JP7454225B2 - 検出対象の分析用センサ作製用基材、検出対象の分析用センサ、及び検出対象の分析法 - Google Patents

検出対象の分析用センサ作製用基材、検出対象の分析用センサ、及び検出対象の分析法 Download PDF

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Description

特許法第３０条第２項適用 ▲１▼ 発行日：令和１年９月４日 刊行物名：第１３回バイオ関連化学シンポジウム 講演要旨集 ▲２▼ 開催日：令和１年９月４日～６日 集会名：第１３回バイオ関連化学シンポジウム ▲３▼ 発行日：令和２年２月２８日 刊行物名：第６７回応用物理学会春季学術講演会 講演予稿集 ▲４▼ 掲載年月日：令和２年３月５日 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｎｅｎｋａｉ．ｃｓｊ．ｊｐ／Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ／ｄｅｔａｉｌ／ｙｅａｒ／２０２０／ｌｅｃｔｕｒｅ＿ｎｏ／２Ｇ２－１１
本発明は、検出対象を基材上で迅速に検出する技術に関する。より具体的には、本発明は、検出対象の分析用センサ作製用基材及びその製造方法、検出対象の分析用センサ及びその製造方法、並びに検出対象の分析法に関する。
エクソソーム等の小型細胞外小胞（Small Extracellular Vesicles；ｓＥＶｓ）は細胞から放出される小胞体の一つであり、直径２０～２００ｎｍの脂質二重膜小胞である。小型細胞外小胞は、その内部にタンパク質、及びｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの核酸を内包するとともに、その表面にもタンパク質を有している。小型細胞外小胞はこのような物質に特徴づけられているため、小型細胞外小胞の特徴を解析することで、分泌した細胞がどのような細胞であるかを推測できると考えられている。また、小型細胞外小胞は様々な体液中で存在が確認されており、比較的容易に採取することができる。
癌細胞から分泌される小型細胞外小胞は腫瘍由来の物質を含んでいる。したがって、体液中の小型細胞外小胞に含まれる物質を解析することで癌の診断を行うことができると期待されている。さらに、小型細胞外小胞は細胞によって能動的に分泌されるものであることから、がんの早期段階であっても何らかの特徴を呈していることが予想されている。
エクソソームの検出方法は種々報告されている。特に、特許文献１に記載されるバイオセンサは、分子インプリント技術により形成された穴を有するポリマー膜において、当該穴の中に選択的に抗体と蛍光分子とが導入されていることで、検出対象となるエクソソームを当該穴の中で特異的に抗原抗体結合させると同時に蛍光検出が可能であるため、特異性及び迅速性に優れたセンサとして有用である。
抗体は、その優れた特異性と親和性とにより、バイオセンサの性能に大きく寄与している。しかしながら、抗体が生体分子であるがゆえに、抗体を用いたバイオセンサは、その作製にある程度のコストを要するとともに、保存及び使用時において温度及びｐＨ等の条件を厳密に管理する必要がある。
ここで、抗体のように分子認識能力を有する物質として、核酸アプタマーが知られている。核酸アプタマーは、化学的に全合成が可能であるため安価に合成でき、外部刺激に対する安定性も高い。
その一方で、非特許文献１に記載されているように、核酸アプタマーには、標的分子に対する結合能がタンパク質からなる抗体と比較して低い場合が多いことが問題点として挙げられる。この問題点は、タンパク質である抗体が２０種類のアミノ酸を構成要素とすることに対し、核酸アプタマーがわずか４種類の塩基を構成要素とするにすぎないことに起因している。具体例としては、非特許文献２のデータによると、ヒトＣＤ６３に特異的なアプタマーの解離定数Ｋｄはわずか１７．１ｎＭである。
核酸アプタマーの親和性を向上させるために、構成塩基として、天然塩基に修飾基を導入したものを用いたり、人工塩基を用いたりすることで、塩基のバリエーションを増やす研究がなされている。非特許文献１では、天然型塩基とは性質の異なる人工塩基を組み込むことにより、ＤＮＡアプタマーの親和性を高める技術を提供しており、具体的には、人工塩基７として－（２－チエニル）イミダゾ［４，５－ｂ］ピリジンを組み込むことで、ＤＮＡアプタマーの親和性が１００倍ほど向上したことが記載されている。
国際公開第２０１８／２２１２７１号
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ３１，ｐａｇｅｓ４５３－４５７（２０１３） "CD63 Aptamer Data Sheet"、［online］、平成１０年４月１日、BasePair Biotechnologies, Inc.、［令和２年３月２５日検索］、インターネット＜URL： https://www.basepairbio.com/wp-content/uploads/2017/04/ATW0056-CD63-Aptamer-Data-Sheet_15Sept17.pdf＞
バイオセンサにおいて、分子認識能力を有する物質として核酸アプタマーを用いれば、抗体を用いる場合に比べ、作製コスト低減、並びに、保存及び使用時における安定性向上が期待できる。しかしながら、天然塩基からなる核酸アプタマーの結合能が低いことが多いことに鑑みると、バイオセンサの結合活性を高める目的においては、天然塩基からなる核酸アプタマーを用いる選択肢は無かった。
また、結合能の低い核酸アプタマーの結合活性を高める技術は、専ら、人工塩基の導入に依存しているのが現状である。核酸アプタマーの構成要素として人工塩基を用いると、天然塩基のみで構成される核酸アプタマーの作製技術（ＳＥＬＥＸ法）で用いられる通常のクローニング及びシーケンスができず、ランダムライブラリーから人工塩基の位置を特定するために特殊な手法を要する制約を伴う。そのような制約を必要としない他の手段でバイオセンサの結合活性の向上が可能になれば、バイオセンサ技術の裾野は更に拡大できると考えられる。
そこで本発明の目的は、小型細胞外小胞等の検出対象を、高い特異性及び迅速性をもって検出でき、更に、高い安定性と共に、向上した結合活性が両立した測定系を提供することにある。
本発明者は、分子インプリント技術により形成された穴を有するポリマー膜において、当該穴の中に選択的に抗体と蛍光分子とが導入されているバイオセンサにおいて、敢えて、抗体の代わりに天然塩基からなる核酸アプタマーを導入したところ、その結合能が、抗体を導入した場合を凌駕する予想外なレベルに高められることを見出した。本発明は、この知見に基づき、さらに検討を重ねることにより完成された。
本発明は、検出対象の分析用センサ作製用基材及びその製造方法、検出対象の分析用センサ及びその製造方法、並びに検出対象の分析法を含む。すなわち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み、
前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し、
前記凹部内に、シグナル物質結合用基と、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材。
項２． 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の長さが８塩基長以上である、項１に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項３． 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基が単鎖である、項１又は２に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項４． 前記ポリマー膜が、前記検出対象又は前記検出対象よりサイズが大きい対象を鋳型とする分子インプリントポリマーで構成され、前記凹部が前記鋳型の表面形状の一部に対応する、項１～３のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項５． 前記シグナル物質結合用基がチオール基である、項１～４のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項６． 項１～５のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材と、
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に結合した、前記検出対象に特異的な核酸アプタマーと、
前記シグナル物質結合用基に結合したシグナル物質と、
を含む、検出対象の分析用センサ。
項７． 前記検出対象が膜構造を有する微小粒体である、項６に記載の検出対象の分析用センサ。
項８． 前記膜構造を有する微小粒体が細胞外小胞である、項７に記載の検出対象の分析用センサ。
項９． 前記検出対象に特異的な核酸アプタマーが、前記膜構造を有する微小粒体の表面に発現している特異的分子に対する特異的結合能を有する、項６～８のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ。
項１０． 項６～９のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサに、検出対象を含む試料を接触させ、前記核酸アプタマーに前記検出対象を結合する工程と、
前記シグナル物質に由来するシグナルの変化を検出する工程と、
を含む、検出対象の分析法。
項１１． 基材に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と重合開始性基とを表面に有する単分子膜を形成する単分子膜形成工程（１－１）と、
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に対し、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と相補結合が可能なポリヌクレオチド基を表面に有する鋳型を導入する鋳型導入工程（１－２）と、
前記鋳型の表面を、可逆的連結基を介して重合性官能基で修飾する表面修飾工程（１－３）と、
重合性モノマーを加え、前記重合性モノマー及び前記重合性官能基を基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程（１－４）と、
前記相補結合及び前記可逆的連結基を開裂させてそれぞれ核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基及びシグナル物質結合用基へ変換するとともに前記鋳型を除去する除去工程（１－５）と、
を含む、検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項１２． 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の長さが８塩基長以上である、項１１に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項１３． 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基が単鎖である、項１１又は１２に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項１４． 前記鋳型が、表面に、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とともに、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合性基を有する、項１１～１３のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項１５． 前記鋳型がシリカ粒子である、項１１～１４のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項１６． 前記シグナル物質結合用基がチオール基であり、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基がチオール基である、項１１～１５のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項１７． 項１１～１６のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法を行う工程（１）と、
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に、検出対象に特異的な核酸アプタマーを相補結合によって結合する工程（２）と、
前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を結合する工程（３）と、
を含む、検出対象の分析用センサの製造方法。
本発明によれば、小型細胞外小胞等の検出対象を、高い特異性及び迅速性をもって検出でき、更に、高い安定性と共に、向上した結合活性が両立した測定系が提供される。つまり、本発明によれば、分子インプリント技術により形成された穴を有するポリマー膜において、当該穴の中に選択的に核酸アプタマーと蛍光分子とが導入されるようにバイオセンサを構築することによって、当該穴の中に抗体を導入した場合と対比して格段に高い結合能が奏され、これによって、より一層高い感度で検出対象を検出することが可能となる。
