JP7454225B2 - 検出対象の分析用センサ作製用基材、検出対象の分析用センサ、及び検出対象の分析法 - Google Patents
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Description
前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し、
前記凹部内に、シグナル物質結合用基と、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材。
項2. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の長さが8塩基長以上である、項1に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項3. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基が単鎖である、項1又は2に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項4. 前記ポリマー膜が、前記検出対象又は前記検出対象よりサイズが大きい対象を鋳型とする分子インプリントポリマーで構成され、前記凹部が前記鋳型の表面形状の一部に対応する、項1~3のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項5. 前記シグナル物質結合用基がチオール基である、項1~4のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項6. 項1~5のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材と、
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に結合した、前記検出対象に特異的な核酸アプタマーと、
前記シグナル物質結合用基に結合したシグナル物質と、
を含む、検出対象の分析用センサ。
項7. 前記検出対象が膜構造を有する微小粒体である、項6に記載の検出対象の分析用センサ。
項8. 前記膜構造を有する微小粒体が細胞外小胞である、項7に記載の検出対象の分析用センサ。
項9. 前記検出対象に特異的な核酸アプタマーが、前記膜構造を有する微小粒体の表面に発現している特異的分子に対する特異的結合能を有する、項6~8のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ。
項10. 項6~9のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサに、検出対象を含む試料を接触させ、前記核酸アプタマーに前記検出対象を結合する工程と、
前記シグナル物質に由来するシグナルの変化を検出する工程と、
を含む、検出対象の分析法。
項11. 基材に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と重合開始性基とを表面に有する単分子膜を形成する単分子膜形成工程(1-1)と、
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に対し、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と相補結合が可能なポリヌクレオチド基を表面に有する鋳型を導入する鋳型導入工程(1-2)と、
前記鋳型の表面を、可逆的連結基を介して重合性官能基で修飾する表面修飾工程(1-3)と、
重合性モノマーを加え、前記重合性モノマー及び前記重合性官能基を基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程(1-4)と、
前記相補結合及び前記可逆的連結基を開裂させてそれぞれ核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基及びシグナル物質結合用基へ変換するとともに前記鋳型を除去する除去工程(1-5)と、
を含む、検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項12. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の長さが8塩基長以上である、項11に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項13. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基が単鎖である、項11又は12に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項14. 前記鋳型が、表面に、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とともに、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合性基を有する、項11~13のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項15. 前記鋳型がシリカ粒子である、項11~14のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項16. 前記シグナル物質結合用基がチオール基であり、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基がチオール基である、項11~15のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項17. 項11~16のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法を行う工程(1)と、
