JP7454225B2 - 検出対象の分析用センサ作製用基材、検出対象の分析用センサ、及び検出対象の分析法 - Google Patents

検出対象の分析用センサ作製用基材、検出対象の分析用センサ、及び検出対象の分析法 Download PDF

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Description

特許法第30条第2項適用 ▲1▼ 発行日:令和1年9月4日 刊行物名:第13回バイオ関連化学シンポジウム 講演要旨集 ▲2▼ 開催日:令和1年9月4日~6日 集会名:第13回バイオ関連化学シンポジウム ▲3▼ 発行日:令和2年2月28日 刊行物名:第67回応用物理学会春季学術講演会 講演予稿集 ▲4▼ 掲載年月日:令和2年3月5日 掲載アドレス:https://nenkai.csj.jp/Proceeding/detail/year/2020/lecture_no/2G2-11
本発明は、検出対象を基材上で迅速に検出する技術に関する。より具体的には、本発明は、検出対象の分析用センサ作製用基材及びその製造方法、検出対象の分析用センサ及びその製造方法、並びに検出対象の分析法に関する。
エクソソーム等の小型細胞外小胞(Small Extracellular Vesicles;sEVs)は細胞から放出される小胞体の一つであり、直径20~200nmの脂質二重膜小胞である。小型細胞外小胞は、その内部にタンパク質、及びmiRNA、mRNAなどの核酸を内包するとともに、その表面にもタンパク質を有している。小型細胞外小胞はこのような物質に特徴づけられているため、小型細胞外小胞の特徴を解析することで、分泌した細胞がどのような細胞であるかを推測できると考えられている。また、小型細胞外小胞は様々な体液中で存在が確認されており、比較的容易に採取することができる。
癌細胞から分泌される小型細胞外小胞は腫瘍由来の物質を含んでいる。したがって、体液中の小型細胞外小胞に含まれる物質を解析することで癌の診断を行うことができると期待されている。さらに、小型細胞外小胞は細胞によって能動的に分泌されるものであることから、がんの早期段階であっても何らかの特徴を呈していることが予想されている。
エクソソームの検出方法は種々報告されている。特に、特許文献1に記載されるバイオセンサは、分子インプリント技術により形成された穴を有するポリマー膜において、当該穴の中に選択的に抗体と蛍光分子とが導入されていることで、検出対象となるエクソソームを当該穴の中で特異的に抗原抗体結合させると同時に蛍光検出が可能であるため、特異性及び迅速性に優れたセンサとして有用である。
抗体は、その優れた特異性と親和性とにより、バイオセンサの性能に大きく寄与している。しかしながら、抗体が生体分子であるがゆえに、抗体を用いたバイオセンサは、その作製にある程度のコストを要するとともに、保存及び使用時において温度及びpH等の条件を厳密に管理する必要がある。
ここで、抗体のように分子認識能力を有する物質として、核酸アプタマーが知られている。核酸アプタマーは、化学的に全合成が可能であるため安価に合成でき、外部刺激に対する安定性も高い。
その一方で、非特許文献1に記載されているように、核酸アプタマーには、標的分子に対する結合能がタンパク質からなる抗体と比較して低い場合が多いことが問題点として挙げられる。この問題点は、タンパク質である抗体が20種類のアミノ酸を構成要素とすることに対し、核酸アプタマーがわずか4種類の塩基を構成要素とするにすぎないことに起因している。具体例としては、非特許文献2のデータによると、ヒトCD63に特異的なアプタマーの解離定数Kdはわずか17.1nMである。
核酸アプタマーの親和性を向上させるために、構成塩基として、天然塩基に修飾基を導入したものを用いたり、人工塩基を用いたりすることで、塩基のバリエーションを増やす研究がなされている。非特許文献1では、天然型塩基とは性質の異なる人工塩基を組み込むことにより、DNAアプタマーの親和性を高める技術を提供しており、具体的には、人工塩基7として-(2-チエニル)イミダゾ[4,5-b]ピリジンを組み込むことで、DNAアプタマーの親和性が100倍ほど向上したことが記載されている。
国際公開第2018/221271号
Nature Biotechnology volume 31,pages453-457(2013) "CD63 Aptamer Data Sheet"、[online]、平成10年4月1日、BasePair Biotechnologies, Inc.、[令和2年3月25日検索]、インターネット<URL: https://www.basepairbio.com/wp-content/uploads/2017/04/ATW0056-CD63-Aptamer-Data-Sheet_15Sept17.pdf>
バイオセンサにおいて、分子認識能力を有する物質として核酸アプタマーを用いれば、抗体を用いる場合に比べ、作製コスト低減、並びに、保存及び使用時における安定性向上が期待できる。しかしながら、天然塩基からなる核酸アプタマーの結合能が低いことが多いことに鑑みると、バイオセンサの結合活性を高める目的においては、天然塩基からなる核酸アプタマーを用いる選択肢は無かった。
また、結合能の低い核酸アプタマーの結合活性を高める技術は、専ら、人工塩基の導入に依存しているのが現状である。核酸アプタマーの構成要素として人工塩基を用いると、天然塩基のみで構成される核酸アプタマーの作製技術(SELEX法)で用いられる通常のクローニング及びシーケンスができず、ランダムライブラリーから人工塩基の位置を特定するために特殊な手法を要する制約を伴う。そのような制約を必要としない他の手段でバイオセンサの結合活性の向上が可能になれば、バイオセンサ技術の裾野は更に拡大できると考えられる。
そこで本発明の目的は、小型細胞外小胞等の検出対象を、高い特異性及び迅速性をもって検出でき、更に、高い安定性と共に、向上した結合活性が両立した測定系を提供することにある。
本発明者は、分子インプリント技術により形成された穴を有するポリマー膜において、当該穴の中に選択的に抗体と蛍光分子とが導入されているバイオセンサにおいて、敢えて、抗体の代わりに天然塩基からなる核酸アプタマーを導入したところ、その結合能が、抗体を導入した場合を凌駕する予想外なレベルに高められることを見出した。本発明は、この知見に基づき、さらに検討を重ねることにより完成された。
本発明は、検出対象の分析用センサ作製用基材及びその製造方法、検出対象の分析用センサ及びその製造方法、並びに検出対象の分析法を含む。すなわち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項1. 基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み、
前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し、
前記凹部内に、シグナル物質結合用基と、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材。
項2. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の長さが8塩基長以上である、項1に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項3. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基が単鎖である、項1又は2に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項4. 前記ポリマー膜が、前記検出対象又は前記検出対象よりサイズが大きい対象を鋳型とする分子インプリントポリマーで構成され、前記凹部が前記鋳型の表面形状の一部に対応する、項1~3のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項5. 前記シグナル物質結合用基がチオール基である、項1~4のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項6. 項1~5のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材と、
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に結合した、前記検出対象に特異的な核酸アプタマーと、
前記シグナル物質結合用基に結合したシグナル物質と、
を含む、検出対象の分析用センサ。
項7. 前記検出対象が膜構造を有する微小粒体である、項6に記載の検出対象の分析用センサ。
項8. 前記膜構造を有する微小粒体が細胞外小胞である、項7に記載の検出対象の分析用センサ。
項9. 前記検出対象に特異的な核酸アプタマーが、前記膜構造を有する微小粒体の表面に発現している特異的分子に対する特異的結合能を有する、項6~8のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ。
項10. 項6~9のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサに、検出対象を含む試料を接触させ、前記核酸アプタマーに前記検出対象を結合する工程と、
前記シグナル物質に由来するシグナルの変化を検出する工程と、
を含む、検出対象の分析法。
項11. 基材に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と重合開始性基とを表面に有する単分子膜を形成する単分子膜形成工程(1-1)と、
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に対し、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と相補結合が可能なポリヌクレオチド基を表面に有する鋳型を導入する鋳型導入工程(1-2)と、
前記鋳型の表面を、可逆的連結基を介して重合性官能基で修飾する表面修飾工程(1-3)と、
重合性モノマーを加え、前記重合性モノマー及び前記重合性官能基を基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程(1-4)と、
前記相補結合及び前記可逆的連結基を開裂させてそれぞれ核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基及びシグナル物質結合用基へ変換するとともに前記鋳型を除去する除去工程(1-5)と、
を含む、検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項12. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の長さが8塩基長以上である、項11に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項13. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基が単鎖である、項11又は12に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項14. 前記鋳型が、表面に、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とともに、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合性基を有する、項11~13のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項15. 前記鋳型がシリカ粒子である、項11~14のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項16. 前記シグナル物質結合用基がチオール基であり、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基がチオール基である、項11~15のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項17. 項11~16のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法を行う工程(1)と、
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に、検出対象に特異的な核酸アプタマーを相補結合によって結合する工程(2)と、
前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を結合する工程(3)と、
を含む、検出対象の分析用センサの製造方法。