本発明によって奏される結合能の高さについては、核酸アプタマーとして天然塩基からなる核酸アプタマーを用いた場合であっても、抗体の結合能の１００倍を超えるケースも可能であった。天然塩基からなる核酸アプタマーの生来的な結合能は、抗体の生来的な結合能を超えるものではなく、むしろ多くの場合で抗体の生来的な結合能よりも低いことに鑑みると、本発明によって抗体を導入した場合に比べて格段に結合能が向上することは、核酸アプタマーの生来的な結合能からみれば驚異的な向上効果であるといえる。このような効果がもたらされる具体的なメカニズムについては定かではないが、核酸アプタマーが比較的小さな分子であることにより、分子インプリント技術により形成された微小な穴の中に複数の核酸アプタマーを配することが可能となり、これによってセンシング時に検出対象が複数の結合で捕捉され、検出対象当たりの核酸アプタマーの結合能が驚異的なレベルに引き上げられたと考えられる。さらに、核酸アプタマーとして、人工塩基を導入した高親和性核酸アプタマーを用いても、当該高親和性核酸アプタマーの生来的な結合能を格段に向上させることが期待できる。
本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材の一例を示す模式図である。 本発明の検出対象の分析用センサの一例を示す模式図である。 本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材を製造する方法における単分子膜形成工程（１－１）を説明する模式図である。 図３に引き続く、鋳型導入工程（１－２）を説明する模式図である。 図４に引き続く、表面修飾工程（１－３）を説明する模式図である。 図５に引き続く、重合工程（１－４）を説明する模式図である。 図６に引き続く、除去工程（１－５）を説明する模式図である。 本発明の検出対象の分析用センサの製造方法を示す模式図である。 本発明の検出対象の分析法の一例を説明する模式図である。 実施例３で、本発明の分析用センサを用いた蛍光分析による小型細胞外小胞検出において得られた、小型細胞外小胞濃度に対する蛍光強度変化を表示したグラフとそのカーブフィッティング結果である。
［１．検出対象の分析用センサ作製用基材］
本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材は、後述の発明の分析用センサを作製するための材料となる基材である。この分析用センサ作製用基材は、ユーザが、小型細胞外小胞などの検出対象をより一層感度高く検出可能なセンサへ簡便にカスタマイズできるように構成されている。
本発明の検出対象の分析センサ作製用基材は、基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み；前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し；前記凹部内に、シグナル物質結合用基と、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とを有する。図１に、本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材の一例を模式的に示す。図１に示すように、分析用センサ作製用基材１０は、基材２０とポリマー膜３０とを含む。ポリマー膜３０は基材２０の表面に設けられており、凹部３１を有する。凹部３１は検出対象（後述の検出対象６０）を受け入れ可能な大きさに形成された穴である。分析用センサ作製用基材１０は、凹部３１内に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂと、シグナル物質結合用基３２ｃとを有する。以下、それぞれの要素について詳述する。
［１－１．基材］
基材２０の材料は、例えば、金属、ガラス、及び樹脂からなる群から選択される材料であってよい。金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等が挙げられる。樹脂としては、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、ＡＢＳ（アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体）、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリウレタン、シリコーン樹脂、フッ素樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等が挙げられる。
基材２０は、上述の材料から選ばれる複数の材料が組み合わされて形成されたものであってもよい。例えば、基材２０は、ガラスまたは樹脂の表面に、金属膜が設けられたものであってもよい。また、基材２０の形状としては、板状及び粒子状を問わない。好ましい例としては、金基板、ガラス基板、金ナノ粒子、二酸化珪素粒子（シリカ粒子、ガラスビーズ等）等が挙げられる。
［１－２．ポリマー膜］
ポリマー膜３０は、基材２０に層状に設けられており、複数の凹部３１を有する。凹部３１は、本発明の検出対象の分析用センサにおけるセンサ場となる部分である。凹部３１は、検出対象を受け入れ可能に形成されていれば限定されるものではないが、好ましくは、後述のように分子インプリント重合法を用いることによって形成された、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ；molecularly imprinted polymer）が挙げられる。この場合、凹部３１は、分子インプリント重合法において用いられる鋳型（後述の鋳型４０）によって型取られたものであり、当該鋳型の表面形状の一部に対応する形状を有する。凹部３１は、検出対象を受け入れ可能な大きさで形成されていればよいため、凹部３１の鋳型は、検出対象と同じ大きさの物質であってもよいし、検出対象よりもサイズが大きい物質であってもよい。好ましくは、凹部３１の鋳型は、検出対象よりもサイズが大きい物質である。
なお、凹部３１が検出対象を受け入れ可能な大きさであるとは、核酸アプタマー（後述の核酸アプタマー５５ｄ）及びシグナル物質（後述のシグナル物質５２ｄ）が結合して分析用センサ（後述の分析用センサ５０）となった場合に、検出対象の少なくとも一部が凹部３１内に進入し核酸アプタマーにアプローチして結合可能となる程度に凹部３１が基材２０表面に十分な大きさで開口していることをいう。
凹部３１の開口径は、検出対象により異なり得るため特に限定されないが、たとえば１ｎｍ～１０μｍが挙げられる。ポリマー膜３０の厚みも検出対象により異なり得るため特に限定されないが、たとえば１ｎｍ～１μｍが挙げられる。
ポリマー膜３０を構成するポリマーは、たとえば、生体適合性モノマー由来成分を含む生体適合性ポリマーであってよい。生体適合性とは、生体物質の接着を誘起しない性質をいう。生体適合性モノマーに由来する成分を含むことにより、ポリマー膜３０において非特異的吸着を良好に抑制することができる。上記の生体適合性モノマーとしては、好ましくは親水性モノマーが挙げられ、より好ましくは双性イオンモノマーが挙げられる。
双性イオンモノマーは、酸性官能基（たとえば、リン酸基、硫酸基、およびカルボキシル基など）に由来するアニオン基と、塩基性官能基（たとえば、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基および４級アンモニウム基など）に由来するカチオン基との両方を１分子中に含む。たとえば、ホスホベタイン、スルホベタイン、およびカルボキシベタインなどが挙げられる。
より具体的には、ホスホベタインとしては、ホスホリルコリン基を側鎖に有する分子が挙げられ、好ましくは、２－メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）などが挙げられる。
スルホベタインとしては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３’－メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト（ＳＰＢ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（４－スルホブチル）－３’－メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト（ＳＢＢ）などが挙げられる。
カルボキシベタインとしては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（１－カルボキシメチル）－２’－メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト（ＣＭＢ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－カルボキシエチル）－２’－メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト（ＣＥＢ）などが挙げられる。
これらの双性イオンモノマーの中でも、好ましくはホスホベタインが挙げられ、より好ましくは２－メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）が挙げられる。
ポリマー膜３０における生体適合性モノマー由来成分の割合としては、たとえば１０モル％以上１００モル％以下が挙げられる。生体適合性モノマー由来成分の含有量が上記下限以上であることは、ポリマー膜３０表面における非特異性吸着を抑制する点で好ましい。上記生体適合性モノマー由来成分の割合の範囲の好ましい下限としては、３０モル％以上、より好ましくは５０モル％以上、さらに好ましくは７０モル％以上、一層好ましくは８０モル％以上、より一層好ましくは９０モル％以上、特に好ましくは９５モル％以上が挙げられる。
［１－３．核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基］
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂは、核酸アプタマー（後述の核酸アプタマー５５ｄ）を相補結合させることで分析用センサ作製用基材１０に核酸アプタマーを導入可能とする基である。なお、後に詳述するが、核酸アプタマー５５ｄは、核酸アプタマー５５ｄに延設された導入用ポリヌクレオチド基（後述の導入用ポリヌクレオチド基５５ｂ）と核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂとが相補結合５５を形成することによって導入される。ユーザは、検出対象を自由にターゲティングすることができ、ターゲットとする検出対象に特異的な核酸アプタマーを自由に選択し、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂへ導入することができる。
また、本発明の分析用センサ作製用基材１０は、１個の基材２０上で、一の凹部３１に対し一の種類の核酸アプタマーを導入し、他の凹部３１に対し他の種類の核酸アプタマーを導入することによって、１個の基材２０において複数種の核酸アプタマーを用いた検出対象の分析が可能となるようにカスタマイズすることもできる。なお、１個の基材２０へ複数種の核酸アプタマーを導入する具体的な方法は、ポリマー膜３０上の領域を複数の領域に分画し、分画された領域毎に異なる核酸アプタマーを導入する方法等が挙げられる。分画の方法としては、ポリマー膜３０が不在の部分を設ける方法、ポリマー膜３０上の凹部が不在の部分を設ける方法、ポリマー膜３０上に障壁を凸設する方法等が挙げられる。このようなカスタマイズの具体例としては、一の凹部３１に対し特定の小型細胞外小胞に結合する核酸アプタマーを導入し、他の凹部３１に対し特定のタンパク質（小型細胞外小胞膜に存在しないタンパク質）に結合する核酸アプタマーを導入することによって、１個の基材２０上で、小型細胞外小胞と当該タンパク質との両方の分析が可能となる。また、カスタマイズの別の具体例としては、一の凹部３１に対し特定の小型細胞外小胞の表面タンパク質Ａに結合する核酸アプタマーを導入し、他の凹部３１に対し当該特定の小型細胞外小胞の表面タンパク質Ｂに結合する核酸アプタマーを導入することによって、１個の基材２０上で、小型細胞外小胞上の異なる種類の表面タンパク質の分析が可能となる。これらの具体例は、小型細胞外小胞だけでなく、ウイルス等の他の膜構造を有する微小粒体にも適用でき、また、異なる種類の表面タンパク質だけでなく、異なる種類の表面標的（たとえば、タンパク質と糖鎖等）にも適用できる。
なお、図示された模式図においては、便宜上の観点で、１個の凹部３１に１個の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂが示されているが、実際には、１個の凹部３１に複数の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂが存在している。基材２０表面において、凹部３１以外の部分には核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂは存在しない。
