CN112898624A - 用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物的制备和应用方法。将替代模板，交联剂、功能单体和引发剂溶于致孔溶剂中，制备成预聚合溶液，在50‑70℃下搅拌聚合反应24‑48h。聚合后得到聚合物经研磨、筛分后，得到粒径为10‑50μm的聚合物颗粒。得到的聚合物颗粒使用刻蚀剂或高温烧蚀的方法，去除替代模板，即得到替代模板印迹聚合物。该替代模板印迹聚合物对外泌体具有很强的特异选择性和富集能力。该材料在保证富集效果的同时，能够降低初始样品需求量，可用于复杂体系中外泌体的分离、富集和纯化。

Description

用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物及制备和应用，属于功能性生物材料和生物样品前处理领域。
背景技术
外泌体是一种细胞内源性的多囊泡体，可通过细胞内吞泡膜向内凹陷形成多囊泡内涵体，内涵体与细胞膜融合后释放其中的小囊泡形成，外泌体具有特征性脂质双层，其平均厚度为5nm，直径在40-100nm[11]。广泛存在于各种体液和组织中，携带脂质、蛋白和核酸等重要功能性成分[12]。自1983年首次在网织红细胞中发现外泌体以来，许多研究表明，外泌体是新形式的细胞间信息传递系统，其与细胞的生理状态、功能以及疾病的发生发展密切相关[5,13]。实现对外泌体的捕获与检测具有十分重要的意义。然而体液和细胞培养液中外泌体含量低，存在大量的干扰蛋白，为后续外泌体的生物学分析带来了巨大的挑战。
高效和高选择性的外泌体富集技术是开展外泌体研究的前提。目前，利用外泌体的物理化学和生物化学性质已经开发了许多用于分离尿液、血液等体液和细胞培养液中的外泌体技术。其中，超速离心技术是目前使用最广、所得外泌体纯度较高的分离和纯化方法。然而该技术需要很大的初始样本量，且外泌体的回收率较低，无法用于微量和珍贵样品的外泌体分离和分析。因此，研究人员开发出了基于聚乙二醇(PEG)沉淀原理的外泌体分离方法。与超速离心相比，PEG沉淀技术能够处理大量样本，对初始样品量的需求少，回收率高。但是该技术存在其他非外泌体污染物的共沉淀，例如蛋白质和聚合物材料，因此其纯度仍有待提高。其他外泌体分离技术如尺寸排阻、透析、免疫磁珠和微流控等往往工艺复杂，通量低、样本需求量大，纯度仍没有明显提高。因此，开发一种新型的具有初始样品需求量小的高纯度外泌体富集新方法十分必要。
作为一种新型的人工抗体制备技术，分子印迹技术通过人工设计和合成具有特定结构和功能的分子识别材料，融合了化学识别和形状匹配两种作用，能够实现复杂样品中目标分子的高特异性识别。以外泌体为模板制备的外泌体印迹材料有望用于外泌体的分离、富集和纯化。但是，目前较纯的外泌体难以获得且脆弱，无法直接用作模板，因此目前还未有直接将外泌体用作模板制备外泌体印迹材料的相关报道。
ζ-电位分析结果表明，外泌体表面具有电负性，能够与带正电荷的分子发生相互作用。另外，由于外泌体尺寸介于40-100nm之间，相对于其他干扰蛋白，具有独特的尺寸分布范围，因此结合静电原理和空间结构效应的协同作用有望成为外泌体富集的新方法。因此，基于外泌体的表面带电性和特殊的尺寸，使用与外泌体尺寸分布相似、表面电性互补的纳米颗粒作为替代模板，制备得到一种替代模板印迹聚合物，从而实现复杂样品中外泌体的分离、富集和纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种对食品、血液、尿液、脑脊液、精液、组织液、淋巴液、唾液、乳汁或细胞培养液中的外泌体具有特异性识别能力的替代模板印迹材料的制备和应用方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物，可按以下步骤制备获得：
(1)将粒径分布在40-100nm的替代模板超声分散于致孔剂中制备成替代模板分散液，替代模板与致孔剂的质量比为0.5-2:0.5-5，其中替代模板为二氧化硅纳米颗粒或聚苯乙烯纳米颗粒、聚乳酸纳米颗粒、聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒中的一种或二种以上，致孔剂为水、二甲基亚砜、乙腈、甲苯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃中的一种或二种以上；
(2)将功能单体和交联剂溶解到含引发剂的致孔剂溶液中，与替代模板分散液混合均匀，制备成预聚合溶液。其中，功能单体为丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、2-(二乙胺基)丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵中的一种或二种以上或氨丙基三乙氧基硅烷、氨丙基三甲氧基硅烷中的一种或二种以上，交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、二乙烯基苯中的一种或二种以上，引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异丁基脒盐酸盐、过硫酸铵和四甲基乙二胺体系中的一种或二种以上；替代模板分散液：功能单体：交联剂：引发剂的质量比为0.05-0.5:0.01-1.5:0.1-10:0.01-1.5；
