WO2018221271A1

WO2018221271A1 - 検出対象の分析用センサ作製用基材、検出対象の分析用センサ、及び検出対象の分析法

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Publication number: WO2018221271A1
Application number: PCT/JP2018/019292
Authority: WO
Inventors: 俊文竹内; 雄己哉北山
Original assignee: 国立大学法人神戸大学
Priority date: 2017-05-29
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2018-12-06
Also published as: EP3647786A4; EP3647786B1; EP3647786A1; US20200110084A1; JP6573351B2; JPWO2018221271A1

Abstract

検出すべき対象を迅速に且つ特異性高く捉えることができる、簡便な測定系を提供する。基材１０と、基材１０の表面上に設けられたポリマー膜３０と、を含み；ポリマー膜３０が、検出対象を受け入れる凹部３１を有し；凹部３１内に、抗体物質結合用基２２とシグナル物質結合用基３２とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材１０。検出対象の分析用センサ作製用基材１０と、抗体物質結合用基２２に結合した、検出対象に特異的な抗体物質と、シグナル物質結合用基３２に結合したシグナル物質と、を含む、検出対象の分析用センサ。

Description

検出対象の分析用センサ作製用基材、検出対象の分析用センサ、及び検出対象の分析法

　本発明は、検出対象を基材上で迅速に検出する技術に関する。より具体的には、本発明は、検出対象の分析用センサ作製用基材及びその製造方法、検出対象の分析用センサ及びその製造方法、並びに検出対象の分析法に関する。

　エクソソームは細胞から放出される小胞体の一つであり、直径２０～１５０ｎｍの脂質二重膜小胞である。エクソソームは、その内部にタンパク質、及びｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの核酸を内包するとともに、その表面にもタンパク質を有している。エクソソームはこのような物質に特徴づけられているため、エクソソームの特徴を解析することで、分泌した細胞がどのような細胞であるかを推測できると考えられている。また、エクソソームは様々な体液中で存在が確認されており、比較的容易に採取することができる。

　癌細胞から分泌されるエクソソームは腫瘍由来の物質を含んでいる。したがって、体液中のエクソソームに含まれる物質を解析することで癌の診断を行うことができる可能性が期待されている。さらに、エクソソームは細胞によって能動的に分泌されるものであることから、がんの早期段階であっても何らかの特徴を呈していることが予想されている。

　エクソソームの検出方法は種々報告されている。例えば特許文献１では、ＢＡＭ（Biocompatible anchor for membrane）と呼ばれるアンカー物質で表面修飾された基板でエクソソームを捕捉し、エクソソーム上の抗原分子に対する抗体を用いてエクソソームを検出する方法が開示されている。特許文献２では、互いに流路で繋げられたエクソソーム精製部と生体分子精製部と生体分子検出部とを含む流体デバイスにおいて、ＢＡＭで修飾されたエクソソーム精製部でエクソソームの捕捉及びエクソソームの破砕を行い、エクソソーム内部の生体分子を生体分子精製部及び生体分子検出部でそれぞれ精製及び検出する方法が開示されている。特許文献３では、エクソソームの表面抗原に対する捕捉用抗体が固定された９６穴プレートでエクソソームを捕捉し、その後、別の表面抗原に対する検出用抗体を作用させ、さらに検出用抗体に対する酵素標識二次抗体を用いることでエクソソームを検出する方法が開示されている。特許文献４では、エクソソームの表面抗原に対する抗体を固定した凹部を有するデバイスにおいて、凹部でエクソソームを捕捉した後に、エクソソームの別の表面抗原に対する抗体を結合させたビーズを作用させた後に、ビーズを計数することでエクソソームを検出する方法が開示されている。特許文献５では、エクソソームの表面抗原に対する抗体であって励起標識に結合可能な抗体と、当該エクソソームの別の表面抗原に対する抗体であってシグナル発生標識が結合した抗体との２種の抗体を用い、それらが励起標識存在下でエクソソームに結合し互いに近接した時に、エネルギ－移動により励起光を発生させることによって、エクソソームを検出する方法が開示されている。特許文献６では、照明時に表面プラズモン共鳴を生成する検出領域を生成するための所定パターンのナノ開口を複数有する金属膜が表面に設けられた透明平面基板と、金属膜に設けられたエクソソームマーカー特異的な捕捉剤と、を含むナノプラズモンセンサを用い、表面プラズモン共鳴を用いてエクソソームを検出する方法が開示されている。非特許文献１では、金の基板上に設けられたビオチン化自己組織化単分子膜に、エクソソーム表面抗原であるＣＤ６３に対する抗体を結合したアビジンを結合させ、ＣＤ６３を介して結合したエクソソームを表面プラズモン共鳴を用いて測定する方法が開示されている。

国際公開第２０１５／０２９９７９号国際公開第２０１５／０４５６６６号特表２０１１－５１０３０９号公報特開２０１４－２１９３８４号公報国際公開第２０１３／０９４３０７号米国特許出願公開第２０１６／０３３４３９８号明細書

Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１４）８６，５９２９－５９３６

　エクソソームは、免疫制御、神経変性疾患の発症、癌の臓器特異的転移などに深く関与する、細胞間コミュニケーションツールの１つとして重要な役割を果たすことが報告されている。したがって、細胞から分泌されたエクソソームを迅速に検出すること、及び検出されたものが何であるかを特異的に捉えることを、簡便な手法で実現することは、細胞間コミュニケーションツールを検出する上で重要である。

　しかしながら、特許文献１に開示されるエクソソーム検出法は、エクソソームを捕捉した後に抗体を結合させる工程が別途必要となることから不可避的にタイムラグが生じ、迅速な検出を行うことはできない。特許文献２に開示されるエクソソーム検出法は、エクソソーム破砕により生じさせた内部分子を精製した後に、内部分子に特異的な物質を用いて検出するという複雑な系が必要となるため、簡便性に欠ける。特許文献３に開示されるエクソソーム検出法は、エクソソームをサンドイッチＥＬＩＳＡで検出するものであるため、エクソソームを捕捉した後に抗体を結合させる工程が別途必要となることから不可避的にタイムラグが生じ、迅速な検出を行うことはできない。特許文献４に開示されるエクソソーム検出法も、エクソソームを捕捉した後に抗体ビーズを結合させる工程が別途必要となることから不可避的にタイムラグが生じ、同様に迅速な検出を行うことはできない。特許文献５に開示されるエクソソーム検出法は、蛍光共鳴エネルギー移動法を用いることから、複雑にデザインされた抗体の組み合わせが必要となるため、簡便性に欠ける。特許文献６及び非特許文献１に開示されるエクソソーム検出法は、金属表面の状態を検出する表面プラズモン共鳴を用いることから、表面に非特異的に吸着した対象も不可避的に検出されるため、特異的に認識された対象のみを検出する特異性に欠ける。

　そこで本発明の目的は、上記の問題に鑑み、検出すべき対象を迅速に且つ特異性高く捉えることができる、簡便な測定系を提供することにある。

　本発明者は鋭意検討の結果、検出対象を受け入れる凹部を有するポリマー膜を表面に形成し、当該凹部内において検出対象に対する結合特異性を確保する抗体を配置できるようにするとともに、当該凹部内にのみシグナル物質を配置することができるように基材を構成することで、上記本発明の目的を達成できることを見出した。本発明は、この知見に基づき、さらに検討を重ねることにより完成された。

　本発明は、検出対象の分析用センサ作製用基材及びその製造方法、検出対象の分析用センサ及びその製造方法、並びに検出対象の分析法を含む。すなわち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。

項１．　基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み、
　前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し、
　前記凹部内に、抗体物質結合用基とシグナル物質結合用基とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材。
項２．　前記ポリマー膜が、前記検出対象又は前記検出対象よりサイズが大きい対象を鋳型とする分子インプリントポリマーで構成され、前記凹部が前記鋳型の表面形状の一部に対応する、項１に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項３．　前記抗体物質結合用基がキレート結合性基である、項１又は２に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項４．　前記シグナル物質結合用基がチオール基である、項１～３のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
項５．　項１から４のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材と、
　前記抗体物質結合用基に結合した、前記検出対象に特異的な抗体物質と、
　前記シグナル物質結合用基に結合したシグナル物質と、
を含む、検出対象の分析用センサ。
項６．　前記検出対象が膜構造を有する微小粒体である、項５に記載の検出対象の分析用センサ。
項７．　前記膜構造を有する微小粒体がエクソソームである、項６に記載の検出対象の分析用センサ。
項８．　前記検出対象に特異的な抗体物質が、前記膜構造を有する微小粒体の表面に発現している特異的抗原に対する特異的結合能を有する、項５から７のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ。
項９．　項５から８のいずれかに記載の検出対象の分析用センサに、検出対象を含む試料を接触させ、前記抗体物質に前記検出対象を結合する工程と、
　前記シグナル物質に由来するシグナルの変化を検出する工程と、
を含む、検出対象の分析法。
項１０．　基材に、結合性官能基と重合開始性基とを表面に有する分子膜を形成する分子膜形成工程と、
　前記結合性官能基に対し、第１の可逆的連結基を介して、人工粒子を鋳型として導入する鋳型導入工程と、
　前記鋳型の表面を、第２の可逆的連結基を介して重合性官能基で修飾する表面修飾工程と、
　重合性モノマーを加え、前記重合性モノマーを基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程と、
　前記第１の可逆的連結基及び第２の可逆的連結基を開裂させてそれぞれ抗体物質結合用基及びシグナル物質結合用基へ変換するとともに前記鋳型を除去する除去工程と、
を含む、検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項１１．　前記人工粒子が、表面に、前記抗体物質結合用基と結合することで前記第１の可逆的連結基の形成が可能な基と、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記第２の可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基とを有する、項１０に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項１２．　前記人工粒子がシリカ粒子である、項１０又は１１に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項１３．　前記抗体物質結合用基がキレート結合性基であり、前記抗体物質結合用基と結合することで前記第１の可逆的連結基の形成が可能な基がヒスチジンタグである、項１０から１２のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項１４．　前記シグナル物質結合用基がチオール基であり、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記第２の可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基がチオール基である、項１０から１３のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
項１５．　項１０から１４のいずれかに記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法を行う工程と、
　前記抗体物質結合用基に、検出対象に特異的な抗体物質を結合する工程と、
　前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を結合する工程と、
を含む、検出対象の分析用センサの製造方法。