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に、検出対象に特異的な核酸アプタマーを相補結合によって結合する工程(2)と、
前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を結合する工程(3)と、
を含む、検出対象の分析用センサの製造方法。
本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材は、後述の発明の分析用センサを作製するための材料となる基材である。この分析用センサ作製用基材は、ユーザが、小型細胞外小胞などの検出対象をより一層感度高く検出可能なセンサへ簡便にカスタマイズできるように構成されている。
基材20の材料は、例えば、金属、ガラス、及び樹脂からなる群から選択される材料であってよい。金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等が挙げられる。樹脂としては、ポリ(メタ)アクリレート、ポリスチレン、ABS(アクリロニトリル-ブタジエン-スチレン共重合体)、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリウレタン、シリコーン樹脂、フッ素樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等が挙げられる。
ポリマー膜30は、基材20に層状に設けられており、複数の凹部31を有する。凹部31は、本発明の検出対象の分析用センサにおけるセンサ場となる部分である。凹部31は、検出対象を受け入れ可能に形成されていれば限定されるものではないが、好ましくは、後述のように分子インプリント重合法を用いることによって形成された、分子インプリントポリマー(MIP;molecularly imprinted polymer)が挙げられる。この場合、凹部31は、分子インプリント重合法において用いられる鋳型(後述の鋳型40)によって型取られたものであり、当該鋳型の表面形状の一部に対応する形状を有する。凹部31は、検出対象を受け入れ可能な大きさで形成されていればよいため、凹部31の鋳型は、検出対象と同じ大きさの物質であってもよいし、検出対象よりもサイズが大きい物質であってもよい。好ましくは、凹部31の鋳型は、検出対象よりもサイズが大きい物質である。
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bは、核酸アプタマー(後述の核酸アプタマー55d)を相補結合させることで分析用センサ作製用基材10に核酸アプタマーを導入可能とする基である。なお、後に詳述するが、核酸アプタマー55dは、核酸アプタマー55dに延設された導入用ポリヌクレオチド基(後述の導入用ポリヌクレオチド基55b)と核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bとが相補結合55を形成することによって導入される。ユーザは、検出対象を自由にターゲティングすることができ、ターゲットとする検出対象に特異的な核酸アプタマーを自由に選択し、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bへ導入することができる。
シグナル物質結合用基32cは、シグナル物質(後述のシグナル物質52d)を結合させることで分析用センサ作製用基材10にシグナル物質を導入可能とする基である。ユーザは、シグナル物質を自由に選択し、シグナル物質結合用基32cへ導入することができる。
本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材は、核酸アプタマー及びシグナル物質の少なくともいずれかがユーザによってカスタマイズされるように構成されていればよい。したがって、他の態様として、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bの方に、検出対象に特異的な核酸アプタマーがすでに結合していてもよい。この場合、ユーザはシグナル物質を自由に選択して導入することができる。
本発明の分析用センサは、上述の検出対象の分析用センサ作製用基材と;前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に結合した、前記検出対象に特異的な核酸アプタマーと;前記シグナル物質結合用基に結合したシグナル物質と;を含む。図2に、本発明の検出対象の分析用センサの一例を模式的に示す。図2に示すように、分析用センサ50は、上述の分析用センサ作製用基材10のポリマー膜30に設けられた凹部31内において、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bに核酸アプタマー55dが結合し、シグナル物質結合用基32cにシグナル物質52dが結合している。
本発明の分析用センサの検出対象(後述の検出対象60)は、核酸アプタマー55dへの特異性結合能を有するものであれば原理上特に限定されるものではない。
核酸アプタマー55dとしては、検出対象への特異的結合能を有する核酸アプタマーが選択される。核酸アプタマーは、所定の標的に対する特異的結合能を有する、比較的短い(例えば20~200塩基長さの)塩基配列を有する核酸分子である。検出対象と核酸アプタマー55dとの特的結合の結合様式は限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、電気的吸着などの化学的な結合、及び形状依存的な係合等の物理的な結合等が挙げられる。
