アッセイを用いた線形回帰のセットとなる。傾き、切片、および変動係数を、適切な９５％信頼区間で計算する。単一検体Ｄ４アッセイが特徴付けされていないので、データについての仮定を避けるために、ブランド／アルトマン（Ｂｌａｎｄ／Ａｌｔｍａｎ）分析もまた行う。
表１．実地使用へのアッセイ移行における、シングルプレックスおよびデュアルプレックスアッセイの開発で評価される分析パラメータ
Figure 0006962914
プロトタイプＤ４ ＡＦＰおよびデュアルＡＦＰ＋ＡＦＰ−Ｌ３ Ｄ４ ＰＯＣＴがいったん開発されると、完全な最高点の検証が、表１に概説された経路にしたがって行われる。仕事を始める前に、ＳＯＰ、データ形式と型、最終的な統計解析の詳細、および検定力を保証するための十分な複製物（これまでに収集した予備データによって使用可能となる）を含む詳細な検証計画を作成する。この検証からの結果は、以下を含む一般的に受け入れられた診断基準と比較される：他のアッセイ特異的測定量（ＬＯＤ、ＬＯＱ、アッセイ範囲）の中でも定性的感度および特異性≧９５％；定量的方法比較の傾き０．９５〜１．０５、バイアス≦５％、Ｒ２≧９０；名義の正確度８５〜１１５％；精度（ＣＶ）≦１０％；直線性≧９０。
臨床的な有用性の例示的な結果は、経験の浅いユーザによる、本明細書に記載されるＤ４アッセイの検証を含み、それは、実施例２１に記載の他のアッセイ特異的測定値（ＬＯＤ、ＬＯＱ、アッセイ範囲）の中でも、感度および特異性≧９５％；定量的方法比較の傾き０．９５〜１．０５、バイアス≦５％、Ｒ２≧９０；名義の正確度８５〜１１５％；精度（ＣＶ）≦１０％；直線性≧９０をもたらす。
実施例２１．新しく採取したヒト血液中での試験
Ｄ４アッセイの試験後、新たに採取した患者の血液を用いた小規模（〜２０回）の試験をサイト１で実施する。Ｄ４結果をＡＦＰおよびＡＦＰ−Ｌ３のＥＬＩＳＡと比較する。臨床研究および実験プロトコールの詳細を以下に記載する。
臨床試験の設計：このセクションは、限られた数の患者の血液サンプルを用いてサイト１において実施される事前検証臨床試験、およびＬＭＩＣサイト：すなわちサイト２におけるＤ４ ＰＯＣＴのより大規模な臨床試験の両方に適用される。２つの研究の最大の違いは囲い地の大きさであり、サイト１ではアームあたり〜２０個、ＬＭＩＣ臨床サイトではアームあたり〜１００個であると予想される。
研究集団：研究の承認は、各試験場の施設倫理審査委員会から得、かつ肝細胞癌腫（ＨＣＣ）患者および健康な対照を含むすべての参加者からのインフォームドコンセントを得る。
ＨＣＣは、超音波、ＣＴまたはＭＲＩによる特徴付け、および生化学（ＡＦＰ血清学および肝臓機能の酵素）に基づいて定義され、および米国肝臓病研究協会のガイドラインに従って組織病理学によって確認される。腫瘍段階は、バルセロナクリニック肝臓癌（ＢＣＬＣ）病期分類システムに従って定義される。ＢＣＬＣステージ０＋Ａを有する腫瘍は、早期ＨＣＣとして分類される。慢性ＨＢＶ感染の診断には、慢性ＨＢＶ感染の予防および治療のガイドラインに従い、過去６ヶ月間のＨＢｓＡｇの存在、１ｍＬ当たり１０３コピーを超えるＨＢＶ ＤＮＡ濃度、および血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ量の上昇が包含される。肝硬変の診断は、肝生検試料の組織病理学、ならびに、そこにおいて可能な、結節性肝臓輪郭（nodular liver contour）、腹水の存在、門脈圧亢進症、静脈瘤、尾状葉の肥大、脾腫、および側副門−静脈吻合を包含する、臨床的な、実験室における、および画像の証拠に基づく。ＡＦＰ濃度が上昇している肝硬変の患者は、複数の方法（超音波検査、ＣＴ、またはＭＲＩ）による画像化を受ける必要があり、かつ登録前少なくとも３ヶ月間は肝臓塊の証拠がない。他の固形腫瘍の病歴を有する患者は、研究から除外される。
健常な対照は、肝臓が生物化学的に正常であり、肝臓病の病歴を有さず、ウイルス性肝炎を有さず、かつ悪性疾患を有さない適格な献血者である。２つの囲い地内において、年齢および性別において、可能な限りグループを適合させた。
統計的解析：
試験段階において、ＨＣＣ患者のグループ、および健常な対照の被験体のグループを募集する。ＡＦＰ量は、平均、中央値および標準誤差によって、２つのグループについて別々にまとめる。２つのグループにおけるＡＦＰ量の中央値が等しいという帰無仮説を、それらはマンホイットニー検定を使用して等しくないという対立仮説に対して試験する。診断試験では、ＡＦＰレベルが特定のカットオフポイントを上回っている場合には「陽性」と分類され、およびそうでない場合には被験体は検査について「陰性」と分類される。カットオフポイントの違いは、試験の動作特性の違いを生む。具体的には、試験の感度は、試験において「陽性」と正しく分類されたＨＣＣ被験体の割合である。特異性は、「陰性」と正しく分類された非ＨＣＣ被験体の割合である。さらに、陽性的中率は、試験において陽性と分類された被験体のうち真陽性である被験体の割合であり；および陰性的中率は、陰性として分類された被験体のうち真陰性である被験体の割合である。受信者操作者特性（ＲＯＣ）曲線は、試験のための様々なカットオフポイントにおける、真陽性の割合に対する偽陽性の割合をプロットすることによって得られる。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて、試験の診断値を評価する。検査に診断値がないという帰無仮説の下では、ＡＵＣは０．５に等しく、かつより高いＡＵＣ値（１まで）はより高い診断値を示す。有意水準０．０５では、真のＡＵＣがそれぞれ０．６、０．６５、０．７および０．７５であれば、帰無仮説を拒絶するために８０％のパワーを達成するために必要な２つのグループ（症例および対照）のそれぞれの被験体の数は約１３０、６０、３０および２０である。感度および特異性の合計を最大化することによって、診断のための最適なカットオフ値を求めるために、受信者操作者特性曲線もまた使用される。最適カットオフを有する試験の感度、特異性、陽性予測値および陰性予測値は、それらの９５％信頼区間とともに計算する。