　本発明によれば、検出すべき対象を迅速に且つ特異性高く捉えることができる、簡便な測定系が提供される。

本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材の一例を示す模式図である。本発明の検出対象の分析用センサの一例を示す模式図である。本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材を製造する方法における分子膜形成工程を説明する模式図である。図３に引き続く、鋳型導入工程を説明する模式図である（鋳型にエクソソームを用いる場合）。図４に引き続く、表面修飾工程を説明する模式図である（鋳型にエクソソームを用いる場合）。図５に引き続く、重合工程を説明する模式図である（鋳型にエクソソームを用いる場合）。図６に引き続く、除去工程を説明する模式図である（鋳型にエクソソームを用いる場合）。本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材を製造する方法における鋳型導入工程を説明する模式図である（鋳型に人工粒子を用いる場合）。図８に引き続く、表面修飾工程を説明する模式図である（鋳型に人工粒子を用いる場合）。図９に引き続く、重合工程を説明する模式図である（鋳型に人工粒子を用いる場合）。図１０に引き続く、除去工程を説明する模式図である（鋳型に人工粒子を用いる場合）。本発明の検出対象の分析法の一例を説明する模式図である。実施例３の、本発明の分析用センサ（鋳型にエクソソームを用いて作製）を用いた蛍光分析によるエクソソーム検出において得られた、エクソソーム濃度に対する蛍光強度変化を対数表示したグラフとそのカーブフィッティング結果である。参考例の、本発明の分析用センサ（鋳型にエクソソームを用いて作製）を用いたＳＰＲによるエクソソーム検出において得られた、エクソソーム濃度に対するＳＰＲシグナル変化を示すグラフとそのカーブフィッティング結果である。実施例５の、本発明の分析用センサ（鋳型にエクソソームを用いて作製）作成の再現性試験において得られた、エクソソーム濃度に対する蛍光強度変化を示したグラフである。実施例６の、本発明の分析用センサ（鋳型にエクソソームを用いて作製）を用いたＦＲＥＴによるエクソソーム検出において得られた、エクソソームの濃度に対する蛍光強度変化を示したグラフである。実施例７の、フリーの抗CD9抗体添加によるエクソソームの結合阻害試験において得られた、本発明の分析用センサ（鋳型にエクソソームを用いて作製）に対し試料と共にフリーの抗CD9抗体を添加した場合と添加しなかった場合における試料中エクソソームの濃度に対する蛍光強度変化を示したグラフである。実施例１０の、本発明の分析用センサ（鋳型にシリカナノ粒子を用いて作製；抗体あり）を用いた蛍光分析によるエクソソーム検出において得られた、エクソソームの濃度に対する蛍光強度変化を示したグラフである。実施例１１の、本発明の分析用センサ（鋳型にシリカナノ粒子を用いて作製）を、誘導放出制御（ＳＴＥＤ）顕微鏡を用いて観察して得られたイメージ像である。実施例１２で、本発明の分析用センサ（鋳型にシリカナノ粒子を用いて作製）を用いて涙液中のエクソソームを検出した結果を示す。

［１．検出対象の分析用センサ作製用基材］
　本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材は、後述の発明の分析用センサを作製するための材料となる基材である。この分析用センサ作製用基材は、エクソソームなどの検出対象を迅速に検出可能なセンサへユーザが簡便にカスタマイズできるように構成されている。

　本発明の検出対象の分析センサ作製用基材は、基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み；前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し；前記凹部内に、抗体物質結合用基とシグナル物質結合用基とを有する。図１に、本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材の一例を模式的に示す。図１に示すように、分析用センサ作製用基材１０は、基材２０とポリマー膜３０とを含む。ポリマー膜３０は基材２０の表面に設けられており、凹部３１を有する。凹部３１は検出対象（後述の検出対象６０）を受け入れ可能な大きさに形成された穴である。分析用センサ作製用基材１０は、凹部３１内に、抗体物質結合用基２２と、シグナル物質結合用基３２とを有する。シグナル物質結合用基３２は、抗体物質結合用基２２の近傍に設けられている。以下、それぞれの要素について詳述する。

［１－１．基材］
　基材２０の材料は、例えば、金属、ガラス、及び樹脂からなる群から選択される材料であってよい。金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等が挙げられる。樹脂としては、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、ＡＢＳ（アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体）、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリウレタン、シリコーン樹脂、フッ素樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等が挙げられる。

　基材２０は、上述の材料から選ばれる複数の材料が組み合わされて形成されたものであってもよい。例えば、基材２０は、ガラスまたは樹脂の表面に、金属膜が設けられたものであってもよい。また、基材２０の形状としては、板状及び粒子状を問わない。好ましい例としては、金基板、ガラス基板、金ナノ粒子、ガラスビーズ等が挙げられる。

［１－２．ポリマー膜］
　ポリマー膜３０は、基材２０に層状に設けられており、複数の凹部３１を有する。凹部３１は、本発明の検出対象の分析用センサにおけるセンサ場となる部分である。凹部３１は、検出対象を受け入れ可能に形成されていれば限定されるものではないが、たとえば、後述のように分子インプリント重合法を用いることによって形成された、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ；molecularly imprinted polymer）であってよい。この場合、凹部３１は、分子インプリント重合法において用いられる鋳型（後述の鋳型４０）によって型取られたものであり、当該鋳型の表面形状の一部に対応する形状を有する。凹部３１は、検出対象を受け入れ可能な大きさで形成されていればよいため、凹部３１の鋳型は、検出対象と同じものであってもよいし、検出対象よりもサイズが大きい対象であってもよい。なお、凹部３１が検出対象を受け入れ可能な大きさであるとは、抗体物質（後述の抗体物質５２）及びシグナル物質（後述のシグナル物質５３）が結合して分析用センサ（後述の分析用センサ５０）となった場合に、検出対象の少なくとも一部が凹部３１内に進入し抗体物質にアプローチして結合可能となる程度に凹部３１が基材２０表面に十分な大きさで開口していることをいう。凹部３１の開口径は、検出対象により異なり得るため特に限定されないが、たとえば１ｎｍ～１０μｍであってよい。ポリマー膜３０の厚みも検出対象により異なり得るため特に限定されないが、たとえば１ｎｍ～１μｍであってよい。

　ポリマー膜３０を構成するポリマーは、たとえば、生体適合性モノマー由来成分を含む生体適合性ポリマーであってよい。生体適合性とは、生体物質の接着を誘起しない性質をいう。生体適合性モノマーに由来する成分を含むことにより、ポリマー膜３０において非特異的吸着を良好に抑制することができる。上記の生体適合性モノマーは、好ましくは親水性モノマーであり、より好ましくは双性イオンモノマーである。

　双性イオンモノマーは、酸性官能基（たとえば、リン酸基、硫酸基、およびカルボキシル基など）に由来するアニオン基と、塩基性官能基（たとえば、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基および４級アンモニウム基など）に由来するカチオン基との両方を１分子中に含む。たとえば、ホスホベタイン、スルホベタイン、およびカルボキシベタインなどが挙げられる。

　より具体的には、ホスホベタインとしては、ホスホリルコリン基を側鎖に有する分子が挙げられ、好ましくは、２－メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）などが挙げられる。
　スルホベタインとしては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３’－メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト（ＳＰＢ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（４－スルホブチル）－３’－メタクリロイルアミノプロパンアミニウムインナーソルト（ＳＢＢ）などが挙げられる。
　カルボキシベタインとしては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（１－カルボキシメチル）－２’－メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト（ＣＭＢ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－カルボキシエチル）－２’－メタクリロイロキシエタンアミニウムインナーソルト（ＣＥＢ）などが挙げられる。

　ポリマー膜３０における生体適合性モノマー由来成分の割合は、たとえば５モル％以上１００モル％以下であってよい。生体適合性モノマー由来成分の含有量が上記下限以上であることは、ポリマー膜３０表面における非特異性吸着を抑制する点で好ましい。ポリマー膜３０における生体適合性モノマー由来成分の割合は、好ましくは１０モル％以上８０モル％以下、さらに好ましくは２０モル％以上６０モル％以下であってよい。

［１－３．抗体物質結合用基］
　抗体物質結合用基２２は、抗体物質（後述の抗体物質５２）を直接的又は間接的に結合させることで分析用センサ作製用基材１０に抗体物質を導入可能とする基である。ユーザは、検出対象を自由にターゲティングすることができ、ターゲットとする検出対象に特異的な抗体物質を自由に選択し、抗体物質結合用基２２へ導入することができる。また、１個の基材２０において、一の凹部３１に対し一の種類の抗体物質を導入し、他の凹部３１に対し他の種類の抗体物質を導入することによって、１個の基材２０において複数種の抗体物質を用いた検出対象の分析が可能となるようにカスタマイズすることもできる。このようなカスタマイズの具体例としては、一の凹部３１に対しエキソソームに結合する抗体物質を導入し、他の凹部３１に対しタンパク質に結合する抗体物質を導入することによって、１個の基材２０において、エキソソームとタンパク質との両方の分析が可能となる。

　本発明においては、１個の凹部３１につき１個の抗体物質結合用基２２が設けられていればよいが、１個の凹部３１につき複数個の抗体物質結合用基２２が設けられていても構わない。なお、基材２０表面において、凹部３１以外の部分には抗体物質結合用基２２は設けられない。

　抗体物質結合用基２２は、不可逆的結合性基であってもよいし可逆的結合性基であってもよく、共有結合性基であってもよいし非共有結合性基であってもよい。好ましくは、抗体物質結合用基２２は可逆的結合性基であり、より好ましくは非共有結合性基である。このような基としては、キレート結合性基が挙げられる。キレート結合性基は、例えばプロテインＧ等の、抗体物質のＦｃ領域に結合する物質を介して間接的に抗体物質を結合することができる。

　キレート結合性基としては、複数の配位座をもつ配位子（多座配位子）を有することにより、金属イオンに結合（配位）する基であれば特に限定されず、例えば、アミノポリカルボン酸系キレート剤由来基、ヒドロキシカルボン酸系キレート剤由来基、デフェロキサミン由来基、デフェラシクロス由来基、デフェリプロン由来基、及びヒスチジンタグ等が挙げられ、好ましくは、アミノポリカルボン酸系キレート剤由来基が挙げられる。

　上述のアミノポリカルボン酸としては、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミンジ酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジヒドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸（ＤＨＥＤＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸、β－アラニンジ酢酸、シクロヘキサンジアミンテトラ酢酸、イミノジ酢酸、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）イミノジ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）エチレンジアミントリ酢酸、グリコールエーテルジアミンテトラ酢酸、グルタミン酸ジ酢酸、アスパラギン酸ジ酢酸、メチルグリシンジ酢酸、イミノジコハク酸、セリンジ酢酸、ヒドロキシイミノジコハク酸、ジヒドロキシエチルグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、および、トリエチレンテトラミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’－六酢酸等が挙げられる、好ましくはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）が挙げられる。

　なお、可逆的結合性基とは、他の可逆的結合性基と結合（共有結合及び非共有結合を問わない）することにより可逆的連結基を構成可能な基であり、可逆的とは、可逆的結合性基から可逆的連結基への変換（結合）及び可逆的連結基から可逆的結合性基への変換（開裂）とが双方向に可能であることをいう（以下において同様）。

［１－４．シグナル物質結合用基］
　シグナル物質結合用基３２は、シグナル物質（後述のシグナル物質５３）を結合させることで分析用センサ作製用基材１０にシグナル物質を導入可能とする基である。ユーザは、シグナル物質を自由に選択し、シグナル物質結合用基３２へ導入することができる。また、１個の基材２０において、一の凹部３１と他の凹部３１とで異なる種類の抗体物質を設ける場合は、抗体物質の種類ごとに異なるシグナル物質を設けるようにカスタマイズすることもできる。

　本発明においては、１個の凹部３１につき、通常複数個のシグナル物質結合用基３２が設けられている。シグナル物質結合用基３２は、本発明の分析センサの凹部３１内でのセンシング時（検出対象を凹部３１内に受け入れた時）に、シグナル強度の変化を検出可能となるように十分な量が用意されていればよい。従って、１個の凹部３１に設けられるシグナル物質結合用基３２の量は特に限定されるものではなく、凹部３１の大きさ及び検出すべき対象物質の大きさにもよるが、１個の凹部３１につき例えば約１００個～約１０００個程度であってよい。なお、基材２０表面において、凹部３１以外の部分にはシグナル物質結合用基３２は設けられない。