本発明によれば、小型細胞外小胞等の検出対象を、高い特異性及び迅速性をもって検出でき、更に、高い安定性と共に、向上した結合活性が両立した測定系が提供される。つまり、本発明によれば、分子インプリント技術により形成された穴を有するポリマー膜において、当該穴の中に選択的に核酸アプタマーと蛍光分子とが導入されるようにバイオセンサを構築することによって、当該穴の中に抗体を導入した場合と対比して格段に高い結合能が奏され、これによって、より一層高い感度で検出対象を検出することが可能となる。
本発明によって奏される結合能の高さについては、核酸アプタマーとして天然塩基からなる核酸アプタマーを用いた場合であっても、抗体の結合能の100倍を超えるケースも可能であった。天然塩基からなる核酸アプタマーの生来的な結合能は、抗体の生来的な結合能を超えるものではなく、むしろ多くの場合で抗体の生来的な結合能よりも低いことに鑑みると、本発明によって抗体を導入した場合に比べて格段に結合能が向上することは、核酸アプタマーの生来的な結合能からみれば驚異的な向上効果であるといえる。このような効果がもたらされる具体的なメカニズムについては定かではないが、核酸アプタマーが比較的小さな分子であることにより、分子インプリント技術により形成された微小な穴の中に複数の核酸アプタマーを配することが可能となり、これによってセンシング時に検出対象が複数の結合で捕捉され、検出対象当たりの核酸アプタマーの結合能が驚異的なレベルに引き上げられたと考えられる。さらに、核酸アプタマーとして、人工塩基を導入した高親和性核酸アプタマーを用いても、当該高親和性核酸アプタマーの生来的な結合能を格段に向上させることが期待できる。
本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材の一例を示す模式図である。 本発明の検出対象の分析用センサの一例を示す模式図である。 本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材を製造する方法における単分子膜形成工程(1-1)を説明する模式図である。 図3に引き続く、鋳型導入工程(1-2)を説明する模式図である。 図4に引き続く、表面修飾工程(1-3)を説明する模式図である。 図5に引き続く、重合工程(1-4)を説明する模式図である。 図6に引き続く、除去工程(1-5)を説明する模式図である。 本発明の検出対象の分析用センサの製造方法を示す模式図である。 本発明の検出対象の分析法の一例を説明する模式図である。 実施例3で、本発明の分析用センサを用いた蛍光分析による小型細胞外小胞検出において得られた、小型細胞外小胞濃度に対する蛍光強度変化を表示したグラフとそのカーブフィッティング結果である。
[1.検出対象の分析用センサ作製用基材]
本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材は、後述の発明の分析用センサを作製するための材料となる基材である。この分析用センサ作製用基材は、ユーザが、小型細胞外小胞などの検出対象をより一層感度高く検出可能なセンサへ簡便にカスタマイズできるように構成されている。
本発明の検出対象の分析センサ作製用基材は、基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み;前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し;前記凹部内に、シグナル物質結合用基と、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とを有する。図1に、本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材の一例を模式的に示す。図1に示すように、分析用センサ作製用基材10は、基材20とポリマー膜30とを含む。ポリマー膜30は基材20の表面に設けられており、凹部31を有する。凹部31は検出対象(後述の検出対象60)を受け入れ可能な大きさに形成された穴である。分析用センサ作製用基材10は、凹部31内に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bと、シグナル物質結合用基32cとを有する。以下、それぞれの要素について詳述する。
[1-1.基材]
基材20の材料は、例えば、金属、ガラス、及び樹脂からなる群から選択される材料であってよい。金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等が挙げられる。樹脂としては、ポリ(メタ)アクリレート、ポリスチレン、ABS(アクリロニトリル-ブタジエン-スチレン共重合体)、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリウレタン、シリコーン樹脂、フッ素樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等が挙げられる。
基材20は、上述の材料から選ばれる複数の材料が組み合わされて形成されたものであってもよい。例えば、基材20は、ガラスまたは樹脂の表面に、金属膜が設けられたものであってもよい。また、基材20の形状としては、板状及び粒子状を問わない。好ましい例としては、金基板、ガラス基板、金ナノ粒子、二酸化珪素粒子(シリカ粒子、ガラスビーズ等)等が挙げられる。
[1-2.ポリマー膜]
ポリマー膜30は、基材20に層状に設けられており、複数の凹部31を有する。凹部31は、本発明の検出対象の分析用センサにおけるセンサ場となる部分である。凹部31は、検出対象を受け入れ可能に形成されていれば限定されるものではないが、好ましくは、後述のように分子インプリント重合法を用いることによって形成された、分子インプリントポリマー(MIP;molecularly imprinted polymer)が挙げられる。この場合、凹部31は、分子インプリント重合法において用いられる鋳型(後述の鋳型40)によって型取られたものであり、当該鋳型の表面形状の一部に対応する形状を有する。凹部31は、検出対象を受け入れ可能な大きさで形成されていればよいため、凹部31の鋳型は、検出対象と同じ大きさの物質であってもよいし、検出対象よりもサイズが大きい物質であってもよい。好ましくは、凹部31の鋳型は、検出対象よりもサイズが大きい物質である。
なお、凹部31が検出対象を受け入れ可能な大きさであるとは、核酸アプタマー(後述の核酸アプタマー55d)及びシグナル物質(後述のシグナル物質52d)が結合して分析用センサ(後述の分析用センサ50)となった場合に、検出対象の少なくとも一部が凹部31内に進入し核酸アプタマーにアプローチして結合可能となる程度に凹部31が基材20表面に十分な大きさで開口していることをいう。
凹部31の開口径は、検出対象により異なり得るため特に限定されないが、たとえば1nm~10μmが挙げられる。ポリマー膜30の厚みも検出対象により異なり得るため特に限定されないが、たとえば1nm~1μmが挙げられる。
ポリマー膜30を構成するポリマーは、たとえば、生体適合性モノマー由来成分を含む生体適合性ポリマーであってよい。生体適合性とは、生体物質の接着を誘起しない性質をいう。生体適合性モノマーに由来する成分を含むことにより、ポリマー膜30において非特異的吸着を良好に抑制することができる。上記の生体適合性モノマーとしては、好ましくは親水性モノマーが挙げられ、より好ましくは双性イオンモノマーが挙げられる。
双性イオンモノマーは、酸性官能基(たとえば、リン酸基、硫酸基、およびカルボキシル基など)に由来するアニオン基と、塩基性官能基(たとえば、1級アミノ基、2級アミノ基、3級アミノ基および4級アンモニウム基など)に由来するカチオン基との両方を1分子中に含む。たとえば、ホスホベタイン、スルホベタイン、およびカルボキシベタインなどが挙げられる。
より具体的には、ホスホベタインとしては、ホスホリルコリン基を側鎖に有する分子が挙げられ、好ましくは、2-メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン(MPC)などが挙げられる。
スルホベタインとしては、N,N-ジメチル-N-(3-スルホプロピル)-3’-メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト(SPB)、N,N-ジメチル-N-(4-スルホブチル)-3’-メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト(SBB)などが挙げられる。
カルボキシベタインとしては、N,N-ジメチル-N-(1-カルボキシメチル)-2’-メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト(CMB)、N,N-ジメチル-N-(2-カルボキシエチル)-2’-メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト(CEB)などが挙げられる。
これらの双性イオンモノマーの中でも、好ましくはホスホベタインが挙げられ、より好ましくは2-メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン(MPC)が挙げられる。
ポリマー膜30における生体適合性モノマー由来成分の割合としては、たとえば10モル%以上100モル%以下が挙げられる。生体適合性モノマー由来成分の含有量が上記下限以上であることは、ポリマー膜30表面における非特異性吸着を抑制する点で好ましい。上記生体適合性モノマー由来成分の割合の範囲の好ましい下限としては、30モル%以上、より好ましくは50モル%以上、さらに好ましくは70モル%以上、一層好ましくは80モル%以上、より一層好ましくは90モル%以上、特に好ましくは95モル%以上が挙げられる。
[1-3.核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基]
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bは、核酸アプタマー(後述の核酸アプタマー55d)を相補結合させることで分析用センサ作製用基材10に核酸アプタマーを導入可能とする基である。なお、後に詳述するが、核酸アプタマー55dは、核酸アプタマー55dに延設された導入用ポリヌクレオチド基(後述の導入用ポリヌクレオチド基55b)と核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bとが相補結合55を形成することによって導入される。ユーザは、検出対象を自由にターゲティングすることができ、ターゲットとする検出対象に特異的な核酸アプタマーを自由に選択し、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bへ導入することができる。
また、本発明の分析用センサ作製用基材10は、1個の基材20上で、一の凹部31に対し一の種類の核酸アプタマーを導入し、他の凹部31に対し他の種類の核酸アプタマーを導入することによって、1個の基材20において複数種の核酸アプタマーを用いた検出対象の分析が可能となるようにカスタマイズすることもできる。なお、1個の基材20へ複数種の核酸アプタマーを導入する具体的な方法は、ポリマー膜30上の領域を複数の領域に分画し、分画された領域毎に異なる核酸アプタマーを導入する方法等が挙げられる。分画の方法としては、ポリマー膜30が不在の部分を設ける方法、ポリマー膜30上の凹部が不在の部分を設ける方法、ポリマー膜30上に障壁を凸設する方法等が挙げられる。このようなカスタマイズの具体例としては、一の凹部31に対し特定の小型細胞外小胞に結合する核酸アプタマーを導入し、他の凹部31に対し特定のタンパク質(小型細胞外小胞膜に存在しないタンパク質)に結合する核酸アプタマーを導入することによって、1個の基材20上で、小型細胞外小胞と当該タンパク質との両方の分析が可能となる。また、カスタマイズの別の具体例としては、一の凹部31に対し特定の小型細胞外小胞の表面タンパク質Aに結合する核酸アプタマーを導入し、他の凹部31に対し当該特定の小型細胞外小胞の表面タンパク質Bに結合する核酸アプタマーを導入することによって、1個の基材20上で、小型細胞外小胞上の異なる種類の表面タンパク質の分析が可能となる。これらの具体例は、小型細胞外小胞だけでなく、ウイルス等の他の膜構造を有する微小粒体にも適用でき、また、異なる種類の表面タンパク質だけでなく、異なる種類の表面標的(たとえば、タンパク質と糖鎖等)にも適用できる。
なお、図示された模式図においては、便宜上の観点で、1個の凹部31に1個の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bが示されているが、実際には、1個の凹部31に複数の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bが存在している。基材20表面において、凹部31以外の部分には核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bは存在しない。