統計分析は、Ｒ（バージョン３．０．２）およびＳＡＳ（バージョン９．０）を用いて行なう。２つの独立したグループ間の差異は、マンホイットニーのＵ検定（連続変数およびノンパラメトリック分析）で検定する。感度、特異性およびそれぞれの曲線下面積（ＡＵＣ）を評価するために、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を構築する。診断の最適カットオフ値は、感度および特異性の合計を最大化することによって調べる。また、最適カットオフ値の下での感度および特異度も、それらの９５％信頼区間とともに計算する。これらの量およびそれらの９５％信頼区間は、試験段階から計算されたものと比較する。
本明細書に記載の新たに採取したヒト血液からの例示的なＤ４アッセイは、感度および特異性の合計を最大にすることによって、ＡＦＰおよびＡＦＰ−Ｌ３による診断のための最適カットオフ値の推定値を提供する。一例においては、９０％の感度および８５％の特異性を提供する、２５０ｎｇ／ｍＬのＡＦＰおよび１００ｎｇ／ｍＬのＡＦＰ−Ｌ３のカットオフ値である。
さらに、本明細書に記載のＤ４アッセイは、中央研究所で実施されるＥＬＩＳＡと同等またはそれ以上の性能測定基準で２０分以内にスマートフォンでアッセイ結果を提供する統合ＰＯＣＴ形式である。性能評価のための例示的な市販のＥＬＩＳＡには、４６ｐｇ／ｍＬのＬＯＤ、および３１２ｐｇ／ｍＬから２０ｎｇ／ｍＬのアッセイ範囲、およびアッセイ範囲にわたって、ＣＶ％＜１０である、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓのヒトアルファ−フェトプロテインＱｕａｎｔｉｋｉｎ ＥＬＩＳＡキット（ＤＡＦＰ００）が含まれる。
実施例２２．赤血球捕捉のためのＰＯＥＧＭＡ抗体アレイ：初期の結果
初期の結果を図１８〜２４に示す。
適切な形態のために、ＧＡＭＡ４０１抗Ｄ抗体以外の全ての抗体用に、イン‐ハウスで開発された印刷バッファーを使用することができ、ＧＡＭＡ４０１抗Ｄ抗体は受け取ったまま印刷する必要がある。
アレイは、Ａ、Ｂ、Ｏ血液型に特異的に見える。
Ｄ陰性の血液は利用できなかったので、ＧＡＭＡ４０１抗Ｄ抗体の特異性はまだ実証されていない。
試験した３つの血液サンプルのいずれにおいても、Ｆ８Ｄ８抗Ｄ抗体によってシグナルは生成されなかった；したがって、スポット形態を評価することはできなかった。
結果は、直感的な読み出しを伴うアレイの作製を実証する。
実施例２３．ＤＮＡの検出
スライド上の各ウェルを、１００μＬのＴｄＴバッファー中で、１０Ｕ ＴｄＴ、１００μＭ ｄＡＴＰ単量体、および０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、または５μＭのＣｙ３−ｄＡＴＰヌクレオチドまたはダイターミネーター、Ｃｙ３ジデオキシヌクレオチド（Ｃｙ３−ｄｄＡＴＰ）とインキュベートすることにより、Ｃｙ５標識オリゴヌクレオチドプライマーをスポットしたガラススライド上で表面開始酵素重合（ＳＩＥＰ）を行った。ＳＩＥＰを３７℃で１時間実施した後、スライドを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＳＳＣバッファーで３回洗浄することによって、非特異的に結合した任意の反応物の除去を容易にした。
ＳＩＥＰによるＲＮＡハイブリダイゼーションのオンチップ蛍光標識。グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子由来のＤＮＡ配列を、我々のアッセイを試験するためのモデル系として選択した。完全に相補的な５’−ビオチン化された１７量体ＰＮＡプローブ［５’−Ａｃ−ＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣ−リシン−ビオチン−３’、１μＭ］およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）配列に由来する非特異的ＰＮＡプローブ［５’−Ａｃ−ＡＣＣＴＴＧＴＣＡＴＧＴＡＣＣＡＴ−リシン−ビオチン−３’、１μＭ］を、ストレプトアビジン（２．５μＭ）と個々に混合し、かつ次いで非接触プリンター（Ｐｉｅｚｚｏｒｒａｙ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、ガラス基板上に伸長した１６、２０の非汚染性ポリ（オリゴ（エチレングリコール）メタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）ブラシ上にスポットした。プローブをスポットしたスライドを、それから真空チャンバー内で一晩インキュベートし、および使用前に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＳＳＣバッファーですすいだ。ハイブリダイゼーションした標的の用量反応曲線を、１ｐＭ〜０．