　シグナル物質結合用基３２は、不可逆的結合性基であってもよいし可逆的結合性基であってもよく、共有結合性基であってもよいし非共有結合性基であってもよい。好ましくは、シグナル物質結合用基３２は、可逆的結合性基であり、より好ましくは共有結合性基である、このような基としては、チオール基（対応する可逆的連結基はジスルフィド基）、アミノオキシ基又はカルボニル基（対応する可逆的連結基はオキシム基）、ボロン酸基とジオール基（対応する可逆的連結基は環状ジエステル基）、アミノ基とカルボニル基（対応する可逆的連結基はシッフ塩基）、アルデヒド基もしくはケトン基とアルコール（対応する可逆的連結基はアセタール基）等が挙げられる。

［１－５．他の態様］
　本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材は、抗体物質及びシグナル物質の少なくともいずれかがユーザによってカスタマイズされるように構成されていればよい。したがって、他の態様として、抗体物質結合用基の方に、検出対象に特異的な抗体物質がすでに結合していてもよい。この場合、ユーザはシグナル物質を自由に選択して導入することができる。

　なお、更に他の態様として、シグナル物質結合用基の方に、すでにシグナル物質が結合していてもよい。この場合、ユーザは検出対象を自由にターゲティングすることができ、ターゲットとする検出対象に特異的な抗体物質を自由に選択し、当該抗体物質を導入することができる。

［２．検出対象の分析用センサ］
　本発明の分析用センサは、上述の検出対象の分析用センサ作製用基材と；前記抗体物質結合用基に結合した、前記検出対象に特異的な抗体物質と；前記シグナル物質結合用基に結合したシグナル物質と；を含む。図２に、本発明の検出対象の分析用センサの一例を模式的に示す。図２に示すように、分析用センサ５０は、上述の分析用センサ作製用基材１０の抗体物質結合用基２２に抗体物質５２が結合し、シグナル物質結合用基３２にシグナル物質５３が結合している。

［２－１．検出対象］
　本発明の分析用センサの検出対象（後述の検出対象６０）は、抗体物質５２への特異性結合能を有するものであれば原理上特に限定されるものではない。具体例としては、低分子物質、タンパク質、及び膜構造を有する微小粒体が挙げられる。低分子物質としては、ホルモン・薬剤・除草剤・農薬・糖・コレステロール・脂質・尿酸・環境ホルモン・ペプチド等の任意の物質が挙げられる。タンパク質としては、HSA, IgG,フィブリノーゲン,トランスフェリン、AST, ALT, LDH, ALP, LAP,γ-GTP, CRP, AFP, PSA等の任意のタンパク質が挙げられる。膜構造を有する微小粒体としては、細胞外微粒子、細胞内小胞、オルガネラ及び細胞が挙げられる。膜構造としては、脂質二重膜構造が挙げられる。細胞外微粒子としては、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体等が挙げられる。細胞内小胞としては、リソソーム、エンドソーム等が挙げられる。オルガネラとしてはミトコンドリア等が挙げられる。細胞としては、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）等の癌細胞、その他の疾患関連細胞等が挙げられる。

　また、後述のように、シグナル物質５３を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こす蛍光色素ペアの一方として構成する場合は、検出対象６０は、予め当該蛍光色素ペアの他方を結合させておく。

［２－２．抗体物質（検出対象に特異的な抗体物質）］
　抗体物質５２は、検出対象への特異的結合能を有していればよい。抗体物質５２とは、抗体と抗体様物質とを含む意である。抗体とは、免疫グロブリンの完全な基本構造を有するタンパク質をいい、抗体様物質とは、免疫グロブリンの断片（抗体フラグメント）をいう。抗体としては、例えば、免疫グロブリン(Ig)、キメラ抗体等が挙げられ、より具体的には、IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等が挙げられる。前記キメラ抗体は、例えば、ヒト化抗体等が挙げられる。前記抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、ヒト等の動物種由来のものでもよく、特に制限されない。前記抗体は、例えば、前記動物種由来の血清から、従来公知の方法により調製してもよいし、市販の抗体を使用してもよい。前記抗体は、例えば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれでもよく、モノクローナル抗体が好ましい。抗体様物質としては、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)₂、ScFv等が挙げられる。

　抗体物質５２は、検出対象に応じて当業者が適宜選択することができる。検出対象が表面に特異的抗原を有するものであれば、抗体物質５２は、特異的抗原に対する特異的結合能を有するものを用いることができる。例えば検出対象がエクソソームである場合、エクソソームは膜タンパク質（エクソソーム特異的抗原）として、例えば、CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1、Rab5、Annexin V、LAMP1等を有しているため、エクソソーム特異的抗原に対する抗体を抗体物質５２として用いることができる。検出対象が癌細胞であれば、癌細胞は癌細胞特異的抗原として、例えば、Caveolin-1、EpCAM、FasL、TRAIL、Galectine3、CD151、Tetraspanin 8、EGFR、HER2、RPN2、CD44、TGF-β等を有しているため、癌細胞特異的抗原に対する抗体を抗体物質５２として用いることができる。検出対象が上記以外の疾患細胞である場合も同様に、疾患細胞特異的抗原に対する抗体を抗体物質５２として用いることができる。

　なお、抗体物質５２としては、簡便性及び検出対象に対する抗体物質のアフィニティを良好に確保する観点、並びに分析用センサ５０の作製容易性又は汎用性等の観点から、修飾基を有していないものを用いることができる。この場合における修飾基とは、シグナル物質等、アフィニティとは異なる目的で設けられる修飾基をいう。一方、修飾基には、抗体物質結合用基２２との結合に寄与する基（例えばヒスチジンタグ等）は含まない。

［２－３．シグナル物質］
　シグナル物質５３は、検出対象に特異的な抗体物質５２と抗体物質結合用基２２との結合情報を読み出すものとして機能する。シグナル物質５３としては、凹部３１への検出対象の結合により検知されるシグナル強度が変化したり、スペクトルが変化（例えばピークがシフト）したりするものであれば特に限定されない。たとえば、蛍光物質、放射性元素含有物質、磁性物質等が挙げられる。検出容易性等の観点から、シグナル物質としては蛍光物質であることが好ましい。蛍光物質としては、フルオレセイン系色素、インドシアニン色素などのシアニン系色素、ローダミン系色素などの蛍光色素；ＧＦＰなどの蛍光タンパク質；金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子などが挙げられる。放射性元素含有物質としては、¹⁸Fなどの放射性同位体でラベルした、糖、アミノ酸、核酸などが挙げられる。磁性物質としては、フェリクロームなどの磁性体を有するもの、フェライトナノ粒子、ナノ磁性粒子などにみられるものが挙げられる。

　また、シグナル物質５３は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こす蛍光色素ペアの一方として構成することができる。ＦＲＥＴを引き起こす蛍光色素ペアとしては特に限定されず、シグナル物質５３としてドナー色素及びアクセプター色素のいずれを選択するかも限定されない。好ましくは、シグナル物質５３としてドナー色素を選択することができる。ＦＲＥＴを引き起こす蛍光色素のペアを構成するドナー色素／アクセプター色素の具体例としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、ＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、Ｒ－フィコエリトリン（Ｒ－ＰＥ）／アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等が挙げられる。

［３．検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法］
　本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法は、以下の工程を含む。
　基材に、結合性官能基と重合開始性基とを表面に有する分子膜を形成する分子膜形成工程；
　前記結合性官能基に対し、第１の可逆的連結基を介して、鋳型を導入する鋳型導入工程；
　重合性モノマーを加え、前記重合性モノマーを基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程；及び
　前記鋳型を除去する除去工程。

［３－１．鋳型にエキソソームを用いる場合］
　鋳型には、エキソソームを用いることができる。図３～図７に、鋳型としてエキソソームを用いる場合の本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材を製造する方法を模式的に示す。この場合における分析用センサ作製用基材を製造する方法は、以下の工程を含む。
　基材２０に、結合性官能基２２ａと重合開始性基２３ａとを表面に有する分子膜２１を形成する分子膜形成工程（図３）；
　結合性官能基２２ａに対し、第１の可逆的連結基２２ｂ及び抗体物質２４を介して、抗体物質２４に特異的に結合する鋳型４０を導入する鋳型導入工程（図４）；
　鋳型４０の表面を、第２の可逆的連結基３２ｂを介して重合性官能基３３で修飾する表面修飾工程（図５）；
　重合性モノマー３５を加え、重合性官能基３３及び重合性モノマー３５を基質とし、重合開始性基２３ａを重合性開始剤として、鋳型４０の表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで基材２０表面にポリマー膜３０を形成する重合工程（図６）；及び
　第１の可逆的連結基２２ｂ及び第２の可逆的連結基３２ｂを開裂させて、それぞれ抗体物質結合用基２２及びシグナル物質結合用基３２へ変換するとともに、抗体物質２４及び鋳型４０を除去する除去工程（図７）。
　以下、各工程について図を参照しながら詳述する。

［３－１－１．分子膜形成工程］
　図３に示すように、分子膜形成工程では、基材２０に、結合性官能基２２ａと重合開始性基２３ａとを表面に有する分子膜２１を形成する。

　結合性官能基２２ａは、重合開始性基２３ａと異なる基であって、後述の鋳型導入工程で鋳型４０まで分子鎖を伸長するために用いられる試薬に応じた基が当業者によって適宜決定される。図示された態様では、結合性官能基２２ａがアミノ基である場合を例示している。

　重合開始性基２３ａとしては、重合開始剤として機能しうる構造を有していれば特に限定されず、後述の重合工程において用いる重合反応に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、重合開始性基２３ａとしては、重合反応時にラジカルを発生する構造を有する基、具体的には有機ハロゲンに由来する炭素－ハロゲン結合基（－ＣＸ基；Ｘはハロゲン原子を示す。）が挙げられる。図示された態様では、重合開始性基２３ａが－ＣＢｒ基である場合を例示している。

　分子膜２１は、結合性官能基２２ａを末端に有する分子及び重合開始性基２３ａを末端に有する分子を用いた混成自己組織化による単分子膜として従来公知の方法で形成することができる。これによって、分子膜２１は、混成自己組織化単分子膜（mixed SAMs）として形成することができる。

［３－１－２．鋳型導入工程］
　図４に示すように、鋳型導入工程では、結合性官能基２２ａに対し、第１の可逆的連結基２２ｂ及び抗体物質２４を介して、抗体物質２４に特異的に結合する鋳型４０を導入する。

　より具体的には、鋳型導入工程は以下の工程を含むことができる。
　結合性官能基２２ａに、第１の可逆的連結基２２ｂを介して抗体物質結合性基２２ｃを導入する工程；
　抗体物質結合性基２２ｃに抗体物質２４を結合する工程；及び
　抗体物質２４に、鋳型４０を結合する工程。