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂは、ポリヌクレオチドで構成される。上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれであってもよいが、安定性の観点から、好ましくはＤＮＡが挙げられる。上記ポリヌクレオチドを構成する塩基としては、天然塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ））及び人工塩基のいずれであってもよいが、製造容易性及びユーザによるカスタマイズ容易性の観点から、天然塩基が挙げられる。
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂの長さとしては特に限定されないが、好ましい相補結合５５を得る観点から、好ましくは８塩基長以上、より好ましくは１２塩基長以上、さらに好ましくは１６塩基長以上、一層好ましくは１８塩基長以上が挙げられる。また、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂの長さの範囲の上限としては、凹部３１中での検出対象の捕捉を可能とする限りにおいて特に限定されないが、例えば２５塩基長以下、好ましくは２３塩基長以下、より好ましくは２１塩基長以下が挙げられる。
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂの配列は、導入する核酸アプタマーの認識部位が誤ってハイブリダイズしない配列が適宜選択される。つまり、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂの配列は、核酸アプタマーと類似しないように設計されればよく、その限りにおいてランダムな塩基配列で構成されていてもよいし、単一ヌクレオチドのポリマーであってもよい。
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂは、図示した好ましい態様においては単鎖であるが、本発明における核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基は、相補結合により核酸アプタマーを導入できる限り、単鎖に限定されるものではなく、二重鎖以上の多重鎖であることも許容する。
［１－４．シグナル物質結合用基］
シグナル物質結合用基３２ｃは、シグナル物質（後述のシグナル物質５２ｄ）を結合させることで分析用センサ作製用基材１０にシグナル物質を導入可能とする基である。ユーザは、シグナル物質を自由に選択し、シグナル物質結合用基３２ｃへ導入することができる。
また、本発明の分析用センサ作製用基材１０は、１個の基材２０において、一の凹部３１と他の凹部３１とで異なる種類の核酸アプタマーを導入する場合は、核酸アプタマーの種類ごとに異なるシグナル物質を導入するようにカスタマイズすることもできる。
本発明においては、１個の凹部３１につき、通常複数個のシグナル物質結合用基３２ｃが設けられている。シグナル物質結合用基３２ｃは、本発明の分析センサの凹部３１内でのセンシング時（検出対象を凹部３１内に受け入れた時）に、シグナル強度の変化を検出可能となるように十分な量が用意されていればよい。従って、１個の凹部３１に設けられるシグナル物質結合用基３２の量は特に限定されるものではなく、一例として、１個の凹部３１につき例えば１個～約２０００個程度が挙げられる。しかしながら、１個の凹部３１当たりのシグナル物質結合用基３２の量はこれに限定されるものではなく、鋳型の特性、ポリマー膜厚、凹部３１の大きさ及び／又は検出すべき対象物質の大きさにもよって異なり得る。なお、基材２０表面において、凹部３１以外の部分にはシグナル物質結合用基３２ｃは実質的に設けられない。
シグナル物質結合用基３２ｃは、不可逆的結合性基であってもよいし可逆的結合性基であってもよく、共有結合性基であってもよいし非共有結合性基であってもよい。なお、可逆的結合性基とは、他の可逆的結合性基と結合（共有結合及び非共有結合を問わない）することにより可逆的連結基を構成可能な基であり、可逆的とは、可逆的結合性基から可逆的連結基への変換（結合）及び可逆的連結基から可逆的結合性基への変換（開裂）とが双方向に可能であることをいう。
シグナル物質結合用基３２ｃは、好ましくは可逆的結合性基であり、より好ましくは共有結合性基である。このような基としては、チオール基（対応する可逆的連結基はジスルフィド基）、アミノオキシ基又はカルボニル基（対応する可逆的連結基はオキシム基）、ボロン酸基とジオール基（対応する可逆的連結基は環状ジエステル基）、アミノ基とカルボニル基（対応する可逆的連結基はシッフ塩基）、アルデヒド基もしくはケトン基とアルコール（対応する可逆的連結基はアセタール基）等が挙げられ、好ましくはチオール基が挙げられる。
［１－５．他の態様］
本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材は、核酸アプタマー及びシグナル物質の少なくともいずれかがユーザによってカスタマイズされるように構成されていればよい。したがって、他の態様として、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂの方に、検出対象に特異的な核酸アプタマーがすでに結合していてもよい。この場合、ユーザはシグナル物質を自由に選択して導入することができる。
なお、更に他の態様として、シグナル物質結合用基の方に、すでにシグナル物質が結合していてもよい。この場合、ユーザは検出対象を自由にターゲティングすることができ、ターゲットとする検出対象に特異的な核酸アプタマーを自由に選択し、当該核酸アプタマーを導入することができる。
［２．検出対象の分析用センサ］
本発明の分析用センサは、上述の検出対象の分析用センサ作製用基材と；前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に結合した、前記検出対象に特異的な核酸アプタマーと；前記シグナル物質結合用基に結合したシグナル物質と；を含む。図２に、本発明の検出対象の分析用センサの一例を模式的に示す。図２に示すように、分析用センサ５０は、上述の分析用センサ作製用基材１０のポリマー膜３０に設けられた凹部３１内において、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂに核酸アプタマー５５ｄが結合し、シグナル物質結合用基３２ｃにシグナル物質５２ｄが結合している。
［２－１．検出対象］
本発明の分析用センサの検出対象（後述の検出対象６０）は、核酸アプタマー５５ｄへの特異性結合能を有するものであれば原理上特に限定されるものではない。
検出対象の化学種としては特に制限されず、例えば、生物に由来しない低分子有機化合物及び高分子化合物、生物に由来する低分子低分子有機化合物及び高分子化合物が挙げられる。これらの化学種の中でも好ましくは生物に由来する低分子低分子有機化合物及び高分子化合物が挙げられ、より好ましくは動物に由来する低分子低分子有機化合物及び高分子化合物が挙げられ、具体的には、糖類、脂質類、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド等が挙げられる。生物としては、ヒト及びヒト以外の動物が挙げられ、ヒト以外の動物としては、脊椎動物が挙げられ、好ましくは哺乳動物が挙げられ、例えば、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ハムスタ－、ウサギ、及びヤギ等が挙げられる。
また、検出対象の機能種としても特に限定されず、抗原、抗体、受容体、疾患マーカー、プリオン、膜構造を有する微小粒体等が挙げられる。また、膜構造を有する微小粒体を検出対象とする場合、その標的分子としては、膜構造を有する微小粒体の表面に発現している、抗原、抗体、受容体、及び／又は疾患マーカー；膜構造を有する微小粒体が当該膜構造の内部に発現している、抗原、抗体、受容体、及び／又は疾患マーカー；並びに、膜構造を有する微小粒体が分泌する、抗原、抗体、受容体、及び／又は疾患マーカー等が挙げられる。
疾患マーカーとしては特に限定されないが、例えば、ＭＵＣ－１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２、ＥＲα、ＧＧＴ１、ＣＤ２４、ＰＲ、その他多数の腫瘍マーカー等が挙げられる。
膜構造を有する微小粒体としては、細胞外小胞、細胞内小胞、オルガネラ、ウイルス及び細胞が挙げられる。膜構造としては、脂質二重膜構造が挙げられる。細胞外小胞としては、小型細胞外小胞（ｓＥＶｓ）が挙げられる。小型細胞外小胞（ｓＥＶｓ）は、国際細胞外小胞学会（International Society for Extracellular Vesicles；ＩＳＥＶ）によって定義される、細胞から放出される核を持たない（複製できない）脂質二重膜で囲まれた粒子であり、具体的には、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体等が挙げられる。細胞内小胞としては、リソソーム、エンドソーム等が挙げられる。オルガネラとしては、ミトコンドリア等が挙げられる。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２等）、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ等）、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、ワクチニアウイルス、ジカウイルス、ＲＳウイルス、ヘルペスウイルス、日本脳炎ウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス、エボラウルイルス、ノロウイルス（ＧＩＩ、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４等）、ロタウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、コロナウイルス（ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）等）等が挙げられる。細胞としては、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）等の癌細胞、その他の疾患関連細胞等が挙げられる。これらの膜構造を有する微小粒体の中でも、好ましくは細胞外小胞及び細胞が挙げられ、より好ましくは小型細胞外小胞、ウイルス、癌関連細胞が挙げられる。
小型細胞外小胞の表面に発現している標的（小型細胞外小胞特異的抗原又は小型細胞外小胞抗原）としては、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、ＬＡＭＰ１、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２等のタンパク質；脂質（フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン等のリン脂質等）；糖鎖等が挙げられる。
ウイルスの表面又は内部に発現している標的としては、スパイク（Ｓ）糖タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、ヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）タンパク質、ヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質、非構造（ＮＳ）タンパク質、等が挙げられる。
癌細胞の表面に発現している標的（癌細胞特異的抗原）としては、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１、ＥｐＣＡＭ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、Ｇａｌｅｃｔｉｎｅ３、ＣＤ１５１、Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ８、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＲＰＮ２、ＣＤ４４、ＴＧＦ－β等のタンパク質；脂質（フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン等のリン脂質等）；糖鎖等が挙げられる。
なお、後述のように、シグナル物質５２ｄを、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こす蛍光色素ペアの一方として構成する場合は、検出対象６０には、予め当該蛍光色素ペアの他方を結合させておく。
［２－２．核酸アプタマー（検出対象に特異的な核酸アプタマー）］
核酸アプタマー５５ｄとしては、検出対象への特異的結合能を有する核酸アプタマーが選択される。核酸アプタマーは、所定の標的に対する特異的結合能を有する、比較的短い（例えば２０～２００塩基長さの）塩基配列を有する核酸分子である。検出対象と核酸アプタマー５５ｄとの特的結合の結合様式は限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、電気的吸着などの化学的な結合、及び形状依存的な係合等の物理的な結合等が挙げられる。