１μＭの濃度範囲をカバーする標的ＲＮＡの溶液によって、印刷したプローブをインキュベートすることによって生成した。ハイブリダイゼーションの前に各標的溶液を９５℃で１０分間加熱し、およびそれから氷中で冷却し、および印刷したプローブと共にインキュベートした。アッセイは２つの標的を用いて実施した：（１）プローブに相補的な２１量体の合成ＲＮＡ標的［５’−ｒＧｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＧｒＧｒＧｒＵｒＧｒＧｒＵｒＧｒＧｒＡｒＣｒＣｒＵｒＣｒＡ−３’］、および（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの全長（約１．４ｋｂ、詳細はＳＩにおいて見つけられる）。各標的を、ハイブリダイゼーションバッファー（３×ＳＳＣ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０および４．９５Ｍ尿素）中で、４２℃において穏やかに振とうしながら一晩（約１６時間）インキュベートした。合成ＲＮＡを受け取ったまま使用した一方で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを、受け取ったまま、または断片化試薬中における７０℃における１５分間のインキュベーションによって断片化して使用した。断片化したＲＮＡ標的のために、洗浄バッファー（１×ＳＣＣ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）ですすいだ（３×）後、結合した断片化したＲＮＡ標的を、３７℃で１時間、オンチップで酵素的に脱リン酸化することによって（０．１２５ ％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０中、０．０６２５ユニット／μＬホスファターゼ）、３’−ＯＨの利用可能性を確保した。次に、結合したＲＮＡ標的の３’−ＯＨを、ＳＩＥＰによりＤＮＡに変換した。ＰａＰを用いて３７℃で２時間、短いオリゴ−ｄＡＴを組み込みＰ（１×ＰａＰバッファー中、６ユニット／μＬ ＰａＰおよび５００μＭ ｄＡＴＰ）、続いて、Ｃｙ５ ｄＡＴＰを組み込むために、３７℃で１時間、ＴｄＴを用いたＳＩＥＰを行った（１×ＴｄＴバッファー中、０．１ユニット／μＬ ＴｄＴ、１００μＭ ｄＡＴＰ、および０．５μＭ Ｃｙ３−ｄＡＴＰ）。次いで、スライドを０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１×ＳＳＣバッファー中で３０分間すすぎ、かつＧｅｎｅＰｉｘスキャナー上で直ちにスキャンした。次いで、スポットの平均シグナル強度（バックグラウンドを差し引いたもの）を標的ＲＮＡ濃度の関数としてプロットした。
実施例２４ マイクロＲＮＡ配列の単一工程検出のための競合結合アッセイ
この実施形態は、図２６に示した。この実施形態は、競合的免疫アッセイと同様であり、標識された／競合する標的を送る方法が異なる―この形式においては、標識された標的は、検体溶液に添加されておらず、しかしながら、代わりに、スポッティングの前に、プローブに対して直接的にハイブリダイズされている。そうであるから、この形式は、スポッティングに先立って、標識された標的にハイブリダイズしたマイクロスポットまたはプローブに依存する。多数の非相補的塩基を含むようにこの標識された標的の配列を設計することにより、このプレハイブリダイズされた、部分的に相補的な標識された標的が、検体溶液中に存在する任意の標的によって置換されることが引き起こされる（検体溶液中に存在する標的は、いかなるミスマッチ塩基も含まず、および従って、より高い親和性でプローブ配列にハイブリダイズする）。この形式において、マイクロスポットシグナル強度の減少は、検体サンプル中の標的の量を定量化するために用いられる。理想的には、この方法はＲＮＡ精製工程を回避し得る。しかしながら、ＲＮＡ精製が必要だとしても、この方法はなお、逆転写、標識化、および／またはＰＣＲ増幅を排除する可能性がある。
以下のパラメータは、感度およびＳＮ比に関して最適化される。１．配列の長さ；２．配列の内容物（ＧＣ対ＡＵ対ＴＡ）３．シーケンスの一意性（ゲノムが他の極端に類似する配列を含むか）４．検体溶液の性質（イオン強度、ｐＨなど）；５．温度；６．ミスマッチ塩基の位置／内容物（プローブの開始／終了に対するプローブの中間、ＡＣ対ＡＧ対ＡＡなど）；７．プローブの長さ（標的鎖とプローブ鎖との間に、何塩基の重複した塩基が存在するか／どの重複した塩基が存在するか、プローブは相補部分の前／後にオーバーハングを含有するか）。８．インキュベーション時間。１〜３は標的配列の機能であり、変化させることはできないが、４〜８を用いてプローブ−標的結合を合わせることができる。
本発明のいくつかの実施形態においては、標識された標的の可溶性スポットがプローブスポットの横に印刷される。この技術は、対照群を１つの標識（たとえばＣｙ３）によって、かつ実験群を別個の標識（たとえばＣｙ５）によって標識することによって、遺伝子発現の倍数変化を測定する、伝統的なＤＮＡアレイに基づくアッセイにさらによく似ている。しかしながら、この実施形態では、標識された標的の可溶性スポットが溶解するにつれて検体溶液に添加される「対照」標的のみが標識される。これらの標識された標的がプローブスポットへと結合する度合いは、検体溶液中に存在する、標識されていない標的配列の濃度と反比例の関係にある。
適切な配列は、以下を包含する：
・ｍｉＲＮＡ 標的 （ｍｉｒ−１５５）
