WO2015045666A1 - 流体デバイス、エキソソームの分析方法、生体分子分析方法及び生体分子検出方法 - Google Patents

流体デバイス、エキソソームの分析方法、生体分子分析方法及び生体分子検出方法 Download PDF

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exosome
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substrate
inlet
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一木　隆範
雅 小林
綾子 林
章一 土屋
貴則 赤木
太郎 上野
高志 船津
宮本　健司
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国立大学法人東京大学
株式会社ニコン
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a fluid device, an exosome analysis method, a biomolecule analysis method, and a biomolecule detection method.
  • Exosomes are small lipid vesicles with a diameter of 30 to 100 nm.
  • various cells such as tumor cells, dendritic cells, T cells, B cells, blood, urine, saliva, etc. Secreted into body fluids.
  • Abnormal cells such as cancer cells express specific proteins, nucleic acids, microRNAs and the like inside the cell membrane.
  • the exosome secreted into the body fluid also expresses microRNA derived from the secretory cell. Therefore, it is expected to establish a technique capable of investigating in vivo abnormalities by analyzing biomolecules present in the exosome membrane in body fluids without performing a biopsy test.
  • the biopsy test refers to a clinical test for examining a disease diagnosis or the like by collecting tissue at a lesion site and observing the lesion site with a microscope.
  • a cancer cell-derived exosome comprising microRNA (hereinafter also referred to as miRNA) is isolated from a biological sample, and the expression level of a predetermined miRNA in the cancer cell-derived exosome is determined.
  • miRNA microRNA
  • Patent Document 1 describes each step in which a researcher isolates an exosome, purifies miRNA from the exosome, and uses the miRNA for analysis. There is no disclosure of any technology that can analyze the exosome contents in the flow, and there is room for improvement.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and by introducing a sample into a device, the exosome contents can be analyzed in a series of flows, a fluid device, an exosome analysis method, a biomolecule analysis method, and a biomolecule
  • An object is to provide a detection method.
  • One embodiment of the present invention provides the following (1) to (5).
  • the fluidic device in one embodiment of the present invention is: A fluid device for detecting a biomolecule contained in an exosome in a sample, An exosome purification unit having a layer modified with a compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain; A biomolecule purification unit; A biomolecule detection unit; A first flow path connecting the exosome purification unit and the biomolecule purification unit; A second flow path connecting the biomolecule purification unit and the biomolecule detection unit; It is provided with.
  • the fluidic device in one embodiment of the present invention is: A fluid device for purifying a biomolecule contained in an exosome in a sample, An inlet for introducing a sample and an inlet for introducing an exosome disruption solution; An exosome fixing part having a layer modified with a compound having the hydrophobic chain and the hydrophilic chain; It is provided with.
  • the method for analyzing exosomes in one embodiment of the present invention comprises a step of purifying and crushing exosomes on an exosome purification unit having a layer modified with a compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain.
  • the biomolecule analysis method in one embodiment of the present invention comprises: (A) An exosome-containing sample is brought into contact with a substrate modified with a compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain in the fluid device, and the exosome is bound to the compound having the hydrophobic chain and the hydrophilic chain on the substrate.
  • the biomolecule detection method in one embodiment of the present invention comprises: (A) A sample containing a structure surrounded by a lipid bilayer is brought into contact with a substrate modified with a compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain to have the hydrophobic chain and the hydrophilic chain on the substrate. Binding a structure surrounded by the lipid bilayer to a compound; (B) crushing the membrane vesicles and releasing the encapsulated biomolecules; (D) detecting the biomolecule; It is characterized by having.
  • exosome contents can be analyzed in a series of flows by introducing the sample into the device.
  • FIG. 7 It is a figure which shows the spot where fluorescence should be observed corresponding to the spot of the image of FIG. 7 (A).
  • the shaded spots are spots corresponding to the target miRNA, and each alphabet corresponds to the following miRNA: A: 141, B: 143, C: 1275, D: 107, E: 181a -2 *, F: 484, S: let-7a, T: let-7b, U: let-7d.
  • a fluid device for example, a microfluidic device (microTAS), a millifluidic device (milliTAS), etc.
  • a fluid device 1 of this embodiment is a layer modified with a compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain.
  • Exosome purification unit 2 biomolecule purification unit 3
  • biomolecule detection unit 4 first flow path 5 connecting exosome purification unit 2 and biomolecule purification unit 3
  • a second flow path 6 connecting the detection unit 4.
  • the fluidic device 1 of the present embodiment is a device that detects a biomolecule contained in an exosome in a sample.
  • the first flow path 5 is a flow path for sending exosome crushing liquid containing biomolecules from the exosome purification section 2 to the biomolecule purification section 3, and the second flow path 6 is a purification path.
  • This is a flow path for feeding the solution containing the biomolecules to the biomolecule detection unit 4.
  • the fluid device 1 of the present embodiment is a device that introduces a sample, crushes an exosome, purifies a biomolecule, and detects a biomolecule with a configuration as shown in FIG. 9A described later. .
  • An exosome is a small lipid vesicle with a diameter of 30 to 100 nm surrounded by a lipid bilayer.
  • various cells such as tumor cells, dendritic cells, T cells, and B cells are used. It is secreted into body fluids such as blood, urine and saliva.
  • An exosome is a secreted product of a cell, and encloses a biomolecule derived from the cell from which it is secreted, such as a protein, nucleic acid, miRNA and the like.
  • Abnormal cells such as cancer cells existing in the body express specific proteins, nucleic acids, miRNAs, and the like inside the cell membrane.
  • exosomes are detected in body fluids such as blood, urine, and saliva circulating in the living body.
  • analyzing exosomes can detect abnormalities in the living body without performing a biopsy test. it can.
  • the fluid device 1 of the present embodiment preferably further includes a waste liquid tank.
  • the fluid device of the present embodiment includes a first waste liquid tank 7, a second waste liquid tank 8, and a third waste liquid tank 9, and the first waste liquid tank 7 and the exosome purification.
  • the road 12 is provided.
  • three waste liquid tanks are shown, but one or two waste liquid tanks may be combined.
  • waste liquid from the exosome purification unit 2 is sent to the first waste liquid tank 7 through the third channel 10.
  • the waste liquid from the biomolecule purification unit 3 is sent to the second waste liquid tank 8 through the fourth channel 11.
  • Waste liquid from the biomolecule detection unit 4 is sent to the third waste liquid tank 9 through the fifth flow path 12.
  • the exosome purification unit 2 performs exosome immobilization and exosome crushing, and includes an exosome immobilization unit 2d having an inlet and a layer modified with a compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain.
  • the exosome purification unit 2 preferably includes an inlet for each reagent to be introduced. That is, the exosome purification unit 2 preferably includes a sample introduction inlet 2b and a crushing liquid introduction inlet 2c, and more preferably includes a cleaning liquid introduction inlet 2a.
  • the compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain in the exosome fixing part 2d is a compound having a hydrophobic chain for binding to the lipid bilayer and a hydrophilic chain for dissolving the lipid chain.
  • an exosome having a lipid bilayer membrane can be fixed on the exosome fixing part 2d.
  • immobilizing an exosome on the exosome fixing part 2d also means that the exosome is adsorbed to the exosome fixing part. Isolation of exosomes from the sample is possible.
  • the hydrophobic chain may be single chain or double chain, and examples thereof include a saturated or unsaturated hydrocarbon group which may have a substituent.
  • the saturated or unsaturated hydrocarbon group is preferably a linear or branched alkyl group or alkenyl group having 6 to 24 carbon atoms, and includes a hexyl group, a heptyl group, an octyl group, a nonyl group, a decyl group, an undecyl group, Dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group, hexadecyl group, heptadecyl group, stearyl group (octadecyl group), nonadecyl group, icosyl group, heicosyl group, docosyl group, tricosyl group, tetracosyl group, myristolyl group, palmitoleyl group Oleyl group, lino
  • hydrophilic chain examples include proteins, oligopeptides, polypeptides, polyacrylamide, polyethylene glycol (PEG), dextran, etc. PEG is preferred.
  • Such hydrophilic chains are preferably chemically modified for bonding to the substrate, more preferably have an active ester group, and particularly preferably an N-hydroxysuccinimide group.
  • lipid-PEG derivative As the compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain, a lipid-PEG derivative is preferable.
  • the lipid-PEG derivative is called BAM (Biocompatible anchor for membrane).
  • BAM Biocompatible anchor for membrane
  • Examples of BAM include a compound represented by the following formula (1).
  • n is an integer of 1 or more.
  • the substrate used as the layer of the exosome fixing part 2d include a glass substrate, a silicon substrate, a polymer substrate, and a metal substrate.
  • the substrate may be bonded via a substance that binds to a hydrophilic chain of a compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain. Examples of such a substance include an amino group, a carboxyl group, a thiol group, a hydroxyl group, and an aldehyde group. And 3-aminopropyltriethoxysilane is preferred.
  • the liquid is driven by an external suction pump, and the flow of the liquid is controlled by opening and closing the valve.
  • the valve is, for example, a pneumatic valve, and opening / closing of the valve is driven and controlled by an external pneumatic device connected to the fluid device 1.
  • the sample is first injected into the sample introduction inlet 2b, the valve 2f of the flow path 2i is opened, and the sample is introduced into the exosome fixing section 2d by suction To do.
  • the sample amount used for the analysis is, for example, from several ⁇ L to several mL, for example, about 1 mL.