シグナル物質52dは、検出対象と検出対象に特異的な核酸アプタマー55dとの結合情報を読み出すものとして機能する。シグナル物質52dとしては、凹部31への検出対象の結合により検知されるシグナル強度が変化したり、スペクトルが変化(例えばピークがシフト)したりするものであれば特に限定されない。たとえば、蛍光物質、放射性元素含有物質、磁性物質等が挙げられる。検出容易性等の観点から、シグナル物質としては蛍光物質であることが好ましい。蛍光物質としては、フルオレセイン系色素、インドシアニン色素などのシアニン系色素、ローダミン系色素などの蛍光色素;GFPなどの蛍光タンパク質;金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子などが挙げられる。放射性元素含有物質としては、18F等の放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸、19FでラベルしたMRIプローブなどが挙げられる。磁性物質としては、フェリクロームなどの磁性体を有するもの、フェライトナノ粒子、ナノ磁性粒子などにみられるものが挙げられる。
本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法は、以下の工程を含む。
基材に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と重合開始性基とを表面に有する単分子膜を形成する単分子膜形成工程(1-1);
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に対し、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と相補結合が可能なポリヌクレオチド基を表面に有する鋳型を導入する鋳型導入工程(1-2);
前記鋳型の表面を、可逆的連結基を介して重合性官能基で修飾する表面修飾工程(1-3);
重合性モノマーを加え、前記重合性モノマー及び前記重合性官能基を基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程(1-4);及び
前記相補結合及び前記可逆的連結基を開裂させてそれぞれ核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基及びシグナル物質結合用基へ変換するとともに前記鋳型を除去する除去工程(1-5)。
基材20に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bと重合開始性基23aとを表面に有する単分子膜21を形成する単分子膜形成工程(1-1)(図3);
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bに対し、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bと相補結合45が可能なポリヌクレオチド基45bを表面に有する鋳型40を導入する鋳型導入工程(1-2)(図4);
前記鋳型40の表面を、可逆的連結基42を介して重合性官能基32aで修飾する表面修飾工程(1-3)(図5);
重合性モノマー35aを加え、前記重合性モノマー35a及び前記重合性官能基32aを基質とし、前記重合開始性基23aを重合性開始剤として、前記鋳型40の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜30を形成する重合工程(1-4)(図6);及び
前記相補結合45及び前記可逆的連結基42を開裂させてそれぞれ核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25b及びシグナル物質結合用基32cへ変換するとともに前記鋳型40を除去する除去工程(1-5)(図7)。
以下、各工程について図を参照しながら詳述する。
図3に示すように、単分子膜形成工程では、基材20に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bと重合開始性基23aとを表面に有する単分子膜21を形成する。
図4に示すように、鋳型導入工程では、単分子膜21表面の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bに対し、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bと相補結合45が可能なポリヌクレオチド基45bを表面に有する鋳型40を導入する。
図5に示すように、表面修飾工程では、鋳型40の表面を、可逆的連結基42を介して重合性官能基32aで修飾する。
図6に示すように、重合工程では、重合性モノマー35aを加え、重合性官能基32a及び重合性モノマー35aを基質とし、重合開始性基23aを重合性開始剤として、鋳型40の表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成する。これによって、基材20表面に、凹部31を有するポリマー膜30を形成する。なお、本明細書においては、鋳型を用いたインプリンティング重合によって合成されるポリマーを、便宜上、分子インプリントポリマーと記載するものとし、本発明では、鋳型として分子でないもの(たとえば膜構造を有する微小粒体)も許容するため、鋳型として分子ではないものを用いたインプリンティング重合によって合成されるポリマーも含まれるものとする。
図7に示すように、除去工程では、相補結合45を開裂させて核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25b変換し、可逆的連結基42を開裂させたシグナル物質結合用基32cへ変換することで、鋳型40を除去する。上述の表面修飾工程で可逆的連結基42が鋳型40の表面のみにデリバリされているため、鋳型40が除去された跡であるポリマー膜30の凹部31には、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bが残るとともに、凹部31内にのみ、可逆的連結基42から生じたシグナル物質結合用基32cが配置される。これによって、分析用センサ作製用基材10が得られる。
本発明の検出対象の分析用センサの製造方法は以下の工程を含む。
検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法を行う工程(1);