５’−ＵＵＡＡＵＧＣＵＡＡＵＣＧＵＧＡＵＡＧＧＧＧＵ
・ＬＮＡ プローブ
５’−ＣＣＴＡＴＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＡＴＴＡＡ−ビオチン
・部分的に相補性を有する、標識されたｍｉＲＮＡ標的（ＡがＣへと変化している、変異は太い下線で示した）
Figure 0006962914
実施例２５ 免疫組織化学を増強するための標的細胞アレイ
免疫組織化学（ＩＨＣ）は病理学の分野において重要な役割を果たし、およびその重要性は、新たな標的治療のためにコンパニオン診断が必要とされるにつれて、増加する運命にある。しかしながら、客観的価値の調査の内在的な主観性から（ｉｎ ｓｉｔｕタンパク質濃度）、コンパニオン診断に必要とされる正確性を獲得するために、新しい技術が必要とされることが示唆される。
ＩＨＣは、患者ケアおよび治療過程の決定において、しばしば重要な役割を果たす。特定のおよび／または稀な細胞型を標的とするように、より多くの薬物が設計されているが、潜在的な副作用およびこれらの薬物の多くが高費用であるために、ＩＨＣは薬物投与の前の薬物応答を予測するためによく使用される。たとえば、トラスツズマブ（ハーセプチン）の使用は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体が過剰発現されている２０％〜３０％の乳癌の治療において示唆されているだけであり、およびトラスツズマブの処方の前に、ＨＥＲ２の過剰発現が実際に存在するかどうかを判定するために、乳癌腫瘍生検をＩＨＣおよび他の方法によって評価しなければならない。しかし、ＩＨＣによって再現性のある結果を獲得することは、固定条件、標本前処理、試薬、検出方法、洗浄手順および結果の解釈を包含する多数の変動要因のために、かなり困難である。この再現性の乏しさは、主要な課題を提示し、および多数の研究が、ＩＨＣアッセイに用いられる品質管理基準を改善する必要性を実証する。ＨＥＲ２過剰発現のためのＩＨＣ試験結果の１つの研究では、初期の局所試験と追跡の中央研究室における試験との間で１５％の不一致率が見出された。
個々の細胞は分析のためにアレイに印刷される。組織サンプルの天然の形態は、伝統的なＩＨＣの間で広く保存されており、およびいくつかの例においては、これは必要かつ有用であるが、分析を単に複雑にするだけだというたくさんの例がある。たとえば、組織生検が特定の表面レセプターの過剰発現について検査されている場合、細胞は分析のために組織サンプル中に埋め込まれたままである必要はない。細胞をアレイの中へと組織化することにより、視覚によって、または自動化された形式のいずれかによって行われても、画像の取得および分析が大幅に単純化される。
標的細胞型に特異的な捕捉剤は、外来細胞の数を制限するために使用される。伝統的なＩＨＣは、多数の細胞からなる全組織切片の分析を包含し、かつ非常にしばしば、これらの細胞の大部分は、特異的および／または珍しい細胞型を特徴付けることが目的である場合は、重要ではない。特定の細胞型を標的とするための抗体などの表面固定化捕捉剤を使用することにより、目的の特異低および／または珍しい細胞型を選択することが可能になる。この技術を使用して、分析する外来細胞の数を制限し、かつそれによって分析時間、試薬要件、および結果として偽陽性の可能性を低減する。
標識された検出剤の基質のバックグラウンドへの非特異的吸着によって生成されたノイズを排除することにより、シグナル対ノイズ比およびアッセイ解釈を大幅に改善することができ、偽陽性の減少およびより敏感かつ定量的な結果を生成する。さらに、非特異的吸着の欠如により、洗浄手順を大幅に低減または排除することができ、アッセイ手順を大幅に簡素化し、かつ信頼性および再現性を改善する。
本発明の本態様に係るアレイの適切な調製方法の１つは、以下の通りである。ガラススライドをポリ（オリゴ（エチレングリコール）メタクリレート）（ＰＯＥＧＭＡ）で被覆するために、表面開始原子移動ラジカル重合を使用する。本発明者らは、血液および細胞溶解物などの複雑な生物学的流体中で実施されるアッセイにおいて、細胞およびタンパク質の非特異的吸着によって引き起こされるバックグラウンドノイズを完全に排除する、この非汚染性コーティングの能力を最近実証した。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体のマイクロスポットアレイをＰＯＥＧＭＡ表面上に直接印刷する。これらのマイクロスポットは、本発明者らの研究室で開発されたＰＯＥＧＭＡ表面上に抗体をパターン化する方法を用いて作製され、非汚染性表面上において安定した抗体マイクロスポットを得るための化学的活性化および不活性化の必要性を排除し、製造プロセスを大幅に単純化する。さらに、本発明者らは、この技術を用いてＰＯＥＧＭＡ表面上に印刷された抗体は、通常の周囲条件下において非常に長い貯蔵寿命を有し、冷蔵またはバッファー中に保存する必要がないことを示した。これにより、これらのアレイの貯蔵および輸送がはるかに単純になる。既に０〜３＋のＨＥＲ２／ｎｅｕ発現スコアを受けている乳房腫瘍サンプルを用いて、アッセイを評価する。腫瘍試料をコラゲナーゼＤで処理し、かつＰＯＥＧＭＡ上の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕアレイを得られた細胞懸濁液に曝露する。ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性細胞は、抗ＨＥＲ２ｎｅｕマイクロスポット（マイクロスポット当たり約１個の細胞となるように、円形で１０μｍの直径のマイクロスポットが使用される）によって捕捉され、かつ続いて、各細胞のＨｅｒ２／ｎｅｕ発現を定量化するために、第２の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体による標識化を用い得る。結果を、事前に決定した０〜３＋のＨＥＲ２／ｎｅｕ発現値と比較する。