(3)将预聚合溶液室温超声5-60min，预聚合溶液中通氮气5-30min除氧后，在50-70℃下搅拌聚合反应12-48h，得到块状聚合物；
(4)将块状聚合物粉碎、研磨、筛分，得到粒度在10-50μm的粉末状聚合物；
(5)采用刻蚀剂或高温烧蚀的方法，刻蚀一定时间后，除去替代模板，用水洗涤三次后，50-70℃真空干燥6-48h，即得到用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物。刻蚀剂为氢氟酸(质量浓度≥40％)，搅拌，刻蚀时间为3-72h，高温烧蚀的温度为300-1000℃，时间为3-24h。
所述用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物作为基质分散固相萃取或固相萃取柱的填料。
所述替代模板印迹聚合物用于特异性识别食品或生物样品中的外泌体。
其中，制备用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物的最佳条件为：在上述操作步骤(1)中的替代模板为粒径分布在40-100nm的二氧化硅纳米颗粒，功能单体为丙烯酰胺和2-(二乙胺基)丙烯酸乙酯，交联剂为N,N-亚甲基双丙烯酰胺，引发剂为偶氮二异丁基脒盐酸盐，按质量比为1：4：100：6混合，致孔剂为水。
本发明具有如下优点：
(1)本发明利用替代模板印迹技术制备得到了能用于特异性识别外泌体的印迹聚合物。利用印迹材料表面形成的与外泌体发生多重作用的印迹位点，提高了外泌体识别和富集的纯度与灵敏度，降低了富集外泌体时非特异性作用的干扰和初始样品需求量。
(2)本发明中的印迹材料对目标外泌体的识别是多重作用，包括空间构型和氢键作用、静电作用以及范德华作用，对目标外泌体表现更强出的互补亲和能力。
(3)本发明中所用的基质材料和预聚合体系具有良好的稳定性，利于重复使用。
(4)本发明中材料的制备流程简单，易于操作。相较于其他外泌体识别与富集方法，采用该材料能简化识别过程，提高识别效率，应用范围更广。
附图说明
图1；二氧化硅替代模板的粒径分布
图2：以二氧化硅纳米颗粒为替代模板的印迹聚合物(EXO-MIP1)
具体实施方式
实施例1
以二氧化硅纳米颗粒为替代模板的印迹聚合物(EXO-MIP1)的制备
将50mL甲醇和7.74mL水混匀后，加入5mL的质量浓度28％的氨水，然后快速加入1.90mL的硅酸四乙酯，40℃搅拌反应30min。采用动态光散射(DLS)测定其粒径分布(图1)，然后6000g离心，得到二氧化硅纳米颗粒，用水洗涤三次后，分散于1mL水中备用。
将0.50g的甲叉双丙烯酰胺、0.01g的丙烯酰胺、0.01g 2-(二乙胺基)丙烯酸乙酯和0.10g二氧化硅纳米颗粒分散液加入到6mL水中，溶解混匀后，加入0.03g的偶氮二异丁基脒盐酸盐引发聚合，60℃反应24h后，60℃真空干燥，研磨，过筛，得到粒径为10-50μm的聚合物，采用氢氟酸搅拌去除硅球模板，搅拌24h，水洗三次后，60℃真空干燥24h，得到替代模板印迹聚合物(EXO-MIP1)(图2)。
实施例2
以聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒为替代模板的印迹聚合物(EXO-MIP2)的制备
将0.02g的氨丙基三乙氧基硅烷、1g的硅酸四乙酯和200μL浓度为2g/mL的粒径分布为40-100nm的聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒水分散液加入到10mL水中，溶解混匀后，加入0.04g的28％的氨水，60℃反应24h后，70℃干燥，研磨，过筛，得到粒径为10-50μm的聚合物，800℃高温刻蚀，去除聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒，得到替代模板印迹聚合物(EXO-MIP2)。
实施例3
以聚苯乙烯纳米颗粒为替代模板的印迹聚合物(EXO-MIP3)的制备
将0.04g的氨丙基三乙氧基硅烷、1g的硅酸四乙酯和100μL浓度为1g/mL的粒径分布为40-100nm的聚苯乙烯纳米颗粒水分散液加入到8mL水中，溶解混匀后，加入0.16g的28％的氨水，50℃反应48h后，50℃干燥，研磨，过筛，得到粒径为10-50μm的聚合物，700℃高温刻蚀12h，去除聚苯乙烯纳米颗粒，得到替代模板印迹聚合物(EXO-MIP3)。
实施例4
以二氧化硅纳米颗粒为替代模板的印迹聚合物(EXO-MIP4)的制备
将0.50g的N-异丙基丙烯酰胺、0.50g甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、5g乙二醇二甲基丙烯酸酯和200μL浓度为2g/mL的粒径分布为40-100nm的二氧化硅纳米颗粒水分散液加入到15mL乙腈中，溶解混匀后，加入1g偶氮二异丁腈，70℃搅拌聚合反应12h后，65℃干燥，研磨，过筛，得到粒径为10-50μm的聚合物，采用氢氟酸搅拌去除硅球模板，搅拌48h，水洗三次后，65℃真空干燥36h，得到替代模板印迹聚合物(EXO-MIP4)。