　第１の可逆的連結基２２ｂは、第１の可逆的連結基２２ｂから可逆的結合性基（すなわち前述の抗体物質結合用基２２）への開裂と、可逆的結合性基（すなわち前述の抗体物質結合用基２２）から第１の可逆的連結基２２ｂへの結合と、が双方向に可能である基であれば特に限定されない。好ましくは、第１の可逆的連結基２２ｂは、キレート結合性基同士が金属の配位を介して結合したキレート結合基であってよい。図示された態様では、第１の可逆的連結基２２ｂとして、アミノポリカルボン酸系キレート剤由来基であるＮＴＡ基（抗体物質結合用基２２の一種）と、当該抗体物質結合用基２２と結合して第１の可逆的連結基２２ｂを形成可能な基２５であるヒスチジンタグ（図中のヒスチジンタグは模式的に示したものであるため、正確な分子構造を示しているわけではなく、ヒスチジンタグの一部のイミダゾイル基を強調表示したものである。）とが、ニッケルイオンを介してキレート結合された構造を例示している。

　抗体物質結合性基２２ｃは、抗体物質２４へ結合可能な基であれば特に限定されないが、抗体物質２４を配向結合する（つまり抗体物質２４の鋳型４０結合部位が外側に向く方向で結合する）観点で、抗体物質２４のＦｃ領域に対する特異的結合能を有する基であることが好ましい。図示された態様では、このような基としてプロテインＧを例示している。

　抗体物質２４は、鋳型４０に応じて決定することができる。具体的には、鋳型４０への特異的結合能を有する抗体物質が抗体物質２４として選択される。また、鋳型４０は、検出対象を考慮することにより決定される。具体的には、検出対象（後述の検出対象６０）と同じものか、又は、当該検出対象よりもサイズが大きい対象が鋳型として選択される。検出対象よりもサイズが大きい対象としては、後述重合工程におけるポリマー膜３０の合成で形成される凹部３１を、検出対象を受け入れ可能な程度に十分な大きさで基材２０表面に開口させられる形状および大きさのものであれば特に限定されず、例えば、タンパク質等の生体分子及び膜構造を有する微小粒体が挙げられる。

　鋳型４０は抗体物質２４を介して結合させられるため、抗体物質２４が特異的に結合する抗原を表面に有するものを用いることが好ましい。たとえば、抗体物質２４としてエクソソーム表面の特異的抗原（表面タンパク質）に対する抗体を用い、鋳型４０としてエクソソームを用いることができる。

　図示された態様では、鋳型導入工程の手順として、結合性官能基２２ａとしてのアミノ基に、アミノポリカルボン酸系キレート剤由来基であるＮＴＡ基を有する分子を結合し、ニッケルイオン存在下でヒスタグを有するリコンビナントプロテインＧを反応させることで第１の可逆的連結基２２ｂ（キレート基）を介して抗体物質結合性基２２ｃとしてのプロテインＧを導入した後、さらに、抗体物質２４としてエクソソームの表面タンパク質に特異的な抗体を結合し、最後に鋳型４０としてのエクソソームを結合させた態様を例示している。

［３－１－３．表面修飾工程］
　図５に示すように、表面修飾工程では、鋳型４０の表面を、第２の可逆的連結基３２ｂを介して重合性官能基３３で修飾する。

　より具体的には、表面修飾工程は、以下の工程を含むことができる。
　アンカー基４３と可逆的結合性基４２とを有するアンカー物質４１を鋳型４０にアンカリングさせる工程；及び
　可逆的結合性基４２を第２の可逆的連結基３２ｂに変換するとともに重合性官能基３３を導入する工程。

　アンカー物質４１は、アンカー基４３と可逆的結合性基４２とを含む物質である。アンカー基４３は、鋳型４０にアンカリング可能な基であり、特に鋳型４０が脂質二重膜を有する膜体である場合は、脂質二重膜へのアンカリングが可能な疎水性鎖基であることが好ましい。疎水性鎖としては、単鎖であっても複鎖であってもよく、飽和炭化水素であっても不飽和炭化水素であってもよく、置換基を有していても有していなくてもよい。具体的には、炭素原子数６～２４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基が好ましく、より具体的には、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、ステアリル基（オクタデシル基）、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基、リシノレイル基、イソステアリル基等が挙げられる。これらの中でも、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基が好ましく、オレイル基がより好ましい。

　アンカー物質４１は、アンカー基４３及び可逆的結合性基４２に加え、親水性鎖基を含んでいてよい。当該親水性鎖基は、アンカー基４３と可逆的結合性基４２との間に位置する連結基であってよい。具体的には、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン等が挙げられ、より好ましくは、ＰＥＧが挙げられる。

　可逆的結合性基４２は、他の可逆的結合性基（具体的には前述のシグナル物質結合用基３２が相当する）と結合することで第２の可逆的連結基３２ｂに変換される基であればよく、たとえば、チオール基（対応する第２の可逆的連結基３２ｂはジスルフィド基）、アミノオキシ基又はカルボニル基（対応する第２の可逆的連結基３２ｂはオキシム基）、ボロン酸基とジオール基（対応する第２の可逆的連結基３２ｂは環状ジエステル基）、アミノ基とカルボニル基（対応する第２の可逆的連結基３２ｂはシッフ塩基）、アルデヒド基もしくはケトン基とアルコール（対応する第２の可逆的連結基３２ｂはアセタール基）等が挙げられる。

　好ましいアンカー物質４１の具体的な例として、下記式で示される物質（ＢＡＭ－ＳＨ）が挙げられる。式中、ｎは例えば０～１８２の整数を表す。

　重合性官能基３３は、重合性不飽和結合を有していればよく、代表的なものとして（メタ）アクリル基が挙げられる。

　図示された態様では、表面修飾工程の手順として、上記式で示されるアンカー物質４１を、鋳型４０としてのエクソソームの脂質二重膜にアンカリングさせ、その後、アンカー物質４１の第２の可逆的結合性基４２であるチオール基に、重合性官能基３３としての（メタ）アクリル基とジスルフィド結合とを含む分子３４をジスルフィド交換することにより、チオール基を第２の可逆的連結基３２ｂであるジスルフィド基に変換するとともに鋳型４０の表面を重合性官能基３３で修飾する態様を例示している。

　このように表面修飾工程では、シグナル物質結合用基３２を生成可能な第２の可逆的連結基３２ｂを、鋳型４０の表面修飾という方法で導入することで、鋳型４０の表面のみに第２の可逆的連結基３２ｂをデリバリすることができる。

［３－１－４．重合工程］
　図６に示すように、重合工程では、重合性モノマー３５を加え、重合性官能基３３及び重合性モノマー３５を基質とし、重合開始性基２３ａを重合性開始剤として、鋳型４０の表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成する。これによって、基材２０表面に、凹部３１を有するポリマー膜３０を形成する。なお、本明細書においては、鋳型を用いたインプリンティング重合によって合成されるポリマーを、便宜上、分子インプリントポリマーと記載するものとし、分子インプリントポリマーには、鋳型として分子ではないもの（たとえば細胞）を用いたインプリンティング重合によって合成されるポリマーも含まれるものとする。

　重合性モノマー３５は、上述のポリマー膜３０において述べたように、生体適合性モノマーは、好ましくは親水性モノマーであり、より好ましくは双性イオンモノマーである。

　基材２０表面上で、重合性官能基３３、重合性モノマー３５、重合開始性基２３ａおよび鋳型４０が共存する重合反応系が構築されることにより、表面開始制御／リビングラジカル重合が進行する。当該重合反応系には、さらに、重合触媒として、遷移金属または遷移金属化合物と配位子とから形成される遷移金属錯体を含むことが好ましく、さらに還元剤を用いることがより好ましい。遷移金属または遷移金属化合物としては、金属銅又は銅化合物が挙げられ、銅化合物としては塩化物、臭素化物、ヨウ素化物、シアン化物、酸化物、水酸化物、酢酸化物、硫酸化物、硝酸化物、好ましくは臭素化物が挙げられる。配位子としては、多座アミンが好ましく、具体的には二座～六座配位子が挙げられる。これらの中でも、好ましくは二座配位子が挙げられ、より好ましくは２，２－ビピリジル、４，４’－ジ－（５－ノニル）－２，２’－ビピリジル、Ｎ－（ｎ－プロピル）ピリジルメタンイミン、Ｎ－（ｎ－オクチル）ピリジルメタンイミン等が挙げられ、より好ましくは２，２－ビピリジルが挙げられる。還元剤としては、アルコール、アルデヒド、フェノール類及び有機酸化合物等が挙げられ、好ましくは有機酸化合物が挙げられる。有機化合物としては、クエン酸、シュウ酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル等が挙げられ、好ましくはアスコルビン酸、アスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル等が挙げられ、より好ましくはアスコルビン酸が挙げられる。具体的には、ラジカル発生源である重合開始性基２３ａから重合性モノマー３５を基質としてポリマー鎖が伸長し、ポリマー膜の厚みを増すと共に、伸長ポリマー鎖が鋳型４０表面に達すると、当該表面に修飾された重合性官能基３３も基質として取り込むことで、鋳型４０の表面形状に沿った形状の凹部３１が形成されるようにポリマーが合成される。ポリマー膜は、基材２０に導入された鋳型４０の上下径（図面の上方を上とした場合）の１／２程度、好ましくは１／３程度に相当する厚みまで成長させることができる。これによって、ポリマー膜３０が得られる。なお、重合反応系における反応溶媒としては、鋳型４０の変性抑制等の観点から、緩衝液等の水系の溶媒が好ましく用いられる。

［３－１－５．除去工程］
　図７に示すように、除去工程では、第１の可逆的連結基２２ｂ及び第２の可逆的連結基３２ｂを開裂させて、それぞれ抗体物質結合用基２２及びシグナル物質結合用基３２へ変換するとともに、抗体物質２４及び鋳型４０を除去する。上述の表面修飾工程で第２の可逆的連結基３２ｂが鋳型４０の表面のみにデリバリされているため、鋳型４０が除去された跡であるポリマー膜３０の凹部３１には、その内部に抗体物質結合用基２２が残るとともに、凹部３１内にのみ、第２の可逆的連結基３２ｂから生じたシグナル物質結合用基３２が配置される。これによって、分析用センサ作製用基材１０が得られる。

［３－２．鋳型に人工粒子を用いる場合］
　鋳型には、上述のエクソソームの他に、人工粒子を用いることができる。人工粒子を用いる場合は、上述の鋳型にエクソソームを用いる場合に準じて検出対象の分析用センサ作製用基材の製造が可能であるが、鋳型を基板に固定するための抗体を用いる必要がないため安価に製造可能であり、工業的生産に好適である。また、鋳型に用いる人工粒子自体が工業生産品であり粒径制御されていることから、分析用センサ作製用基材に形成する凹部のサイズの制御及び均質化も容易であるため、得られる分析用センサ作製用基材からは、より分析特性に優れた分析用センサを作製することができる。

　鋳型に人工粒子を用いる場合の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法は、基材に、結合性官能基と重合開始性基とを表面に有する分子膜を形成する分子膜形成工程と；前記結合性官能基に対し、第１の可逆的連結基を介して、人工粒子を鋳型として導入する鋳型導入工程と；前記鋳型の表面を、第２の可逆的連結基を介して重合性官能基で修飾する表面修飾工程と；重合性モノマーを加え、前記重合性モノマーを基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程と；前記第１の可逆的連結基及び第２の可逆的連結基を開裂させてそれぞれ抗体物質結合用基及びシグナル物質結合用基へ変換するとともに前記鋳型を除去する除去工程と、を含むことができる。