この実施形態は、ＩＨＣ試験を、より信頼性が高く、より速く、より安価にし、かつより容易にポイント‐オブ‐ケアに適用できるようにする。乳癌腫瘍におけるＨＥＲ２／ｎｅｕ発現を、本発明のこの実施形態を用いてアッセイする。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態が単なる例示として提供されることは、当業者には明らかであろう。
本発明から逸脱することなく、当業者には数多くの変形、変更、および置換が可能である。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、かつこれらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの等価物がその中に包含されることが意図される。
図１は、ポリオリゴ（エチレングリコール）メチルメタクリレート（ＰＯＥＧＭＡ）ブラシ上における、２−Ｄ拡散ポイント‐オブ‐ケア（ＰＯＣ）アッセイの設計を示す。ＰＯＥＧＭＡブラシにより被覆されたチップ上に、２つのタイプのスポットが印刷される：（１）血液から検体を捕捉し、かつ検出複合体の下半分を形成する、捕捉抗体の「安定な」スポット、および（２）血液との接触時にそれらの印刷されたスポットから拡散し、かつ検出複合体の標識された半分を形成する、検出抗体の「可溶性」スポット。 図２は、Ｄ４ ＰＯＣ試験（Ｄ４＝分注、溶解、拡散、検出）のワークフローを示す。（Ａ）血液導入前のマイクロアレイチップ。（Ｂ〜Ｅ）毛細血管作用を介した指採血からの血液の導入。（Ｆ）電話機に装置を接続する。（Ｇ）チップを装置に挿入する。（Ｈ）キャップを装置上に置く。（Ｉ）電話カメラを用いて撮像する準備ができている装置。（Ｊ）血液添加後のマイクロアレイの電話画像―裏面からの撮像および光照射は、血液からの光学的干渉を排除する。（Ｋ）検出器の設計の切り抜き概略図。 図３は、ＳＩ−ＡＴＲＰによるガラス上のＰＯＥＧＭＡブラシの合成を示す。洗浄したガラススライドを、工程１においてＡＰＴＥＳで官能化し、およびシラン単層中のアミン基を、工程２においてＡＴＲＰ開始剤を付着させるために使用する。次いで、スライドをＯＥＧＭＡモノマーおよび触媒の溶液に浸漬して、ＳＩ―ＡＴＲＰによって、ＰＯＥＧＭＡブラシをスライド上に伸長させる。 図４は、以下を示す。（Ａ）血清から直接の情報を得た典型的なＩＬ−６マイクロアレイの画像。（Ｂ）ＰＯＥＧＭＡブラシ上のバッファーおよび血清中のＯＰＧの用量反応曲線。（Ｃ）ＰＯＥＧＭＡブラシおよびニトロセルロース上の血清中のＩＬ−６の用量反応曲線。（Ｄ）全血から直接の情報を得たＩＬ−６マイクロアレイの用量反応曲線。Ｂ〜Ｄにおいて、縦軸はスポットにおける、平均バックグラウンドを引いた蛍光強度を示し、かつＸ軸は溶液中の検体濃度を示す。エラーバーは、１標準偏差である。 図５は、安定的な捕捉剤スポットおよび不安定な検出剤スポットを、同じ表面上に印刷することの実行可能性の原則証明を示す。不安定なＣｙ５−ストレプトアビジンスポットを溶液に溶解し、およびバッファー一滴をチップに添加した後、ビオチン化Ａｂの安定的なスポットに結合させた。 図６は、ワックスの格子を型押しされた、ＰＯＥＧＭＡブラシを有するガラススライドを示す。（Ａ）抗体マイクロアレイは、ワックスの囲いの中央にスポットされている。（Ｂ）可溶性蛍光検出試薬を含むマイクロスポットに囲まれた、内側の４×４捕捉抗体アレイの拡大図。（Ａ）の画像はデジタルカメラにより取得し、（Ｂ）は蛍光マイクロアレイスライドスキャナによって取得した。 図７は、例示的なアッセイを示す。（Ａ）血液を分注する、（Ｂ）５分間インキュベートする；および（Ｃ）Ｖｉｓｉｎｅ（商標）ボトルからの１ｍＬで洗浄する。 図８は、全血中のヒトＩｇＧおよびＩｇＭについての例示的なＤ４ ＰＯＣＴの結果を示す。（Ａ）液体曝露前の印刷されたアッセイ。（Ｂ）〜（Ｄ）５分間の１０μＬのヒト血液の後、すすぎ洗いする。（Ｂ）「不安定な」検出スポットの外側の列にスポットされた、Ｃｙ５−抗ＩｇＧおよびＣｙ５−抗ＩｇＭ。（Ｃ）不安定な検出スポットにおけるＣｙ５−抗ＩｇＧのみ。（Ｄ）不安定な検出スポットにおけるＣｙ５抗ＩｇＭのみ。（Ｅ）ニワトリの全血１０μＬの後。（Ｆ）１０μＬのＰＢＳの後。 図９は、ニワトリの全血に添加したヒトＰＳＡおよびＩＬ−６に対する多重化Ｄ４ ＰＯＣＴの結果を示す。ＬＯＤはブランク＋３ＳＤである。 図１０は、印刷後、１日（三角）および２３日（四角）室温保存した後のＢＮＰ Ｄ４ ＰＯＣＴの用量反応曲線を説明する。上段：＋対照、最下位列：ＢＮＰ 図１１は、第２世代のＤ４チップの例を示す（Ａ）。抗体マイクロアレイは、チャネルの中央の底部カバースリップ上に印刷される。どのように血液が中央チャネルに充填され、かつ毛細管作用（Ｂ〜Ｄ）によってチャネル内に保持されるかを示す図（Ｂ〜Ｄ）。 図１２は、以下を示す。（Ａ）Ｄ４光学的検出器の設計の切り抜き概略図。スマートフォンに付着する磁気リングは、（Ａ）の底部にある。切り抜き図は、蛍光発光の裏面からの光励起および読み出しを示す。