  • the sample is obtained from the environment surrounding the cell to be detected and is not particularly limited as long as it contains an exosome secreted by the cell.
  • Blood, urine, breast milk, bronchoalveolar lavage fluid, amniotic fluid examples include malignant exudates and saliva.
  • blood or urine that can easily detect exosomes is preferable.
  • plasma is preferable because of easy detection of exosomes.
  • samples also include cell culture fluids containing exosomes secreted by cultured cells.
  • Examples of cells to be detected include cancer cells, mast cells, dendritic cells, reticulocytes, epithelial cells, B cells, and nerve cells that are known to produce exosomes.
  • the sample may be prepared by ultracentrifugation, ultrafiltration, continuous flow electrophoresis, filtration using a size filter, gel filtration chromatography, or the like, but in the present embodiment, the exosome fixing part 2d. Since the affinity between the compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain in exosome and exosome is very high, the sample itself may not be prepared.
  • the exosome fixing part 2d From the viewpoint of specifically binding the exosome to the exosome fixing part 2d, it is preferable to provide a nonspecific adsorption suppressing part in the exosome fixing part 2d.
  • a portion where the compound having the hydrophobic chain and the hydrophilic chain is not modified is treated with a compound having a hydrophilic group such as PEG. Can be mentioned.
  • the exosome in the sample introduced into the exosome fixing part 2d is captured by the above-described compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain. Since the affinity between the compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain and the exosome is very high, it is not necessary to leave the sample in the exosome fixing part 2d, and at the same time the sample continuously passes on the exosome fixing part 2d.
  • the exosome in the sample is captured on the exosome fixing part 2d.
  • the suction pressure during exosome capture is 1 to 30 kPa, and the time required for capture is about 15 seconds.
  • the solution that has passed through the exosome fixing part 2d is sent to the first waste liquid tank 7 through the third channel 10 via the valve 10a.
  • the ceiling height of the exosome fixing part 2d low. Therefore, the opportunity of contact with the compound which has a hydrophobic chain
  • the blood contains extracellular vesicles such as microvesicles and apoptotic bodies in addition to exosomes, and these extracellular vesicles may be fixed to the exosome fixing part 2d. From the viewpoint of removing these extracellular vesicles from the exosome fixing part 2d, it is preferable to wash the exosomes on the exosome fixing part 2d. As an example, as shown in FIG. 3, the valve 2e on the flow path 2h is opened, the cleaning liquid is injected into the cleaning liquid introduction inlet 2a, and is introduced into the exosome fixing part 2d.
  • the flow rate can be adjusted quickly, and washing in a short time is possible.
  • washing is performed by feeding 500 ⁇ L of PBS washing solution at a suction pressure of 1 to 30 kPa for about 15 seconds.
  • the waste liquid that has passed through the exosome fixing part 2d is sent to the first waste liquid tank 7 through the third flow path 10 through the valve 10a.
  • the exosome fixed to the exosome fixing part 2d is crushed.
  • the valve 2g on the flow path 2j is opened, the crushing liquid is injected into the crushing liquid introduction inlet 2c, and the crushing liquid is introduced into the exosome fixing part 2d by suction.
  • the crushing liquid include conventionally known ones used for cell lysis.
  • the suction pressure at the time of crushing exosomes is 1 to 30 kPa, and the time required for crushing is about 30 seconds.
  • the waste liquid that has passed through the exosome fixing part 2d is sent to the first waste liquid tank 7 through the third flow path 10 through the valve 10a.
  • the biomolecule released from the exosome is sent to the biomolecule purification unit 3 through the first channel 5 via the valve 5a.
  • the biomolecule purification unit 3 preferably includes a biomolecule recovery liquid introduction inlet 3b and a biomolecule immobilization section 3c, and more preferably includes a biomolecule cleaning liquid introduction inlet 3a.
  • the biomolecule immobilization part 3c is not particularly limited as long as it can immobilize a biomolecule, and as an example, when the biomolecule is a nucleic acid, a silica membrane that immobilizes the nucleic acid is exemplified.
  • the exosome holds proteins and nucleic acids derived from the secretory cell. Examples of the nucleic acid include miRNA.
  • the biomolecule fixed by the biomolecule fixing part 3c is preferably miRNA.
  • the biomolecule fixing part 3c as described above, a silica membrane embedded in a flow path can be used.
  • the suction pressure at the time of feeding the exosome disruption liquid is 50 to 70 kPa, and the time required for the liquid feeding is about 1 minute.
  • the waste liquid that has passed through the biomolecule fixing part 3c is sent to the second waste liquid tank 8 through the fourth channel 11 via the valve 11a.
  • the valve 3d on the flow path 3e is opened, the cleaning liquid is injected into the biomolecule cleaning liquid introduction inlet 3a, and the cleaning liquid is introduced into the biomolecule fixing part 3c by suction.
  • the cleaning liquid for example, about 70% to 80% ethanol can be used.
  • the amount of cleaning liquid used at the time of cleaning is about 1 mL
  • the suction pressure is 50 to 70 kPa
  • the time required for feeding the cleaning liquid is about 1 minute.
  • the waste liquid that has passed through the biomolecule fixing part 3c is sent to the second waste liquid tank 8 through the fourth channel 11 via the valve 11a.
  • the biomolecule released from the exosome is sent to the biomolecule purification unit 3 through the first channel 5 via the valve 5a.
  • the biomolecule immobilization unit 3c In order to prevent the biomolecule washing liquid from being brought into the biomolecule detection unit, it is preferable to dry the biomolecule immobilization unit 3c after washing the biomolecule immobilization unit 3c. As shown in FIG. 3, air is sucked from the biomolecule cleaning liquid introduction inlet 3a and dried by passing through the biomolecule fixing portion 3c. As an example, the suction pressure when drying the biomolecule fixing part 3c is 50 to 70 kPa, and the time required for drying is about 2 minutes.
  • the biomolecule fixed to the biomolecule fixing part 3c is eluted.
  • the valve 3f of the flow path 3g is opened, the biomolecule recovery liquid is injected into the biomolecule recovery liquid introduction inlet 3b, and the biomolecule recovery liquid is introduced into the biomolecule fixing part 3c.
  • the biomolecule recovery liquid is RNase-free water
  • the usage amount of the recovery liquid is 30 ⁇ L
  • the recovery liquid is aspirated at a suction pressure of 50 to 70 kPa
  • the recovery liquid reaches the biomolecule fixing part 3c. Suction is stopped at the time and held for about 3 minutes.
  • the biomolecule is recovered from the biomolecule fixing part 3c.
  • the recovered liquid is recovered over 30 seconds at a suction pressure of 50 to 70 kPa.
  • the biomolecule passes through the second flow path 6 and is sent to the biomolecule detection unit 4.
  • the suction pressure of the biomolecule to the biomolecule detection unit 4 is 6 kPa or less, and the liquid is fed over about 30 seconds.
  • the biomolecule detection unit 4 includes, as an example, a substrate on which a substance having affinity for biomolecules is fixed.
  • a substrate on which a substance having affinity for biomolecules is fixed when the biomolecule is a nucleic acid, it is preferably provided with a nucleic acid array, and when the biomolecule is a protein, it is preferably provided with a protein array.
  • the biomolecule when the biomolecule is miRNA, it is preferable to include a substrate 4c on which a probe complementary to the target miRNA is immobilized (see FIG. 3). Examples of the substrate on which a probe complementary to the target miRNA is immobilized include a conventionally known DNA chip.
  • the biomolecule detector 4 preferably has the following configuration. As shown in FIGS. 9A and 9B, the biomolecule detection unit 4 hybridizes with the first part 31 when the target miRNA 33 is divided into the first part 31 and the second part 32. It is preferable to include a substrate on which a capture probe 34 including a sequence capable of soybeans is fixed, and an inlet 4a for detecting probe introduction (see FIG. 3).
  • the detection probe 35 includes two stem portions 35c and 35d forming a double strand, a region between the two stem portions 35c and 35d, a loop portion 35e labeled with a labeling substance 35a, and a target miRNA 33. When divided into a first portion 31 and a second portion 32, it has a sequence 35b capable of hybridizing with the second portion 32, and has a 5 ′ protruding end or a 3 ′ protruding end.
  • the capture probe 34 and the detection probe 35 are capable of hybridizing to the first portion 31 and the second portion 32 of the miRNA 33, respectively. Therefore, the length of the first portion 31 and the second portion 32 is preferably 5 to 17 bases, and more preferably 7 to 15 bases from the viewpoint of the number of bases obtained by dividing the miRNA consisting of about 22 bases into two.
  • the 5 ′ portion of the miRNA 33 is the first portion 31, and the 3 ′ portion of the miRNA 33 is the second portion 32.
  • “can hybridize” means that a part of the capture probe and the detection probe used in the present invention hybridizes to a target nucleic acid (target miRNA) under stringent conditions. This means that it does not hybridize to nucleic acid molecules other than nucleic acid (target miRNA).
  • stringent conditions include, for example, conditions described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • the capture probe 34 includes a sequence capable of hybridizing with the first portion 31 of the miRNA 33 in the 5 ′ end region. From the viewpoint of quantifying the miRNA 33 with high accuracy, the capture probe 34 preferably does not contain a sequence complementary to the second portion 32 of the miRNA 33 so as not to hybridize with the second portion 32 of the miRNA 33. In order for the capture probe 34 fixed to the substrate 36 to hybridize with the miRNA 33, molecular freedom is required. Therefore, the capture probe 34 has a spacer 34a at the 3 ′ end that binds to the substrate 36. It is preferable. The length of the spacer 34a is not particularly limited, but is preferably 3 to 50 bases, more preferably 5 to 25 bases.