　図８～図１１に、鋳型として人工粒子を用いる場合の本発明の検出対象の分析用センサ作製用基材を製造する方法を模式的に示す。図８は鋳型導入工程、図９は表面修飾工程、図１０は重合工程、図１１は除去工程を示す。

［３－２－１．分子膜形成工程］
　分子膜形成工程は、鋳型としてエクソソームを用いる場合と同様であり、具体的には、上記の「３－１－１．分子膜形成工程」及び図３に記載の通りである。

［３－２－２．鋳型導入工程］
　図８に示すように、鋳型導入工程では、結合性官能基２２ａに対し、第１の可逆的連結基２２ｂを介して、人工粒子を鋳型４０として導入する。結合性官能基２２及び第１の可逆的連結基２２ｂについては、それぞれ、上述の「３－１－１．分子膜形成工程」及び「３－１－２．鋳型導入工程」に記載の通りである。図示された態様では、結合性官能基２２ａはアミノ基であり、第１の可逆的連結基２２ｂはニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基（抗体物質結合用基２２の一種）とヒスチジンタグ（抗体物質結合用基２２と結合して第１の可逆的連結基２２ｂを形成可能な基２５の一種）との結合により形成される基である。

　鋳型４０として用いられる人工粒子としては、鋳型として用いることができる限度において特に限定されず、人工的に製造された無機粒子及び有機粒子が挙げられる。無機粒子としては、金属、金属の酸化物、窒化物、フッ化物、硫化物、ホウ化物、及びそれらの複合化合物、並びに、ハイドロキシアパタイト等が挙げられ、好ましくは、二酸化珪素（シリカ）が挙げられる。また、有機粒子としては、ラテックス硬化物、デキストラン、キトサン、ポリ乳酸、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリスチレン、ポリエチレンイミン等が挙げられる。凹部３１（図１等参照）の大きさが鋳型４０の大きさに依存するため、人工粒子の大きさは検出対象の大きさによって適宜決定することができる。目的の検出対象を受け入れるための凹部３１を形成するためには、当該検出対象と同程度か又はそれ以上の大きさを有する人工粒子を用いればよい。例えば、人工粒子の大きさとしては、１ｎｍ～１０μｍのものから選択することができる。

　人工粒子としての鋳型４０は、表面に、上述の抗体物質結合用基２２と結合することで上述の第１の可逆的連結基２２ｂの形成が可能な基２５と、上述のシグナル物質結合用基３２と結合することで上述の第２の可逆的連結基３２ｂの形成が可能な可逆的結合基４２とを有する。抗体物質結合用基２２、第１の可逆的連結基２２ｂ、抗体物質結合用基２２と結合して第１の可逆的連結基２２ｂを形成可能な基２５、第２の可逆的連結基３２ｂ、及び可逆的連結基４２はすでに述べたとおりであり、図示された態様においては、抗体物質結合用基２２はニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基、抗体物質結合用基２２と結合して第１の可逆的連結基２２ｂを形成可能な基２５はヒスチジンタグ、可逆的連結基４２はチオール基である。チオール基として示される可逆的連結基４２は、シグナル物質結合用基３２と結合して第２の可逆的連結基３２ｂを形成する。このように人工粒子の表面を特定の基で修飾する方法は広く知られているため、当業者は、導入すべき基２５及び可逆的結合基４２を、それら基の種類及び人工粒子の構成材料を考慮し、公知の表面修飾法に基づいて適宜導入することができる。

　このように、基２５としてヒスチジンタグと可逆的結合基４２としてチオール基とを人工粒子表面に有する鋳型４０を結合させることによって、基材２０上の結合性官能基２２ａであるアミノ基に対し、第１の可逆的連結基２２ｂを介して、人工粒子の鋳型４０が導入される。

［３－２－３．表面修飾工程］
　図９に示すように、表面修飾工程では、鋳型４０の表面を、第２の可逆的連結基３２ｂを介して重合性官能基３３で修飾する。より具体的には、鋳型４０表面の可逆的結合性基４２を第２の可逆的連結基３２ｂに変換するとともに重合性官能基３３を導入される。重合性官能基３３としては、上述の「３－１－３．表面修飾工程」で述べたとおりである。図示された態様では、鋳型４０表面における第２の可逆的結合性基４２であるチオール基に、重合性官能基３３としての（メタ）アクリル基とジスルフィド結合とを含む分子３４をジスルフィド交換することにより、チオール基を第２の可逆的連結基３２ｂであるジスルフィド基に変換するとともに鋳型４０の表面を重合性官能基３３で修飾する態様を例示している。人工粒子を鋳型４０として用いる場合においては、予め表面に第２の可逆的結合性基４２であるチオール基を有している鋳型４０を用いることで、第２の可逆的連結基３２ｂを鋳型４０の表面のみに形成することができる。

［３－２－４．重合工程］
　図１０に示すように、重合工程では、重合性モノマー３５を加え、重合性官能基３３及び重合性モノマー３５を基質とし、重合開始性基２３ａを重合性開始剤として、鋳型４０の表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成する。これによって、基材２０表面に、凹部３１を有するポリマー膜３０を形成する。重合性モノマー３５及びポリマー膜３０については、上述の「３－１－４．重合工程」で記載した通りである。

［３－２－５．除去工程］
　図１１に示すように、除去工程では、第１の可逆的連結基２２ｂ及び第２の可逆的連結基３２ｂを開裂させて、それぞれ抗体物質結合用基２２及びシグナル物質結合用基３２へ変換するとともに、鋳型４０を除去する。上述の表面修飾工程で第２の可逆的連結基３２ｂが鋳型４０の表面のみに形成されるため、鋳型４０が除去された跡であるポリマー膜３０の凹部３１には、その内部に抗体物質結合用基２２が残るとともに、凹部３１内にのみ、第２の可逆的連結基３２ｂから生じたシグナル物質結合用基３２が配置される。これによって、分析用センサ作製用基材１０が得られる。

［４．検出対象の分析用センサの製造］
　検出対象の分析用センサ５０は、分析用センサ作製用基材１０において、抗体物質結合用基２２に、検出対象に特異的な抗体物質５２を結合し、シグナル物質結合用基３２にシグナル物質５３を結合すればよい。

　抗体様物質５２は、検出対象に特異的であれば特に限定されず、分析用センサ作製用基材１０の製造で用いた抗体様物質２４と同じ抗体様物質であってもよいし、当該抗体様物質２４とは異なる抗体様物質であってもよい。

　分析用センサ作製用基材１０は、基板２０表面においてセンサ場となる凹部３１のみにシグナル物質結合用基３２を有するため、シグナル物質５３は凹部３１のみに配置されることができる。

　１個の分析用センサ作製用基材１０に対しては、全ての凹部３１に１種類の抗体様物質５２と１種類のシグナル物質５３とを導入してもよいし、一の凹部３１に対し一の種類の抗体様物質を導入し、他の凹部３１に対し他の種類の抗体様物質を導入するとともに、それぞれ抗体様物質の種類に対応して異なる種類のシグナル物質５３を導入してもよい。

［５．対象物質の分析法］
　図１２に、本発明の検出対象の分析法の一例を説明する模式図を示す。図１２に示すように、本発明の検出対象の分析法では、分析用センサ５０の基材２０表面上に、検出対象６０を含む分析試料液を接触させる。

　検出対象６０としては、抗体物質５２と特異的に結合する物質であれば原理上特に限定させるものではなく、前述したように、低分子物質、タンパク質、及び膜構造を有する微小粒体が挙げられる。低分子物質としては、ホルモン・薬剤・除草剤・農薬・糖・コレステロール・脂質・尿酸・環境ホルモン・ペプチド等任意の物質が挙げられる。タンパク質としては、HSA, IgG,フィブリノーゲン,トランスフェリン、AST, ALT, LDH, ALP, LAP,γ-GTP, CRP, AFP, PSA等の任意のタンパク質が挙げられる。膜構造を有する微小粒体としては、細胞外微粒子、細胞内小胞、オルガネラ及び細胞が挙げられる。膜構造としては、脂質二重膜構造が挙げられる。細胞外微粒子としては、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体等が挙げられる。細胞内小胞としては、リソソーム、エンドソーム等が挙げられる。オルガネラとしてはミトコンドリア等が挙げられる。細胞としては、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）等の癌細胞、その他の疾患関連細胞等が挙げられる。

　検出対象６０を含む分析試料液の態様としては特に限定されないが、分析の迅速性の観点から、検出対象６０を分離する処理を経ていないものであることが好ましい。検出対象６０を分離する処理としては、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、サイズフィルターを用いたろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。

　検出対象６０を含む分析試料液としては、（検出対象６０が細胞または細胞外微粒子である場合は）検出対象６０が存在している環境から得られる試料、又は、（検出対象６０が細胞外微粒子であって、細胞からの産生物である場合は）検出対象６０が生じうる環境から得られる試料であってよい。具体的には、細胞を含む生体試料であってよい。検出対象６０がエクソソームなどの細胞外微粒子である場合、検出対象６０を産生する細胞としては、がん細胞、肥満細胞、樹状細胞、網赤血球、上皮細胞、Ｂ細胞、神経細胞等が挙げられる。より具体的には、検出対象６０を含む分析試料液としては、血液、乳汁、尿、唾液、リンパ液、髄液、羊水、涙液、汗、鼻漏等の体液が挙げられ、さらに、これらの体液を、不要成分を除去する等の前処理を行った処理液、及びこれらの体液に含まれる細胞を培養して得られた培養液も挙げられる。これらの分析試料液のうち、尿、唾液、涙液、汗、鼻漏等の体液は、非侵襲性及び採取容易性の点で特に好ましい。

　分析用センサ５０の基材２０表面上に検出対象６０を含む分析試料液を接触させると、検出対象６０が凹部３１内の抗体物質５２に特異的に捕捉される。例えば検出対象６０がエクソソームである場合、エクソソームは膜タンパク質（エクソソーム特異的抗原）としての、例えば、CD63、CD9、CD81、CD37、CD53、CD82、CD13、CD11、CD86、ICAM-1、Rab5、Annexin V、LAMP1等を介して抗体物質５２に特異的に結合することによって捕捉される。検出対象６０が癌細胞である場合、癌細胞は癌細胞特異的抗原としての、例えば、Caveolin-1、EpCAM、FasL、TRAIL、Galectine3、CD151、Tetraspanin 8、EGFR、HER2、RPN2、CD44、TGF-β等を介して抗体物質５２に特異的に結合することによって捕捉される。

　検出対象６０が凹部３１内の抗体物質５２に特異的に捕捉されると、その瞬間、シグナル物質５３が検出対象６０によって遮蔽されるため、シグナル物質５３から検知されるシグナル強度が低減する。このシグナル強度の変化によって検出対象６０が検出される。検出対象６０の捕捉とシグナル強度の変化とがほぼ同時に起こるため、検出対象６０の検出のために試薬を加える必要もなく、検出を迅速に行うことができる。