（Ｂ）検出器のスマートフォンへの磁気カップリングおよびスマートフォンに対する検出器の光学位置合わせ。（Ｃ）蛍光試験抗体アレイのデジタル画像。（Ｄ）シグナルの視覚検査。 図１３は、ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）のＤ４マイクロアレイの例示的な形式を示す。＋対照スポット内においてＡＦＰ濃度を変えることによって生成されるシグナル勾配は、内部較正標準として役立つ。 図１４は、試験アレイ形式を示す。２つの別々のアレイが印刷され、１つは抗ＡＦＰ捕捉スポットおよびＡＦＰ較正用であり、かつもう１つは可溶性抗ＡＦＰ検出スポット用である。これらの２つのアレイが検体溶液に曝される順序は、互い違いである―血液が最初に最初にパネルＡの捕獲スポットに接触し、かつ最初にパネルＢの検出スポットに接触する。 図１５は、検出抗体の拡散距離を減少させるために、各安定捕捉スポットを不安定な検出スポットで取り囲むことができることを示す。 図１６は、陽性の対照較正標準を用いた、ＡＦＰおよびＡＦＰ−Ｌ３のための例示的な二層Ｄ４アレイを示す。 図１７は、例示的なＤ４ ＰＯＣＴバイオインタフェースを示す。 図１８は、ＰＯＥＧＭＡ抗体アレイ形式１を説明する。全ての抗体は、スポット直径約１２５ミクロンで、受け取ったまま印刷した。ワックスの囲い内に印刷された実際のアレイの画像を上部に示し、抗体の位置を重ねて表示した画像を下部に示した。アレイ中の抗体の位置：ＲＢＣ＝３３Ｆ１抗ヒト赤血球；Ａ＝ＧＡＭＡ１２０抗Ａ；Ｂ＝ＧＡＭＡ１１０抗Ｂ；Ｄ１＝Ｆ８Ｄ８抗Ｄ；Ｄ２＝ＧＡＭＡ４０１抗Ｄ。 図１９は、Ａ＋血液に曝露したＰＯＥＧＭＡ抗体アレイのいくつかの結果を説明する：洗浄前（上）ならびに洗浄および吸引後（下）のアレイの画像。洗浄前にはスポットが見えるが、重力沈降した細胞および溶液中の細胞によって覆い隠される。 Ａ＋血液に曝露したＰＯＥＧＭＡ抗体アレイの結果を説明する：洗浄および吸引後のアレイの画像（上）、および選択したスポットの形態（下）。Ａ＋血液について予想されるように、１，６行目の抗ＲＢＣ、２行目の抗Ａおよび５行目の抗Ｄ２に対して結合が起こる。 図２１は、バッファー添加物で印刷されたＰＯＥＧＭＡ抗体アレイを説明する。全ての抗体は、印刷バッファーで１：１に希釈した。スポットの直径はおおよそ１１０ミクロンである。ワックスの囲いの中に印刷された実際のアレイの画像を上に示し、抗体の位置を重ねて表示した画像を下に示す。アレイ中の抗体の位置：ＲＢＣ＝３３Ｆ１抗ヒト赤血球；Ａ＝ＧＡＭＡ１２０抗Ａ；Ｂ＝ＧＡＭＡ１１０抗Ｂ；Ｄ１＝Ｆ８Ｄ８抗Ｄ；Ｄ２＝ＧＡＭＡ４０１抗Ｄ。 図２２は、血液型抗原の検出のためのＰＯＥＧＭＡ抗体アレイの結果を示す。Ａ＋血液に曝露（上）；Ｂ＋血液に曝露（中）；Ｏ＋血液に曝露（下）。結果は、アレイがＡ、Ｂ、Ｏ血液型に特異的であることを示している。 図２３は、Ａ＋血液に曝露された場合の、血液型抗原の検出のためのＰＯＥＧＭＡ抗体の結果を示す。 図２４は、視覚的読み出しによる血液型抗原の検出のためのＰＯＥＧＭＡ抗体アレイを示す。アレイには、Ａ、Ｂ、またはＡＢのような血液型を、正または負の符号で表示する。Ｏは、ＡまたはＢの非存在によって示される。アレイ中の抗体の位置：ＲＢＣ ＝ ３３Ｆ１抗ヒト赤血球；Ａ＝ＧＡＭＡ１２０抗Ａ；Ｂ＝ＧＡＭＡ１１０抗Ｂ；Ｄ１＝Ｆ８Ｄ８抗Ｄ；Ｄ２＝ＧＡＭＡ４０１抗Ｄ。 図２５は、本発明の検出器の一実施形態の概略図を提供する。図２５Ａは、検出器の上面図を示す概略図である。図２５Ｂは上面斜視図である。図２５Ｃは側面図である。図２５Ｄは底面斜視図である。図２５Ｅは、検出器の長軸を通る平面に沿った断面図である。 図２６は、マイクロＲＮＡ配列の単一工程検出のための競合的結合アッセイの概略図を提供する。

Claims (54)

  1. チップ内を通るチャネルと、前記チャネルの少なくとも１つの表面上に配置された非汚染性ポリマー層とを含むチップであって、
    前記チャネルは前記チップ内に実質的に囲まれ、毛細管作用に依存してサンプルを前記チャネル内に引き込むように構成されており、
    前記チップは、直接的に、非共有結合的に、前記非汚染性ポリマー層に結合した捕捉剤をさらに含み、
    前記非汚染性ポリマー層は、ヒドロキシ末端重合オリゴエチレングリコールメチルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ）のホモポリマー、またはメトキシ末端ＯＥＧＭＡとヒドロキシ末端ＯＥＧＭＡとのコポリマーを含む、チップ。
  2. 前記非汚染性ポリマー層は、ｉ）ｐＨ７．４を有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液によって１０分間予備処理した後；ｉｉ）それからｍｌあたりフィブロネクチン１ｍｇの濃度のフィブロネクチン溶液に２５℃で２０分間曝露し、；およびｉｉｉ）次いで、ｐＨ７．４を有するＰＢＳ溶液で１０分間すすぎ；表面プラズモン共鳴または代替法によって評価した場合、１ｎｇ／ｃｍ２以下のフィブロネクチン吸収を示す、請求項１に記載のチップ。
  3. 前記チップが、前記非汚染性ポリマー層がバルク水ではなく水和水を含むようにして保管される場合、前記捕捉剤は、２５℃の温度において少なくとも１ヶ月間、少なくとも５０％の結合活性を保持する、請求項１又は２に記載のチップ。
  4. 前記チップは、体液を分析して、体液中の検体を検出することが可能である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のチップ。