  • the base used for the spacer can be replaced with a linker such as PEG having the same length and softness.
  • the number of bases used for the spacer 34a may be 0 bases.
  • the length of the capture probe 34 is not particularly limited as long as it is a length necessary for functioning as a probe, but is preferably 3 to 50 bases in consideration of the number of bases of the first portion 31 and the spacer 34a. 40 bases are more preferred.
  • the capture probe 34 may be DNA or RNA, and is not limited to natural and non-natural as long as it has the same function as DNA or RNA, but is not limited to natural, non-natural, PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), BNA (BridgedgNucleic). Acid) or other artificial nucleic acid may be included.
  • the capture probe 34 has an affinity for the target miRNA 33, is not easily recognized by a DNA degrading enzyme or an RNA degrading enzyme, and can be a substrate for a DNA ligase such as T4 DNA ligase. Preferably it contains BNA.
  • Examples of the substrate 36 used for fixing the capture probe 34 include a glass substrate, a silicon substrate, a plastic substrate, and a metal substrate.
  • Examples of a method for fixing the capture probe 34 on the substrate 36 include a method for fixing the probe at a high density on the substrate using an optical lithography technique and a method for fixing the probe by spotting on a glass substrate or the like.
  • the detection probe 35 includes a sequence 35b capable of hybridizing with the second portion 32 of the miRNA 33 in the 3 ′ end region. From the viewpoint of quantifying the miRNA 33 with high accuracy, the detection probe 35 preferably does not contain a sequence complementary to the first portion 31 of the miRNA 33 so as not to hybridize with the first portion 31 of the miRNA 33.
  • the detection probe 35 forms a stem loop structure.
  • a stem-loop structure is a single-stranded nucleic acid that, when there are complementary sequences in two distant regions within the molecule, forms a double-strand (stem structure) by the interaction between nucleic acid base pairs. , Which means that the sequence narrowed in the two regions forms a loop structure, also called a hairpin loop.
  • the detection probe 35 includes, from the 5 ′ end side, two stem portions 35c and 35d that form a double strand, a loop portion 35e that is a region between the two stem portions 35c and 35d, 2 and a sequence 35b capable of hybridizing with the portion 32. That is, the detection probe 35 has a 3 ′ protruding end.
  • the detection probe has a protruding end, and whether the protruding end of the detection probe is a 5 ′ protruding end or a 3 ′ protruding end depends on whether the capture probe and the substrate are connected via the 5 ′ end of the capture probe. Depending on whether it is bound via the 3 'end.
  • the length of the stem portion in the detection probe 35 is determined by the balance with the length of the loop portion, and is not particularly limited as long as the detection probe 35 can stably form a stem loop structure, but 3 to 50 bases are preferable. More preferred is 5 to 20 bases.
  • the length of the loop portion in the detection probe 35 is determined by the balance with the length of the stem portion, and is not particularly limited as long as the detection probe 35 can stably form a stem loop structure, but preferably 3 to 200 bases. More preferred is 5 to 100 bases.
  • the length of the detection probe 35 is not particularly limited as long as it can form a stem loop structure and is necessary for functioning as a probe, but the number of bases of the second portion 32 and the base necessary for forming the stem loop structure In consideration of the number, 14 to 200 bases are preferable, and 24 to 150 bases are more preferable.
  • the detection probe 35 may be DNA or RNA, and is not limited to natural and non-natural as long as it has a function similar to DNA or RNA, but is not limited to PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), BNA (Bridged Nucleic Acid) or other artificial nucleic acid may be included.
  • the detection probe 35 has a high affinity for a target miRNA, is not easily recognized by a DNA degrading enzyme or an RNA degrading enzyme, and can be a substrate for a DNA ligase such as T4 DNA ligase.
  • it contains BNA. It is preferable that at least one of the capture probe 34 and the detection probe 35 includes LNA or BNA, and it is more preferable that both the capture probe 34 and the detection probe 35 include LNA or BNA.
  • the detection probe 35 is labeled with a labeling substance 35a.
  • the labeling substance include fluorescent dyes, fluorescent beads, quantum dots, biotin, antibodies, antigens, energy absorbing substances, radioisotopes, chemiluminescent substances, enzymes, and the like.
  • fluorescent dyes FAM (carboxyfluorescein), JOE (6-carboxy-4 ′, 5′-dichloro2 ′, 7′-dimethoxyfluorescein), FITC (fluorescein isothiocyanate), TET (tetrachlorofluorescein), HEX ( 5′-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite), Cy3, Cy5, Alexa568, Alexa647 and the like. Since only a very small amount of miRNA is present in total RNA, it is difficult to label miRNA with high efficiency without fractionation. On the other hand, in this embodiment, since a pre-labeled detection probe is used, miRNA can be detected with high sensitivity.
  • the biomolecule detection unit 4 preferably further includes an inlet 4b for introducing a cleaning liquid.
  • the biomolecule detection unit 4 includes a rotary mixer including a flow path through which the liquid circulates and a pump valve (not shown) as shown in FIG.
  • the valve 4d is opened, and the detection probe solution is injected into the detection probe introduction inlet 4a.
  • the composition of the detection probe lysis solution is 100 to 200 nM detection probe, 100 to 200 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 to 400 mM NaCl, 10 to 30 mM MgCl 2 , 0.5 to 2 mg / mL BSA, 10 -30 mM DTT, 5-20 units / ⁇ L T4 DNA ligase, and the detection probe solution is fed at a suction pressure of 6 kPa or less over about 30 seconds.
  • the biomolecule and the detection probe solution are circulated and mixed in the biomolecule detection unit.
  • opening and closing of a pump valve (not shown) is continued for about 10 minutes.
  • a complex miRNA33-detection probe 35-capture probe 34 complex
  • the cleaning liquid is injected into the cleaning liquid introduction inlet 4b, and is introduced into the substrate 4c.
  • the cleaning liquid is 0.2 ⁇ SSC buffer, the amount used is 500 ⁇ L, and cleaning is performed by feeding the cleaning liquid at a suction pressure of 6 kPa or less over 1 minute.
  • the waste liquid that has passed through the substrate 4c passes through the fifth flow path 12 via the valve 12a and is sent to the third waste liquid tank 9.
  • substrate 4c is measured. Since the strength of the labeling substance reflects the abundance of the biomolecule, according to the present embodiment, the amount of the biomolecule contained in the sample can be quantified.
  • the measurement of the intensity of the labeling substance is performed by a control unit such as a microscope, a light source, a personal computer (not shown) as an example.
  • the analysis of exosomes which conventionally required one day or more, can be quickly performed in only about one hour.
  • a biomolecule existing on the surface of the exosome may be detected in the exosome purification unit.
  • a method for detecting a biomolecule present on the surface of an exosome immobilized on a substrate is formed by allowing a biomolecule present on the surface of an exosome to interact with a first molecule that specifically binds to the biomolecule. And detecting a complex (first molecule-exosome complex) on the substrate.
  • the method for detecting the first molecule-exosome complex is, for example, a step of detecting the fluorescence of the first molecule-exosome complex labeled with fluorescence.
  • a secondary antibody against the first molecule antibody is labeled with an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase, or labeled with nanoparticles such as gold colloid or quantum dots. It is preferable to use one.
  • the quantum dot include CdSe and CdTe. These quantum dots are superior in that they are brighter and less susceptible to photobleaching than conventional organic dyes and fluorescent proteins.
  • a detection method using ELISA may be used.
  • An example is a method in which an enzyme-labeled secondary antibody is allowed to act on the primary antibody, a chromogenic substrate is added, and the color development of the enzyme reaction product is detected. In this case as well, exosomes can be detected as in the case of the fluorescent label.
  • the exosome purification part of this device includes an inlet for introducing a detection solution for detecting a biomolecule on the exosome surface as an example.
  • the detection solution is a solution containing a first molecule and a secondary antibody.
  • An exosome is a secreted product of a cell, and expresses a cell-derived biomolecule such as a protein, a nucleic acid, a sugar chain, and a glycolipid on the surface thereof.
  • a cell-derived biomolecule such as a protein, a nucleic acid, a sugar chain, and a glycolipid on the surface thereof.
  • Abnormal cells such as cancer cells present in the living body express proteins and the like that are unique to their cell membranes. Therefore, by analyzing the protein expressed on the surface of the exosome, abnormality of the secretory cell can be detected.
  • the surface of the exosome is a membrane surface of a membrane vesicle secreted from a cell, and refers to a portion where the secreted exosome is in contact with the environment in the living body.
  • An example of the interaction between the first molecule and the exosome is a binding reaction such as an antigen-antibody reaction.
  • An abnormal cell that secretes an exosome expresses a specific protein as a biomolecule on the cell surface, or the abnormal cell lacks the expression of the specific protein. Therefore, cell abnormalities can be detected by using, as a first molecule, an antibody having a protein with a different expression pattern as an antigen as compared to normal cells. From such a viewpoint, it is preferable that the antibody used is an antigen that is a protein that is highly expressed in abnormal cells or normal cells. More preferably.
  • the first molecule is not limited to an antibody, and an aptamer is also preferably used. Examples of aptamers include nucleic acid aptamers and peptide aptamers.