　また、分析用センサ５０を、シグナル物質５３が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を引き起こす蛍光色素ペアの一方となるように構成し、且つ、検出対象６０に予め当該蛍光色素ペアの一方を結合させておく場合、検出対象６０が凹部３１内の抗体物質５２に特異的に捕捉されると、その瞬間、シグナル物質５３における蛍光色素と検出対象６０における蛍光色素とが近接するため、ＦＲＥＴにより蛍光が放射される。このＦＲＥＴによる蛍光放射によって検出対象６０が検出される。検出対象６０の捕捉とＦＲＥＴによる蛍光放射とがほぼ同時に起こるため、検出対象６０の検出のために試薬を加える必要もなく、検出を迅速に行うことができる。ＦＲＥＴを引き起こす蛍光色素ペアとしては特に限定されず、シグナル物質５３としてドナー色素及びアクセプター色素のいずれを選択するかも限定されない。好ましくは、シグナル物質５３としてドナー色素を選択することができる。ＦＲＥＴを引き起こす蛍光色素のペアを構成するドナー色素／アクセプター色素の具体例としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、ＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒ６４７／Ｃｙ５.５、Ｒ－フィコエリトリン（Ｒ－ＰＥ）／アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等が挙げられる。

　さらに、本発明の分析用センサ５０は、基材２０表面において、凹部３１以外にシグナル物質５３が設けられていないため、凹部３１外の基材２０表面に非特異吸着があったとしても不所望のバックグラウンドに影響されることがない。したがって、検出対象６０を感度良く検出することができる。

　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

［実施例１：エクソソームを鋳型に用いた検出対象の分析用センサ作製用基材］
　本実施例では、金薄膜蒸着ガラス基板上にアミノ基及びブロモ基が末端となる混成自己組織化単分子膜(mixed SAMs)を作製し（分子膜形成工程）、アミノ基末端へNTA基を導入し、NTA-Ni錯体を形成した後、キレート結合により抗体結合タンパク質ProteinGを結合させ、Anti-CD9抗体を固定化し、さらに抗CD9抗体を介してエクソソームを固定化した（鋳型導入工程）。その後、BAMを用いてエクソソーム膜にメタクリル基修飾を施し（表面修飾工程）、表面開始制御／リビングラジカル重合によりポリマー薄膜を合成した（重合工程）。最後にエクソソームを除去し（除去工程）、検出対象の分析用センサ作製用基材を得た。

１．mixed SAMsの作製（分子膜形成工程）
　濃硫酸及び30w/v%過酸化水素水を3:1（体積基準）で混合し、ピラニア溶液を作製した。金薄膜蒸着ガラス基板（ＳＰＲ測定に供する場合はGE Healthcare社のSIA Kit Auを用い、蛍光測定に供する場合はジャスコエンジニアリング社の金蒸着ミラーを用いた。）をピラニア溶液に室温で15分間浸漬させ有機残滓を除去した。基板を純水で洗浄後、0.5 mM Amino-EG6-undecanthiol hydrochloride（同仁化学研究所）、0.5mM Bis [2-(2-bromoisobutyryloxy) undecyl] disulfide（Sigma-Aldrich）のEtOH溶液に基板を浸漬させ、25℃で24時間静置した。

２．Protein G及びAnti-CD9抗体を介したエクソソームの固定化（鋳型導入工程）
　20 mM Isothiocyanobenzyl-NTA（同仁化学研究所）DMSO溶液80 μLを基板に滴下し、25℃で2時間静置した。基板をDMSO及び純水で洗浄後、4 mM NiCl₂水溶液100 μLを基板に滴下し、室温で15分間静置した。基板を純水で洗浄後、100 μM Recombinant His-tagged Protein G（Bio Vision）PBS(10 mM posphate, 140 mM NaCl, pH7.4)溶液100 μLを基板に滴下して、25℃で30分間静置した。基板をPBSで洗浄後、0.3 μM Anti-CD9(Human)mAb（MBLライフサイエンス）PBS(10 mM posphate, 140 mM NaCl, pH7.4)溶液100 μLを基板に滴下して、25℃で30分間静置した。これによって、Protein G及びAnti-CD9抗体を固定化した。なお、Protein G及びAnti-CD9抗体が固定化されたことは、表面プラズモン共鳴分析（測定条件は、sample 1：100 μM Protein G、sample 2：0.3 μM Anti-CD9、flow rate:30 μL/min、injection volume：30 μL、running buffer：PBS (10 mM posphate,140 mM NaCl, pH7.4)、temperature：25℃）を用い、ＳＰＲシグナル（応答ユニットRU）の増大（ΔRuは、Protein Gで4500、Anti-CD9で5919であった。）により確認した。表面プラズモン共鳴分析には、表面プラズモン共鳴分子間相互作用解析装置Biacore Q（GE Healthecare）を用いた（以下、ＳＰＲ分析を行う場合において同様）。

　さらに、基板をPBSで洗浄後、20 μg/mL エクソソーム（Exosomes from PC3 cell, HansaBioMed）PBS(10 mM posphate, 140 mM NaCl, pH7.4)溶液100 μLを基板に滴下し、25℃で30分間静置した。これによって、エクソソームを固定化した。なお、エクソソームが固定化されたことは、Anti-CD9抗体を固定化していないことを除いて同じ基板を別途作製し、両者で、ＳＰＲ（測定条件は、sample：exosome、concentration：25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000 ng/mL、flow rate：10 μL/min、injection volume：30 μL、running buffer：PBS (10 mM posphate,140 mM NaCl, pH7.4)、temperature：25℃）を用いたエクソソームの結合挙動比較において、Anti-CD9抗体を固定化した基板の方でエクソソームの吸着量が多いことを確認することにより行った。

３．エクソソームへのメタクリル基修飾（表面修飾工程）
３－１．アンカー物質BAM-SH（図５中アンカー物質４１に相当）の合成
　BAM（Biocompatible Anchor for cell Membrane(Mw=2000)；SUNBRIGHT OE-020CS、油化産業株式会社）10.3 mg (5.65 μmol)及び2-Aminoethanethiol hydrochloride（東京化成工業）31.9 mg (280 μmol, 49.7 eq)を、PB(10 mM posphate, pH7.0) 50 μLに溶解させて25°Cで4時間反応させ、アンカー物質BAM-SHを得た。ここでpH7.0の緩衝液を用いたのは、BAMのNHS基の加水分解速度を下げてアミノ基との反応性を上げるためである。

３－２．2-(2-Pyridyl)dithioethyl methacrylate（図５中分子３４に相当）の合成
　2,2-Dipyridyl disulfide (1.545 g, 7.01 mmol)をmethanol (15 mL)に溶解させ、acetic acid 180 μL を加えて攪拌した。methanolに溶解させた2-Mercaptoethanol (600 μL, 8.45 mmol)を室温で少量ずつ加え、一晩反応させた。シリカゲルクロマトグラフィー(EtOAc:hexane = 50:50(体積基準))によりRf=0.33のフラクションを回収して減圧留去することで，うすい黄色で透明な油状の精製物（2-hydroxyethyl 2-pyridyl disulfide）を得た。

　2-hydroxyethyl 2-pyridyl disulfide (1.028 g, 5.49 mmol)、Methacrylic Acid (0.70 mL, 8.23 mmol, 1.5 eq)、WSC-HCl(1.5825 g, 8.23 mmol, 1.5 eq)、及びDIEA(0.956 mL8.23 mmol, 1.5 eq)を適量の methanol に溶解させ、室温で攪拌して３日反応させた。飽和食塩水及び純水で洗浄後、回収した有機相をNa₂SO₄で脱水した。溶媒除去後，シリカゲルクロマトグラフィー(EtOAc : hexane = 20:80(体積基準))によりRf=0.37のフラクションを回収して減圧留去することで，褐色で透明な油状の精製物（2-(2-Pyridyl)dithioethyl methacrylate）を得た。（¹H-NMR (CDCl₃, 300 MHz), δ (ppm): 8.48 (m, 1H, aromatic proton ortho-N), 7.60-7.71 (m, 2H, 9 aromatic proton meta-N and para-N), 7.11 (m, 1H, aromatic proton, orthodisulfide linkage), 6.22 (d, 1H, vinylic proton, cis-ester), 5.59(d, 1H, vinylic proton, trans-ester) 4.41 (t, 2H, -S-S-CH₂CH₂O-), 3.12 (t, 2H, -S-S-CH₂CH₂O-), 1.92(s, 3H, methyl proton of the methacryloyl group)）

　BAM-SHをPBで希釈して100 μM BAM-SHの PB(10 mM posphate, pH7.0)溶液とし、エクソソーム固定化基板を浸漬させて25℃で1時間静置し、基板をPBS(10 mM posphate, 140 mM NaCl, pH7.4)で洗浄した。その後、2-(2-Pyridyl)dithioethylmethacrylateを50 μLのDMSOで溶解させた後にPBS(10 mM posphate, 140 mM NaCl, pH7.4)で100 μMに希釈し（DMSOは全体の0.9 wt%程度）、100 μM 2-(2-Pyridyl)dithioethylmethacrylateのPBS(pH 7.4)溶液を調製した。調製した溶液基板を浸して25℃で一晩反応させた。

４． MIP薄膜の作製（重合工程）
　下記表に示したレシピ（Recipe of SI-ATRP for synthesis of Exosome-MIP）に従い、表面開始原子移動ラジカル重合(SI-ATRP；Surface-initiated atom transfer radical polymerization)によってポリマー薄膜を合成した。

　25 mLのシュレンクフラスコに、２－メタクリロイロキシエチルホスホリルコリン（MPC）、2,2'-Bipyridyl（ナカライテスク）、CuBr₂（ナカライテスク）及びPBS (10 mM posphate,140 NaCl, pH7.4)からなる溶液を調製し、脱気を行った後に基板を浸漬させた。再度脱気を行った後、L-Ascorbic Acid（L(+)-Ascorbic Acid、ナカライテスク）をシリンジで注入し、重合を開始した。重合条件は、40℃のウォーターバス中で１時間とし、重合反応の間、低速で振とうし続けた。

５．エクソソーム及び抗体の除去（除去工程）
　1 M EDTA-4Na 水溶液に基板を15分間浸してCu²⁺を取り除いた。50 mM TCEP水溶液に基板を25℃で3時間浸漬させ、ジスルフィド結合を還元した。純水で基板を洗浄後、0.5wt% SDSを含む50 mM酢酸バッファー(pH 4.0)に基板を浸して低速で1時間振とうし、ポリマー薄膜からProtein G、Anti-CD9及びエクソソームを切り出した。なお、エクソソームが実際に切り出されたことは、ＳＰＲ（測定条件は、sample1：50 mM TCEP水溶液 x3、sample2：酢酸buffer(10 mM, pH4.0), 0.5wt% SDS solutions x2、flow rate：30 μL/min、injection volume：30 μL、running buffer：PBS (10 mM posphate,140 mM NaCl, pH7.4)、temperature：25℃）を用い、ＳＰＲシグナル（応答ユニットRu）の減少により確認した。これによって、検出対象の分析用センサ作製用基材（MIP基板）が得られた。

［実施例２：エクソソームを鋳型に用いた検出対象の分析用センサ］
　実施例１で得られた分析用センサ作製用基材（MIP基板）に、4 mM NiCl₂水溶液100μL、100μM Protein G PBS(10 mM posphate,140 mM NaCl, pH7.4)溶液100μL、及び抗CD9抗体の0.3μM PBS(10 mM posphate, 140 mM NaCl, pH7.4)溶液100μLを滴下し、抗CD9抗体を固定した。さらに、500 μM POLARIC-MLI（五稜化薬）DMSO溶液100μLを基板に滴下して25℃で1時間静置し、その後洗浄した。これによって、検出対象の分析用センサが得られた。