实施例5
替代模板印迹聚合物(EXO-MIP1)用于捕获尿液和细胞培养液中的外泌体
先将萃取筛板加入到200μL枪头(高度为2-3cm)中，然后将EXO-MIP1分散在甲醇中后加入到枪头中，离心(10000g)10min，重复直至加入EXO-MIP1高度为1cm左右。然后加入200μL水，离心(10000g)10min，重复三次，得到外泌体纯化印迹柱。
取健康人尿液(1mL)或经SILAC标记细胞培养液(3mL)，加入到外泌体纯化印迹柱中，离心(16000g)20min。然后加入50μL的质量分数为4％的十二烷基磺酸钠溶液，将EXO-MIP1填料取出，用20μL的质量分数4％的十二烷基磺酸钠溶液将柱子洗涤三次后与填料合并超声2min后，16000g离心10min，取上清备用，并采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。将获得的蛋白质样品进行常规的蛋白质组学分析与鉴定。鉴定结果表明，在未经处理的尿液中鉴定到的外泌体标志蛋白质覆盖数据库中64.22％的排名前100的常见外泌体蛋白。经过EXO-MIP1富集后，该覆盖度提高至97.25％。经EXO-MIP1富集后，被SILAC标记的蛋白在鉴定到的总蛋白质数目中占比大于90％，说明EXO-MIP1在富集外泌体过程中具有高选择性，且能够降低样品初始用量。

Claims (5)

1.用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物，其特征在于：可按如下步骤制备获得：
(1)将粒径分布在40-100nm的替代模板超声分散于致孔剂中制备成替代模板分散液，替代模板与致孔剂的质量比为0.5-2:0.5-5，其中替代模板为二氧化硅纳米颗粒、聚苯乙烯纳米颗粒、聚乳酸纳米颗粒、聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒中的一种或二种以上，致孔剂为水、二甲基亚砜、乙腈、甲苯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃中的一种或二种以上；
(2)将功能单体和交联剂溶解到含引发剂的致孔剂溶液中，与步骤(1)中的替代模板分散液混合均匀，制备成预聚合溶液；
其中，功能单体为丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、2-(二乙胺基)丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵中的一种或二种以上或氨丙基三乙氧基硅烷、氨丙基三甲氧基硅烷中的一种或二种以上；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、二乙烯基苯中的一种或二种以上；引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异丁基脒盐酸盐、过硫酸铵和四甲基乙二胺体系中的一种或二种以上；致孔剂为水、二甲基亚砜、乙腈、甲苯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃中的一种或二种以上；
(3)将预聚合溶液室温超声5-60min，预聚合溶液中通氮气5-30min除氧后，在50-70℃下搅拌聚合反应12-48h，得到块状聚合物；
(4)将块状聚合物粉碎、研磨、筛分，得到粒度在10-50μm的粉末状聚合物；
(5)采用刻蚀剂或高温烧蚀的方法，刻蚀或烧蚀除去替代模板，用水洗涤后，50-70℃真空干燥6-48h，即得到用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物。
2.如权利要求1所述的用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物，其特征在于：
步骤(2)中，替代模板分散液：功能单体：交联剂：引发剂的质量比为0.05-0.5:0.01-1.5:0.1-10:0.01-1.5，优选地，比例为0.1:0.02:0.5:0.03；
步骤(5)中，刻蚀剂为氢氟酸(质量浓度≥40％)，搅拌，刻蚀时间为3-72h；高温烧蚀的温度为300-1000℃优选地，温度为800℃，时间为3-24h。
3.一种权利要求1或2所述的用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物作为分离材料在富集纯化液体样品中外泌体的应用。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物作为基质分散固相萃取或固相萃取柱的填料用于富集纯化食品、血液、尿液、脑脊液、精液、组织液、淋巴液、唾液、乳汁或细胞培养液中的外泌体。
5.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：所述用于特异性识别外泌体的替代模板印迹聚合物具有较高的选择性，将其应用于样品前处理可以降低初始样品需求量。
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