  5. 前記検体は、ヒトＡ血液型抗原、ヒトＢ血液型抗原、ヒトＡＢ血液型抗原、ヒトＯ血液型抗原、ヒトＲｈ因子抗原、グリコホリン、生物脅威病原体、感染性病原体に由来する抗原、癌抗原、心臓血管疾患に関連する抗原、代謝性疾患に関連する抗原、またはそれらの任意の組み合わせ、または上記のいずれかを認識する抗体である、または含む、請求項４に記載のチップ。
  6. 前記非汚染性ポリマー層は、１０ｎｍ〜１５０ｎｍの厚さである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のチップ。
  7. 前記非汚染性ポリマー層は、３０ｎｍの厚さである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のチップ。
  8. さらに検出剤を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のチップ。
  9. 前記捕捉剤と検出剤とが、前記非汚染性ポリマー層の反対側の端部に位置する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のチップ。
  10. 前記チップがさらにダムを備える、請求項１〜９のいずれか１項に記載のチップ。
  11. 前記ダムが、前記捕捉剤と検出剤との間に位置する、請求項１０に記載のチップ。
  12. 前記ダムが、水溶性塩、水溶性糖、水溶性ポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０または１１に記載のチップ。
  13. 前記ダムが、リン酸塩、クエン酸塩、トレハロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０から１２のいずれか１項に記載のチップ。
  14. 前記チャネルは、０．０１μＬから５００μＬの容量を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のチップ。
  15. （ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載のチップと；
    （ｂ）前記チップを受け入れるように構成された本体と；
    （ｃ）前記チップが前記本体に配置された場合に、前記本体との組み合わせで、前記チップを実質的に取り囲む蓋と；および
    （ｄ）光が非汚染性ポリマー層に接触するように第１の波長の光を放射するように位置した光源とを含む、検出器。
  16. 前記非汚染性ポリマー層から放射された光をフィルタリングするように位置したフィルタをさらに備える、請求項１５に記載の検出器。
  17. 前記フィルタを通過する第２の波長の光を増強するように配置されたレンズをさらに備える、請求項１６に記載の検出器。
  18. 前記光源に電力を供給する電源をさらに備える、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の検出器。
  19. 前記検出器は、おおよそ２０ｃｍ３〜３０ｃｍ３の容積を有する、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の検出器。
  20. 請求項１５に記載の（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）と；
    前記非汚染性ポリマー層から放射された第２の波長の光をフィルタリングするように位置したフィルタと；
    前記フィルタを通過する前記第２の波長の光を増強するように位置したレンズと；および
    前記光源に電力を供給する電源と；を含み、
    検出器は、おおよそ２０ｃｍ３〜３０ｃｍ３の容積を有する、検出器。
  21. 請求項１５に記載の（ａ）及び（ｄ）と
    ；
    前記第１の波長の光をフィルタリングし、かつ非汚染性ポリマー層から放射された第２の波長の光がフィルタを通過するように位置したフィルタと；
    前記フィルタを通過する前記第２の波長の光を増強するように位置したレンズと；
    前記光源に電力を供給する電源と；
    本体と；および
    検出器内に含まれる場合に、本体との組み合わせで、実質的にチップを取り囲む蓋と；を含み、
    検出器は、おおよそ２０ｃｍ３〜３０ｃｍ３の容積を有する、検出器。
  22. 前記検出器は、２５ｃｍ３の容積を有する、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の検出器。
  23. 前記検出器は、自給式である、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の検出器。
  24. 前記光源は、１つ以上の発光ダイオードを含む、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の検出器。
  25. 前記光源は、前記チップ内に含まれる検出剤の励起を可能にする角度で、前記チップの前記非汚染性ポリマー層を照射する、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の検出器。
  26. 前記検出剤は、フルオロフォアである、請求項２５に記載の検出器。
  27. 前記検出器は、さらに１つから８つの光源を含む、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載の検出器。