［実施例３：検出対象の分析用センサを用いた蛍光分析によるエクソソーム検出］
　実施例２で得られた分析用センサを用い、エクソソームの結合挙動を観察した。具体的には、作製した基板に濃度が異なるエクソソーム（推定平均分子量：1.92×10⁸Da）溶液を10μLずつ滴下し、18x18mmのカバーガラスをかぶせ、室温で10分間静置した。静置は遮光下で行った。反応後の基板について蛍光強度の測定を行った。蛍光強度の測定には、蛍光顕微鏡（倒立型リサーチ顕微鏡IX 73(OLYMPUS)）を用い、測定条件は、濃度：2.5, 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000 ng/mL、フィルター：BW、対物レンズ：x10、露光時間：0.50 sec、光量：100%とし、測定値は5点の平均値とした。分光学ソフトウェアとしては、Andor SOLISを用いた。エクソソーム濃度に対する蛍光強度変化（(Io-I)/Io）を測定してグラフを作成し、それをカーブフィッティング（回帰分析）して結合定数を算出した結果を図１３に示す。グラフの作成とカーブフィッティングにはグラフ作製ソフトDeltaGraphを用い、結合定数は下記式で算出式した。その結果、結合定数Kaは1.50×10¹⁴[M^-1]と算出された。

［参考例：検出対象の分析用センサを用いたＳＰＲによるエクソソーム検出］
　実施例２で得られた分析用センサを用い、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析により結合定数を求めた。ＳＰＲ測定条件は、sample：Exosome、concentration：25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000 ng/mL、flow rate：10 μL/min、injection volume：30 μL、running buffer：PBS (10 mM posphate, 140 mM NaCl, pH7.4)、temperature：25℃とした。エクソソーム濃度に対する、ＳＰＲシグナル（応答ユニットRU）を示すグラフから、実施例３と同様にしてカーブフィッティングを行い、結合定数を算出した結果を図１４に示す。結果、結合定数Kaは2.03×10¹²[M^-1]と算出された。上述の実施例３よりも大きい結合定数が算出されたのは、上記実施例３がセンサ場となる凹部のみにおける蛍光変化を特異的に検出しており、センサ場以外で非特異吸着があっても当該非特異吸着が検出結果に影響しなかったことに対し、本参考例ではＳＰＲ分析の原理上、センサ場だけでなくセンサ場以外における非特異吸着をも検出したことによる。このように、本発明によると特異的に認識された対象のみを検出することができる。

［実施例５：検出対象の分析用センサ作成の再現性］
　実施例２と同じ方法によって検出対象の分析用センサを３枚作成した。作成した３枚の検出対象の分析用センサに対し、実施例３と同じ方法によって、濃度が異なるエキソソーム溶液を滴下して反応させ、反応後の蛍光強度の測定を行った。蛍光強度の測定は、分析用センサそれぞれにおいて３点ずつ、合計９点について行った。９点の測定点における蛍光強度変化を図１５に示す。図１５中、横軸はエクソソーム濃度（ng/ml）、縦軸は蛍光強度変化(（I-I₀）/I₀)を示す。図１５に示されるように、分析用センサ間の測定誤差は小さく、センサを再現性よく作成できたことが示された。

［実施例６：検出対象の分析用センサを用いたＦＲＥＴによるエクソソーム検出］
１．エクソソームのローダミン標識
（１）チオール化BAM（BAM-SH）の合成
　BAM (SUNBRIGHT OE-020CS, Mw=2000) 10 mg (5.6 μmol)及び2-aminoethanethiol hydrochloride 32 mg (280μmol, 50 eq)をPBS(pH 7.0) 50μLに溶解させ、25℃で一晩反応させた。
（２）チオール化BAMによるエクソソーム表面のチオール化
　得られたチオール化BAM溶液を10 mM PBS (pH 7.4)で100倍希釈した溶液400μLとエクソソーム溶液2μg/100 μLとを混合し、4℃で3時間反応させた。
（３）チオール反応性ローダミンによるエクソソームのローダミン標識
　得られた反応液について限外ろ過(Amicon Ultra 0.5 ; 100 kDa)を三回行い、回収液27μLに1 mMのチオール反応性ローダミンマレイミド溶液(10 mM PBS pH 7.4)を450μL加え、暗所、4℃で3時間反応させた。
（４）透析によるローダミン標識エクソソームの精製
　孔径１０ｋＤａの透析膜を用いて4℃、24時間透析を行い、ローダミン標識エクソソームを精製した。

２．フルオレセインで標識した検出対象の分析用センサの作製
　500μM POLARIC-MLI（五稜化薬）DMSO溶液100μLを滴下して25℃で1時間静置した代わりに100μMのチオール反応性フルオレセインマレイミド溶液を滴下して室温で３時間静置したことを除き、実施例２と同様にして検出対象の分析用センサを作製した。
３．フルオレセイン標識センサを用いたFRETによるローダミン標識エクソソームの測定
　0, 5, 10, 50, 100, 500 ng/mLのエクソソーム溶液をセンサ上に滴下し、３分反応させ、純水及びPBSで十分に洗浄した。洗浄後、PBSを滴下し、カバーガラスを装着して、以下の測定条件で蛍光強度の測定を行った。
　　測定条件：フィルタ
　　励起：Fluiorescein用フィルタ
　　蛍光：Rhodamine用フィルタ
　　対物レンズ：40倍
　　露光時間： 0.1 sec;

　測定結果を図１６に示す。図１６中、横軸はエクソソームの濃度を示し、縦軸は蛍光強度の変化量（ΔI）を示す。図１６に示すように、フルオレセインの励起波長でローダミンの蛍光が観察された（つまりＦＲＥＴが確認された）。ＦＲＥＴはフルオレセインとローダミンとが互いに近傍に配置されない限り起こらないことから、確かにエクソソームが分析用センサのフルオレセイン標識された凹部に結合したことが示された。

［実施例７：フリーの抗CD9抗体添加によるエクソソームの結合阻害試験］
　本実施例では、エクソソームが分析用センサの凹部に抗体を介して結合することを確かめるため、エクソソームの滴下時にフリー（遊離）の抗体を共存させることによるエクソソームの結合挙動の変化を調べた。

　まず、POLARIC-MLIの代わりにAlexa FluorTM 647を用いたことを除いて、実施例２と同様にして検出対象の分析用センサを作製した。次に、フリーの抗体を共存させない試料として、0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ng/mlのエクソソームのPBS (10 mM phosphate, 140 mM NaCl, pH7.4)溶液を調製し、フリーの抗体を共存させた試料として、20 ng/mlのエクソソームのPBS(10 mM phosphate, 140 mM NaCl, pH7.4)溶液100μlに0.3μM抗CD9抗体のPBS(10 mM phosphate,140 mM NaCl, pH7.4)溶液100μlを加えて4℃で１時間インキュベートし、得られた溶液をPBSで希釈することで、フリーの抗体が共存する0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ng/mlのエクソソームのPBS(10 mM phosphate, 140 mM NaCl, pH7.4) 溶液を調製した。

　フリーの抗体を共存させない試料と、フリーの抗体を共存させた試料それぞれについて、実施例３と同様にして蛍光強度変化の測定を行った。その結果を図１７に示す。図１７に示すように、フリーの抗体が共存する場合は、エクソソームの結合が阻害されることが分かった。エクソソームの結合が結合空間内の抗体を介して起こっていることを強く示唆している。従って、分析用センサの凹部に抗体と蛍光色素とが設けられ、エクソソームの結合情報を読み出せることがわかった。

［実施例８：シリカナノ粒子を鋳型に用いた検出対象の分析用センサ作製用基材］
１．鋳型の合成－チオール基およびヒスチジンタグ(His-tag)を導入したシリカナノ粒子の合成
　FITC標識シリカナノ粒子200μl(200μlあたり表面に-COOH 5 nmolを有するもの、粒子径200nm)をジクロロメタン(DCM)に分散させた（シリカナノ粒子分散液）。エチル(ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド(EDC: 50 nmol, 10 eq)、N-ヒドロキシコハク酸イミド(NHS: 50 nmol, 10 eq)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA: 50 nmol, 10 eq) をdry DCMに溶解させ、シリカナノ粒子分散液と混合した。一晩反応させることでシリカナノ粒子表面をNHSで修飾した。表面修飾したシリカナノ粒子に対して、ヒスチジンが６個ペプチド結合で連結されたHis-tag (末端はリジン残基でありフリーのεアミノ基を有する：0.10μmol, 40eq)及び2-アミノエタンチオール塩酸塩(0.1μmol, 40eq)を加えて、室温で反応させた。反応終了後、遠心分離およびろ過によりチオール基およびHis-tagを導入したシリカナノ粒子（SH・His-tag化シリカナノ粒子）を精製した。

　２．予備実験－Ni-NTAを介したSH・His-tag化シリカナノ粒子の固定と脱離
　実施例１の項目１で得られたmixed SAMsに、20 mM Isothiocyanobenzyl-NTA（同仁化学研究所）DMSO溶液80μLを基板に滴下し、25℃で2時間静置した。基板をDMSO及び純水で洗浄後、4 mM NiCl₂水溶液100μLを基板に滴下し、室温で15分間静置した。基板を純水で洗浄後、10 mM posphate,140 mM NaCl, pH7.4に分散したSH・His-tag化シリカナノ粒子を滴下することにより、SH・His-tag化シリカナノ粒子が固定化された基板を得た。また、比較用に、His-tag修飾を行わなかったシリカナノ粒子の分散液も同様に滴下した基板も得た。これらの基板に対し、シリカナノ粒子の滴下前と滴下１時間後における、シリカナノ粒子に導入されている蛍光分子フルオレセイン（励起480 nm/ 蛍光 510 nm）由来の蛍光強度を測定することにより、シリカナノ粒子の固定化を確認した。また、結合したシリカナノ粒子が脱離するかどうか確かめるため、酸性緩衝液（0.5 wt% SDS 50 mM 酢酸buffer (pH4.0)）で処理し、その後、再び基板表面の蛍光強度を測定した。

　上記表に示すように、His-tag修飾なしのシリカナノ粒子とHis-tag修飾したシリカナノ粒子のうち、His-tag修飾したシリカナノ粒子を基板に滴下した後に蛍光強度が上昇していることから、シリカナノ粒子の固定化が確認された。さらに、His-tag修飾したシリカナノ粒子においては、酸性緩衝液（0.5 wt% SDS 50 mM 酢酸buffer(pH4.0)）で処理した後に蛍光強度が滴下前と同じレベルまで減少したことから、Ni-NTAを介して結合したシリカナノ粒子が、酸性かつ界面活性剤存在下で脱離されたことが分かった。

３．シリカナノ粒子を鋳型に用いた検出対象の分析用センサ作製用基材の作製
　以下のようにして、金薄膜蒸着ガラス基板上にアミノ基及びブロモ基が末端となる混成自己組織化単分子膜(mixed SAMs)を作製し（分子膜形成工程）、アミノ基末端へNTA基を導入し、NTA-Ni錯体を形成した後、キレート結合によりシリカナノ粒子を固定化した（鋳型導入工程）。その後、シリカナノ粒子にメタクリル基修飾を施し（表面修飾工程）、表面開始制御／リビングラジカル重合によりポリマー薄膜を合成した（重合工程）。最後にシリカナノ粒子を除去し（除去工程）、検出対象の分析用センサ作製用基材を得た。