本発明において用いられる核酸アプタマー５５ｄとしては、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー及びＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド型アプタマー（ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ型アプタマー）等が挙げられる。安定性の観点から、本発明において用いられる核酸アプタマー５５ｄとしては、好ましくはＤＮＡアプタマーが挙げられる。核酸アプタマー５５ｄを構成する塩基としては、天然塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ））及び人工塩基のいずれであってもよい。
本発明では、検出対象当たりの核酸アプタマーの結合能を各段に向上させることができるため、生来的な結合能が抗体の結合能以下又は抗体の結合能未満である核酸アプタマーであっても、効果的に検出対象当たりの核酸のアプタマー結合能向上効果を得ることができる。このような観点から、本発明における好適な核酸アプタマー５５ｄの構成塩基としては、天然塩基が挙げられる。核酸アプタマー５５ｄの構成塩基が天然塩基であることは、取得容易性、製造容易性及びユーザによるカスタマイズ容易性の観点からも好ましい。なお、核酸アプタマーの生来的な結合能とは、核酸アプタマーが、本発明の分析用センサ５０のような凹部３１内ではなく、平面上に固定された場合又は非固定の遊離状態の場合における結合能をいう。また、結合能は、結合定数又は解離定数によって測定される値である。
無論、本発明においては、より一層向上した結合能を得ることを目的として、核酸アプタマー５５ｄとして、生来的な結合能を向上させた人工塩基を含む核酸アプタマーを用いてもよい。
核酸アプタマー５５ｄの塩基配列及び分子の立体構造は、検出対象に応じて当業者により決定される。核酸アプタマー５５ｄとしては、既に知られている核酸アプタマーを用いることができ、更に、任意の公知の方法によって取得された新たな核酸アプタマーを用いることもできる。核酸アプタマーを取得する方法としては特に限定されず、任意の公知の方法が用いられる。このような方法の代表例としては、ＳＥＬＥＸ法（標的に対して、ランダムな配列を持つ多数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドライブラリーを接触させ、標的に対して親和性の高いオリゴヌクレオチド群を選抜し、選抜したオリゴヌクレオチドを増幅して、標的分子に特異的に結合するかどうかを確認する手法）が挙げられる。
具体的な核酸アプタマー５５ｄの例としては、ＣＤ６３に特異的な核酸アプタマーとしてCACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA（配列番号１）が挙げられ、ＭＵＣ－１に特異的な核酸アプタマーとしてGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG（配列番号２）が挙げられ、ＥｐＣＡＭに特異的な核酸アプタマーとしてCACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG（配列番号３）が挙げられ、ＨＥＲ２に特異的な核酸アプタマーとしてGGGCCGTCGAACACGAGCATGGTGCGTGGACCTAGGATGACCTGAGTACTGTCC（配列番号４）が挙げられ、ＥＲαに特異的な核酸アプタマーとしてATACCAGCTTATTCAATTCGTTGCATTTAGGTGCATTACGGGGGTTATCCGCTCTCTCAGATAGTATGTGCAATCA（配列番号５）等が挙げられる。
具体的な核酸アプタマー５５ｄの他の例としては、プリオン、インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ９Ｎ２等）、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、ワクチニアウイルス、ジカウイルス、ＲＳウイルス、ヘルペスウイルス、日本脳炎ウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス、エボラウルイルス、ノロウイルス（ＧＩＩ、ＧＩＩ．３、ＧＩＩ．４等）、デングウイルス、又はＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）に特異的な核酸アプタマーとして、ウイルス検出と抗ウイルス療法へのアプタマーの応用に関する総説（X. Zou1, J. Wu1, J. Gu1, L. Shen, L. Mao, Application of Aptamers in Virus Detection and Antiviral Therapy, Front. Microbiol. 2019, 10, 1462.）等で報告されているＤＮＡ又はＲＮＡアプタマーが挙げられ、ＳＡＲＳコロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に特異的な核酸アプタマーとして、例えば、Song Y, Song J, Wei X, Huang M, Sun M, Zhu L, Lin B, Shen H, Zhu Z, Yang C, Discovery of Aptamers Targeting Receptor-Binding Domain of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein, Preprint from ChemRxiv, 04 Apr 2020で報告されている、CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACA（配列番号６）、ATCCAGAGTGACGCAGCATTTCATCGGGTCCAAAAGGGGCTGCTCGGGATTGCGGATATGGACACGT（配列番号７）等が挙げられる。
［２－３．シグナル物質］
シグナル物質５２ｄは、検出対象と検出対象に特異的な核酸アプタマー５５ｄとの結合情報を読み出すものとして機能する。シグナル物質５２ｄとしては、凹部３１への検出対象の結合により検知されるシグナル強度が変化したり、スペクトルが変化（例えばピークがシフト）したりするものであれば特に限定されない。たとえば、蛍光物質、放射性元素含有物質、磁性物質等が挙げられる。検出容易性等の観点から、シグナル物質としては蛍光物質であることが好ましい。蛍光物質としては、フルオレセイン系色素、インドシアニン色素などのシアニン系色素、ローダミン系色素などの蛍光色素；ＧＦＰなどの蛍光タンパク質；金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子などが挙げられる。放射性元素含有物質としては、18Ｆ等の放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸、19ＦでラベルしたＭＲＩプローブなどが挙げられる。磁性物質としては、フェリクロームなどの磁性体を有するもの、フェライトナノ粒子、ナノ磁性粒子などにみられるものが挙げられる。
また、シグナル物質５２ｄは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こす蛍光色素ペアの一方として構成することができる。ＦＲＥＴを引き起こす蛍光色素ペアとしては特に限定されず、シグナル物質５２ｄとしてドナー色素及びアクセプター色素のいずれを選択するかも限定されない。好ましくは、シグナル物質５２ｄとしてドナー色素を選択することができる。ＦＲＥＴを引き起こす蛍光色素のペアを構成するドナー色素／アクセプター色素の具体例としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、Ｒ－フィコエリトリン（Ｒ－ＰＥ）／アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等が挙げられる。
［３．検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法］
本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法は、以下の工程を含む。
基材に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と重合開始性基とを表面に有する単分子膜を形成する単分子膜形成工程（１－１）；
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に対し、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と相補結合が可能なポリヌクレオチド基を表面に有する鋳型を導入する鋳型導入工程（１－２）；
前記鋳型の表面を、可逆的連結基を介して重合性官能基で修飾する表面修飾工程（１－３）；
重合性モノマーを加え、前記重合性モノマー及び前記重合性官能基を基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程（１－４）；及び
前記相補結合及び前記可逆的連結基を開裂させてそれぞれ核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基及びシグナル物質結合用基へ変換するとともに前記鋳型を除去する除去工程（１－５）。
図３、４、５、６、及び７に、それぞれ、単分子膜形成工程（１－１）、鋳型導入工程（１－２）、表面修飾工程（１－３）、重合工程（１－４）及び除去工程（１－５）を模式的に示す。つまり、図示された態様において、分析用センサ作製用基材１０を製造する方法は、以下の工程を含む。
基材２０に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂと重合開始性基２３ａとを表面に有する単分子膜２１を形成する単分子膜形成工程（１－１）（図３）；
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂに対し、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂと相補結合４５が可能なポリヌクレオチド基４５ｂを表面に有する鋳型４０を導入する鋳型導入工程（１－２）（図４）；
前記鋳型４０の表面を、可逆的連結基４２を介して重合性官能基３２ａで修飾する表面修飾工程（１－３）（図５）；
重合性モノマー３５ａを加え、前記重合性モノマー３５ａ及び前記重合性官能基３２ａを基質とし、前記重合開始性基２３ａを重合性開始剤として、前記鋳型４０の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜３０を形成する重合工程（１－４）（図６）；及び
前記相補結合４５及び前記可逆的連結基４２を開裂させてそれぞれ核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂ及びシグナル物質結合用基３２ｃへ変換するとともに前記鋳型４０を除去する除去工程（１－５）（図７）。
以下、各工程について図を参照しながら詳述する。
［３－１．単分子膜形成工程］
図３に示すように、単分子膜形成工程では、基材２０に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂと重合開始性基２３ａとを表面に有する単分子膜２１を形成する。
図示された例では、具体的にはまず、基材２０表面に、重合性開始基２３ａと結合性官能基２５ａとを表面に有する単分子膜を形成する。この単分子膜は、重合性開始基２３ａを末端に有する分子と、重合性開始基２３ａとは異なる結合性官能基２５ａを末端に有する分子とを用いた混成自己組織化による混成自己組織化単分子膜（mixed SAMs）として形成することができる。
重合開始性基２３ａとしては、重合開始剤として機能しうる構造を有していれば特に限定されず、後述の重合工程において用いる重合反応に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、重合開始性基２３ａとしては、重合反応時にラジカルを発生する構造を有する基、具体的には有機ハロゲンに由来する炭素－ハロゲン結合基（－ＣＸ基；Ｘはハロゲン原子を示す。）が挙げられる。図示された態様では、重合開始性基２３ａが－ＣＢｒ基である場合を例示している。
結合性官能基２５ａとしては、ポリヌクレオチド２５を結合可能な基であれば特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。ポリヌクレオチド２５は、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂと結合性官能基２５ｃとを有する。図示された態様では、図示された態様では、単分子膜の結合性官能基２５ａがカルボキシル基であり、ポリヌクレオチド２５の結合性官能基２５ｃがアミノ基である場合を例示している。
次に、上記の単分子膜におけるカルボキシル基である結合性官能基２５ａを、必要に応じて活性エステル化した後、ポリヌクレオチド２５の結合性官能基２５ｃを反応させることで、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂを延設する。これによって、単分子膜２１を得ることができる。
［３－２．鋳型導入工程］
図４に示すように、鋳型導入工程では、単分子膜２１表面の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂに対し、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂと相補結合４５が可能なポリヌクレオチド基４５ｂを表面に有する鋳型４０を導入する。