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に、検出対象に特異的な核酸アプタマーを相補結合によって結合する工程(2);及び
前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を結合する工程(3)。
検出対象の分析用センサ作製用基材10の製造方法を行う工程(1);
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bに、検出対象に特異的な核酸アプタマー55dを相補結合55によって結合する工程(2);及び
シグナル物質結合用基32cにシグナル物質52dを結合する工程(3)。
図9に、本発明の検出対象の分析法の一例を説明する模式図を示す。図9に示すように、本発明の検出対象の分析法では、分析用センサ50の基材20表面上に、検出対象60を含む分析試料液を接触させる。
本実施例では、図3~図7に示す検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法の具体例に基づいて、図1に示す検出対象の分析用センサ作製用基材の具体例を製造した。
・鋳型40の材料となる人工粒子:シリカ粒子;sicastar(R)-redF;表面にカルボキシル基を有するシリカ粒子であり、Malvern製ゼータサイザーナノZS MAL500735で動的光散乱法により測定されるZ平均粒子径が205nm(pdi:0.017)
・ポリヌクレオチド基45b:ODN2;CACAAATCTGTCGCTGAGTA(配列番号8)
・ポリヌクレオチド基45bを与える試薬:ODN2-NH2;ODN2の3’末端にアミノ基が付加した分子
・可逆的結合性基42c:チオール基
・可逆的結合性基42cを与える試薬:2-アミノエタンチオール塩酸塩
・基板20:金スパッタ基板
・結合性官能基25a:カルボキシル基
・結合性官能基25aを末端に有する分子:11-Mercapto-undecanoic acid
・重合性官能基23a:有機ブロモ基
・重合性開始基23aを末端に有する分子:2-(2-bromoisobutyryloxy)-undecyl thiol
・核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25b:ODN1;TACTCAGCGACAGATTTGTG(配列番号9)
・結合性官能基25c:アミノ基
・ポリヌクレオチド25:ODN1-NH2;ODN1の3’末端にアミノ基が付加した分子
・重合性官能基32a:アクリロイル基
・重合性官能基32aとジスルフィド結合とを含む分子32:2-(2-Pyridyl) dithioethyl acryloylamide
・重合性モノマー35a:2-メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン(MPC)
シリカ粒子(COOH:25nmol)を水中に含む懸濁液1mLに、100μMのODN2-NH2水溶液と、0.10mMの2-アミノエタンチオール塩酸塩水溶液(2.5nmol)とを混合した後、0.10mMのDMT-MM水溶液(25nmol)を加え、25℃で一晩攪拌して反応させた。その後、遠心分離(10000G、10分)及び上清の純水への置換の一連の操作を3回行うことにより、粒子の精製を行った。これによって、シリカ粒子表面に、チオール基と、ODN2とを導入した鋳型を得た。
エタノール洗浄及び窒素噴霧を行った後、20分UVオゾン処理を行った金スパッタガラス基板を、0.30mMの11-Mercapto-undecanoic acid及び0.60mMの2-(2-bromoisobutyryloxy)-undecyl thiolを含むエタノール溶液1mLに、25℃で一晩浸漬させた。反応後の基板を、エタノール洗浄し、窒素噴霧により乾燥させた。これによって、基板表面に、カルボキシル基及び重合性官能基を有する単分子膜を得た。
上記(2)で作製した単分子膜21を形成した基板をディップコーターにセットし、上記(1)で作製した鋳型40の1mg/mL水溶液3.5mLに30分浸漬した。基板を1mm/分で引き上げた後、250μlのPBSで満たしたPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(タカラバイオ製、TaKaRa Thermal Cycler Dice Touch、以下において同様)を用いて、60℃で10分加熱し、30分かけて25℃まで冷却する処理を行なうことで、鋳型40のポリヌクレオチド基45b(ODN2)と基板上の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25b(ODN1)とをハイブリダイズさせた。これによって、基板上に鋳型を導入した。
鋳型40を導入した基板を、100μMの2-(2-Pyridyl) dithioethyl acryloylamideのPBS(pH.7.4)溶液1mLに浸漬して25℃で一晩反応させ、ジスルフィド交換反応を行った。これによって、鋳型表面をアクリロイル基で修飾した。
50mMのMPC、1mMのCuBr2、及び2mMの2,2’-ビピリジルを10mMを10mM PBS(pH7.4、100mM NaCl)9mLに溶解させたプレポリマー溶液と、上記(4)で得られた基板をシュレンクフラスコ内に入れ、シリコン栓で密封し、脱気窒素置換を行った。ディスポーサブルシリンジを用いて、0.5mMのL-アスコルビン酸溶液(10mM PBS(pH7.4))1mLを、シュレンクフラスコ内のプレポリマー溶液に添加した。さらに脱気窒素置換を行い、40℃の恒温槽で3時間振とうすることで、表面開始原子移動ラジカル重合(SI-ATRP)を行った。重合後の基板を、純水で洗浄し、窒素噴霧により乾燥させた後、100mMのEDTA-4Na水溶液1mLに25℃で15分浸漬させ、ポリマー膜内部に残存する銅イオンの除去を行った。これによって、基板表面にポリマー膜を合成した。