（１）ブロモ基およびアミノ基をもつ混合自己組織化単分子膜形成（分子膜形成工程）
　実施例１の項目１と同様に金薄膜蒸着ガラス基板の有機残滓の除去及び洗浄を行い、0.5 mM amino-EG6-undecanthiol hydrochloride及び0.5mM 2-(2-bromoisobutyryloxy) undecyl thiolのエタノール溶液に基板を浸漬させ、25℃で24時間静置することにより、ブロモ基およびアミノ基をもつ混合自己組織化単分子膜を形成させた。

（２）SH・His-tag化シリカナノ粒子のNi-NTAを介した固定化（鋳型導入工程）
　5 mM isothiocyanobenzyl-nitrilotriacetic acid (ITC-NTA)のDMSO溶液80 μLを基板に滴下し、25℃で2時間静置してアミノ基をNTAで修飾した。基板をDMSO及び純水で洗浄後、4 mM NiCl₂水溶液100 μLを基板に滴下し、室温で15分間静置することで、Ni-NTA錯体を形成した。その後、SH・His-tag化シリカナノ粒子(固形分濃度5.1 mg/ml)含有水溶液100 μlを基板に滴下し、25°Cで1時間静置した。

（３）固定されたSH・His-tag化シリカナノ粒子のメタクリロイル化（表面修飾工程）
　100 μM 2-(2-Pyridyl)dithioethyl methacrylateの PBS (pH 7.4)溶液に基板を浸して一晩静置させることで、ジスルフィド交換反応によってシリカナノ粒子表面のSH基にジスルフィドを介してメタクリロイル基の導入を行った。

（４）MIP薄膜の作製（重合工程）
　重合時間を３時間としたことを除いて、実施例１の項目４と同様にして、基板上にポリマー薄膜を合成した。これによって、基板上に、表１のモノマーと共にシリカナノ粒子のメタクリロイル基も共重合されたポリマー薄膜を得た。重合終了後、1 M エチレンジアミン四酢酸-4Na 水溶液に基板を15分間浸し、ATRPに用いたCu²⁺を取り除いた。

（５）シリカナノ粒子の除去（除去工程）
　50 mM トリス(2-カルボキシエチル)フォスフィン・HCl(TCEP)水溶液に25℃で３時間浸漬させ、ポリマーとシリカナノ粒子とを結合させているジスルフィド結合を還元・切断した。ポリマー側にはフリーのSH基が残るが、このSH基は、SH・His-tag化シリカナノ粒子由来であることから、ポリマー薄膜のうち鋳型に対応した凹部以外の部分には存在せず、鋳型に対応した凹部内のみに存在する。前述のEDTA-4Na処理で、NI-NTAのニッケルも除去されてHis-tagがこの時点でフリーとなる可能性が高いが、念のため以下の操作も行った。純水で洗浄後、0.5 wt% SDSを含む50 mM酢酸バッファー (pH 4.0)に基板を浸して、Ni-NTA及びHis-tagを介して結合していたシリカナノ粒子をポリマー薄膜から洗い出した。

［実施例９：シリカナノ粒子を鋳型に用いた検出対象の分析用センサ］
　実施例８で得られた分析用センサ作製用基材（MIP基板）に再度Ni-NTAを形成させるため、4 mM NiCl₂水溶液でMIP基板を処理した。その後、PBSに溶解した100 μM His-tag Protein Gを基板に添加することで、His-tagを介して抗体を結合可能なProtein Gを固定化した。最後に、PBSに溶解した0.3 μM 抗CD9抗体を基板に添加し、抗CD9抗体をProtein Gを介して固定化した。Protein Gは、抗体のFc領域に結合することから、固定化された抗体の配向は一様となる。

　さらに、蛍光分子としてチオール反応性のAlexa Fluor^(R) 647 C₂ Maleimide を用いて分析用センサの凹部への蛍光分子の選択的導入を行った。導入前の蛍光強度は113±0.6 (n-3)であったのに対し、導入後は151±2.1 (n-3)であったことから、蛍光の導入が確認された。これによって、検出対象の分析用センサが得られた。

［実施例１０：検出対象の分析用センサを用いた蛍光分析によるエクソソーム検出］
　実施例９で得られた分析用センサ（抗体あり）を用い、エクソソームの結合挙動を観察した。また、比較用として、当該分析用センサの抗CD9抗体が固定されていない基板（抗体なし）についても同様にエクソソームの結合挙動を観察した。試料としては、エクソソームのPBS (10 mM posphate,140 mM NaCl, pH7.4)溶液（濃度はそれぞれ、0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ng/mL）を用い、エクソソームの蛍光検出は顕微鏡下で行った。蛍光顕微鏡測定条件は以下の通りである。
　　　フィルタ：Cy5
　　　対物レンズ：×5
　　　露光時間：0.1秒
　　　光源：水銀ランプ

　結果を図１８に示す。図１８中、横軸はエクソソームの濃度を示し、縦軸は蛍光強度変化を示す。図１８の結果に基づき吸着等温線から算出された解離定数は、K_d=3.8x10^-15 [M]であった。エクソソームの推定M_wが2.33x10⁸Daであることから、エクソソームを鋳型にした場合に比べても遜色ない優れた感度でエクソソームを検出することができた。

［実施例１１：分析用センサ表面のＳＴＥＤ超解像イメージ像］
　蛍光分子として（下記式に示すP=O-Rhodolを用いたことを除いて、実施例９と同様にして分析用センサを作製した。得られた分析用センサを、誘導放出制御（ＳＴＥＤ）顕微鏡（Leica社製SP8-STED3X）を用いて観察した。得られたＳＴＥＤ超解像イメージ像を図１９に示す。図１９に示すように、約200 nmサイズのドット状の蛍光が観察され、当該蛍光のサイズは、鋳型に用いたシリカナノ粒子と同等であり、鋳型効果により形成された凹部であることが確認できた。また、当該凹部以外にバックグラウンド蛍光がほとんど観察されなかったことから、蛍光レポーター分子が当該凹部に選択的に導入されたことも示された。

［実施例１２：涙液中のエクソソームの測定］
　シルマー試験紙を用いて涙液を採取した後、試験紙を、500 μlの140 mMNaClを含む10 mM リン酸バッファー（PBS）に4℃,６時間浸漬し、涙に含まれるエクソソームを涙液試料として回収した。涙液試料を、実施例９の分析用センサを用いた蛍光測定に供することで、涙液中のエクソソームを測定した。比較用に、コントロールとして、実施例９の検出対象の分析用センサを用いたPBSの測定、及び、分析用センサの抗体への涙液エクソソームの結合性を確認するため、実施例９の分析用センサの抗体が固定されていない基板を用いた涙液試料の測定も行った。

　結果を図２０に示す。図２０において、「ＰＢＳ」は、実施例９の分析用センサにＰＢＳを供した結果、「涙（抗体あり）」は、実施例９の分析用センサに涙液試料を供した結果、及び、「涙（抗体なし）」は、実施例９の分析用センサの抗体が固定されていない基板に涙液試料を供した結果を示す。図２０に示されるように、抗体が固定されている実施例９の分析用センサに涙液試料を供した場合に蛍光消光の度合いが最も大きいことから、涙液中のエクソソームが測定されたことが示された。

　本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明はそれらのみに限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な実施形態が他になされる。

１０…分析用センサ作製用基材
２０…基材
２１…分子膜
２２…抗体物質結合用基（可逆的結合性基）
２２ａ…結合性官能基
２２ｂ…第１の可逆的連結基
２２ｃ…抗体物質結合性基
２３ａ…重合開始性基
２４…抗体物質
２５…抗体物質結合用基と結合することで第１の可逆的連結基の形成が可能な基
３０…ポリマー膜
３１…凹部
３２…シグナル物質結合用基（可逆的結合性基）
３２ｂ…第２の可逆的連結基
３３…重合性官能基
３５…重合性モノマー
４０…鋳型
４１…アンカー物質
４２…可逆的結合性基（シグナル物質結合用基と結合することで第２の可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基）
４３…アンカー基
５０…分析用センサ
５２…検出対象に特異的な抗体物質
５３…シグナル物質
６０…検出対象

Claims

　基材と、前記基材の表面上に設けられたポリマー膜と、を含み、
　前記ポリマー膜が、検出対象を受け入れる凹部を有し、
　前記凹部内に、抗体物質結合用基とシグナル物質結合用基とを有する、検出対象の分析用センサ作製用基材。
　前記ポリマー膜が、前記検出対象又は前記検出対象よりサイズが大きい対象を鋳型とする分子インプリントポリマーで構成され、前記凹部が前記鋳型の表面形状の一部に対応する、請求項１に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
　前記抗体物質結合用基がキレート結合性基である、請求項１又は２に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
　前記シグナル物質結合用基がチオール基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材。
　請求項１から４のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材と、
　前記抗体物質結合用基に結合した、前記検出対象に特異的な抗体物質と、
　前記シグナル物質結合用基に結合したシグナル物質と、
を含む、検出対象の分析用センサ。
　前記検出対象が膜構造を有する微小粒体である、請求項５に記載の検出対象の分析用センサ。
　前記膜構造を有する微小粒体がエクソソームである、請求項６に記載の検出対象の分析用センサ。
　前記検出対象に特異的な抗体物質が、前記膜構造を有する微小粒体の表面に発現している特異的抗原に対する特異的結合能を有する、請求項５から７のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ。
　請求項５から８のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサに、検出対象を含む試料を接触させ、前記抗体物質に前記検出対象を結合する工程と、
　前記シグナル物質に由来するシグナルの変化を検出する工程と、
を含む、検出対象の分析法。
　基材に、結合性官能基と重合開始性基とを表面に有する分子膜を形成する分子膜形成工程と、
　前記結合性官能基に対し、第１の可逆的連結基を介して、人工粒子を鋳型として導入する鋳型導入工程と、
　前記鋳型の表面を、第２の可逆的連結基を介して重合性官能基で修飾する表面修飾工程と、
　重合性モノマーを加え、前記重合性モノマーを基質とし、前記重合開始性基を重合性開始剤として、前記鋳型の前記表面の一部に対する分子インプリントポリマーを合成することで前記基材表面にポリマー膜を形成する重合工程と、
　前記第１の可逆的連結基及び第２の可逆的連結基を開裂させてそれぞれ抗体物質結合用基及びシグナル物質結合用基へ変換するとともに前記鋳型を除去する除去工程と、
を含む、検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
　前記人工粒子が、表面に、前記抗体物質結合用基と結合することで前記第１の可逆的連結基の形成が可能な基と、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記第２の可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基とを有する、請求項１０に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
　前記人工粒子がシリカ粒子である、請求項１０又は１１に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
　前記抗体物質結合用基がキレート結合性基であり、前記抗体物質結合用基と結合することで前記第１の可逆的連結基の形成が可能な基がヒスチジンタグである、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
　前記シグナル物質結合用基がチオール基であり、前記シグナル物質結合用基と結合することで前記第２の可逆的連結基の形成が可能な可逆的結合基がチオール基である、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法。
　請求項１０から１４のいずれか１項に記載の検出対象の分析用センサ作製用基材の製造方法を行う工程と、
　前記抗体物質結合用基に、検出対象に特異的な抗体物質を結合する工程と、
　前記シグナル物質結合用基にシグナル物質を結合する工程と、
を含む、検出対象の分析用センサの製造方法。