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bは、ポリヌクレオチドで構成される。上記ポリヌクレオチドは、DNA及びRNAのいずれであってもよいが、安定性の観点から、好ましくはDNAが挙げられる。上記ポリヌクレオチドを構成する塩基としては、天然塩基(アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、ウラシル(U))及び人工塩基のいずれであってもよいが、製造容易性及びユーザによるカスタマイズ容易性の観点から、天然塩基が挙げられる。
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bの長さとしては特に限定されないが、好ましい相補結合55を得る観点から、好ましくは8塩基長以上、より好ましくは12塩基長以上、さらに好ましくは16塩基長以上、一層好ましくは18塩基長以上が挙げられる。また、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bの長さの範囲の上限としては、凹部31中での検出対象の捕捉を可能とする限りにおいて特に限定されないが、例えば25塩基長以下、好ましくは23塩基長以下、より好ましくは21塩基長以下が挙げられる。
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bの配列は、導入する核酸アプタマーの認識部位が誤ってハイブリダイズしない配列が適宜選択される。つまり、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bの配列は、核酸アプタマーと類似しないように設計されればよく、その限りにおいてランダムな塩基配列で構成されていてもよいし、単一ヌクレオチドのポリマーであってもよい。
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bは、図示した好ましい態様においては単鎖であるが、本発明における核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基は、相補結合により核酸アプタマーを導入できる限り、単鎖に限定されるものではなく、二重鎖以上の多重鎖であることも許容する。
[1-4.シグナル物質結合用基]
シグナル物質結合用基32cは、シグナル物質(後述のシグナル物質52d)を結合させることで分析用センサ作製用基材10にシグナル物質を導入可能とする基である。ユーザは、シグナル物質を自由に選択し、シグナル物質結合用基32cへ導入することができる。
また、本発明の分析用センサ作製用基材10は、1個の基材20において、一の凹部31と他の凹部31とで異なる種類の核酸アプタマーを導入する場合は、核酸アプタマーの種類ごとに異なるシグナル物質を導入するようにカスタマイズすることもできる。
本発明においては、1個の凹部31につき、通常複数個のシグナル物質結合用基32cが設けられている。シグナル物質結合用基32cは、本発明の分析センサの凹部31内でのセンシング時(検出対象を凹部31内に受け入れた時)に、シグナル強度の変化を検出可能となるように十分な量が用意されていればよい。従って、1個の凹部31に設けられるシグナル物質結合用基32の量は特に限定されるものではなく、一例として、1個の凹部31につき例えば1個~約2000個程度が挙げられる。しかしながら、1個の凹部31当たりのシグナル物質結合用基32の量はこれに限定されるものではなく、鋳型の特性、ポリマー膜厚、凹部31の大きさ及び/又は検出すべき対象物質の大きさにもよって異なり得る。なお、基材20表面において、凹部31以外の部分にはシグナル物質結合用基32cは実質的に設けられない。
シグナル物質結合用基32cは、不可逆的結合性基であってもよいし可逆的結合性基であってもよく、共有結合性基であってもよいし非共有結合性基であってもよい。なお、可逆的結合性基とは、他の可逆的結合性基と結合(共有結合及び非共有結合を問わない)することにより可逆的連結基を構成可能な基であり、可逆的とは、可逆的結合性基から可逆的連結基への変換(結合)及び可逆的連結基から可逆的結合性基への変換(開裂)とが双方向に可能であることをいう。
シグナル物質結合用基32cは、好ましくは可逆的結合性基であり、より好ましくは共有結合性基である。このような基としては、チオール基(対応する可逆的連結基はジスルフィド基)、アミノオキシ基又はカルボニル基(対応する可逆的連結基はオキシム基)、ボロン酸基とジオール基(対応する可逆的連結基は環状ジエステル基)、アミノ基とカルボニル基(対応する可逆的連結基はシッフ塩基)、アルデヒド基もしくはケトン基とアルコール(対応する可逆的連結基はアセタール基)等が挙げられ、好ましくはチオール基が挙げられる。
[1-5.他の態様]
本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材は、核酸アプタマー及びシグナル物質の少なくともいずれかがユーザによってカスタマイズされるように構成されていればよい。したがって、他の態様として、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bの方に、検出対象に特異的な核酸アプタマーがすでに結合していてもよい。この場合、ユーザはシグナル物質を自由に選択して導入することができる。
なお、更に他の態様として、シグナル物質結合用基の方に、すでにシグナル物質が結合していてもよい。この場合、ユーザは検出対象を自由にターゲティングすることができ、ターゲットとする検出対象に特異的な核酸アプタマーを自由に選択し、当該核酸アプタマーを導入することができる。
[2.検出対象の分析用センサ]
本発明の分析用センサは、上述の検出対象の分析用センサ作製用基材と;前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に結合した、前記検出対象に特異的な核酸アプタマーと;前記シグナル物質結合用基に結合したシグナル物質と;を含む。図2に、本発明の検出対象の分析用センサの一例を模式的に示す。図2に示すように、分析用センサ50は、上述の分析用センサ作製用基材10のポリマー膜30に設けられた凹部31内において、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bに核酸アプタマー55dが結合し、シグナル物質結合用基32cにシグナル物質52dが結合している。
[2-1.検出対象]
本発明の分析用センサの検出対象(後述の検出対象60)は、核酸アプタマー55dへの特異性結合能を有するものであれば原理上特に限定されるものではない。
検出対象の化学種としては特に制限されず、例えば、生物に由来しない低分子有機化合物及び高分子化合物、生物に由来する低分子低分子有機化合物及び高分子化合物が挙げられる。これらの化学種の中でも好ましくは生物に由来する低分子低分子有機化合物及び高分子化合物が挙げられ、より好ましくは動物に由来する低分子低分子有機化合物及び高分子化合物が挙げられ、具体的には、糖類、脂質類、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド等が挙げられる。生物としては、ヒト及びヒト以外の動物が挙げられ、ヒト以外の動物としては、脊椎動物が挙げられ、好ましくは哺乳動物が挙げられ、例えば、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ハムスタ-、ウサギ、及びヤギ等が挙げられる。
また、検出対象の機能種としても特に限定されず、抗原、抗体、受容体、疾患マーカー、プリオン、膜構造を有する微小粒体等が挙げられる。また、膜構造を有する微小粒体を検出対象とする場合、その標的分子としては、膜構造を有する微小粒体の表面に発現している、抗原、抗体、受容体、及び/又は疾患マーカー;膜構造を有する微小粒体が当該膜構造の内部に発現している、抗原、抗体、受容体、及び/又は疾患マーカー;並びに、膜構造を有する微小粒体が分泌する、抗原、抗体、受容体、及び/又は疾患マーカー等が挙げられる。
疾患マーカーとしては特に限定されないが、例えば、MUC-1、EpCAM、HER2、ERα、GGT1、CD24、PR、その他多数の腫瘍マーカー等が挙げられる。
膜構造を有する微小粒体としては、細胞外小胞、細胞内小胞、オルガネラ、ウイルス及び細胞が挙げられる。膜構造としては、脂質二重膜構造が挙げられる。細胞外小胞としては、小型細胞外小胞(sEVs)が挙げられる。小型細胞外小胞(sEVs)は、国際細胞外小胞学会(International Society for Extracellular Vesicles;ISEV)によって定義される、細胞から放出される核を持たない(複製できない)脂質二重膜で囲まれた粒子であり、具体的には、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体等が挙げられる。細胞内小胞としては、リソソーム、エンドソーム等が挙げられる。オルガネラとしては、ミトコンドリア等が挙げられる。ウイルスとしては、インフルエンザウイルス(H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等)、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス(HBV、HCV等)、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、ワクチニアウイルス、ジカウイルス、RSウイルス、ヘルペスウイルス、日本脳炎ウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス、エボラウルイルス、ノロウイルス(GII、GII.3、GII.4等)、ロタウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、コロナウイルス(SARSコロナウイルス(SARS-CoV)、SARSコロナウイルス-2(SARS-CoV-2)等)等が挙げられる。細胞としては、循環腫瘍細胞(CTC)等の癌細胞、その他の疾患関連細胞等が挙げられる。これらの膜構造を有する微小粒体の中でも、好ましくは細胞外小胞及び細胞が挙げられ、より好ましくは小型細胞外小胞、ウイルス、癌関連細胞が挙げられる。
小型細胞外小胞の表面に発現している標的(小型細胞外小胞特異的抗原又は小型細胞外小胞抗原)としては、CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1、Rab5、Annexin V、LAMP1、EpCAM、HER2等のタンパク質;脂質(フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン等のリン脂質等);糖鎖等が挙げられる。
ウイルスの表面又は内部に発現している標的としては、スパイク(S)糖タンパク質、エンベロープ(E)タンパク質、膜(M)タンパク質、ヘマグルチニンエステラーゼ(HE)タンパク質、ヌクレオカプシド(NC)タンパク質、非構造(NS)タンパク質、等が挙げられる。
癌細胞の表面に発現している標的(癌細胞特異的抗原)としては、Caveolin-1、EpCAM、FasL、TRAIL、Galectine3、CD151、Tetraspanin 8、EGFR、HER2、RPN2、CD44、TGF-β等のタンパク質;脂質(フォスファチジルセリン、フォスファチジルコリン等のリン脂質等);糖鎖等が挙げられる。
なお、後述のように、シグナル物質52dを、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を引き起こす蛍光色素ペアの一方として構成する場合は、検出対象60には、予め当該蛍光色素ペアの他方を結合させておく。
[2-2.核酸アプタマー(検出対象に特異的な核酸アプタマー)]
核酸アプタマー55dとしては、検出対象への特異的結合能を有する核酸アプタマーが選択される。核酸アプタマーは、所定の標的に対する特異的結合能を有する、比較的短い(例えば20~200塩基長さの)塩基配列を有する核酸分子である。検出対象と核酸アプタマー55dとの特的結合の結合様式は限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、電気的吸着などの化学的な結合、及び形状依存的な係合等の物理的な結合等が挙げられる。
本発明において用いられる核酸アプタマー55dとしては、RNAアプタマー、DNAアプタマー及びDNA-RNAハイブリッド型アプタマー(DNA/RNAキメラ型アプタマー)等が挙げられる。安定性の観点から、本発明において用いられる核酸アプタマー55dとしては、好ましくはDNAアプタマーが挙げられる。核酸アプタマー55dを構成する塩基としては、天然塩基(アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、ウラシル(U))及び人工塩基のいずれであってもよい。