  • the exosome can be analyzed in two steps by performing detection of a biomolecule existing on the surface of the exosome as described above and detection of miRNA included in the exosome on the device.
  • exosomes derived from breast cancer cells express MUC1, CD24, and ADAM10 as membrane proteins on the surface. These membrane proteins bind to anti-MUC1 antibody, anti-CD24 antibody, and anti-ADAM10 antibody, respectively.
  • miR-1275 and miR21 are included in exosomes derived from breast cancer cells. Therefore, in the case of a breast cancer test, a test with higher accuracy and reliability can be realized by analyzing the membrane protein and miRNA using this device.
  • this device can analyze exosomes in two stages by detecting membrane proteins on the surface of exosomes corresponding to diseases and miRNA encapsulated in exosomes.
  • the fluidic device 20 of the present embodiment is a fluidic device that purifies a biomolecule contained in an exosome in a sample, and includes a sample introduction inlet 2b and an exosome disruption fluid introduction inlet 2c, An exosome fixing part 2d having a layer modified with a compound having the hydrophobic chain and the hydrophilic chain. Further, as shown in FIG. 4, it is more preferable that the fluid device 20 of this embodiment further includes an inlet 2 a for introducing a cleaning liquid.
  • omitted a biomolecule in an exosome can be purified simply and efficiently.
  • the exosome analysis method of the present embodiment includes a step of purifying and crushing exosomes on an exosome purification unit having a layer modified with a compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain. Furthermore, the exosome analysis method of the present embodiment preferably includes a step of purifying and detecting a biomolecule flowing out from the disrupted exosome. The detecting step may not be performed in the fluidic device. As an example, a step of analyzing a nucleic acid in an exosome using a DNA sequencer can be mentioned. Other details are omitted because they are described in the first embodiment of the “fluid device”.
  • the biomolecule analysis method of this embodiment is (A) An exosome-containing sample is brought into contact with a substrate modified with a compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain in the fluid device, and the exosome is bound to the compound having the hydrophobic chain and the hydrophilic chain on the substrate.
  • the biomolecule analysis method of the present embodiment uses a biomolecule in an exosome as an analysis target.
  • Step (d) may not be performed in the fluidic device.
  • a step of analyzing a nucleic acid in an exosome using a DNA sequencer can be mentioned.
  • the purification step (c) includes: (C1) capturing the biomolecule in a capturing unit; (C2) eluting the biomolecule from the capture part; It is preferable to have.
  • a process (c1) is a process of sending the crushing liquid containing the biomolecule obtained in the said process (b) to a capture part, and capturing the biomolecule contained in a crushing liquid.
  • the capture unit is not particularly limited as long as it can capture biomolecules, and examples thereof include the biomolecule fixing unit 3c described above.
  • the disrupted liquid and the capture liquid to the capture part such as a silica membrane do not have the same composition.
  • phenol or a surfactant is used for crushing, but in that case, it is necessary to additionally mix ethanol necessary for capturing in the capturing section.
  • exosomes are easier to crush than cells, and in this embodiment, crushing and capturing can be performed with the same composition.
  • the configuration of the device can be simplified.
  • a biomolecule existing on the surface of the exosome is detected on a substrate to which the exosome is bound.
  • Other details are omitted because they are described in the first embodiment of the “fluid device”.
  • the biomolecule detection method of this embodiment is (A) A sample containing a structure surrounded by a lipid bilayer is brought into contact with a substrate modified with a compound having a hydrophobic chain and a hydrophilic chain to have the hydrophobic chain and the hydrophilic chain on the substrate. Binding a structure surrounded by the lipid bilayer to a compound; (B) crushing the membrane vesicles and releasing the encapsulated biomolecules; (D) detecting the biomolecule; Have In the step (a) according to this embodiment, the target is not limited to exosomes.
  • a structure surrounded by a lipid bilayer such as leukocytes can also be captured.
  • the crushing liquid which crushes the structure surrounded not by exosome but by lipid bilayers, such as a cell and a leukocyte is a phenol and surfactant in an example.
  • ethanol is additionally mixed in order to capture the nucleic acid encapsulated in the structure surrounded by the lipid bilayer on a silica membrane or the like.
  • the exosome suspension obtained by ultracentrifugation of the culture supernatant of the breast cancer cell line MCF-7 and the exosomes in human serum were fixed in the device.
  • the exosome fixation was evaluated by measuring the fixed particle density with AFM.
  • FIG. 5 shows an AFM image of the exosome immobilized in the device and the immobilization density.
  • [MiRNA purification] A miniaturized silica membrane was fixed in the channel, and miRNA was purified. The exosome disruption solution containing miRNA was subjected to suction operation and passed through a silica membrane. Subsequently, the silica membrane was washed and dried, and then the miRNA eluate was introduced to collect the miRNA. The amount of miRNA recovered was determined by quantitative real-time PCR. In addition, as a comparison with a general spin column method, a QIAGEN miRNeasy Mini Kit was used. The results of miRNA recovery are shown in FIG. By reducing the size of the silica membrane in this unit, the required time and reagents used were reduced. In addition, with the reduction in size, miRNA can be recovered with a small amount of eluate, and the miRNA solution can be concentrated.
  • This device has miR-141, miR-143, miR-1275, miR-107, miR-181a-2 *, miR-484, miR-21, let-7a, let-7b, let-7d as target miRNAs.
  • Let-7f A total of 12 kinds of detection probes having a sequence complementary to each target miRNA were designed and synthesized.
  • capture probes having a sequence complementary to each target miRNA were synthesized on a glass substrate and arranged in a spot shape.
  • MiR-141 is encapsulated in exosomes derived from prostate cancer or ovarian cancer.
  • miR-143 is encapsulated in exosomes derived from chronic heart disease.
  • miR-1275 is encapsulated in exosomes derived from breast cancer.
  • miR-107 is encapsulated in exosomes derived from prostate cancer or ovarian cancer.
  • miR-181a-2 * is encapsulated in exosomes derived from prostate cancer.
  • miR-484 is encapsulated in exosomes derived from prostate cancer or ovarian cancer.
  • miR-21 is encapsulated in exosomes derived from prostate cancer, liver cancer, ovarian cancer, breast cancer, pancreatic cancer, or lung cancer.
  • Let-7a and let-7b are encapsulated in exosomes derived from colorectal cancer, lung cancer, stomach cancer, and ovarian cancer.
  • let-7d and let-7f are encapsulated in exosomes derived from gastric cancer and ovarian cancer.
  • miR-39 is a nematode-derived control spot. The sequences of the target miRNA, capture probe, and detection probe are shown below.
  • Target miRNA miR-141 [Sequence: 5′-UAACACUGUGUGGUAAAAUGUG-3 ′] (SEQ ID NO: 22mer)
  • Target miRNA2 miR-143 [Sequence: 5′-UGAGAUGAAGCACUGUAGUCUC-3 ′] (SEQ ID NO: 21 mer)
  • Target miRNA3 miR-1275 [Sequence: 5′-GUGGGGGAGAGGCUUGUC-3 ′] (SEQ ID NO: 3: 17mer)
  • Target miRNA4 miR-107 [SEQ ID NO: 5′-AGCAGCAUUGUACAGGGGCUAUCA-3 ′] (SEQ ID NO: 23mer)
  • Target miRNA5 miR-181a-2 * [Sequence: 5′-ACCACUGACCGUUGACUGUACC-3 ′] (SEQ ID NO: 5: 22mer)
  • Target miRNA6 miR-484 [Sequence: 5′-UCAGGGCUCAGUCCCCUCCCCGAU-3 ′] (
  • Capture probe 1 (Capture probe 1) [Sequence: 5′-p-X1-fS-3 ′]
  • X1 represents the following sequence
  • p represents phosphoric acid
  • S represents a thiol group
  • f represents 6-FAM (6-fluorocein).
  • Detection probe 1 [Sequence: 5′-p-X2-Al-X3-3 ′]
  • X2 and X3 represent the following sequences, p represents phosphoric acid, and Al represents Alexa647-AminoC6-dA.
  • the DNA microarray substrate on which the above-described capture probe was immobilized was allowed to stand at room temperature for 90 minutes while contacting the solution shown in Table 1.
  • the DNA microarray substrate was washed with ultrapure water and dried, and then placed in a rotary mixer (biomolecule detector).
  • the composition of Takara 10 ⁇ buffer is 500 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl 2, 50 mM DTT.
  • a miRNA solution having an arbitrary concentration was prepared as shown in Table 2, and a hybridization reaction solution containing the detection probe 1 was prepared as shown in Table 3.
  • the prepared miRNA solution and hybridization reaction solution were introduced from different inlets, respectively, and circulated for 10 minutes in a rotary mixer for hybridization.
  • FIGS. 7 (A) and 7 (B) are shown in FIGS. 7 (A) and 7 (B).
  • FIG. 7A is an image of the substrate showing the miRNA detection result.
  • FIG. 7B corresponds to the spot in the left image, and the shaded spot is a spot corresponding to the target miRNA and a spot where fluorescence is to be observed.
  • Each alphabet corresponds to the following miRNA.
  • FIG. 9A shows a schematic diagram of a fluidic device for explaining the opening / closing operation of the valve in this embodiment.
  • This device includes an exosome purification unit (exosome purification unit 2), a miRNA purification unit (biomolecule purification unit 3), a DNA chip (biomolecule detection unit 4), a waste liquid tank 7, a waste liquid tank 8, and a waste liquid tank 9.