鋳型４０は、検出対象と同じ物質であってもよいし、検出対象と異なる物質であってもよい。本発明においては、鋳型４０として、人工粒子を用いることができる。人工粒子は、工業生産品であり粒径制御されていることから、分析用センサ作製用基材に形成する凹部のサイズの制御及び均質化が容易であり、得られる分析用センサ作製用基材から、より一層分析特性に優れた分析用センサを作製することができる点で好ましい。
鋳型４０として用いられる人工粒子としては、分子インプリントにおける鋳型として用いることができる限度において特に限定されず、人工的に製造された無機粒子及び有機粒子が挙げられる。無機粒子としては、金属、金属の酸化物、窒化物、フッ化物、硫化物、ホウ化物、及びそれらの複合化合物、並びに、ハイドロキシアパタイト等が挙げられ、好ましくは、二酸化珪素（シリカ）が挙げられる。また、有機粒子としては、ラテックス硬化物、デキストラン、キトサン、ポリ乳酸、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリスチレン、ポリエチレンイミン等が挙げられる。
凹部３１（図１等参照）の大きさが鋳型４０の大きさに依存するため、鋳型４０の大きさは検出対象の大きさに応じて適宜決定することができる。目的の検出対象を受け入れるための凹部３１を形成するためには、当該検出対象と同程度か又はそれ以上の大きさを有する鋳型４０を用いればよい。例えば、鋳型４０粒子の平均粒子径としては、例えば１ｎｍ～１０μｍ、好ましくは５０～１μｍ、より好ましくは１００～５００ｎｍ、さらに好ましくは１５０～２００ｎｍが挙げられる。なお、平均粒子径とは、動的光散乱法により測定されるＺ平均粒子径を指す。
鋳型４０は、表面に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂと相補結合４５が可能なポリヌクレオチド基４５ｂを表面に有する。具体的には、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂの配列をＡとすると、鋳型４０のポリヌクレオチド基４５ｂは、配列Ａと相補的な塩基のみからなる完全相補配列であることが最も好ましいが、相補結合４５が形成可能である限りにおいて、ミスマッチ塩基を含んでいることも許容する。
図示された態様では、鋳型４０は、表面に、可逆的結合性基４２ｃを有する。可逆的結合性基４２ｃは、シグナル物質結合用基３２ｃ（前述図１、及び後述図５）と結合することで可逆的連結基４２（後述図５）の形成が可能な基である。このような基としては、チオール基（対応する可逆的連結基４２はジスルフィド基）、アミノオキシ基又はカルボニル基（対応する可逆的連結基４２はオキシム基）、ボロン酸基とジオール基（対応する可逆的連結基４２は環状ジエステル基）、アミノ基とカルボニル基（対応する可逆的連結基４２はシッフ塩基）、アルデヒド基もしくはケトン基とアルコール（対応する可逆的連結基４２はアセタール基）等が挙げられ、好ましくはチオール基が挙げられる。
粒子の表面を特定の基で修飾する方法は広く知られているため、当業者は、導入すべきポリヌクレオチド基４５ｂ及び可逆的結合性基４２ｃを、それら基の種類及び人工粒子の構成材料を考慮し、公知の表面修飾法に基づいて適宜導入することができる。
このように、ポリヌクレオチド基４５ｂと可逆的結合性基４２ｃとを表面に有する鋳型４０を結合させることによって、基材２０上の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂに対し、相補結合４５を形成することによって、鋳型４０が導入される。
なお、図示された模式図では、便宜上の観点で、基材２０と鋳型４０との間で形成された相補結合４５が１個示されているが、実際には、基材２０と鋳型４０との間で複数の相補結合４５が形成される。
［３－３．表面修飾工程］
図５に示すように、表面修飾工程では、鋳型４０の表面を、可逆的連結基４２を介して重合性官能基３２ａで修飾する。
可逆的結合性基４２ｃは、他の可逆的結合性基（具体的には前述のシグナル物質結合用基３２ｃが相当する）と結合することで可逆的連結基４２に変換される基であればよく、たとえば、チオール基（対応する可逆的連結基４２はジスルフィド基）、アミノオキシ基又はカルボニル基（対応する可逆的連結基４２はオキシム基）、ボロン酸基とジオール基（対応する可逆的連結基４２は環状ジエステル基）、アミノ基とカルボニル基（対応する可逆的連結基４２ｂはシッフ塩基）、アルデヒド基もしくはケトン基とアルコール（対応する可逆的連結基４２はアセタール基）等が挙げられる。
重合性官能基３２ａは、重合性不飽和結合を有していればよく、代表的なものとして（メタ）アクリル基が挙げられる。
図示された態様では、鋳型４０の表面における可逆的結合性基４２ｃの一例であるチオール基に、重合性官能基３２ａの一例である（メタ）アクリル基とジスルフィド結合とを含む分子３２をジスルフィド交換することにより、チオール基を可逆的連結基４２であるジスルフィド基に変換することで鋳型４０の表面を重合性官能基３２ａで修飾する態様を例示している。
このように、予め、表面に可逆的結合性基４２ｃを有している鋳型４０を用いることで、可逆的連結基４２を鋳型４０の表面のみにデリバリすることができる。
［３－４．重合工程］
図６に示すように、重合工程では、重合性モノマー３５ａを加え、重合性官能基３２ａ及び重合性モノマー３５ａを基質とし、重合開始性基２３ａを重合性開始剤として、鋳型４０の表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成する。これによって、基材２０表面に、凹部３１を有するポリマー膜３０を形成する。なお、本明細書においては、鋳型を用いたインプリンティング重合によって合成されるポリマーを、便宜上、分子インプリントポリマーと記載するものとし、本発明では、鋳型として分子でないもの（たとえば膜構造を有する微小粒体）も許容するため、鋳型として分子ではないものを用いたインプリンティング重合によって合成されるポリマーも含まれるものとする。
重合性モノマー３５は、上述のポリマー膜３０について述べたように、生体適合性モノマーであり、好ましくは親水性モノマーであり、より好ましくは双性イオンモノマーである。
双性イオンモノマーは、酸性官能基（たとえば、リン酸基、硫酸基、およびカルボキシル基など）に由来するアニオン基と、塩基性官能基（たとえば、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基および４級アンモニウム基など）に由来するカチオン基との両方を１分子中に含む。たとえば、ホスホベタイン、スルホベタイン、およびカルボキシベタインなどが挙げられる。
より具体的には、ホスホベタインとしては、ホスホリルコリン基を側鎖に有する分子が挙げられ、好ましくは、２－メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）などが挙げられる。
スルホベタインとしては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３’－メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト（ＳＰＢ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（４－スルホブチル）－３’－メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト（ＳＢＢ）などが挙げられる。
カルボキシベタインとしては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（１－カルボキシメチル）－２’－メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト（ＣＭＢ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－カルボキシエチル）－２’－メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト（ＣＥＢ）などが挙げられる。
基材２０表面上で、重合性官能基３２ａ、重合性モノマー３５ａ、重合開始性基２３ａおよび鋳型４０が共存する重合反応系が構築されることにより、表面開始原子移動ラジカル重合（ＳＩ－ＡＴＲＰ）が進行する。当該重合反応系には、さらに、重合触媒として、遷移金属または遷移金属化合物と配位子とから形成される遷移金属錯体を含むことが好ましく、さらに還元剤を用いることがより好ましい。
遷移金属または遷移金属化合物としては、金属銅又は銅化合物が挙げられ、銅化合物としては塩化物、臭素化物、ヨウ素化物、シアン化物、酸化物、水酸化物、酢酸化物、硫酸化物、硝酸化物、好ましくは臭素化物が挙げられる。配位子としては、多座アミンが好ましく、具体的には二座～六座配位子が挙げられる。これらの中でも、好ましくは二座配位子が挙げられ、より好ましくは２，２－ビピリジル、４，４’－ジ－（５－ノニル）－２，２’－ビピリジル、Ｎ－（ｎ－プロピル）ピリジルメタンイミン、Ｎ－（ｎ－オクチル）ピリジルメタンイミン等が挙げられ、より好ましくは２，２－ビピリジルが挙げられる。
還元剤としては、アルコール、アルデヒド、フェノール類及び有機酸化合物等が挙げられ、好ましくは有機酸化合物が挙げられる。有機化合物としては、クエン酸、シュウ酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル等が挙げられ、好ましくはアスコルビン酸、アスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル等が挙げられ、より好ましくはアスコルビン酸が挙げられる。
ラジカル発生源である重合開始性基２３ａから重合性モノマー３５ａを基質としてポリマー鎖が伸長し、ポリマー膜の厚みを増すと共に、伸長ポリマー鎖が鋳型４０表面に達すると、当該表面に修飾された重合性官能基３２ａも基質として取り込むことで、鋳型４０の表面形状に沿った形状の凹部３１が形成されるようにポリマーが合成される。ポリマー膜は、基材２０に導入された鋳型４０の上下径（図面の上方を上とした場合）の１／３～１／２程度に相当する厚みまで成長させることができる。これによって、ポリマー膜３０が得られる。なお、重合反応系における反応溶媒としては、緩衝液等の水系の溶媒が好ましく用いられる。
［３－５．除去工程］
図７に示すように、除去工程では、相補結合４５を開裂させて核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂ変換し、可逆的連結基４２を開裂させたシグナル物質結合用基３２ｃへ変換することで、鋳型４０を除去する。上述の表面修飾工程で可逆的連結基４２が鋳型４０の表面のみにデリバリされているため、鋳型４０が除去された跡であるポリマー膜３０の凹部３１には、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂが残るとともに、凹部３１内にのみ、可逆的連結基４２から生じたシグナル物質結合用基３２ｃが配置される。これによって、分析用センサ作製用基材１０が得られる。
なお、図示された模式図では、便宜上の観点で、１個の凹部３１に１個の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂが生じることが示されているが、上述のとおり、基材２０と鋳型４０との間で複数の相補結合４５が形成されるため、実際には、１個の凹部３１に複数の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂが生じる。
［４．検出対象の分析用センサの製造］
本発明の検出対象の分析用センサの製造方法は以下の工程を含む。
検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法を行う工程（１）；
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に、検出対象に特異的な核酸アプタマーを相補結合によって結合する工程（２）；及び
前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を結合する工程（３）。
工程（２）及び工程（３）の順番としては、いずれを先に行ってもよいし、同時に行ってもよい。
図８に、本発明の検出対象の分析用センサの製造方法を模式的に示す。つまり、図示された態様において、検出対象の分析用センサ５０の製造方法は以下の工程を含む。
検出対象の分析用センサ作製用基材１０の製造方法を行う工程（１）；
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂに、検出対象に特異的な核酸アプタマー５５ｄを相補結合５５によって結合する工程（２）；及び
シグナル物質結合用基３２ｃにシグナル物質５２ｄを結合する工程（３）。
検出対象の分析用センサ作製用基材１０を製造する工程（１）については、上記「３．検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法」で詳述した通りであり、この工程（１）では、上述の単分子膜形成工程（１－１）、鋳型導入工程（１－２）、表面修飾工程（１－３）、重合工程（１－４）及び除去工程（１－５）を行う。