上記(5)で得られたポリマー膜基板をPCRチューブに入れ、50mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン水溶液250μlに浸漬させ、サーマルサイクラーにて、60℃で3時間加熱し、ジスルフィド結合を還元してチオール基へ変換し、基板を純水で洗浄後、2Mの尿素水溶液250μlに浸漬させ、サーマルサイクラーにて99℃で30分加熱することで、相補結合を開裂してODN1へ変換し、基板を純水で洗浄した。これによって、鋳型の除去を行った。以上の操作によって、基板上のポリマー膜に設けられた鋳型の分子インプリントによる凹部内にチオール基とODN1とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材を得た。
本実施例では、図8に示す検出対象の分析用センサの製造方法の具体例に基づいて、図2に示す検出対象の分析用センサの具体例として、小型細胞外小胞CD63の分析用センサを製造した。
・核酸アプタマー55dを与える成分55AP:DNAアプタマー含有ポリヌクレオチド;CD63特異的DNAアプタマーの5’末端にODNが延設されている;CACAAATCTGTCGCTGAGTACACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA(配列番号10)
・核酸アプタマー55d:CD63特異的DNAアプタマー;CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA(配列番号1)
・ポリヌクレオチド基55b:ODN2;CACAAATCTGTCGCTGAGTA(配列番号6)
・シグナル物質52dを与える成分52SG:Alexa Fluor(R)647 C 2 Maleimide
・シグナル物質52d:蛍光物質;Alexa Fluor(R)647
・結合性基52c:マレイミド基
DNAアプタマー含有ポリヌクレオチドを1μM(10mM PBS、pH7.4、100mM NaCl)に調製した溶液250μlを、アニーリング処理(95℃、10分、その後30分かけて25℃まで冷却)した。実施例1で得られた検出対象の分析用センサ作製用基材をPCRチューブに入れ、アニーリング処理したDNAアプタマー含有ポリヌクレオチド溶液で満たした。サーマルサイクラーにて、60℃で10分加熱し、30分かけて25℃まで冷却する処理を行い、基板上のODN1と、DNAアプタマー含有ポリヌクレオチドのODN2とをハイブリダイズさせた。これによって、分析用センサ作製用基材にCD63特異的DNAアプタマーを導入した。
上記(1)でCD63特異的DNAアプタマー導入基板に、100μMのAlexa Fluor(R) 647 C2 Maleimide溶液(10mM PBS pH7.4、100mM NaCl)を40μl滴下し、室温で1時間、マイケル付加反応させた。これによって、分析用センサ作製用基材に蛍光物質を導入した。以上の操作によって、基板上のポリマー膜に設けられた鋳型の分子インプリントによる凹部内に蛍光物質とCD63特異的DNAアプタマーとを有する、小型細胞外小胞CD63の分析用センサを得た。
本実験例では、実施例2で得られた小型細胞外小胞CD63の分析用センサを用いて、分析対象として、ヒト前立腺癌PC3細胞株の培養上清から取得された小型細胞外小胞(HNB製、HBM PC3 100、PC3由来小型細胞外小胞)を用いた分析を行った。
・蛍光顕微鏡:オリンパス製IX73倒立顕微鏡
・フィルタ:オリンパス製CY5-4040C(604-644 nm for excitation and 672-712 nm for emission)
・対物レンズ:×100;オリンパス製UPLSAPO100XO
・光量:100%
・露光時間:0.1秒
・光源:水源ランプ;オリンパス製HGLGPS-SET
検出対象の分析用センサ作製用基材上の凹部内のODN1に対して導入する核酸として、CD63特異的DNAアプタマー(配列番号1)の代わりに、CD63に対する特異性を有さないランダムポリヌクレオチド(TGTGCGGCGAAATATTATAGCTACCGCAATTA(配列番号11))としたことを除いて、実施例3と同様にしてCD63の分析用センサ(比較例1-1)を作製した。また、検出対象の分析用センサ作製用基材上の凹部内のODN1に対して、何も導入しなかったことを除いて、実施例3と同様にしてCD63の分析用センサ(比較例1-2)を作製した。
検出対象の分析用センサ作製用基材上の凹部内のODN1に対して導入する核酸として、CD63特異的DNAアプタマー(配列番号1)の代わりに、MUC-1特異的DNAアプタマー(配列番号2)としたことを除いて、実施例3と同様にしてMUC-1の分析用センサを作製した。
核酸アプタマーの代わりに抗体を導入した小型細胞外小胞の分析用センサを作製した。具体的には、(i)基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み;前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し、前記凹部内に、抗体物質結合用基とシグナル物質結合用基とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材を作製し、(ii)前記抗体物質結合用基に前記検出対象に特異的な抗体物質を導入し;前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を導入することによって、検出対象の分析用センサを作製した。