  • the waste liquid tank has a suction port. It was confirmed that the flow of the fluid can be controlled by opening / closing control of the valve in each step as shown in FIG. For example, when introducing supernatant, valve 1 (1), valve 3 (3), valve 5 (5), valve 7 (7), valve 8 (8) in FIG. Then, valve 10 (10) and valve 13 (13) are opened, and the solution is sucked from the suction port A of the supernatant waste liquid tank.
  • the exosome contents can be analyzed in a series of flows by introducing the sample into the device.

Abstract

本発明は、サンプルをデバイスに導入することで一連の流れでエキソソーム内容物まで分析できる、流体デバイス、エキソソームの分析方法、生体分子分析方法及び生体分子検出方法を提供する。本発明の流体デバイス（１）は、サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を検出する流体デバイスであって、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部（２）と、生体分子精製部（３）と、生体分子検出部（４）と、前記エキソソーム精製部（２）と前記生体分子精製部（３）を繋ぐ第一の流路（５）と、前記生体分子精製部（３）と前記生体分子検出部（４）を繋ぐ第二の流路（６）と、を備えたことを特徴とする。

Description

流体デバイス、エキソソームの分析方法、生体分子分析方法及び生体分子検出方法
　本発明は、流体デバイス、エキソソームの分析方法、生体分子分析方法及び生体分子検出方法に関する。
　エキソソームは、直径３０～１００ｎｍの小型脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
　がん細胞等の異常細胞は、細胞膜の内部に特有のタンパク質や核酸、マイクロＲＮＡなどを発現している。そして、体液中に分泌されるエキソソームも、分泌元の細胞由来のマイクロＲＮＡなどを発現している。
　そのため、体液中のエキソソームの膜内部に存在する生体分子を分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を調べることができる技術の確立が期待されている。
　なお、バイオプシー検査とは、病変部位の組織を採取し顕微鏡で病変部位を観察することによって、病気の診断等を調べる臨床検査をいう。
　このような期待に対して、生物学的サンプルからマイクロＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡともいう。）を含んでなるがん細胞由来エキソソームを単離し、がん細胞由来エキソソーム中の所定のｍｉＲＮＡの発現量と、被検体由来のエキソソーム中のｍｉＲＮＡの発現量と、を比較して、被検体ががん細胞を有するかを評価するエキソソームの分析方法が提案されている（特許文献１参照。）。
特開２０１３－１０２７６８号公報
　しかしながら、特許文献１には、研究者がエキソソームを単離して、該エキソームからｍｉＲＮＡを精製し、該ｍｉＲＮＡを分析に供する各工程について記載されているが、サンプルをデバイスに導入することで一連の流れでエキソソーム内容物まで分析できる技術については何ら開示されておらず、改良の余地がある。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、サンプルをデバイスに導入することで一連の流れでエキソソーム内容物まで分析できる、流体デバイス、エキソソームの分析方法、生体分子分析方法及び生体分子検出方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部を用いることにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）～（５）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における流体デバイスは、
　サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を検出する流体デバイスであって、
　疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部と、
　生体分子精製部と、
　生体分子検出部と、
　前記エキソソーム精製部と前記生体分子精製部を繋ぐ第一の流路と、
　前記生体分子精製部と前記生体分子検出部を繋ぐ第二の流路と、
　を備えたことを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における流体デバイスは、
　サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を精製する流体デバイスであって、
　サンプル導入用インレット及びエキソソーム破砕液導入用インレットと、
　前記疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム固定部と、
を備えたことを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様におけるエキソソームの分析方法は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部上でエキソソームを精製し、破砕する工程を有することを特徴とする。
（４）本発明の一実施態様における生体分子分析方法は、
　（ａ）流体デバイス中の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板に、エキソソーム含有試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物にエキソソームを結合させる工程と、
　（ｂ）前記エキソソームが結合した基板に破砕液を流入して前記エキソソームを破砕し、内包される生体分子を放出させる工程と、
　（ｃ）前記生体分子を精製する工程と、
　（ｄ）前記生体分子を検出する工程と、
を有することを特徴とする。
（５）本発明の一実施態様における生体分子検出方法は、
　（ａ）疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板に脂質二重層で囲まれた構造体を含有する試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物に前記脂質二重層で囲まれた構造体を結合させる工程と、
　（ｂ）前記膜小胞体を破砕し、内包される生体分子を放出させる工程と、
　（ｄ）前記生体分子を検出する工程と、
を有することを特徴とする。
　本発明によれば、サンプルをデバイスに導入することで一連の流れでエキソソーム内容物まで分析できる。
本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。 本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。 本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。 本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。 実施例におけるＢＡＭ基板に固定したエキソソームの定量結果である。 実施例における精製したｍｉＲＮＡの定量結果である。 実施例におけるｍｉＲＮＡに相補的なプローブが固定されてなる基板を備えた検出部、を有する流体デバイスを用いたｍｉＲＮＡ検出結果である。 図７（Ａ）の画像のスポットに対応した、蛍光が観察されるべきスポットを示す図である。図中、網掛けで示したスポットが、標的ｍｉＲＮＡに対応するスポットで、各アルファベットは下記のｍｉＲＮＡに対応している： A：141、B：143、C：1275、D：107、E：181a-2*、F：484、S：let-7a、T：let-7b、U：let-7d。 本実施形態における流体デバイスの基板の一態様の模式図である。 本実施形態における流体デバイスの一態様の模式図である。 実施例における流体デバイス中のバルブの制御の詳細を示した結果である。
≪流体デバイス≫
［第一実施形態］
　図１に示すように、本実施形態の流体デバイス（たとえばマイクロ流体デバイス（マイクロＴＡＳ）、ミリ流体デバイス（ミリＴＡＳ）など）１は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部２と、生体分子精製部３と、生体分子検出部４と、エキソソーム精製部２と生体分子精製部３を繋ぐ第一の流路５と、生体分子精製部３と生体分子検出部４を繋ぐ第二の流路６と、を備えている。
　本実施形態の流体デバイス１は、サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を検出するデバイスである。
　本実施形態において、第一の流路５は、生体分子を含むエキソソームの破砕液をエキソソーム精製部２から生体分子精製部３に送液する流路であり、第二の流路６は、精製された生体分子を含む溶液を生体分子検出部４に送液する流路である。
　また、たとえば、本実施形態の流体デバイス１は後述する図９（Ａ）に示すような構成によって、サンプルを導入し、エキソソームを破砕し、生体分子を精製し、生体分子を検出するデバイスである。
　エキソソームは、脂質二重膜で囲まれた直径３０～１００ｎｍの小型脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
　エキソソームは、細胞の分泌物であり、分泌元の細胞由来の生体分子、例えばタンパク質、核酸、ｍｉＲＮＡなどを内包している。生体内に存在するがん細胞等の異常細胞は、その細胞膜の内部に特有のタンパク質や核酸、ｍｉＲＮＡなどを発現している。
　そのため、エキソソームに内包される生体分子を分析することで分泌元の細胞の異常を検出することができる。エキソソームに内包される生体分子を取り出す（抽出する）手段として、一例にはエキソソームの脂質二重膜の破砕などが挙げられる。
　更に、エキソソームは、生体内で循環している血液、尿、唾液などの体液中で検出されるため、エキソソームを分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を検出することができる。
　分析に用いるサンプルによる二次感染を防止する観点から、本実施形態の流体デバイス１は、更に廃液槽を備えていることが好ましい。一例として、図２に示すように、本実施形態の流体デバイスは、第一の廃液槽７、第二の廃液槽８、第三の廃液槽９を備え、第一の廃液槽７とエキソソーム精製部２を繋ぐ第三の流路１０、第二の廃液槽８と生体分子精製部３を繋ぐ第四の流路１１、第三の廃液槽９と生体分子検出部４を繋ぐ第五の流路１２を備えたものであることが好ましい。
　尚、図２においては三つの廃液槽を示しているが一つ又は二つの廃液槽にまとめたものであってもよい。