本発明では、検出対象当たりの核酸アプタマーの結合能を各段に向上させることができるため、生来的な結合能が抗体の結合能以下又は抗体の結合能未満である核酸アプタマーであっても、効果的に検出対象当たりの核酸のアプタマー結合能向上効果を得ることができる。このような観点から、本発明における好適な核酸アプタマー55dの構成塩基としては、天然塩基が挙げられる。核酸アプタマー55dの構成塩基が天然塩基であることは、取得容易性、製造容易性及びユーザによるカスタマイズ容易性の観点からも好ましい。なお、核酸アプタマーの生来的な結合能とは、核酸アプタマーが、本発明の分析用センサ50のような凹部31内ではなく、平面上に固定された場合又は非固定の遊離状態の場合における結合能をいう。また、結合能は、結合定数又は解離定数によって測定される値である。
無論、本発明においては、より一層向上した結合能を得ることを目的として、核酸アプタマー55dとして、生来的な結合能を向上させた人工塩基を含む核酸アプタマーを用いてもよい。
核酸アプタマー55dの塩基配列及び分子の立体構造は、検出対象に応じて当業者により決定される。核酸アプタマー55dとしては、既に知られている核酸アプタマーを用いることができ、更に、任意の公知の方法によって取得された新たな核酸アプタマーを用いることもできる。核酸アプタマーを取得する方法としては特に限定されず、任意の公知の方法が用いられる。このような方法の代表例としては、SELEX法(標的に対して、ランダムな配列を持つ多数のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドライブラリーを接触させ、標的に対して親和性の高いオリゴヌクレオチド群を選抜し、選抜したオリゴヌクレオチドを増幅して、標的分子に特異的に結合するかどうかを確認する手法)が挙げられる。
具体的な核酸アプタマー55dの例としては、CD63に特異的な核酸アプタマーとしてCACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA(配列番号1)が挙げられ、MUC-1に特異的な核酸アプタマーとしてGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG(配列番号2)が挙げられ、EpCAMに特異的な核酸アプタマーとしてCACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG(配列番号3)が挙げられ、HER2に特異的な核酸アプタマーとしてGGGCCGTCGAACACGAGCATGGTGCGTGGACCTAGGATGACCTGAGTACTGTCC(配列番号4)が挙げられ、ERαに特異的な核酸アプタマーとしてATACCAGCTTATTCAATTCGTTGCATTTAGGTGCATTACGGGGGTTATCCGCTCTCTCAGATAGTATGTGCAATCA(配列番号5)等が挙げられる。
具体的な核酸アプタマー55dの他の例としては、プリオン、インフルエンザウイルス(H1N1、H3N2、H5N1、H9N2等)、ヒト免疫不全ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、ワクチニアウイルス、ジカウイルス、RSウイルス、ヘルペスウイルス、日本脳炎ウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトパピローマウイルス、エボラウルイルス、ノロウイルス(GII、GII.3、GII.4等)、デングウイルス、又はSARSコロナウイルス(SARS-CoV)に特異的な核酸アプタマーとして、ウイルス検出と抗ウイルス療法へのアプタマーの応用に関する総説(X. Zou1, J. Wu1, J. Gu1, L. Shen, L. Mao, Application of Aptamers in Virus Detection and Antiviral Therapy, Front. Microbiol. 2019, 10, 1462.)等で報告されているDNA又はRNAアプタマーが挙げられ、SARSコロナウイルス-2(SARS-CoV-2)に特異的な核酸アプタマーとして、例えば、Song Y, Song J, Wei X, Huang M, Sun M, Zhu L, Lin B, Shen H, Zhu Z, Yang C, Discovery of Aptamers Targeting Receptor-Binding Domain of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein, Preprint from ChemRxiv, 04 Apr 2020で報告されている、CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACA(配列番号6)、ATCCAGAGTGACGCAGCATTTCATCGGGTCCAAAAGGGGCTGCTCGGGATTGCGGATATGGACACGT(配列番号7)等が挙げられる。
[2-3.シグナル物質]
シグナル物質52dは、検出対象と検出対象に特異的な核酸アプタマー55dとの結合情報を読み出すものとして機能する。シグナル物質52dとしては、凹部31への検出対象の結合により検知されるシグナル強度が変化したり、スペクトルが変化(例えばピークがシフト)したりするものであれば特に限定されない。たとえば、蛍光物質、放射性元素含有物質、磁性物質等が挙げられる。検出容易性等の観点から、シグナル物質としては蛍光物質であることが好ましい。蛍光物質としては、フルオレセイン系色素、インドシアニン色素などのシアニン系色素、ローダミン系色素などの蛍光色素;GFPなどの蛍光タンパク質;金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子などが挙げられる。放射性元素含有物質としては、18F等の放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸、19FでラベルしたMRIプローブなどが挙げられる。磁性物質としては、フェリクロームなどの磁性体を有するもの、フェライトナノ粒子、ナノ磁性粒子などにみられるものが挙げられる。
また、シグナル物質52dは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を引き起こす蛍光色素ペアの一方として構成することができる。FRETを引き起こす蛍光色素ペアとしては特に限定されず、シグナル物質52dとしてドナー色素及びアクセプター色素のいずれを選択するかも限定されない。好ましくは、シグナル物質52dとしてドナー色素を選択することができる。FRETを引き起こす蛍光色素のペアを構成するドナー色素/アクセプター色素の具体例としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)/テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、Alexa Fluor647/Cy5.5、HiLyte Fluor647/Cy5.5、R-フィコエリトリン(R-PE)/アロフィコシアニン(APC)等が挙げられる。
[3.検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法]
本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法は、以下の工程を含む。
基材に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と重合開始性基とを表面に有する単分子膜を形成する単分子膜形成工程(1-1);
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に対し、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と相補結合が可能なポリヌクレオチド基を表面に有する鋳型を導入する鋳型導入工程(1-2);
前記鋳型の表面を、可逆的連結基を介して重合性官能基で修飾する表面修飾工程(1-3);
重合性モノマーを加え、前記重合性モノマー及び前記重合性官能基を基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程(1-4);及び
前記相補結合及び前記可逆的連結基を開裂させてそれぞれ核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基及びシグナル物質結合用基へ変換するとともに前記鋳型を除去する除去工程(1-5)。
図3、4、5、6、及び7に、それぞれ、単分子膜形成工程(1-1)、鋳型導入工程(1-2)、表面修飾工程(1-3)、重合工程(1-4)及び除去工程(1-5)を模式的に示す。つまり、図示された態様において、分析用センサ作製用基材10を製造する方法は、以下の工程を含む。
基材20に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bと重合開始性基23aとを表面に有する単分子膜21を形成する単分子膜形成工程(1-1)(図3);
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bに対し、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bと相補結合45が可能なポリヌクレオチド基45bを表面に有する鋳型40を導入する鋳型導入工程(1-2)(図4);
前記鋳型40の表面を、可逆的連結基42を介して重合性官能基32aで修飾する表面修飾工程(1-3)(図5);
重合性モノマー35aを加え、前記重合性モノマー35a及び前記重合性官能基32aを基質とし、前記重合開始性基23aを重合性開始剤として、前記鋳型40の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜30を形成する重合工程(1-4)(図6);及び
前記相補結合45及び前記可逆的連結基42を開裂させてそれぞれ核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25b及びシグナル物質結合用基32cへ変換するとともに前記鋳型40を除去する除去工程(1-5)(図7)。
以下、各工程について図を参照しながら詳述する。
[3-1.単分子膜形成工程]
図3に示すように、単分子膜形成工程では、基材20に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bと重合開始性基23aとを表面に有する単分子膜21を形成する。
図示された例では、具体的にはまず、基材20表面に、重合性開始基23aと結合性官能基25aとを表面に有する単分子膜を形成する。この単分子膜は、重合性開始基23aを末端に有する分子と、重合性開始基23aとは異なる結合性官能基25aを末端に有する分子とを用いた混成自己組織化による混成自己組織化単分子膜(mixed SAMs)として形成することができる。
重合開始性基23aとしては、重合開始剤として機能しうる構造を有していれば特に限定されず、後述の重合工程において用いる重合反応に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、重合開始性基23aとしては、重合反応時にラジカルを発生する構造を有する基、具体的には有機ハロゲンに由来する炭素-ハロゲン結合基(-CX基;Xはハロゲン原子を示す。)が挙げられる。図示された態様では、重合開始性基23aが-CBr基である場合を例示している。
結合性官能基25aとしては、ポリヌクレオチド25を結合可能な基であれば特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。ポリヌクレオチド25は、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bと結合性官能基25cとを有する。図示された態様では、図示された態様では、単分子膜の結合性官能基25aがカルボキシル基であり、ポリヌクレオチド25の結合性官能基25cがアミノ基である場合を例示している。
次に、上記の単分子膜におけるカルボキシル基である結合性官能基25aを、必要に応じて活性エステル化した後、ポリヌクレオチド25の結合性官能基25cを反応させることで、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bを延設する。これによって、単分子膜21を得ることができる。
[3-2.鋳型導入工程]
図4に示すように、鋳型導入工程では、単分子膜21表面の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bに対し、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bと相補結合45が可能なポリヌクレオチド基45bを表面に有する鋳型40を導入する。
鋳型40は、検出対象と同じ物質であってもよいし、検出対象と異なる物質であってもよい。本発明においては、鋳型40として、人工粒子を用いることができる。人工粒子は、工業生産品であり粒径制御されていることから、分析用センサ作製用基材に形成する凹部のサイズの制御及び均質化が容易であり、得られる分析用センサ作製用基材から、より一層分析特性に優れた分析用センサを作製することができる点で好ましい。