工程（２）では、図８に示すように、検出対象の分析用センサ作製用基材１０に核酸アプタマー５５ｄを与える成分５５ＡＰをハイブリダイズさせる。核酸アプタマー５５ｄを与える成分５５ＡＰは、核酸アプタマー５５ｄと、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂと相補結合５５を形成可能なポリヌクレオチド基５５ｂとを含む。核酸アプタマー５５ｄとしては、上記「２－２．核酸アプタマー（検出対象に特異的な核酸アプタマー）」において述べた通りである。また、ポリヌクレオチド基５５ｂは、核酸アプタマー５５ｄに延設されたポリヌクレオチドであり、核酸アプタマー５５ｄとポリヌクレオチド基５５ｂとは、直接的に結合していてもよいし、他の連結基（例えば塩基又はポリヌクレオチド）が介在していることも許容する。ポリヌクレオチド基５５ｂとしては、上記「３－２．鋳型導入工程」において鋳型４０のポリヌクレオチド基４５ｂとして述べた基と同様であり、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂの配列をＡとすると、配列Ａと相補的な塩基のみからなる完全相補配列であることが最も好ましいが、相補結合５５が形成可能である限りにおいて、ミスマッチ塩基を含んでいることも許容する。
なお、図示された模式図では、便宜上の観点で、１個の凹部３１に１個の核酸アプタマー５５ｄが導入されることが示されているが、上述のとおり、１個の凹部３１に複数の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂが存在するため、実際には、１個の凹部３１に複数の核酸アプタマー５５ｄが導入される。
工程（３）では、図８に示すように、検出対象の分析用センサ作製用基材１０にシグナル物質５２ｄを与える成分５２ＳＧを反応させる。シグナル物質５２ｄを与える成分５２ＳＧは、シグナル物質５２ｄと結合性基５２ｃとを含む。シグナル物質５２ｄとしては、上記「２－３．シグナル物質」において述べた通りである。結合性基５２ｃは、シグナル物質結合用基３２ｃと反応及び結合可能な基が選択される。
分析用センサ作製用基材１０は、基板２０表面においてセンサ場となる凹部３１のみにシグナル物質結合用基３２ｃを有するため、シグナル物質５２ｄは結合性基５２ｃの反応性によって凹部３１のみに配置されることができる。
１個の分析用センサ作製用基材１０に対しては、全ての凹部３１に１種類の核酸アプタマー５５ｄと１種類のシグナル物質５２ｄとを導入してもよいし、一の凹部３１に対し一の種類の核酸アプタマーを導入し、他の凹部３１に対し他の種類の核酸アプタマーを導入するとともに、それぞれ核酸アプタマーの種類に対応して異なる種類のシグナル物質を導入してもよい。
［５．対象物質の分析法］
図９に、本発明の検出対象の分析法の一例を説明する模式図を示す。図９に示すように、本発明の検出対象の分析法では、分析用センサ５０の基材２０表面上に、検出対象６０を含む分析試料液を接触させる。
検出対象６０としては、核酸アプタマー５５ｄと特異的に結合する物質であれば原理上特に限定させるものではなく、上記「２－１．検出対象」で述べたとおりの物質が挙げられる。
検出対象６０を含む分析試料液の態様としては特に限定されないが、分析の迅速性の観点から、検出対象６０を分離する処理を経ていないものであることが好ましい。検出対象６０を分離する処理としては、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、サイズフィルターを用いたろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。
検出対象６０を含む分析試料液としては、（検出対象６０が細胞または細胞外小胞である場合は）検出対象６０が存在している環境から得られる試料、又は、（検出対象６０が細胞外小胞であって、細胞からの産生物である場合は）検出対象６０が生じうる環境から得られる試料であってよい。具体的には、細胞を含む生体試料であってよい。検出対象６０が小型細胞外小胞などの細胞外小胞である場合、検出対象６０を産生する細胞としては、がん細胞、肥満細胞、樹状細胞、網赤血球、上皮細胞、Ｂ細胞、神経細胞等が挙げられる。より具体的には、検出対象６０を含む分析試料液としては、血液、乳汁、尿、唾液、リンパ液、髄液、羊水、涙液、汗、鼻漏等の体液が挙げられ、さらに、これらの体液を、不要成分を除去する等の前処理を行った処理液、及びこれらの体液に含まれる細胞を培養して得られた培養液も挙げられる。これらの分析試料液のうち、尿、唾液、涙液、汗、鼻漏等の体液は、非侵襲性及び採取容易性の点で特に好ましい。
分析用センサ５０の基材２０表面上に検出対象６０を含む分析試料液を接触させると、検出対象６０が凹部３１内の核酸アプタマー５５ｄに特異的に捕捉される。例えば検出対象６０が小型細胞外小胞である場合、小型細胞外小胞は膜タンパク質（小型細胞外小胞特異的抗原）としての、例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ８２、ＣＤ１３、ＣＤ１１、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ－１、Ｒａｂ５、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、ＬＡＭＰ１等を介して核酸アプタマー５５ｄに特異的に結合することによって捕捉される。検出対象６０が癌細胞である場合、癌細胞は癌細胞特異的抗原としての、例えば、Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１、ＥｐＣＡＭ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、Ｇａｌｅｃｔｉｎｅ３、ＣＤ１５１、Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ ８、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＲＰＮ２、ＣＤ４４、ＴＧＦ－β等を介して核酸アプタマー５５ｄに特異的に結合することによって捕捉される。
検出対象６０が凹部３１内の核酸アプタマー５５ｄに特異的に捕捉されると、その瞬間、シグナル物質５２ｄが検出対象６０によって環境変化を受けるため、検出対象６０の補足前後でシグナル変化をもたらす。つまり、分析用センサ５０は、センシング対象となる検出対象６０の結合情報をシグナル変化で読み出すことができ、このシグナル変化によって検出対象６０が検出される。検出対象６０の捕捉とシグナル変化とがほぼ同時に起こるため、検出対象６０の検出のために試薬を加える必要もなく、検出を迅速に行うことができる。
また、分析用センサ５０を、シグナル物質５２ｄが蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こす蛍光色素ペアの一方となるように構成し、且つ、検出対象６０に予め当該蛍光色素ペアの一方を結合させておく場合、検出対象６０が凹部３１内の核酸アプタマー５５ｄに特異的に捕捉されると、その瞬間、シグナル物質５２ｄにおける蛍光色素と検出対象６０における蛍光色素とが近接するため、ＦＲＥＴにより蛍光が放射される。このＦＲＥＴによる蛍光放射によって検出対象６０が検出される。検出対象６０の捕捉とＦＲＥＴによる蛍光放射とがほぼ同時に起こるため、検出対象６０の検出のために試薬を加える必要もなく、検出を迅速に行うことができる。ＦＲＥＴを引き起こす蛍光色素ペアとしては特に限定されず、シグナル物質５２ｄとしてドナー色素及びアクセプター色素のいずれを選択するかも限定されない。好ましくは、シグナル物質５２ｄとしてドナー色素を選択することができる。ＦＲＥＴを引き起こす蛍光色素のペアを構成するドナー色素／アクセプター色素の具体例としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、Ｒ－フィコエリトリン（Ｒ－ＰＥ）／アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等が挙げられる。
さらに、本発明の分析用センサ５０は、基材２０表面において、凹部３１以外にシグナル物質５２ｄが実質的に設けられていないため、凹部３１外の基材２０表面に非特異吸着があったとしても不所望のバックグラウンドに影響されることがない。したがって、検出対象６０を感度良く検出することができる。
なお、図示された模式図では、便宜上の観点で、１個の凹部３１において検出対象６０表面に発現している分子の１個が核酸アプタマー５５ｄに特異的に捕捉されることが示されているにすぎないが、検出対象６０表面には当該分子が複数発現しており、また、上述のとおり、１個の凹部３１に複数の核酸アプタマー５５ｄが導入されているため、１個の凹部３１において検出対象６０表面に発現している複数の分子がそれぞれ複数の核酸アプタマー５５ｄに特異的に捕捉される。このため、検出対象６０当たりの核酸アプタマー５５ｄの結合能が驚異的なレベルに引き上げられる。
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
［実施例１：検出対象の分析用センサ作製用基材の製造］
本実施例では、図３～図７に示す検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法の具体例に基づいて、図１に示す検出対象の分析用センサ作製用基材の具体例を製造した。
（試薬等）
・鋳型４０の材料となる人工粒子：シリカ粒子；ｓｉｃａｓｔａｒ(R)－ｒｅｄＦ；表面にカルボキシル基を有するシリカ粒子であり、Ｍａｌｖｅｒｎ製ゼータサイザーナノＺＳ ＭＡＬ５００７３５で動的光散乱法により測定されるＺ平均粒子径が２０５ｎｍ（ｐｄｉ：０．０１７）
・ポリヌクレオチド基４５ｂ：ＯＤＮ２；CACAAATCTGTCGCTGAGTA（配列番号８）
・ポリヌクレオチド基４５ｂを与える試薬：ＯＤＮ２－ＮＨ2；ＯＤＮ２の３’末端にアミノ基が付加した分子
・可逆的結合性基４２ｃ：チオール基
・可逆的結合性基４２ｃを与える試薬：２－アミノエタンチオール塩酸塩
・基板２０：金スパッタ基板
・結合性官能基２５ａ：カルボキシル基
・結合性官能基２５ａを末端に有する分子：11-Mercapto-undecanoic acid
・重合性官能基２３ａ：有機ブロモ基
・重合性開始基２３ａを末端に有する分子：2-(2-bromoisobutyryloxy)-undecyl thiol
・核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂ：ＯＤＮ１；TACTCAGCGACAGATTTGTG（配列番号９）
・結合性官能基２５ｃ：アミノ基
・ポリヌクレオチド２５：ＯＤＮ１－ＮＨ2；ＯＤＮ１の３’末端にアミノ基が付加した分子
・重合性官能基３２ａ：アクリロイル基
・重合性官能基３２ａとジスルフィド結合とを含む分子３２：2-(2-Pyridyl) dithioethyl acryloylamide
・重合性モノマー３５ａ：２－メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）
（１）鋳型４０の作製
シリカ粒子（ＣＯＯＨ：２５ｎｍｏｌ）を水中に含む懸濁液１ｍＬに、１００μＭのＯＤＮ２－ＮＨ2水溶液と、０．１０ｍＭの２－アミノエタンチオール塩酸塩水溶液（２．５ｎｍｏｌ）とを混合した後、０．１０ｍＭのＤＭＴ－ＭＭ水溶液（２５ｎｍｏｌ）を加え、２５℃で一晩攪拌して反応させた。その後、遠心分離（１００００Ｇ、１０分）及び上清の純水への置換の一連の操作を３回行うことにより、粒子の精製を行った。これによって、シリカ粒子表面に、チオール基と、ＯＤＮ２とを導入した鋳型を得た。
（２）単分子膜２１の作製（工程１－１）
エタノール洗浄及び窒素噴霧を行った後、２０分ＵＶオゾン処理を行った金スパッタガラス基板を、０．３０ｍＭの11-Mercapto-undecanoic acid及び０．６０ｍＭの2-(2-bromoisobutyryloxy)-undecyl thiolを含むエタノール溶液１ｍＬに、２５℃で一晩浸漬させた。反応後の基板を、エタノール洗浄し、窒素噴霧により乾燥させた。これによって、基板表面に、カルボキシル基及び重合性官能基を有する単分子膜を得た。
５．０×１０-2μｍｏｌのエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、５．０×１０-2μｍｏｌのＮ－ヒドロキシスクシンイミド、５．０×１０-2μｍｏｌのジイソプロピルエチルアミンを３ｍＬのｄｒｙジクロロメタンに溶解させ、これに、得られた単分子膜を形成した基板を２５℃で一晩浸漬させ、単分子膜表面の結合性官能基２５ａ（カルボキシル基）の活性エステル化を行い、ｄｒｙジクロロメタンで洗浄後、１０μＭのＯＤＮ１－ＮＨ2溶液（１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）を４０μｌ滴下し、２５℃で３時間反応させることで、ＯＤＮ１を導入した。これによって、これによって、基板表面に、ＯＤＮ１及び重合性官能基を有する単分子膜（単分子膜２１）を形成した。
（３）鋳型４０の導入（工程１－２）
上記（２）で作製した単分子膜２１を形成した基板をディップコーターにセットし、上記（１）で作製した鋳型４０の１ｍｇ／ｍＬ水溶液３．５ｍＬに３０分浸漬した。基板を１ｍｍ／分で引き上げた後、２５０μｌのＰＢＳで満たしたＰＣＲチューブに入れ、サーマルサイクラー（タカラバイオ製、TaKaRa Thermal Cycler Dice Touch、以下において同様）を用いて、６０℃で１０分加熱し、３０分かけて２５℃まで冷却する処理を行なうことで、鋳型４０のポリヌクレオチド基４５ｂ（ＯＤＮ２）と基板上の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基２５ｂ（ＯＤＮ１）とをハイブリダイズさせた。これによって、基板上に鋳型を導入した。