　後述するように、エキソソーム精製部２からの廃液が第三の流路１０を通って第一の廃液槽７に送られる。生体分子精製部３からの廃液が第四の流路１１を通って第二の廃液槽８に送られる。生体分子検出部４からの廃液が第五の流路１２を通って第三の廃液槽９に送られる。
　本実施形態の流体デバイス１における各構成の一例について、図３を用いて説明する。
　エキソソーム精製部２は、エキソソームの固定と、エキソソームの破砕を行うものであり、インレットと、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム固定部２ｄを備える。図３に示すように、エキソソーム精製部２は、導入する試薬別にインレットを備えることが好ましい。即ち、エキソソーム精製部２は、サンプル導入用インレット２ｂと破砕液導入用インレット２ｃを備えることが好ましく、更に洗浄液導入用インレット２ａを備えることがより好ましい。
　エキソソーム固定部２ｄにおける疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とは、脂質二重膜に結合するための疎水性鎖と、この脂質鎖を溶解するための親水性鎖を有する化合物である。係る化合物を用いることにより、エキソソーム固定部２ｄ上に脂質二重膜を有するエキソソームを固定することができる。
　尚、本明細書において、「エキソソーム固定部２ｄ上にエキソソームを固定する」とは、エキソソーム固定部にエキソソームを吸着させることも意味する。サンプル中からのエキソソームの単離が可能である。
　疎水性鎖としては、単鎖であっても複鎖であってもよく、例えば、置換基を有していてもよい飽和又は不飽和の炭化水素基が挙げられる。
　飽和又は不飽和の炭化水素基としては、炭素原子数６～２４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基が好ましく、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、ステアリル基（オクタデシル基）、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基、リシノレイル基、イソステアリル基等が挙げられる。
　中でも、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基が好ましく、オレイル基がより好ましい。
　親水性鎖としては、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン等が挙げられ、ＰＥＧが好ましい。係る親水性鎖は、基板との結合のために化学修飾されていることが好ましく、活性エステル基を有することがより好ましく、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基を有することが特に好ましい。
　即ち、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物としては、脂質－ＰＥＧ誘導体が好ましい。脂質－ＰＥＧ誘導体は、ＢＡＭ（Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ　ａｎｃｈｏｒ　ｆｏｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）と呼ばれる。ＢＡＭとしては、例えば下記式（１）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
［式中、ｎは１以上の整数である。］
　エキソソーム固定部２ｄの層として用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、ポリマー基板、金属基板等が挙げられる。基板は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物の親水性鎖と結合する物質を介して結合していてもよく、係る物質としては、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基、アルデヒド基を有する物質が挙げられ、３－アミノプロピルトリエトキシシランが好ましい。
　本実施形態の流体デバイス１における液体の駆動は、外部吸引ポンプによってなされ、液体の流れはバルブの開閉によって制御される。バルブは一例として空圧式バルブであり、バルブの開閉は、流体デバイス１に連結した外部空圧装置によって駆動・制御される。
　図３に示すように、エキソソームの分析において、まず上述したエキソソーム精製部において、サンプル導入用インレット２ｂにサンプルを注入し、流路２ｉのバルブ２ｆを開き、吸引によりサンプルをエキソソーム固定部２ｄに導入する。
　分析に用いられるサンプル量としては、一例として数μＬから数ｍＬであり、例えば１ｍＬ程度である。
　サンプルとしては、検出対象の細胞をとりまく環境から得られるものであって、該細胞が分泌したエキソソームを含有するものであれば特に限定されず、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液等が挙げられる。中でも、エキソソームを検出しやすい血液又は尿が好ましい。更に、血液においては、エキソソームの検出のしやすさから、血漿が好ましい。
　また、係るサンプルには、培養細胞が分泌したエキソソームを含有する細胞培養液も含まれる。
　検出対象の細胞としては、エキソソームを産生することが知られているがん細胞、肥満細胞、樹状細胞、網赤血球、上皮細胞、Ｂ細胞、神経細胞等が挙げられる。
　サンプルは、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、サイズフィルターを用いたろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等により調製されたものであってもよいが、本実施形態においては、エキソソーム固定部２ｄにおける疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とエキソソームとの親和性が非常に高いため、調製を加えていないサンプルそのものであってもよい。
　エキソソーム固定部２ｄにエキソソームを特異的に結合させる観点から、エキソソーム固定部２ｄに非特異的吸着抑制部を設けることが好ましい。一例として基板を、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾した後、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物が修飾されていない箇所を、ＰＥＧ等の親水性基を有する化合物で処理することが挙げられる。
　エキソソーム固定部２ｄに導入されたサンプル中のエキソソームは、上述した疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物によって捕捉される。疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とエキソソームとの親和性が非常に高いため、サンプルをエキソソーム固定部２ｄに静置する必要はなく、連続的にエキソソーム固定部２ｄ上をサンプルが通過すると同時にサンプル中のエキソソームがエキソソーム固定部２ｄ上に捕捉される。
　一例として、エキソソーム捕捉時の吸引圧力は、１～３０ｋＰａであり、捕捉に要する時間は１５秒程度である。エキソソーム固定部２ｄを通過した溶液は、バルブ１０ａを介して第三の流路１０を通り第一の廃液槽７へ送られる。
　本実施形態の流体デバイス１において、エキソソーム固定部２ｄの天井高を低く設計しておくことが好ましい。これにより、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物と、エキソソームとの接触の機会を増し、エキソソームの捕捉効率を高めることができる。
　血液中には、エキソソーム以外にもマイクロベシクルやアポトーシス小体等の細胞外小胞が含まれており、これら細胞外小胞もエキソソーム固定部２ｄに固定される可能性がある。エキソソーム固定部２ｄからこれらの細胞外小胞を除去する観点から、エキソソーム固定部２ｄ上のエキソソームを洗浄することが好ましい。
　一例として、図３に示すように、流路２ｈ上のバルブ２ｅを開き、洗浄液導入用インレット２ａに洗浄液を注入し、エキソソーム固定部２ｄに導入する。
　本実施形態においては疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層とエキソソームとの結合が強力であるため、流速を速く調整でき、短時間での洗浄が可能である。一例として、ＰＢＳ洗浄液５００μＬを吸引圧力１～３０ｋＰａで１５秒程度送液することにより洗浄される。エキソソーム固定部２ｄを通過した廃液は、バルブ１０ａを介して第三の流路１０を通り第一の廃液槽７へ送られる。
　次いで、エキソソーム固定部２ｄに固定されたエキソソームを破砕する。図３に示すように、流路２ｊ上のバルブ２ｇを開き、破砕液導入用インレット２ｃに破砕液を注入し、吸引により破砕液をエキソソーム固定部２ｄへ導入する。破砕液としては、例えば細胞溶解に用いられる従来公知のものが挙げられる。
　破砕液がエキソソーム固定部２ｄを通ることにより、エキソソーム固定部２ｄ上に捕捉されたエキソソームが破砕され、エキソソームに内包される生体分子が放出される。
　一例として、エキソソーム破砕時の吸引圧力は、１～３０ｋＰａであり、破砕に要する時間は３０秒程度である。エキソソーム固定部２ｄを通過した廃液は、バルブ１０ａを介して第三の流路１０を通り第一の廃液槽７へ送られる。エキソソームから放出された生体分子は、バルブ５ａを介して第一の流路５を通り生体分子精製部３へ送られる。
　図３に示すように、生体分子精製部３は、生体分子回収液導入用インレット３ｂと、生体分子固定部３ｃとを備えることが好ましく、更に生体分子洗浄液導入用インレット３ａを備えることがより好ましい。
　生体分子固定部３ｃは、生体分子を固定可能なものであれば特に限定されないが、一例として生体分子が核酸である場合には核酸を固定するシリカメンブレンが挙げられる。
　エキソソームは、分泌元の細胞に由来するタンパク質や核酸を保持している。核酸としては、ｍｉＲＮＡが挙げられる。近年、短鎖の非コードＲＮＡであるｍｉＲＮＡが、生体内の遺伝子発現の制御をしていることが報告され、ｍｉＲＮＡの異常発現とがんを初めとした様々な疾患との関係が明らかになりつつある。
　本実施形態において、生体分子固定部３ｃが固定する生体分子はｍｉＲＮＡであることが好ましい。生体分子固定部３ｃとしては、上述したように、流路上に埋め込まれたシリカメンブレンが挙げられる。
　生体分子固定部３ｃをエキソソーム破砕液が通過することにより、生体分子固定部３ｃ上に生体分子が捕捉される。
　一例として、エキソソーム破砕液送液時の吸引圧力は、５０～７０ｋＰａであり、送液に要する時間は１分程度である。生体分子固定部３ｃを通過した廃液は、バルブ１１ａを介して第四の流路１１を通り第二の廃液槽８へ送られる。
　生体分子固定部３ｃに生体分子を固定した後、生体分子固定部３ｃを洗浄し、目的とする生体分子以外の夾雑物を取り除くことが好ましい。
　図３に示すように、流路３ｅ上のバルブ３ｄを開き、生体分子洗浄液導入用インレット３ａに洗浄液を注入し、吸引により洗浄液を生体分子固定部３ｃへ導入する。洗浄液としては、例えば７０％～８０％程度のエタノールが挙げられる。