鋳型40として用いられる人工粒子としては、分子インプリントにおける鋳型として用いることができる限度において特に限定されず、人工的に製造された無機粒子及び有機粒子が挙げられる。無機粒子としては、金属、金属の酸化物、窒化物、フッ化物、硫化物、ホウ化物、及びそれらの複合化合物、並びに、ハイドロキシアパタイト等が挙げられ、好ましくは、二酸化珪素(シリカ)が挙げられる。また、有機粒子としては、ラテックス硬化物、デキストラン、キトサン、ポリ乳酸、ポリ(メタ)アクリル酸、ポリスチレン、ポリエチレンイミン等が挙げられる。
凹部31(図1等参照)の大きさが鋳型40の大きさに依存するため、鋳型40の大きさは検出対象の大きさに応じて適宜決定することができる。目的の検出対象を受け入れるための凹部31を形成するためには、当該検出対象と同程度か又はそれ以上の大きさを有する鋳型40を用いればよい。例えば、鋳型40粒子の平均粒子径としては、例えば1nm~10μm、好ましくは50~1μm、より好ましくは100~500nm、さらに好ましくは150~200nmが挙げられる。なお、平均粒子径とは、動的光散乱法により測定されるZ平均粒子径を指す。
鋳型40は、表面に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bと相補結合45が可能なポリヌクレオチド基45bを表面に有する。具体的には、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bの配列をAとすると、鋳型40のポリヌクレオチド基45bは、配列Aと相補的な塩基のみからなる完全相補配列であることが最も好ましいが、相補結合45が形成可能である限りにおいて、ミスマッチ塩基を含んでいることも許容する。
図示された態様では、鋳型40は、表面に、可逆的結合性基42cを有する。可逆的結合性基42cは、シグナル物質結合用基32c(前述図1、及び後述図5)と結合することで可逆的連結基42(後述図5)の形成が可能な基である。このような基としては、チオール基(対応する可逆的連結基42はジスルフィド基)、アミノオキシ基又はカルボニル基(対応する可逆的連結基42はオキシム基)、ボロン酸基とジオール基(対応する可逆的連結基42は環状ジエステル基)、アミノ基とカルボニル基(対応する可逆的連結基42はシッフ塩基)、アルデヒド基もしくはケトン基とアルコール(対応する可逆的連結基42はアセタール基)等が挙げられ、好ましくはチオール基が挙げられる。
粒子の表面を特定の基で修飾する方法は広く知られているため、当業者は、導入すべきポリヌクレオチド基45b及び可逆的結合性基42cを、それら基の種類及び人工粒子の構成材料を考慮し、公知の表面修飾法に基づいて適宜導入することができる。
このように、ポリヌクレオチド基45bと可逆的結合性基42cとを表面に有する鋳型40を結合させることによって、基材20上の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bに対し、相補結合45を形成することによって、鋳型40が導入される。
なお、図示された模式図では、便宜上の観点で、基材20と鋳型40との間で形成された相補結合45が1個示されているが、実際には、基材20と鋳型40との間で複数の相補結合45が形成される。
[3-3.表面修飾工程]
図5に示すように、表面修飾工程では、鋳型40の表面を、可逆的連結基42を介して重合性官能基32aで修飾する。
可逆的結合性基42cは、他の可逆的結合性基(具体的には前述のシグナル物質結合用基32cが相当する)と結合することで可逆的連結基42に変換される基であればよく、たとえば、チオール基(対応する可逆的連結基42はジスルフィド基)、アミノオキシ基又はカルボニル基(対応する可逆的連結基42はオキシム基)、ボロン酸基とジオール基(対応する可逆的連結基42は環状ジエステル基)、アミノ基とカルボニル基(対応する可逆的連結基42bはシッフ塩基)、アルデヒド基もしくはケトン基とアルコール(対応する可逆的連結基42はアセタール基)等が挙げられる。
重合性官能基32aは、重合性不飽和結合を有していればよく、代表的なものとして(メタ)アクリル基が挙げられる。
図示された態様では、鋳型40の表面における可逆的結合性基42cの一例であるチオール基に、重合性官能基32aの一例である(メタ)アクリル基とジスルフィド結合とを含む分子32をジスルフィド交換することにより、チオール基を可逆的連結基42であるジスルフィド基に変換することで鋳型40の表面を重合性官能基32aで修飾する態様を例示している。
このように、予め、表面に可逆的結合性基42cを有している鋳型40を用いることで、可逆的連結基42を鋳型40の表面のみにデリバリすることができる。
[3-4.重合工程]
図6に示すように、重合工程では、重合性モノマー35aを加え、重合性官能基32a及び重合性モノマー35aを基質とし、重合開始性基23aを重合性開始剤として、鋳型40の表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成する。これによって、基材20表面に、凹部31を有するポリマー膜30を形成する。なお、本明細書においては、鋳型を用いたインプリンティング重合によって合成されるポリマーを、便宜上、分子インプリントポリマーと記載するものとし、本発明では、鋳型として分子でないもの(たとえば膜構造を有する微小粒体)も許容するため、鋳型として分子ではないものを用いたインプリンティング重合によって合成されるポリマーも含まれるものとする。
重合性モノマー35は、上述のポリマー膜30について述べたように、生体適合性モノマーであり、好ましくは親水性モノマーであり、より好ましくは双性イオンモノマーである。
双性イオンモノマーは、酸性官能基(たとえば、リン酸基、硫酸基、およびカルボキシル基など)に由来するアニオン基と、塩基性官能基(たとえば、1級アミノ基、2級アミノ基、3級アミノ基および4級アンモニウム基など)に由来するカチオン基との両方を1分子中に含む。たとえば、ホスホベタイン、スルホベタイン、およびカルボキシベタインなどが挙げられる。
より具体的には、ホスホベタインとしては、ホスホリルコリン基を側鎖に有する分子が挙げられ、好ましくは、2-メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン(MPC)などが挙げられる。
スルホベタインとしては、N,N-ジメチル-N-(3-スルホプロピル)-3’-メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト(SPB)、N,N-ジメチル-N-(4-スルホブチル)-3’-メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト(SBB)などが挙げられる。
カルボキシベタインとしては、N,N-ジメチル-N-(1-カルボキシメチル)-2’-メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト(CMB)、N,N-ジメチル-N-(2-カルボキシエチル)-2’-メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト(CEB)などが挙げられる。
基材20表面上で、重合性官能基32a、重合性モノマー35a、重合開始性基23aおよび鋳型40が共存する重合反応系が構築されることにより、表面開始原子移動ラジカル重合(SI-ATRP)が進行する。当該重合反応系には、さらに、重合触媒として、遷移金属または遷移金属化合物と配位子とから形成される遷移金属錯体を含むことが好ましく、さらに還元剤を用いることがより好ましい。
遷移金属または遷移金属化合物としては、金属銅又は銅化合物が挙げられ、銅化合物としては塩化物、臭素化物、ヨウ素化物、シアン化物、酸化物、水酸化物、酢酸化物、硫酸化物、硝酸化物、好ましくは臭素化物が挙げられる。配位子としては、多座アミンが好ましく、具体的には二座~六座配位子が挙げられる。これらの中でも、好ましくは二座配位子が挙げられ、より好ましくは2,2-ビピリジル、4,4’-ジ-(5-ノニル)-2,2’-ビピリジル、N-(n-プロピル)ピリジルメタンイミン、N-(n-オクチル)ピリジルメタンイミン等が挙げられ、より好ましくは2,2-ビピリジルが挙げられる。
還元剤としては、アルコール、アルデヒド、フェノール類及び有機酸化合物等が挙げられ、好ましくは有機酸化合物が挙げられる。有機化合物としては、クエン酸、シュウ酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル等が挙げられ、好ましくはアスコルビン酸、アスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル等が挙げられ、より好ましくはアスコルビン酸が挙げられる。
ラジカル発生源である重合開始性基23aから重合性モノマー35aを基質としてポリマー鎖が伸長し、ポリマー膜の厚みを増すと共に、伸長ポリマー鎖が鋳型40表面に達すると、当該表面に修飾された重合性官能基32aも基質として取り込むことで、鋳型40の表面形状に沿った形状の凹部31が形成されるようにポリマーが合成される。ポリマー膜は、基材20に導入された鋳型40の上下径(図面の上方を上とした場合)の1/3~1/2程度に相当する厚みまで成長させることができる。これによって、ポリマー膜30が得られる。なお、重合反応系における反応溶媒としては、緩衝液等の水系の溶媒が好ましく用いられる。
[3-5.除去工程]
図7に示すように、除去工程では、相補結合45を開裂させて核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25b変換し、可逆的連結基42を開裂させたシグナル物質結合用基32cへ変換することで、鋳型40を除去する。上述の表面修飾工程で可逆的連結基42が鋳型40の表面のみにデリバリされているため、鋳型40が除去された跡であるポリマー膜30の凹部31には、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bが残るとともに、凹部31内にのみ、可逆的連結基42から生じたシグナル物質結合用基32cが配置される。これによって、分析用センサ作製用基材10が得られる。
なお、図示された模式図では、便宜上の観点で、1個の凹部31に1個の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bが生じることが示されているが、上述のとおり、基材20と鋳型40との間で複数の相補結合45が形成されるため、実際には、1個の凹部31に複数の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bが生じる。
[4.検出対象の分析用センサの製造]
本発明の検出対象の分析用センサの製造方法は以下の工程を含む。
検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法を行う工程(1);
前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に、検出対象に特異的な核酸アプタマーを相補結合によって結合する工程(2);及び
前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を結合する工程(3)。
工程(2)及び工程(3)の順番としては、いずれを先に行ってもよいし、同時に行ってもよい。
図8に、本発明の検出対象の分析用センサの製造方法を模式的に示す。つまり、図示された態様において、検出対象の分析用センサ50の製造方法は以下の工程を含む。
検出対象の分析用センサ作製用基材10の製造方法を行う工程(1);
核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bに、検出対象に特異的な核酸アプタマー55dを相補結合55によって結合する工程(2);及び
シグナル物質結合用基32cにシグナル物質52dを結合する工程(3)。
検出対象の分析用センサ作製用基材10を製造する工程(1)については、上記「3.検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法」で詳述した通りであり、この工程(1)では、上述の単分子膜形成工程(1-1)、鋳型導入工程(1-2)、表面修飾工程(1-3)、重合工程(1-4)及び除去工程(1-5)を行う。