FITC標識シリカナノ粒子200μl(200μlあたり表面に-COOH 5 nmolを有するもの、粒子径200nm)をジクロロメタン(DCM)に分散させた(シリカナノ粒子分散液)。エチル(ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド(EDC: 50 nmol, 10 eq)、N-ヒドロキシコハク酸イミド(NHS: 50 nmol, 10 eq)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA: 50 nmol, 10 eq) をdry DCMに溶解させ、シリカナノ粒子分散液と混合した。一晩反応させることでシリカナノ粒子表面をNHSで修飾した。表面修飾したシリカナノ粒子に対して、ヒスチジンが6個ペプチド結合で連結されたHis-tag (末端はリジン残基でありフリーのεアミノ基を有する:0.10μmol, 40eq)及び2-アミノエタンチオール塩酸塩(0.1μmol, 40eq)を加えて、室温で反応させた。反応終了後、遠心分離およびろ過によりチオール基およびHis-tagを導入したシリカナノ粒子(SH・His-tag化シリカナノ粒子)を精製した。
以下のようにして、金薄膜蒸着ガラス基板上にアミノ基及びブロモ基が末端となる混成自己組織化単分子膜(mixed SAMs)を作製し(分子膜形成工程)、アミノ基末端へNTA基を導入し、NTA-Ni錯体を形成した後、キレート結合によりシリカナノ粒子を固定化した(鋳型導入工程)。その後、シリカナノ粒子にメタクリル基修飾を施し(表面修飾工程)、表面開始制御/リビングラジカル重合によりポリマー薄膜を合成した(重合工程)。最後にシリカナノ粒子を除去し(除去工程)、検出対象の分析用センサ作製用基材を得た。
実施例1の項目1と同様に金薄膜蒸着ガラス基板の有機残滓の除去及び洗浄を行い、0.5 mM amino-EG6-undecanthiol hydrochloride及び0.5mM 2-(2-bromoisobutyryloxy) undecyl thiolのエタノール溶液に基板を浸漬させ、25℃で24時間静置することにより、ブロモ基およびアミノ基をもつ混合自己組織化単分子膜を形成させた。
5 mM isothiocyanobenzyl-nitrilotriacetic acid (ITC-NTA)のDMSO溶液80 μLを基板に滴下し、25℃で2時間静置してアミノ基をNTAで修飾した。基板をDMSO及び純水で洗浄後、4 mM NiCl2水溶液100 μLを基板に滴下し、室温で15分間静置することで、Ni-NTA錯体を形成した。その後、SH・His-tag化シリカナノ粒子(固形分濃度5.1 mg/ml)含有水溶液100 μlを基板に滴下し、25°Cで1時間静置した。
100 μM 2-(2-Pyridyl)dithioethyl methacrylateの PBS (pH 7.4)溶液に基板を浸して一晩静置させることで、ジスルフィド交換反応によってシリカナノ粒子表面のSH基にジスルフィドを介してメタクリロイル基の導入を行った。
重合時間を3時間としたことを除いて、実施例1の項目4と同様にして、基板上にポリマー薄膜を合成した。これによって、基板上に、表1のモノマーと共にシリカナノ粒子のメタクリロイル基も共重合されたポリマー薄膜を得た。重合終了後、1 M エチレンジアミン四酢酸-4Na 水溶液に基板を15分間浸し、ATRPに用いたCu2+を取り除いた。
50 mM トリス(2-カルボキシエチル)フォスフィン・HCl(TCEP)水溶液に25℃で3時間浸漬させ、ポリマーとシリカナノ粒子とを結合させているジスルフィド結合を還元・切断した。ポリマー側にはフリーのSH基が残るが、このSH基は、SH・His-tag化シリカナノ粒子由来であることから、ポリマー薄膜のうち鋳型に対応した凹部以外の部分には存在せず、鋳型に対応した凹部内のみに存在する。前述のEDTA-4Na処理で、NI-NTAのニッケルも除去されてHis-tagがこの時点でフリーとなる可能性が高いが、念のため以下の操作も行った。純水で洗浄後、0.5 wt% SDSを含む50 mM酢酸バッファー (pH 4.0)に基板を浸して、Ni-NTA及びHis-tagを介して結合していたシリカナノ粒子をポリマー薄膜から洗い出した。
フィルタ:Cy5
対物レンズ:×5
露光時間:0.1秒
光源:水銀ランプ
20…基材
21…単分子膜
25b…核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基(可逆的結合性基)
25a…結合性官能基
23a…重合開始性基
30…ポリマー膜
31…凹部
32c…シグナル物質結合用基(可逆的結合性基)
32a…重合性官能基
35a…重合性モノマー
40…鋳型
42…可逆的結合性基(シグナル物質結合用基と結合することで第2の可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基)
45…相補結合
50…分析用センサ
55d…検出対象に特異的な核酸アプタマー
55…相補結合
52d…シグナル物質
60…検出対象
配列番号2は、MUC-1に特異的なDNAアプタマーである。
配列番号3は、EpCAMに特異的なDNAアプタマーである。
配列番号4は、HER2に特異的なDNAアプタマーである。
配列番号5は、ERαに特異的なDNAアプタマーである。
配列番号6は、SARSコロナウイルス-2(SARS-CoV-2)に特異的なDNAアプタマーである。
配列番号7は、SARSコロナウイルス-2(SARS-CoV-2)に特異的なDNAアプタマーである。
配列番号8は、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基にハイブリダイズできるポリヌクレオチドである。
配列番号9は、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の配列である。
配列番号10は、核酸アプタマーを与えるポリヌクレオチドである。
配列番号11は、CD63に対する特異性を有さないランダムポリヌクレオチドである。
Claims (17)
- 基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み、
前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し、