　一例として、洗浄時の洗浄液使用量は１ｍＬ程度であり、吸引圧力は、５０～７０ｋＰａであり、洗浄液の送液に要する時間は１分程度である。生体分子固定部３ｃを通過した廃液は、バルブ１１ａを介して第四の流路１１を通り第二の廃液槽８へ送られる。エキソソームから放出された生体分子は、バルブ５ａを介して第一の流路５を通り生体分子精製部３へ送られる。
　生体分子検出部への生体分子洗浄液の持ち込みを防止するために、生体分子固定部３ｃを洗浄した後、生体分子固定部３ｃを乾燥させることが好ましい。
　図３に示すように、生体分子洗浄液導入用インレット３ａから空気を吸引し、生体分子固定部３ｃを通過させることにより乾燥させる。
　一例として、生体分子固定部３ｃ乾燥時の吸引圧力は、５０～７０ｋＰａであり、乾燥に要する時間は２分程度である。
　次いで、生体分子固定部３ｃに固定された生体分子を溶出させる。生体分子の回収率を向上させるために、生体分子回収液を生体分子固定部３ｃに導入した後、一定時間保持させることが好ましい。
　図３に示すように、流路３ｇのバルブ３ｆを開け、生体分子回収液導入用インレット３ｂに生体分子回収液を注入し、生体分子回収液を生体分子固定部３ｃに導入する。
　一例として、生体分子回収液は、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒであり、該回収液の使用量は３０μＬであり、吸引圧力５０～７０ｋＰａで回収液を吸引し、回収液が生体分子固定部３ｃに到達した時点で吸引を停止させ、３分程度保持する。
　次いで、生体分子固定部３ｃから生体分子を回収する。一例として、吸引圧力５０～７０ｋＰａで回収液を３０秒かけて回収する。
　生体分子は第二の流路６を通り、生体分子検出部４へ送られる。一例として、生体分子検出部４への生体分子の吸引圧力は、６ｋＰａ以下であり、３０秒程度かけて送液する。
　生体分子検出部４は、一例として、生体分子に親和性を有する物質が固定されてなる基板を備えている。一例として、生体分子を核酸とする場合には核酸アレイを備えていることが好ましく、生体分子をタンパク質とする場合にはプロテインアレイを備えていることが好ましい。生体分子をｍｉＲＮＡとする場合には、標的ｍｉＲＮＡに相補的なプローブが固定されてなる基板４ｃを備えていることが好ましい（図３参照。）。標的ｍｉＲＮＡに相補的なプローブが固定されてなる基板としては、例えば従来公知のＤＮＡチップが挙げられる。
　更に、特異的にかつ高感度に標的ｍｉＲＮＡを検出するという観点から、生体分子検出部４は、以下の構成を備えていることが好ましい。
　図９（Ａ）及び図９（Ｂ）に示すように、生体分子検出部４は、標的ｍｉＲＮＡ３３を第一の部分３１と第二の部分３２に分割した場合に、第一の部分３１とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブ３４が固定されてなる基板と、検出プローブ導入用インレット４ａ（図３参照。）と、を備えていることが好ましい。
　検出プローブ３５は、二本鎖を形成する二つのステム部３５ｃ，３５ｄと、該二つのステム部３５ｃ，３５ｄ間の領域であり、標識物質３５ａにより標識されているループ部３５ｅと、標的ｍｉＲＮＡ３３を第一の部分３１と第二の部分３２に分割した場合に、第二の部分３２とハイブリダイズし得る配列３５ｂを有し、５’突出末端又は３’突出末端を有する。
　捕捉プローブ３４及び検出プローブ３５は、それぞれ、ｍｉＲＮＡ３３の第１の部分３１及び第２の部分３２にハイブリダイズし得るものである。そのため、第１の部分３１及び第２の部分３２の長さは、５～１７塩基が好ましく、約２２塩基からなるｍｉＲＮＡを２分割した塩基数という観点から、７～１５塩基がより好ましい。
　　本実施形態においては、ｍｉＲＮＡ３３の５’側の部分を第１の部分３１とし、ｍｉＲＮＡ３３の３’側の部分を第２の部分３２とする。
　尚、本発明及び本願明細書において「ハイブリダイズし得る」とは、本発明に用いられる捕捉プローブ及び検出プローブの一部がストリンジェントな条件下で標的核酸（標的ｍｉＲＮＡ）にハイブリダイズし、標的核酸（標的ｍｉＲＮＡ）以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　ＴＨＩＲＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の条件が挙げられる。
　捕捉プローブ３４は、５’末端領域に、ｍｉＲＮＡ３３の第１の部分３１とハイブリダイズし得る配列を含む。
　ｍｉＲＮＡ３３を高精度に定量する観点から、捕捉プローブ３４は、ｍｉＲＮＡ３３の第２の部分３２とハイブリダイズしないように、ｍｉＲＮＡ３３の第２の部分３２に相補的な配列を含まないことが好ましい。
　基板３６に固定された捕捉プローブ３４が、ｍｉＲＮＡ３３とハイブリダイゼーションするためには、分子的な自由度が必要であることから、捕捉プローブ３４は、基板３６と結合する３’末端にスペーサー３４ａを有していることが好ましい。スペーサー３４ａの長さとしては、特に限定されないが、３～５０塩基が好ましく、５～２５塩基がより好ましい。ただし、スペーサーに用いられる塩基は、同程度の長さと柔らかさを持ったＰＥＧ等のリンカーで代替可能である。係る場合には、スペーサー３４ａに用いられる塩基数は０塩基でもよい。
　捕捉プローブ３４の長さは、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第１の部分３１及びスペーサー３４ａの塩基数を勘案し、３～５０塩基が好ましく、５～４０塩基がより好ましい。
　捕捉プローブ３４は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡやＲＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡと比較して、標的ｍｉＲＮＡ３３との親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくく、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼの基質になり得る観点から、捕捉プローブ３４は、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましい。
　捕捉プローブ３４を固定するために用いられる基板３６としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。捕捉プローブ３４を基板３６上に固定する方法としては、光リソグラフ技術を利用して、基板上に高密度でプローブを固定する方法やガラス基板等にスポッティングによりプローブを固定する方法が挙げられる。
　本実施形態において、検出プローブ３５は、３’末端領域に、ｍｉＲＮＡ３３の第２の部分３２とハイブリダイズし得る配列３５ｂを含む。
　ｍｉＲＮＡ３３を高精度に定量する観点から、検出プローブ３５は、ｍｉＲＮＡ３３の第１の部分３１とハイブリダイズしないように、ｍｉＲＮＡ３３の第１の部分３１に相補的な配列を含まないことが好ましい。
　検出プローブ３５は、ステムループ構造を形成する。ステムループ構造とは、一本鎖核酸において、分子内で離れた二箇所の領域に相補的な配列がある場合、核酸の塩基対間の相互作用によって二本鎖（ステム構造）を形成するとともに、その二箇所の領域に狭まれた配列がループ構造を形成するものをいい、ヘアピンループとも称される。
　本実施形態において、検出プローブ３５は、５’末端側から、二本鎖を形成する二つのステム部３５ｃ，３５ｄと、該２つのステム部３５ｃ，３５ｄ間の領域であるループ部３５ｅと、第２の部分３２とハイブリダイズし得る配列３５ｂとからなる。即ち、検出プローブ３５は、３’突出末端を有している。検出プローブは、突出末端を有しており、検出プローブが有する突出末端が、５’突出末端であるか３’突出末端であるかは、捕捉プローブと基板とが捕捉プローブの５’末端を介して結合しているか３’末端を介して結合しているかによる。
　検出プローブ３５におけるステム部の長さは、ループ部の長さとの兼ね合いによって決まり、検出プローブ３５が安定してステムループ構造を形成できる長さであれば特に限定されないが、３～５０塩基が好ましく、５～２０塩基がより好ましい。
　検出プローブ３５におけるループ部の長さは、ステム部の長さとの兼ね合いによって決まり、検出プローブ３５が安定してステムループ構造を形成できる長さであれば特に限定されないが、３～２００塩基が好ましく、５～１００塩基がより好ましい。
　検出プローブ３５の長さは、ステムループ構造を形成でき、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第２の部分３２の塩基数及びステムループ構造形成に必要な塩基数を勘案し、１４～２００塩基が好ましく、２４～１５０塩基がより好ましい。
　検出プローブ３５は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡやＲＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。ＤＮＡやＲＮＡと比較して、標的ｍｉＲＮＡとの親和性が高く、ＤＮＡ分解酵素やＲＮＡ分解酵素に認識されにくく、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のＤＮＡリガーゼの基質になり得る観点から、検出プローブ３５は、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましい。
　捕捉プローブ３４及び検出プローブ３５の少なくともいずれか一方が、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことが好ましく、捕捉プローブ３４及び検出プローブ３５の両方が、ＬＮＡ又はＢＮＡを含むことがより好ましい。
　検出プローブ３５は、標識物質３５ａにより標識されている。標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光ビーズ、量子ドット、ビオチン、抗体、抗原、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素等が挙げられる。
　蛍光色素としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６－カルボキシ－４’,５’－ジクロロ２’ ,７’－ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等が挙げられる。
　全ＲＮＡ中、ｍｉＲＮＡはごく微量しか存在しないため、分画せずにｍｉＲＮＡを高効率に標識することは困難である。一方、本実施形態においては、予め標識した検出プローブを用いるため、高感度に、ｍｉＲＮＡを検出することができる。
　また、図３に示すように、生体分子検出部４は、更に洗浄液導入用インレット４ｂを備えていることが好ましい。また、生体分子検出部４は、図３のように液が循環する流路と、図示略のポンプバルブとで構成される回転式混合器を含む。
　生体分子が生体分子検出部４へ送られた後、バルブ４ｄを開け、検出プローブ導入用インレット４ａに検出プローブ溶解液を注入する。
　一例として、検出プローブ溶解液の組成は、１００～２００ｎＭ検出プローブ、１００～２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００～４００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０～３０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．５～２ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ、１０～３０ｍＭ　ＤＴＴ、５～２０ｕｎｉｔｓ／μＬ　Ｔ４ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅであり、係る検出プローブ溶解液を吸引圧力６ｋＰａ以下、３０秒程度かけて送液する。