工程(2)では、図8に示すように、検出対象の分析用センサ作製用基材10に核酸アプタマー55dを与える成分55APをハイブリダイズさせる。核酸アプタマー55dを与える成分55APは、核酸アプタマー55dと、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bと相補結合55を形成可能なポリヌクレオチド基55bとを含む。核酸アプタマー55dとしては、上記「2-2.核酸アプタマー(検出対象に特異的な核酸アプタマー)」において述べた通りである。また、ポリヌクレオチド基55bは、核酸アプタマー55dに延設されたポリヌクレオチドであり、核酸アプタマー55dとポリヌクレオチド基55bとは、直接的に結合していてもよいし、他の連結基(例えば塩基又はポリヌクレオチド)が介在していることも許容する。ポリヌクレオチド基55bとしては、上記「3-2.鋳型導入工程」において鋳型40のポリヌクレオチド基45bとして述べた基と同様であり、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bの配列をAとすると、配列Aと相補的な塩基のみからなる完全相補配列であることが最も好ましいが、相補結合55が形成可能である限りにおいて、ミスマッチ塩基を含んでいることも許容する。
なお、図示された模式図では、便宜上の観点で、1個の凹部31に1個の核酸アプタマー55dが導入されることが示されているが、上述のとおり、1個の凹部31に複数の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25bが存在するため、実際には、1個の凹部31に複数の核酸アプタマー55dが導入される。
工程(3)では、図8に示すように、検出対象の分析用センサ作製用基材10にシグナル物質52dを与える成分52SGを反応させる。シグナル物質52dを与える成分52SGは、シグナル物質52dと結合性基52cとを含む。シグナル物質52dとしては、上記「2-3.シグナル物質」において述べた通りである。結合性基52cは、シグナル物質結合用基32cと反応及び結合可能な基が選択される。
分析用センサ作製用基材10は、基板20表面においてセンサ場となる凹部31のみにシグナル物質結合用基32cを有するため、シグナル物質52dは結合性基52cの反応性によって凹部31のみに配置されることができる。
1個の分析用センサ作製用基材10に対しては、全ての凹部31に1種類の核酸アプタマー55dと1種類のシグナル物質52dとを導入してもよいし、一の凹部31に対し一の種類の核酸アプタマーを導入し、他の凹部31に対し他の種類の核酸アプタマーを導入するとともに、それぞれ核酸アプタマーの種類に対応して異なる種類のシグナル物質を導入してもよい。
[5.対象物質の分析法]
図9に、本発明の検出対象の分析法の一例を説明する模式図を示す。図9に示すように、本発明の検出対象の分析法では、分析用センサ50の基材20表面上に、検出対象60を含む分析試料液を接触させる。
検出対象60としては、核酸アプタマー55dと特異的に結合する物質であれば原理上特に限定させるものではなく、上記「2-1.検出対象」で述べたとおりの物質が挙げられる。
検出対象60を含む分析試料液の態様としては特に限定されないが、分析の迅速性の観点から、検出対象60を分離する処理を経ていないものであることが好ましい。検出対象60を分離する処理としては、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、サイズフィルターを用いたろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。
検出対象60を含む分析試料液としては、(検出対象60が細胞または細胞外小胞である場合は)検出対象60が存在している環境から得られる試料、又は、(検出対象60が細胞外小胞であって、細胞からの産生物である場合は)検出対象60が生じうる環境から得られる試料であってよい。具体的には、細胞を含む生体試料であってよい。検出対象60が小型細胞外小胞などの細胞外小胞である場合、検出対象60を産生する細胞としては、がん細胞、肥満細胞、樹状細胞、網赤血球、上皮細胞、B細胞、神経細胞等が挙げられる。より具体的には、検出対象60を含む分析試料液としては、血液、乳汁、尿、唾液、リンパ液、髄液、羊水、涙液、汗、鼻漏等の体液が挙げられ、さらに、これらの体液を、不要成分を除去する等の前処理を行った処理液、及びこれらの体液に含まれる細胞を培養して得られた培養液も挙げられる。これらの分析試料液のうち、尿、唾液、涙液、汗、鼻漏等の体液は、非侵襲性及び採取容易性の点で特に好ましい。
分析用センサ50の基材20表面上に検出対象60を含む分析試料液を接触させると、検出対象60が凹部31内の核酸アプタマー55dに特異的に捕捉される。例えば検出対象60が小型細胞外小胞である場合、小型細胞外小胞は膜タンパク質(小型細胞外小胞特異的抗原)としての、例えば、CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1、Rab5、Annexin V、LAMP1等を介して核酸アプタマー55dに特異的に結合することによって捕捉される。検出対象60が癌細胞である場合、癌細胞は癌細胞特異的抗原としての、例えば、Caveolin-1、EpCAM、FasL、TRAIL、Galectine3、CD151、Tetraspanin 8、EGFR、HER2、RPN2、CD44、TGF-β等を介して核酸アプタマー55dに特異的に結合することによって捕捉される。
検出対象60が凹部31内の核酸アプタマー55dに特異的に捕捉されると、その瞬間、シグナル物質52dが検出対象60によって環境変化を受けるため、検出対象60の補足前後でシグナル変化をもたらす。つまり、分析用センサ50は、センシング対象となる検出対象60の結合情報をシグナル変化で読み出すことができ、このシグナル変化によって検出対象60が検出される。検出対象60の捕捉とシグナル変化とがほぼ同時に起こるため、検出対象60の検出のために試薬を加える必要もなく、検出を迅速に行うことができる。
また、分析用センサ50を、シグナル物質52dが蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を引き起こす蛍光色素ペアの一方となるように構成し、且つ、検出対象60に予め当該蛍光色素ペアの一方を結合させておく場合、検出対象60が凹部31内の核酸アプタマー55dに特異的に捕捉されると、その瞬間、シグナル物質52dにおける蛍光色素と検出対象60における蛍光色素とが近接するため、FRETにより蛍光が放射される。このFRETによる蛍光放射によって検出対象60が検出される。検出対象60の捕捉とFRETによる蛍光放射とがほぼ同時に起こるため、検出対象60の検出のために試薬を加える必要もなく、検出を迅速に行うことができる。FRETを引き起こす蛍光色素ペアとしては特に限定されず、シグナル物質52dとしてドナー色素及びアクセプター色素のいずれを選択するかも限定されない。好ましくは、シグナル物質52dとしてドナー色素を選択することができる。FRETを引き起こす蛍光色素のペアを構成するドナー色素/アクセプター色素の具体例としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)/テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、Alexa Fluor647/Cy5.5、HiLyte Fluor647/Cy5.5、R-フィコエリトリン(R-PE)/アロフィコシアニン(APC)等が挙げられる。
さらに、本発明の分析用センサ50は、基材20表面において、凹部31以外にシグナル物質52dが実質的に設けられていないため、凹部31外の基材20表面に非特異吸着があったとしても不所望のバックグラウンドに影響されることがない。したがって、検出対象60を感度良く検出することができる。
なお、図示された模式図では、便宜上の観点で、1個の凹部31において検出対象60表面に発現している分子の1個が核酸アプタマー55dに特異的に捕捉されることが示されているにすぎないが、検出対象60表面には当該分子が複数発現しており、また、上述のとおり、1個の凹部31に複数の核酸アプタマー55dが導入されているため、1個の凹部31において検出対象60表面に発現している複数の分子がそれぞれ複数の核酸アプタマー55dに特異的に捕捉される。このため、検出対象60当たりの核酸アプタマー55dの結合能が驚異的なレベルに引き上げられる。
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
[実施例1:検出対象の分析用センサ作製用基材の製造]
本実施例では、図3~図7に示す検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法の具体例に基づいて、図1に示す検出対象の分析用センサ作製用基材の具体例を製造した。
(試薬等)
・鋳型40の材料となる人工粒子:シリカ粒子;sicastar(R)-redF;表面にカルボキシル基を有するシリカ粒子であり、Malvern製ゼータサイザーナノZS MAL500735で動的光散乱法により測定されるZ平均粒子径が205nm(pdi:0.017)
・ポリヌクレオチド基45b:ODN2;CACAAATCTGTCGCTGAGTA(配列番号8)
・ポリヌクレオチド基45bを与える試薬:ODN2-NH2;ODN2の3’末端にアミノ基が付加した分子
・可逆的結合性基42c:チオール基
・可逆的結合性基42cを与える試薬:2-アミノエタンチオール塩酸塩
・基板20:金スパッタ基板
・結合性官能基25a:カルボキシル基
・結合性官能基25aを末端に有する分子:11-Mercapto-undecanoic acid
・重合性官能基23a:有機ブロモ基
・重合性開始基23aを末端に有する分子:2-(2-bromoisobutyryloxy)-undecyl thiol
・核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25b:ODN1;TACTCAGCGACAGATTTGTG(配列番号9)
・結合性官能基25c:アミノ基
・ポリヌクレオチド25:ODN1-NH2;ODN1の3’末端にアミノ基が付加した分子
・重合性官能基32a:アクリロイル基
・重合性官能基32aとジスルフィド結合とを含む分子32:2-(2-Pyridyl) dithioethyl acryloylamide
・重合性モノマー35a:2-メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン(MPC)
(1)鋳型40の作製
シリカ粒子(COOH:25nmol)を水中に含む懸濁液1mLに、100μMのODN2-NH2水溶液と、0.10mMの2-アミノエタンチオール塩酸塩水溶液(2.5nmol)とを混合した後、0.10mMのDMT-MM水溶液(25nmol)を加え、25℃で一晩攪拌して反応させた。その後、遠心分離(10000G、10分)及び上清の純水への置換の一連の操作を3回行うことにより、粒子の精製を行った。これによって、シリカ粒子表面に、チオール基と、ODN2とを導入した鋳型を得た。
(2)単分子膜21の作製(工程1-1)
エタノール洗浄及び窒素噴霧を行った後、20分UVオゾン処理を行った金スパッタガラス基板を、0.30mMの11-Mercapto-undecanoic acid及び0.60mMの2-(2-bromoisobutyryloxy)-undecyl thiolを含むエタノール溶液1mLに、25℃で一晩浸漬させた。反応後の基板を、エタノール洗浄し、窒素噴霧により乾燥させた。これによって、基板表面に、カルボキシル基及び重合性官能基を有する単分子膜を得た。
5.0×10-2μmolのエチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、5.0×10-2μmolのN-ヒドロキシスクシンイミド、5.0×10-2μmolのジイソプロピルエチルアミンを3mLのdryジクロロメタンに溶解させ、これに、得られた単分子膜を形成した基板を25℃で一晩浸漬させ、単分子膜表面の結合性官能基25a(カルボキシル基)の活性エステル化を行い、dryジクロロメタンで洗浄後、10μMのODN1-NH2溶液(10mM PBS(pH7.4)、100mM NaCl)を40μl滴下し、25℃で3時間反応させることで、ODN1を導入した。これによって、これによって、基板表面に、ODN1及び重合性官能基を有する単分子膜(単分子膜21)を形成した。
(3)鋳型40の導入(工程1-2)
上記(2)で作製した単分子膜21を形成した基板をディップコーターにセットし、上記(1)で作製した鋳型40の1mg/mL水溶液3.5mLに30分浸漬した。基板を1mm/分で引き上げた後、250μlのPBSで満たしたPCRチューブに入れ、サーマルサイクラー(タカラバイオ製、TaKaRa Thermal Cycler Dice Touch、以下において同様)を用いて、60℃で10分加熱し、30分かけて25℃まで冷却する処理を行なうことで、鋳型40のポリヌクレオチド基45b(ODN2)と基板上の核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基25b(ODN1)とをハイブリダイズさせた。これによって、基板上に鋳型を導入した。
(4)鋳型40表面の修飾(工程1-3)