（４）鋳型４０表面の修飾（工程１－３）
鋳型４０を導入した基板を、１００μＭの2-(2-Pyridyl) dithioethyl acryloylamideのＰＢＳ（ｐＨ．７．４）溶液１ｍＬに浸漬して２５℃で一晩反応させ、ジスルフィド交換反応を行った。これによって、鋳型表面をアクリロイル基で修飾した。
（５）ポリマー膜の合成（工程１－４）
５０ｍＭのＭＰＣ、１ｍＭのＣｕＢｒ2、及び２ｍＭの２，２’－ビピリジルを１０ｍＭを１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ）９ｍＬに溶解させたプレポリマー溶液と、上記（４）で得られた基板をシュレンクフラスコ内に入れ、シリコン栓で密封し、脱気窒素置換を行った。ディスポーサブルシリンジを用いて、０．５ｍＭのＬ－アスコルビン酸溶液（１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４））１ｍＬを、シュレンクフラスコ内のプレポリマー溶液に添加した。さらに脱気窒素置換を行い、４０℃の恒温槽で３時間振とうすることで、表面開始原子移動ラジカル重合（ＳＩ－ＡＴＲＰ）を行った。重合後の基板を、純水で洗浄し、窒素噴霧により乾燥させた後、１００ｍＭのＥＤＴＡ－４Ｎａ水溶液１ｍＬに２５℃で１５分浸漬させ、ポリマー膜内部に残存する銅イオンの除去を行った。これによって、基板表面にポリマー膜を合成した。
（６）鋳型の除去（工程１－５）
上記（５）で得られたポリマー膜基板をＰＣＲチューブに入れ、５０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン水溶液２５０μｌに浸漬させ、サーマルサイクラーにて、６０℃で３時間加熱し、ジスルフィド結合を還元してチオール基へ変換し、基板を純水で洗浄後、２Ｍの尿素水溶液２５０μｌに浸漬させ、サーマルサイクラーにて９９℃で３０分加熱することで、相補結合を開裂してＯＤＮ１へ変換し、基板を純水で洗浄した。これによって、鋳型の除去を行った。以上の操作によって、基板上のポリマー膜に設けられた鋳型の分子インプリントによる凹部内にチオール基とＯＤＮ１とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材を得た。
［実施例２：小型細胞外小胞ＣＤ６３の分析用センサの製造］
本実施例では、図８に示す検出対象の分析用センサの製造方法の具体例に基づいて、図２に示す検出対象の分析用センサの具体例として、小型細胞外小胞ＣＤ６３の分析用センサを製造した。
（試薬等）
・核酸アプタマー５５ｄを与える成分５５ＡＰ：ＤＮＡアプタマー含有ポリヌクレオチド；ＣＤ６３特異的ＤＮＡアプタマーの５’末端にＯＤＮが延設されている；CACAAATCTGTCGCTGAGTACACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA（配列番号１０）
・核酸アプタマー５５ｄ：ＣＤ６３特異的ＤＮＡアプタマー；CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA（配列番号１）
・ポリヌクレオチド基５５ｂ：ＯＤＮ２；CACAAATCTGTCGCTGAGTA（配列番号６）
・シグナル物質５２ｄを与える成分５２ＳＧ：Alexa Fluor(R)647 C 2 Maleimide
・シグナル物質５２ｄ：蛍光物質；Alexa Fluor(R)647
・結合性基５２ｃ：マレイミド基
（１）ＣＤ６３特異的ＤＮＡアプタマーの導入（工程２）
ＤＮＡアプタマー含有ポリヌクレオチドを１μＭ（１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ）に調製した溶液２５０μｌを、アニーリング処理（９５℃、１０分、その後３０分かけて２５℃まで冷却）した。実施例１で得られた検出対象の分析用センサ作製用基材をＰＣＲチューブに入れ、アニーリング処理したＤＮＡアプタマー含有ポリヌクレオチド溶液で満たした。サーマルサイクラーにて、６０℃で１０分加熱し、３０分かけて２５℃まで冷却する処理を行い、基板上のＯＤＮ１と、ＤＮＡアプタマー含有ポリヌクレオチドのＯＤＮ２とをハイブリダイズさせた。これによって、分析用センサ作製用基材にＣＤ６３特異的ＤＮＡアプタマーを導入した。
（２）蛍光物質の導入
上記（１）でＣＤ６３特異的ＤＮＡアプタマー導入基板に、１００μＭのAlexa Fluor(R) 647 C2 Maleimide溶液（１０ｍＭ ＰＢＳ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ）を４０μｌ滴下し、室温で１時間、マイケル付加反応させた。これによって、分析用センサ作製用基材に蛍光物質を導入した。以上の操作によって、基板上のポリマー膜に設けられた鋳型の分子インプリントによる凹部内に蛍光物質とＣＤ６３特異的ＤＮＡアプタマーとを有する、小型細胞外小胞ＣＤ６３の分析用センサを得た。
［実施例３：小型細胞外小胞ＣＤ６３の分析用センサを用いた小型細胞外小胞ＣＤ６３の分析方法］
本実験例では、実施例２で得られた小型細胞外小胞ＣＤ６３の分析用センサを用いて、分析対象として、ヒト前立腺癌ＰＣ３細胞株の培養上清から取得された小型細胞外小胞（ＨＮＢ製、HBM PC3 100、ＰＣ３由来小型細胞外小胞）を用いた分析を行った。
分析対象溶液として、ＰＣ３由来小型細胞外小胞を、ＰＢＳ中、０、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０ｎｇ／ｍＬとなるように調製した。小型細胞外小胞ＣＤ６３の分析用センサ基板に、分析対象溶液４０μｌを滴下し、２５℃で１分の反応、１ｍＬのＰＢＳでの洗浄、及び以下の条件による蛍光測定を行った。なお、蛍光測定のＲＯＩは輝点ごとに取り、各分析対象溶液ごとに３０のＲＯＩを取得した。測定値は、蛍光強度の平均値とした。
（蛍光測定条件）
・蛍光顕微鏡：オリンパス製ＩＸ７３倒立顕微鏡
・フィルタ：オリンパス製CY5-4040C(604-644 nm for excitation and 672-712 nm for emission)
・対物レンズ：×１００；オリンパス製UPLSAPO100XO
・光量：１００％
・露光時間：０．１秒
・光源：水源ランプ；オリンパス製HGLGPS-SET
小型細胞外小胞濃度に対する蛍光強度変化（(Io-I)/Io）を測定して吸着等温線を作成したところ、ＰＣ３由来小型細胞外小胞の特異的吸着による有意な蛍光消光が確認され、特異的なレスポンスが認められた。
また、得られた吸着等温線をカーブフィッティング（回帰分析）して解離定数を算出した結果を図１０に示す。なお、ソフトとしては日本ポラデジタル株式会社製の解析ソフトDeltaGraph 5.4.5vを用い、以下の式によってフィッティングした。式中、Ｋａは結合定数を表し、Ｋｄは解離定数を表し、Ｇは小型細胞外小胞濃度を表し、Ｈはフィッティングカーブから算出し、Ｄは蛍光変化率の最大変化量を表す。
Figure 0007454225000001
さらに、以下の式に基づいて検出限界（ＬＯＤ）を得た。式中、ｍは、吸着等温線の直線領域の傾き（濃度範囲：０、０．０１、０．０５、０．１ｎｇ／ｍＬ）を表し、ＳDは、濃度０ｎｇ／ｍＬにおける標準偏差を表す。
Figure 0007454225000002
結果として、解離定数Ｋｄは６．９×１０-18［Ｍ］と算出され、高い結合能力が示された。また、ＬＯＤは０．１６ｎｇ／ｍＬと算出された。今回用いた小型細胞外小胞は、１．９０×１０11粒子／ｍｇであったため、ＬＯＤを小型細胞外小胞数に換算すると２．９５×１０5粒子／ｍＬとなった。この値は、血中小型細胞外小胞数１０11粒子／ｍＬ、体液中小型細胞外小胞数１０8～１０11粒子／ｍＬを大きく下回っていた。また、非特許文献２に示されているように、ＣＤ６３アプタマーのＣＤ６３断片への解離定数Ｋｄは１７．１ｎ［Ｍ］、つまり１０-8［Ｍ］オーダーである。さらに、後述比較例２に示すように、核酸アプタマーの代わりに抗体を用いた小型細胞外小胞分析用センサでは解離定数Ｋｄが３．８ｘ１０-15［Ｍ］である。つまり、分子インプリントで形成した微小な凹部内のセンシング環境は、検出対象に特異的な分子として抗体を用いる場合に比べて核酸アプタマーを用いた場合に、極めて高い結合能を奏させることが分かった。
［比較例１：ＣＤ６３特異的ＤＮＡアプタマーを有しない小型細胞外小胞ＣＤ６３の分析用センサを用いた小型細胞外小胞ＣＤ６３の分析方法］
検出対象の分析用センサ作製用基材上の凹部内のＯＤＮ１に対して導入する核酸として、ＣＤ６３特異的ＤＮＡアプタマー（配列番号１）の代わりに、ＣＤ６３に対する特異性を有さないランダムポリヌクレオチド（TGTGCGGCGAAATATTATAGCTACCGCAATTA（配列番号１１））としたことを除いて、実施例３と同様にしてＣＤ６３の分析用センサ（比較例１－１）を作製した。また、検出対象の分析用センサ作製用基材上の凹部内のＯＤＮ１に対して、何も導入しなかったことを除いて、実施例３と同様にしてＣＤ６３の分析用センサ（比較例１－２）を作製した。
比較例１－１及び比較例１－２のＣＤ６３特異的ＤＮＡアプタマーを有しない小型細胞外小胞ＣＤ６３の分析用センサについて、実施例３と同様にしてＰＣ３由来小型細胞外小胞の分析を行い、吸着等温線を作成した。その結果、ＰＣ由来小型細胞外小胞の非特異吸着による僅かな蛍光消光が確認されたのみで、特異的なレスポンスは認められなかった。
［実施例４：小型細胞外小胞ＭＵＣ－１の分析用センサの製造］
検出対象の分析用センサ作製用基材上の凹部内のＯＤＮ１に対して導入する核酸として、ＣＤ６３特異的ＤＮＡアプタマー（配列番号１）の代わりに、ＭＵＣ－１特異的ＤＮＡアプタマー（配列番号２）としたことを除いて、実施例３と同様にしてＭＵＣ－１の分析用センサを作製した。
得られたＭＵＣ－１の分析用センサについて、分析対象として、ヒト癌細胞株ＭＣＦ－７由来小型細胞外小胞（ＳＢ１製、EXOP-100A-1、表面にＭＵＣ－１を発現している）及びヒト健常血清由来小型細胞外小胞（ＳＢ１製、EXOP-500A-1、表面にＭＵＣ－１を発現していない）をそれぞれ用いて、実施例３と同様にして小型細胞外小胞の分析を行い、吸着等温線を作成した。その結果、分析対象としてＭＣＦ－７由来小型細胞外小胞を用いた場合に、ＭＣＦ－７由来小型細胞外小胞の特異的な吸着による有意な蛍光消光が確認され、特異的なレスポンスが認められた。一方で、健常ヒト由来小型細胞外小胞についてはレスポンスは認められなかった。
［比較例２：抗体導入型小型細胞外小胞の分析用センサを用いた分析方法］
核酸アプタマーの代わりに抗体を導入した小型細胞外小胞の分析用センサを作製した。具体的には、（i）基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み；前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し、前記凹部内に、抗体物質結合用基とシグナル物質結合用基とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材を作製し、（ii）前記抗体物質結合用基に前記検出対象に特異的な抗体物質を導入し；前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を導入することによって、検出対象の分析用センサを作製した。
（１）鋳型の合成－チオール基およびヒスチジンタグ(His-tag)を導入したシリカナノ粒子の合成
FITC標識シリカナノ粒子200μl(200μlあたり表面に-COOH 5 nmolを有するもの、粒子径200nm)をジクロロメタン(DCM)に分散させた（シリカナノ粒子分散液）。エチル(ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド(EDC: 50 nmol, 10 eq)、N-ヒドロキシコハク酸イミド(NHS: 50 nmol, 10 eq)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA: 50 nmol, 10 eq) をdry DCMに溶解させ、シリカナノ粒子分散液と混合した。一晩反応させることでシリカナノ粒子表面をNHSで修飾した。表面修飾したシリカナノ粒子に対して、ヒスチジンが６個ペプチド結合で連結されたHis-tag (末端はリジン残基でありフリーのεアミノ基を有する：0.10μmol, 40eq)及び2-アミノエタンチオール塩酸塩(0.1μmol, 40eq)を加えて、室温で反応させた。反応終了後、遠心分離およびろ過によりチオール基およびHis-tagを導入したシリカナノ粒子（SH・His-tag化シリカナノ粒子）を精製した。
（２）シリカナノ粒子を鋳型に用いた検出対象の分析用センサ作製用基材の作製
以下のようにして、金薄膜蒸着ガラス基板上にアミノ基及びブロモ基が末端となる混成自己組織化単分子膜(mixed SAMs)を作製し（分子膜形成工程）、アミノ基末端へNTA基を導入し、NTA-Ni錯体を形成した後、キレート結合によりシリカナノ粒子を固定化した（鋳型導入工程）。その後、シリカナノ粒子にメタクリル基修飾を施し（表面修飾工程）、表面開始制御／リビングラジカル重合によりポリマー薄膜を合成した（重合工程）。最後にシリカナノ粒子を除去し（除去工程）、検出対象の分析用センサ作製用基材を得た。