  28. 撮像装置に接続されている、請求項１５〜２７のいずれか１項に記載の検出器。
  29. 前記撮像装置はスマートフォンである、請求項２８に記載の検出器。
  30. チップを含み、
    前記チップは、第１の面を有する第１の基板を含み、
    前記第１の面は実質的に平坦であり、
    前記非汚染性ポリマー層は、前記光源と前記非汚染性ポリマー層とが、前記第１の面の反対側となるように位置し、および
    前記光源は、前記第１の面に垂直な線から測定して９０度以下の角度で、前記第１の基板および前記非汚染性ポリマー層を照射するように構成されている、請求項１５〜２９のいずれか１項に記載の検出器。
  31. 前記フィルタと前記レンズとの間の距離は、０ｃｍ〜３ｃｍの範囲である、請求項１７、２０、又は２１に記載の検出器。
  32. 前記チップを備え、前記フィルタと前記チップとの間の距離は、０ｃｍ〜３ｃｍの範囲である、請求項１６、２０又は２１に記載の検出器。
  33. 前記光源から前記チップまでの距離が、０ｃｍ〜５ｃｍの範囲である、請求項１６、２０又は２１に記載の検出器。
  34. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載のチップを含む検出器。
  35. 少なくとも１つの捕捉剤を非汚染性ポリマー層中へと堆積する工程を含み、前記非汚染性ポリマーはチップによって取り囲まれ、前記非汚染性ポリマー層が請求項１に記載の非汚染性ポリマー層を含む、チップを作製する方法。
  36. 前記非汚染性ポリマー層上に、少なくとも１つの検出剤を堆積する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記非汚染性ポリマー層上に、少なくとも１つの賦形剤を堆積する工程をさらに含む、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. 前記非汚染性ポリマー層の幅にわたってダムを堆積させる工程をさらに含む、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. ａ）請求項１〜１４のいずれか１項に記載のチップをサンプルと接触させる工程と；および
    ｂ）検体の存在または非存在を決定する工程とを含み、
    前記チップからの検出可能なシグナルは、検体の存在を示し、または前記チップからの検出可能なシグナルが存在しないことは、検体の非存在を示す、検体の存在または非存在を検出する方法。
  40. 前記検体が、表面抗原、溶液媒介抗原、または結合した抗原である、または含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記検体が、ヒトＡ型血液型抗原、ヒトＢ型血液型抗原、ヒトＡＢ血液型抗原、ヒトＯ型血液型抗原、ヒトＲｈ因子抗原、グリコホリン、もしくはそれらのいずれかの組み合わせである、または含む、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. 前記検体は、生物脅威病原体である、または含む、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記生物脅威病原体が、炭疽病、リシン毒素、ペスト、野兎病、天然痘、ブルセラ症、チフス熱(typhus fever)、ウイルス性脳炎、ウイルス性出血熱、Ｑ熱、メリディオド症、鼻疽、ボツリヌス毒素、ＳＥＢ毒素、または食中毒細菌である、または含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記検体が感染性病原体に由来する抗原である、請求項３９に記載の方法。
  45. 前記検体が癌抗原である、請求項３９に記載の方法。
  46. 前記検体が、心臓血管疾患に関連する抗原である、請求項３９に記載の方法。
  47. 前記検体が、代謝性疾患に関連する抗原である、請求項３９に記載の方法。
  48. 前記検体が、個々の被験体由来である、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のチップと；
    検出器と；および
    携帯電話とを含む、検体を検出するためのシステム。
  50. 前記チップが、前記非汚染性ポリマー層上に配置された、捕捉剤と、検出剤とを含む、請求項４９に記載のシステム。
  51. 前記捕捉剤が非汚染性ポリマー層に非共有結合的に付着している、請求項５０に記載のシステム。
  52. 前記検体が、ヒトＡ血液型抗原、ヒトＢ血液型抗原、ヒトＡＢ血液型抗原、ヒトＯ血液型抗原、ヒトＲｈ因子抗原、グリコホリン、生物脅威病原体、感染性病原体に由来する抗原、癌抗原、心臓血管疾患に関連する抗原、代謝性疾患に関連する抗原、もしくはそれらのいずれかの組み合わせ、もしくは上記のいずれかを認識する抗体である、または含む、請求項４９から５１のいずれか１項に記載のシステム。
  53. 前記検出剤がフルオロフォアを含み、かつ前記検出器が前記フルオロフォアを励起する光の波長を放射する光源を含む、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載のシステム。
  54. 請求項１〜１４のいずれか１項のチップと；
    請求項１５〜３４のいずれか１項の検出器と；および
    携帯電話とを含む、検体を検出するためのシステム。
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