鋳型40を導入した基板を、100μMの2-(2-Pyridyl) dithioethyl acryloylamideのPBS(pH.7.4)溶液1mLに浸漬して25℃で一晩反応させ、ジスルフィド交換反応を行った。これによって、鋳型表面をアクリロイル基で修飾した。
(5)ポリマー膜の合成(工程1-4)
50mMのMPC、1mMのCuBr2、及び2mMの2,2’-ビピリジルを10mMを10mM PBS(pH7.4、100mM NaCl)9mLに溶解させたプレポリマー溶液と、上記(4)で得られた基板をシュレンクフラスコ内に入れ、シリコン栓で密封し、脱気窒素置換を行った。ディスポーサブルシリンジを用いて、0.5mMのL-アスコルビン酸溶液(10mM PBS(pH7.4))1mLを、シュレンクフラスコ内のプレポリマー溶液に添加した。さらに脱気窒素置換を行い、40℃の恒温槽で3時間振とうすることで、表面開始原子移動ラジカル重合(SI-ATRP)を行った。重合後の基板を、純水で洗浄し、窒素噴霧により乾燥させた後、100mMのEDTA-4Na水溶液1mLに25℃で15分浸漬させ、ポリマー膜内部に残存する銅イオンの除去を行った。これによって、基板表面にポリマー膜を合成した。
(6)鋳型の除去(工程1-5)
上記(5)で得られたポリマー膜基板をPCRチューブに入れ、50mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン水溶液250μlに浸漬させ、サーマルサイクラーにて、60℃で3時間加熱し、ジスルフィド結合を還元してチオール基へ変換し、基板を純水で洗浄後、2Mの尿素水溶液250μlに浸漬させ、サーマルサイクラーにて99℃で30分加熱することで、相補結合を開裂してODN1へ変換し、基板を純水で洗浄した。これによって、鋳型の除去を行った。以上の操作によって、基板上のポリマー膜に設けられた鋳型の分子インプリントによる凹部内にチオール基とODN1とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材を得た。
[実施例2:小型細胞外小胞CD63の分析用センサの製造]
本実施例では、図8に示す検出対象の分析用センサの製造方法の具体例に基づいて、図2に示す検出対象の分析用センサの具体例として、小型細胞外小胞CD63の分析用センサを製造した。
(試薬等)
・核酸アプタマー55dを与える成分55AP:DNAアプタマー含有ポリヌクレオチド;CD63特異的DNAアプタマーの5’末端にODNが延設されている;CACAAATCTGTCGCTGAGTACACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA(配列番号10)
・核酸アプタマー55d:CD63特異的DNAアプタマー;CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA(配列番号1)
・ポリヌクレオチド基55b:ODN2;CACAAATCTGTCGCTGAGTA(配列番号6)
・シグナル物質52dを与える成分52SG:Alexa Fluor(R)647 C 2 Maleimide
・シグナル物質52d:蛍光物質;Alexa Fluor(R)647
・結合性基52c:マレイミド基
(1)CD63特異的DNAアプタマーの導入(工程2)
DNAアプタマー含有ポリヌクレオチドを1μM(10mM PBS、pH7.4、100mM NaCl)に調製した溶液250μlを、アニーリング処理(95℃、10分、その後30分かけて25℃まで冷却)した。実施例1で得られた検出対象の分析用センサ作製用基材をPCRチューブに入れ、アニーリング処理したDNAアプタマー含有ポリヌクレオチド溶液で満たした。サーマルサイクラーにて、60℃で10分加熱し、30分かけて25℃まで冷却する処理を行い、基板上のODN1と、DNAアプタマー含有ポリヌクレオチドのODN2とをハイブリダイズさせた。これによって、分析用センサ作製用基材にCD63特異的DNAアプタマーを導入した。
(2)蛍光物質の導入
上記(1)でCD63特異的DNAアプタマー導入基板に、100μMのAlexa Fluor(R) 647 C2 Maleimide溶液(10mM PBS pH7.4、100mM NaCl)を40μl滴下し、室温で1時間、マイケル付加反応させた。これによって、分析用センサ作製用基材に蛍光物質を導入した。以上の操作によって、基板上のポリマー膜に設けられた鋳型の分子インプリントによる凹部内に蛍光物質とCD63特異的DNAアプタマーとを有する、小型細胞外小胞CD63の分析用センサを得た。
[実施例3:小型細胞外小胞CD63の分析用センサを用いた小型細胞外小胞CD63の分析方法]
本実験例では、実施例2で得られた小型細胞外小胞CD63の分析用センサを用いて、分析対象として、ヒト前立腺癌PC3細胞株の培養上清から取得された小型細胞外小胞(HNB製、HBM PC3 100、PC3由来小型細胞外小胞)を用いた分析を行った。
分析対象溶液として、PC3由来小型細胞外小胞を、PBS中、0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10ng/mLとなるように調製した。小型細胞外小胞CD63の分析用センサ基板に、分析対象溶液40μlを滴下し、25℃で1分の反応、1mLのPBSでの洗浄、及び以下の条件による蛍光測定を行った。なお、蛍光測定のROIは輝点ごとに取り、各分析対象溶液ごとに30のROIを取得した。測定値は、蛍光強度の平均値とした。
(蛍光測定条件)
・蛍光顕微鏡:オリンパス製IX73倒立顕微鏡
・フィルタ:オリンパス製CY5-4040C(604-644 nm for excitation and 672-712 nm for emission)
・対物レンズ:×100;オリンパス製UPLSAPO100XO
・光量:100%
・露光時間:0.1秒
・光源:水源ランプ;オリンパス製HGLGPS-SET
小型細胞外小胞濃度に対する蛍光強度変化((Io-I)/Io)を測定して吸着等温線を作成したところ、PC3由来小型細胞外小胞の特異的吸着による有意な蛍光消光が確認され、特異的なレスポンスが認められた。
また、得られた吸着等温線をカーブフィッティング(回帰分析)して解離定数を算出した結果を図10に示す。なお、ソフトとしては日本ポラデジタル株式会社製の解析ソフトDeltaGraph 5.4.5vを用い、以下の式によってフィッティングした。式中、Kaは結合定数を表し、Kdは解離定数を表し、Gは小型細胞外小胞濃度を表し、Hはフィッティングカーブから算出し、Dは蛍光変化率の最大変化量を表す。
Figure 0007454225000001
さらに、以下の式に基づいて検出限界(LOD)を得た。式中、mは、吸着等温線の直線領域の傾き(濃度範囲:0、0.01、0.05、0.1ng/mL)を表し、SDは、濃度0ng/mLにおける標準偏差を表す。
Figure 0007454225000002
結果として、解離定数Kdは6.9×10-18[M]と算出され、高い結合能力が示された。また、LODは0.16ng/mLと算出された。今回用いた小型細胞外小胞は、1.90×1011粒子/mgであったため、LODを小型細胞外小胞数に換算すると2.95×105粒子/mLとなった。この値は、血中小型細胞外小胞数1011粒子/mL、体液中小型細胞外小胞数108~1011粒子/mLを大きく下回っていた。また、非特許文献2に示されているように、CD63アプタマーのCD63断片への解離定数Kdは17.1n[M]、つまり10-8[M]オーダーである。さらに、後述比較例2に示すように、核酸アプタマーの代わりに抗体を用いた小型細胞外小胞分析用センサでは解離定数Kdが3.8x10-15[M]である。つまり、分子インプリントで形成した微小な凹部内のセンシング環境は、検出対象に特異的な分子として抗体を用いる場合に比べて核酸アプタマーを用いた場合に、極めて高い結合能を奏させることが分かった。
[比較例1:CD63特異的DNAアプタマーを有しない小型細胞外小胞CD63の分析用センサを用いた小型細胞外小胞CD63の分析方法]
検出対象の分析用センサ作製用基材上の凹部内のODN1に対して導入する核酸として、CD63特異的DNAアプタマー(配列番号1)の代わりに、CD63に対する特異性を有さないランダムポリヌクレオチド(TGTGCGGCGAAATATTATAGCTACCGCAATTA(配列番号11))としたことを除いて、実施例3と同様にしてCD63の分析用センサ(比較例1-1)を作製した。また、検出対象の分析用センサ作製用基材上の凹部内のODN1に対して、何も導入しなかったことを除いて、実施例3と同様にしてCD63の分析用センサ(比較例1-2)を作製した。
比較例1-1及び比較例1-2のCD63特異的DNAアプタマーを有しない小型細胞外小胞CD63の分析用センサについて、実施例3と同様にしてPC3由来小型細胞外小胞の分析を行い、吸着等温線を作成した。その結果、PC由来小型細胞外小胞の非特異吸着による僅かな蛍光消光が確認されたのみで、特異的なレスポンスは認められなかった。
[実施例4:小型細胞外小胞MUC-1の分析用センサの製造]
検出対象の分析用センサ作製用基材上の凹部内のODN1に対して導入する核酸として、CD63特異的DNAアプタマー(配列番号1)の代わりに、MUC-1特異的DNAアプタマー(配列番号2)としたことを除いて、実施例3と同様にしてMUC-1の分析用センサを作製した。
得られたMUC-1の分析用センサについて、分析対象として、ヒト癌細胞株MCF-7由来小型細胞外小胞(SB1製、EXOP-100A-1、表面にMUC-1を発現している)及びヒト健常血清由来小型細胞外小胞(SB1製、EXOP-500A-1、表面にMUC-1を発現していない)をそれぞれ用いて、実施例3と同様にして小型細胞外小胞の分析を行い、吸着等温線を作成した。その結果、分析対象としてMCF-7由来小型細胞外小胞を用いた場合に、MCF-7由来小型細胞外小胞の特異的な吸着による有意な蛍光消光が確認され、特異的なレスポンスが認められた。一方で、健常ヒト由来小型細胞外小胞についてはレスポンスは認められなかった。
[比較例2:抗体導入型小型細胞外小胞の分析用センサを用いた分析方法]
核酸アプタマーの代わりに抗体を導入した小型細胞外小胞の分析用センサを作製した。具体的には、(i)基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み;前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し、前記凹部内に、抗体物質結合用基とシグナル物質結合用基とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材を作製し、(ii)前記抗体物質結合用基に前記検出対象に特異的な抗体物質を導入し;前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を導入することによって、検出対象の分析用センサを作製した。
(1)鋳型の合成-チオール基およびヒスチジンタグ(His-tag)を導入したシリカナノ粒子の合成
FITC標識シリカナノ粒子200μl(200μlあたり表面に-COOH 5 nmolを有するもの、粒子径200nm)をジクロロメタン(DCM)に分散させた(シリカナノ粒子分散液)。エチル(ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド(EDC: 50 nmol, 10 eq)、N-ヒドロキシコハク酸イミド(NHS: 50 nmol, 10 eq)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA: 50 nmol, 10 eq) をdry DCMに溶解させ、シリカナノ粒子分散液と混合した。一晩反応させることでシリカナノ粒子表面をNHSで修飾した。表面修飾したシリカナノ粒子に対して、ヒスチジンが6個ペプチド結合で連結されたHis-tag (末端はリジン残基でありフリーのεアミノ基を有する:0.10μmol, 40eq)及び2-アミノエタンチオール塩酸塩(0.1μmol, 40eq)を加えて、室温で反応させた。反応終了後、遠心分離およびろ過によりチオール基およびHis-tagを導入したシリカナノ粒子(SH・His-tag化シリカナノ粒子)を精製した。
(2)シリカナノ粒子を鋳型に用いた検出対象の分析用センサ作製用基材の作製
以下のようにして、金薄膜蒸着ガラス基板上にアミノ基及びブロモ基が末端となる混成自己組織化単分子膜(mixed SAMs)を作製し(分子膜形成工程)、アミノ基末端へNTA基を導入し、NTA-Ni錯体を形成した後、キレート結合によりシリカナノ粒子を固定化した(鋳型導入工程)。その後、シリカナノ粒子にメタクリル基修飾を施し(表面修飾工程)、表面開始制御/リビングラジカル重合によりポリマー薄膜を合成した(重合工程)。最後にシリカナノ粒子を除去し(除去工程)、検出対象の分析用センサ作製用基材を得た。
(2-1)ブロモ基およびアミノ基をもつ混合自己組織化単分子膜形成(分子膜形成工程)