（２－１）ブロモ基およびアミノ基をもつ混合自己組織化単分子膜形成（分子膜形成工程）
実施例１の項目１と同様に金薄膜蒸着ガラス基板の有機残滓の除去及び洗浄を行い、0.5 mM amino-EG6-undecanthiol hydrochloride及び0.5mM 2-(2-bromoisobutyryloxy) undecyl thiolのエタノール溶液に基板を浸漬させ、25℃で24時間静置することにより、ブロモ基およびアミノ基をもつ混合自己組織化単分子膜を形成させた。
（２－２）SH・His-tag化シリカナノ粒子のNi-NTAを介した固定化（鋳型導入工程）
5 mM isothiocyanobenzyl-nitrilotriacetic acid (ITC-NTA)のDMSO溶液80 μLを基板に滴下し、25℃で2時間静置してアミノ基をNTAで修飾した。基板をDMSO及び純水で洗浄後、4 mM NiCl2水溶液100 μLを基板に滴下し、室温で15分間静置することで、Ni-NTA錯体を形成した。その後、SH・His-tag化シリカナノ粒子(固形分濃度5.1 mg/ml)含有水溶液100 μlを基板に滴下し、25°Cで1時間静置した。
（２－３）固定されたSH・His-tag化シリカナノ粒子のメタクリロイル化（表面修飾工程）
100 μM 2-(2-Pyridyl)dithioethyl methacrylateの PBS (pH 7.4)溶液に基板を浸して一晩静置させることで、ジスルフィド交換反応によってシリカナノ粒子表面のSH基にジスルフィドを介してメタクリロイル基の導入を行った。
（２－４）MIP薄膜の作製（重合工程）
重合時間を３時間としたことを除いて、実施例１の項目４と同様にして、基板上にポリマー薄膜を合成した。これによって、基板上に、表１のモノマーと共にシリカナノ粒子のメタクリロイル基も共重合されたポリマー薄膜を得た。重合終了後、1 M エチレンジアミン四酢酸-4Na 水溶液に基板を15分間浸し、ATRPに用いたCu2+を取り除いた。
（２－５）シリカナノ粒子の除去（除去工程）
50 mM トリス(2-カルボキシエチル)フォスフィン・HCl(TCEP)水溶液に25℃で３時間浸漬させ、ポリマーとシリカナノ粒子とを結合させているジスルフィド結合を還元・切断した。ポリマー側にはフリーのSH基が残るが、このSH基は、SH・His-tag化シリカナノ粒子由来であることから、ポリマー薄膜のうち鋳型に対応した凹部以外の部分には存在せず、鋳型に対応した凹部内のみに存在する。前述のEDTA-4Na処理で、NI-NTAのニッケルも除去されてHis-tagがこの時点でフリーとなる可能性が高いが、念のため以下の操作も行った。純水で洗浄後、0.5 wt% SDSを含む50 mM酢酸バッファー (pH 4.0)に基板を浸して、Ni-NTA及びHis-tagを介して結合していたシリカナノ粒子をポリマー薄膜から洗い出した。
（３）得られた分析用センサ作製用基材（MIP基板）に再度Ni-NTAを形成させるため、4 mM NiCl2水溶液でMIP基板を処理した。その後、PBSに溶解した100 μM His-tag Protein Gを基板に添加することで、His-tagを介して抗体を結合可能なProtein Gを固定化した。最後に、PBSに溶解した0.3 μM 抗CD9抗体を基板に添加し、抗CD9抗体をProtein Gを介して固定化した。Protein Gは、抗体のFc領域に結合することから、固定化された抗体の配向は一様となる。
さらに、蛍光分子としてチオール反応性のAlexa Fluor(R) 647 C2 Maleimide を用いて分析用センサの凹部への蛍光分子の選択的導入を行った。導入前の蛍光強度は113±0.6 (n-3)であったのに対し、導入後は151±2.1 (n-3)であったことから、蛍光の導入が確認された。これによって、抗体導入型検出対象の分析用センサが得られた。
（４）得られた抗体導入型分析用センサを用い、小型細胞外小胞の結合挙動を観察した。分析対象としては、小型細胞外小胞のPBS (10 mM posphate,140 mM NaCl, pH7.4)溶液（濃度はそれぞれ、0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ng/mL）を用い、小型細胞外小胞の蛍光検出は顕微鏡下で行った。蛍光顕微鏡測定条件は以下の通りである。
フィルタ：Cy5
対物レンズ：×5
露光時間：0.1秒
光源：水銀ランプ
実施例３に記載される方法で吸着等温線から解離定数を算出した。結果として、解離定数は、Ｋd＝３．８ｘ１０-15［Ｍ］であった。
本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明はそれらのみに限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な実施形態が他になされる。
１０…分析用センサ作製用基材
２０…基材
２１…単分子膜
２５ｂ…核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基（可逆的結合性基）
２５ａ…結合性官能基
２３ａ…重合開始性基
３０…ポリマー膜
３１…凹部
３２ｃ…シグナル物質結合用基（可逆的結合性基）
３２ａ…重合性官能基
３５ａ…重合性モノマー
４０…鋳型
４２…可逆的結合性基（シグナル物質結合用基と結合することで第２の可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基）
４５…相補結合
５０…分析用センサ
５５ｄ…検出対象に特異的な核酸アプタマー
５５…相補結合
５２ｄ…シグナル物質
６０…検出対象
配列番号１は、ＣＤ６３に特異的なＤＮＡアプタマーである。
配列番号２は、ＭＵＣ－１に特異的なＤＮＡアプタマーである。
配列番号３は、ＥｐＣＡＭに特異的なＤＮＡアプタマーである。
配列番号４は、ＨＥＲ２に特異的なＤＮＡアプタマーである。
配列番号５は、ＥＲαに特異的なＤＮＡアプタマーである。
配列番号６は、ＳＡＲＳコロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に特異的なＤＮＡアプタマーである。
配列番号７は、ＳＡＲＳコロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に特異的なＤＮＡアプタマーである。
配列番号８は、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基にハイブリダイズできるポリヌクレオチドである。
配列番号９は、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の配列である。
配列番号１０は、核酸アプタマーを与えるポリヌクレオチドである。
配列番号１１は、ＣＤ６３に対する特異性を有さないランダムポリヌクレオチドである。

Claims (17)

  1. 基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み、
    前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し、
    前記凹部内に、シグナル物質結合用基と、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材。
  2. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の長さが８塩基長以上である、請求項１に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
  3. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基が単鎖である、請求項１又は２に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
  4. 前記ポリマー膜が、前記検出対象又は前記検出対象よりサイズが大きい対象を鋳型とする分子インプリントポリマーで構成され、前記凹部が前記鋳型の表面形状の一部に対応する、請求項１～３のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
  5. 前記シグナル物質結合用基がチオール基である、請求項１～４のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
  6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材と、
    前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に結合した、前記検出対象に特異的な核酸アプタマーと、
    前記シグナル物質結合用基に結合したシグナル物質と、
    を含む、検出対象の分析用センサ。
  7. 前記検出対象が膜構造を有する微小粒体である、請求項６に記載の検出対象の分析用センサ。
  8. 前記膜構造を有する微小粒体が細胞外小胞である、請求項７に記載の検出対象の分析用センサ。
  9. 前記検出対象に特異的な核酸アプタマーが、前記膜構造を有する微小粒体の表面に発現している特異的分子に対する特異的結合能を有する、請求項６～８のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ。
  10. 請求項６～９のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサに、検出対象を含む試料を接触させ、前記核酸アプタマーに前記検出対象を結合する工程と、
    前記シグナル物質に由来するシグナルの変化を検出する工程と、
    を含む、検出対象の分析法。
  11. 基材に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と重合開始性基とを表面に有する単分子膜を形成する単分子膜形成工程（１－１）と、
    前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に対し、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と相補結合が可能なポリヌクレオチド基を表面に有する鋳型を導入する鋳型導入工程（１－２）と、
    前記鋳型の表面を、可逆的連結基を介して重合性官能基で修飾する表面修飾工程（１－３）と、
    重合性モノマーを加え、前記重合性モノマー及び前記重合性官能基を基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程（１－４）と、
    前記相補結合及び前記可逆的連結基を開裂させてそれぞれ核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基及びシグナル物質結合用基へ変換するとともに前記鋳型を除去する除去工程（１－５）と、
    を含む、検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
  12. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の長さが８塩基長以上である、請求項１１に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
  13. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基が単鎖である、請求項１１又は１２に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
  14. 前記鋳型が、表面に、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とともに、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合性基を有する、請求項１１～１３のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
  15. 前記鋳型がシリカ粒子である、請求項１１～１４のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
  16. 前記シグナル物質結合用基がチオール基であり、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基がチオール基である、請求項１１～１５のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
  17. 請求項１１～１６のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法を行う工程（１）と、
    前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に、検出対象に特異的な核酸アプタマーを相補結合によって結合する工程（２）と、
    前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を結合する工程（３）と、
    を含む、検出対象の分析用センサの製造方法。
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