前記凹部内に、シグナル物質結合用基と、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材。 - 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の長さが8塩基長以上である、請求項1に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
- 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基が単鎖である、請求項1又は2に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
- 前記ポリマー膜が、前記検出対象又は前記検出対象よりサイズが大きい対象を鋳型とする分子インプリントポリマーで構成され、前記凹部が前記鋳型の表面形状の一部に対応する、請求項1~3のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
- 前記シグナル物質結合用基がチオール基である、請求項1~4のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材と、
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に結合した、前記検出対象に特異的な核酸アプタマーと、
前記シグナル物質結合用基に結合したシグナル物質と、
を含む、検出対象の分析用センサ。 - 前記検出対象が膜構造を有する微小粒体である、請求項6に記載の検出対象の分析用センサ。
- 前記膜構造を有する微小粒体が細胞外小胞である、請求項7に記載の検出対象の分析用センサ。
- 前記検出対象に特異的な核酸アプタマーが、前記膜構造を有する微小粒体の表面に発現している特異的分子に対する特異的結合能を有する、請求項6~8のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ。
- 請求項6~9のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサに、検出対象を含む試料を接触させ、前記核酸アプタマーに前記検出対象を結合する工程と、
前記シグナル物質に由来するシグナルの変化を検出する工程と、
を含む、検出対象の分析法。 - 基材に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と重合開始性基とを表面に有する単分子膜を形成する単分子膜形成工程(1-1)と、
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に対し、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と相補結合が可能なポリヌクレオチド基を表面に有する鋳型を導入する鋳型導入工程(1-2)と、
前記鋳型の表面を、可逆的連結基を介して重合性官能基で修飾する表面修飾工程(1-3)と、
重合性モノマーを加え、前記重合性モノマー及び前記重合性官能基を基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程(1-4)と、
前記相補結合及び前記可逆的連結基を開裂させてそれぞれ核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基及びシグナル物質結合用基へ変換するとともに前記鋳型を除去する除去工程(1-5)と、
を含む、検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。 - 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の長さが8塩基長以上である、請求項11に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
- 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基が単鎖である、請求項11又は12に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
- 前記鋳型が、表面に、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とともに、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合性基を有する、請求項11~13のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
- 前記鋳型がシリカ粒子である、請求項11~14のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
- 前記シグナル物質結合用基がチオール基であり、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基がチオール基である、請求項11~15のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
- 請求項11~16のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法を行う工程(1)と、
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に、検出対象に特異的な核酸アプタマーを相補結合によって結合する工程(2)と、
前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を結合する工程(3)と、
を含む、検出対象の分析用センサの製造方法。
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