実施例1の項目1と同様に金薄膜蒸着ガラス基板の有機残滓の除去及び洗浄を行い、0.5 mM amino-EG6-undecanthiol hydrochloride及び0.5mM 2-(2-bromoisobutyryloxy) undecyl thiolのエタノール溶液に基板を浸漬させ、25℃で24時間静置することにより、ブロモ基およびアミノ基をもつ混合自己組織化単分子膜を形成させた。
(2-2)SH・His-tag化シリカナノ粒子のNi-NTAを介した固定化(鋳型導入工程)
5 mM isothiocyanobenzyl-nitrilotriacetic acid (ITC-NTA)のDMSO溶液80 μLを基板に滴下し、25℃で2時間静置してアミノ基をNTAで修飾した。基板をDMSO及び純水で洗浄後、4 mM NiCl2水溶液100 μLを基板に滴下し、室温で15分間静置することで、Ni-NTA錯体を形成した。その後、SH・His-tag化シリカナノ粒子(固形分濃度5.1 mg/ml)含有水溶液100 μlを基板に滴下し、25°Cで1時間静置した。
(2-3)固定されたSH・His-tag化シリカナノ粒子のメタクリロイル化(表面修飾工程)
100 μM 2-(2-Pyridyl)dithioethyl methacrylateの PBS (pH 7.4)溶液に基板を浸して一晩静置させることで、ジスルフィド交換反応によってシリカナノ粒子表面のSH基にジスルフィドを介してメタクリロイル基の導入を行った。
(2-4)MIP薄膜の作製(重合工程)
重合時間を3時間としたことを除いて、実施例1の項目4と同様にして、基板上にポリマー薄膜を合成した。これによって、基板上に、表1のモノマーと共にシリカナノ粒子のメタクリロイル基も共重合されたポリマー薄膜を得た。重合終了後、1 M エチレンジアミン四酢酸-4Na 水溶液に基板を15分間浸し、ATRPに用いたCu2+を取り除いた。
(2-5)シリカナノ粒子の除去(除去工程)
50 mM トリス(2-カルボキシエチル)フォスフィン・HCl(TCEP)水溶液に25℃で3時間浸漬させ、ポリマーとシリカナノ粒子とを結合させているジスルフィド結合を還元・切断した。ポリマー側にはフリーのSH基が残るが、このSH基は、SH・His-tag化シリカナノ粒子由来であることから、ポリマー薄膜のうち鋳型に対応した凹部以外の部分には存在せず、鋳型に対応した凹部内のみに存在する。前述のEDTA-4Na処理で、NI-NTAのニッケルも除去されてHis-tagがこの時点でフリーとなる可能性が高いが、念のため以下の操作も行った。純水で洗浄後、0.5 wt% SDSを含む50 mM酢酸バッファー (pH 4.0)に基板を浸して、Ni-NTA及びHis-tagを介して結合していたシリカナノ粒子をポリマー薄膜から洗い出した。
(3)得られた分析用センサ作製用基材(MIP基板)に再度Ni-NTAを形成させるため、4 mM NiCl2水溶液でMIP基板を処理した。その後、PBSに溶解した100 μM His-tag Protein Gを基板に添加することで、His-tagを介して抗体を結合可能なProtein Gを固定化した。最後に、PBSに溶解した0.3 μM 抗CD9抗体を基板に添加し、抗CD9抗体をProtein Gを介して固定化した。Protein Gは、抗体のFc領域に結合することから、固定化された抗体の配向は一様となる。
さらに、蛍光分子としてチオール反応性のAlexa Fluor(R) 647 C2 Maleimide を用いて分析用センサの凹部への蛍光分子の選択的導入を行った。導入前の蛍光強度は113±0.6 (n-3)であったのに対し、導入後は151±2.1 (n-3)であったことから、蛍光の導入が確認された。これによって、抗体導入型検出対象の分析用センサが得られた。
(4)得られた抗体導入型分析用センサを用い、小型細胞外小胞の結合挙動を観察した。分析対象としては、小型細胞外小胞のPBS (10 mM posphate,140 mM NaCl, pH7.4)溶液(濃度はそれぞれ、0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ng/mL)を用い、小型細胞外小胞の蛍光検出は顕微鏡下で行った。蛍光顕微鏡測定条件は以下の通りである。
フィルタ:Cy5
対物レンズ:×5
露光時間:0.1秒
光源:水銀ランプ
実施例3に記載される方法で吸着等温線から解離定数を算出した。結果として、解離定数は、Kd=3.8x10-15[M]であった。
本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明はそれらのみに限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な実施形態が他になされる。
10…分析用センサ作製用基材
20…基材
21…単分子膜
25b…核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基(可逆的結合性基)
25a…結合性官能基
23a…重合開始性基
30…ポリマー膜
31…凹部
32c…シグナル物質結合用基(可逆的結合性基)
32a…重合性官能基
35a…重合性モノマー
40…鋳型
42…可逆的結合性基(シグナル物質結合用基と結合することで第2の可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基)
45…相補結合
50…分析用センサ
55d…検出対象に特異的な核酸アプタマー
55…相補結合
52d…シグナル物質
60…検出対象
配列番号1は、CD63に特異的なDNAアプタマーである。
配列番号2は、MUC-1に特異的なDNAアプタマーである。
配列番号3は、EpCAMに特異的なDNAアプタマーである。
配列番号4は、HER2に特異的なDNAアプタマーである。
配列番号5は、ERαに特異的なDNAアプタマーである。
配列番号6は、SARSコロナウイルス-2(SARS-CoV-2)に特異的なDNAアプタマーである。
配列番号7は、SARSコロナウイルス-2(SARS-CoV-2)に特異的なDNAアプタマーである。
配列番号8は、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基にハイブリダイズできるポリヌクレオチドである。
配列番号9は、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の配列である。
配列番号10は、核酸アプタマーを与えるポリヌクレオチドである。
配列番号11は、CD63に対する特異性を有さないランダムポリヌクレオチドである。

Claims (17)

  1. 基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み、
    前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し、
    前記凹部内に、シグナル物質結合用基と、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材。
  2. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の長さが8塩基長以上である、請求項1に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
  3. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基が単鎖である、請求項1又は2に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
  4. 前記ポリマー膜が、前記検出対象又は前記検出対象よりサイズが大きい対象を鋳型とする分子インプリントポリマーで構成され、前記凹部が前記鋳型の表面形状の一部に対応する、請求項1~3のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
  5. 前記シグナル物質結合用基がチオール基である、請求項1~4のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
  6. 請求項1~5のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材と、
    前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に結合した、前記検出対象に特異的な核酸アプタマーと、
    前記シグナル物質結合用基に結合したシグナル物質と、
    を含む、検出対象の分析用センサ。
  7. 前記検出対象が膜構造を有する微小粒体である、請求項6に記載の検出対象の分析用センサ。
  8. 前記膜構造を有する微小粒体が細胞外小胞である、請求項7に記載の検出対象の分析用センサ。
  9. 前記検出対象に特異的な核酸アプタマーが、前記膜構造を有する微小粒体の表面に発現している特異的分子に対する特異的結合能を有する、請求項6~8のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ。
  10. 請求項6~9のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサに、検出対象を含む試料を接触させ、前記核酸アプタマーに前記検出対象を結合する工程と、
    前記シグナル物質に由来するシグナルの変化を検出する工程と、
    を含む、検出対象の分析法。
  11. 基材に、核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と重合開始性基とを表面に有する単分子膜を形成する単分子膜形成工程(1-1)と、
    前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に対し、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基と相補結合が可能なポリヌクレオチド基を表面に有する鋳型を導入する鋳型導入工程(1-2)と、
    前記鋳型の表面を、可逆的連結基を介して重合性官能基で修飾する表面修飾工程(1-3)と、
    重合性モノマーを加え、前記重合性モノマー及び前記重合性官能基を基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程(1-4)と、
    前記相補結合及び前記可逆的連結基を開裂させてそれぞれ核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基及びシグナル物質結合用基へ変換するとともに前記鋳型を除去する除去工程(1-5)と、
    を含む、検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
  12. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基の長さが8塩基長以上である、請求項11に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
  13. 核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基が単鎖である、請求項11又は12に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
  14. 前記鋳型が、表面に、前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基とともに、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合性基を有する、請求項11~13のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
  15. 前記鋳型がシリカ粒子である、請求項11~14のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
  16. 前記シグナル物質結合用基がチオール基であり、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基がチオール基である、請求項11~15のいずれか1項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
  17. 請求項11~16のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法を行う工程(1)と、
    前記核酸アプタマー結合用ポリヌクレオチド基に、検出対象に特異的な核酸アプタマーを相補結合によって結合する工程(2)と、
    前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を結合する工程(3)と、
    を含む、検出対象の分析用センサの製造方法。
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