　次いで、生体分子と検出プローブ溶解液を生体分子検出部内で循環させ、混合する。一例として図示略のポンプバルブの開閉を１０分間程度継続させる。液を循環させることにより短時間で効率よく複合体（ｍｉＲＮＡ３３―検出プローブ３５－捕捉プローブ３４複合体）が基板上に形成される（図９（Ａ）及び図９（Ｂ）参照。）。
　次いで、捕捉プローブが固定されてなる基板（図３における基板４ｃ）を洗浄し、該基板上の非特異的吸着物を取り除くことが好ましい。バルブ４ｅを開け、洗浄液導入用インレット４ｂに洗浄液を注入し、基板４ｃに導入する。
　一例として、洗浄液は０．２×ＳＳＣバッファーであり、使用量は５００μＬであり、該洗浄液を吸引圧力６ｋＰａ以下、１分かけて送液して洗浄を行う。
　基板４ｃを通過した廃液は、バルブ１２ａを介して第五の流路１２を通り、第三の廃液槽９へ送られる。
　次いで、基板４ｃ上に形成された複合体の標識物質の強度を測定する。標識物質の強度は、生体分子の存在量を反映するため、本実施形態によれば、サンプル中に含まれる生体分子の量を定量することができる。
　標識物質の強度の測定は、一例として、図示略の顕微鏡、光源、パソコンなどの制御部により行われる。
　本実施形態によれば、従来は１日以上要したエキソソームの分析をわずか一時間程度で迅速に行うことができる。
　また、本デバイスのエキソソーム精製部で上述のようにエキソソームを固定した後、エキソソーム精製部においてエキソソームの表面に存在する生体分子を検出してもよい。
　基板に固定されたエキソソームの表面に存在する生体分子の検出方法は、エキソソームの表面に存在する生体分子と該生体分子と特異的に結合する第１の分子とを相互作用させて複合体を形成し、基板上の複合体（第１の分子－エキソソーム複合体）を検出することを含む。
　第１の分子－エキソソーム複合体を検出する方法は、例えば蛍光標識した第１の分子－エキソソーム複合体の蛍光を検出する工程である。一例として、第１の分子として抗体を用いる場合、第１の分子である抗体に対する二次抗体を、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素で標識したもの、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識したものを用いることが好ましい。
　量子ドットとしては、ＣｄＳｅやＣｄＴｅが挙げられる。これらの量子ドットは、従来の有機系色素や蛍光タンパク質と比べて明るく光退色しにくい点で優れている。
　また、ＥＬＩＳＡによる検出方法を利用してもよい。一例としては、酵素標識された二次抗体を一次抗体に作用させ、発色性の基質を加え、酵素反応生成物の発色を検出する方法が挙げられる。この場合においても、上記蛍光標識の場合と同様に、エキソソームの検出が可能である。
　本デバイスのエキソソーム精製部は、一例としてエキソソーム表面の生体分子を検出する検出溶液の導入用インレットを含む。その検出溶液は第１の分子および二次抗体を含む溶液である。
　エキソソームは、細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来の生体分子、例えば、タンパク質、核酸、糖鎖、糖脂質などを発現している。生体内に存在するがん細胞等の異常細胞は、その細胞膜に特有のタンパク質などを発現している。
　そのため、エキソソームの表面に発現しているタンパク質を分析することで、分泌源の細胞の異常を検出することができる。ここで、エキソソームの表面とは、細胞から分泌される膜小胞の膜表面であって、分泌されたエキソソームが生体内の環境と接する部分をいう。
　第１の分子とエキソソームの相互作用の一例として、例えば抗原－抗体反応といった結合反応が挙げられる。
　エキソソームを分泌する異常細胞は、その細胞表面に、生体分子として特有のタンパク質を発現しているか、又は、該異常細胞において、特有のタンパク質の発現が欠損している。従って、正常細胞と比較して、発現パターンの異なるタンパク質を抗原とする抗体を第１の分子として用いることで、細胞の異常を検出できる。
　係る観点から、用いられる抗体は、異常細胞又は正常細胞に高発現が認められるタンパク質を抗原とするものであることが好ましく、異常細胞特異的又は正常細胞特異的に発現が認められるタンパク質を抗原とするものであることがより好ましい。
　また、第１の分子としては、抗体に限られず、アプタマーも好適に用いられる。アプタマーの一例として、核酸アプタマーやペプチドアプタマーが挙げられる。
　上記のようなエキソソームの表面に存在する生体分子の検出と、そのエキソソームに内包されるｍｉＲＮＡの検出とを本デバイス上で行うことによって、エキソソームを二段階で分析することができる。一例として、乳がんの場合、乳がん細胞由来のエキソソームは表面に膜タンパクとしてＭＵＣ１、ＣＤ２４、ＡＤＡＭ１０を発現している。これらの膜タンパクにはそれぞれ、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＡＤＡＭ１０抗体が結合する。また、乳がん細胞由来のエキソソームには、ｍｉＲ－１２７５、ｍｉＲ２１が内包される。したがって、乳がんの検査の場合、本デバイスを用いて、膜タンパクとｍｉＲＮＡとを分析することで、より精度や信頼性の高い検査が実現できる。本デバイスは、乳がん以外においても同様に、疾患に対応するエキソソーム表面の膜タンパクとエキソソームに内包されるｍｉＲＮＡとを検出することでエキソソームを二段階に分析することができる。
［第二実施形態］
　図４に示されるように、本実施形態の流体デバイス２０は、サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を精製する流体デバイスであって、サンプル導入用インレット２ｂ及びエキソソーム破砕液導入用インレット２ｃと、前記疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム固定部２ｄと、を備える。
　また、図４に示されるように、本実施形態の流体デバイス２０は、更に洗浄液導入用インレット２ａを備えることがより好ましい。
　本実施形態の流体デバイス２０における各構成については、第一実施形態における各構成と重複するため説明を省略する。
　本実施形態によれば、簡便に効率よくエキソソーム中の生体分子を精製することができる。
≪エキソソームの分析方法≫
　本実施形態のエキソソームの分析方法は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部上でエキソソームを精製し、破砕する工程を有する。
　更に、本実施形態のエキソソームの分析方法は、前記破砕されたエキソソームから流出する生体分子を精製し、検出する工程を有することが好ましい。検出する工程は、流体デバイス内で行われなくともよい。一例として、ＤＮＡシーケンサーを用いてエキソソーム中の核酸を分析する工程が挙げられる。
　その他の詳細については、≪流体デバイス≫の第一実施形態で述べたため省略する。
≪生体分子分析方法≫
　本実施形態の生体分子分析方法は、
　（ａ）流体デバイス中の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板に、エキソソーム含有試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物にエキソソームを結合させる工程と、
　（ｂ）前記エキソソームが結合した基板に破砕液を流入して前記エキソソームを破砕し、内包される生体分子を放出させる工程と、
　（ｃ）前記生体分子を精製する工程と、
　（ｄ）前記生体分子を検出する工程と、
　を有する。
　本実施形態の生体分子分析方法は、分析対象をエキソソーム中の生体分子としたものである。工程（ｄ）は、流体デバイス内で行われなくともよい。一例として、ＤＮＡシーケンサーを用いてエキソソーム中の核酸を分析する工程が挙げられる。
　また、前記工程前記精製工程（ｃ）は、
　（ｃ１）前記生体分子を捕捉部に捕捉する工程と、
　（ｃ２）前記生体分子を捕捉部から溶出させる工程と、
を有することが好ましい。
　本実施形態において、工程（ｃ１）は、前記工程（ｂ）において得られる生体分子を含む破砕液を捕捉部に送液し、破砕液に含まれる生体分子を捕捉する工程であることが好ましい。
　捕捉部としては、生体分子を捕捉できるものであれば特に限定されず、一例として上述した生体分子固定部３ｃが挙げられる。
　細胞中の生体分子の分析の場合には、通常、破砕液と、シリカメンブレン等の捕捉部への捕捉液は同一組成ではない。破砕にはフェノールや界面活性剤を用いることが多いが、その場合捕捉部への捕捉に必要なエタノールを追加混合する必要がある。本発明者は、エキソソームは細胞に比べ破砕が容易であることを確認したため、本実施形態においては、破砕と捕捉を同一の組成で行うことが可能となった。本実施形態によれば、デバイスの構成の簡略化が可能である。
また、本実施形態において、一例には、前記エキソソームが結合した基板上で、前記エキソソームの表面に存在する生体分子の検出を行う。
　その他の詳細については、≪流体デバイス≫の第一実施形態で述べたため省略する。
≪生体分子検出方法≫
　本実施形態の生体分子検出方法は、
　（ａ）疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板に脂質二重層で囲まれた構造体を含有する試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物に前記脂質二重層で囲まれた構造体を結合させる工程と、
　（ｂ）前記膜小胞体を破砕し、内包される生体分子を放出させる工程と、
　（ｄ）前記生体分子を検出する工程と、
を有する。
　本実施形態に係る工程（ａ）において、対象はエキソソームに限られない。疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板は、脂質二重層を捕捉する性質があるため、白血球等の脂質二重層で囲まれた構造体も捕捉することができる。
　また、対象がエキソソームではなく細胞や白血球などの脂質二重層で囲まれた構造体を破砕する破砕液は、一例にはフェノールや界面活性剤である。その場合には、脂質二重層で囲まれた構造体に内包される核酸をシリカメンブレン等に捕捉するにあたって、一例にはエタノールを追加混合する。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［エキソソームの精製］
　ガラス表面に３－アミノプロピルトリエトキシシラン（以下、ＡＰＴＥＳともいう。）を修飾し、ＡＰＴＥＳ末端にエキソソームを固定化する前記式（１）で表されるＰＥＧ脂質誘導体、非特異吸着を抑制するメトキシＰＥＧを修飾した。乳がん細胞株ＭＣＦ－７の培養上清を超遠心し回収したエキソソーム懸濁液およびヒト血清中のエキソソームをデバイス内で固定した。
　エキソソームの固定の評価は、ＡＦＭで固定粒子密度を計測して行った。
　デバイス内で固定化されたエキソソームのＡＦＭ像と固定密度を図５に示す。まず、ＡＦＭ像より３０－２００ｎｍの直径を持つ粒子が固定化されていることを確認した。
　次に、固定層からの距離に対し、固定密度が指数関数的に減少することを確認した。また、ヒト血清から直接固定化した場合の固定量が、精製済みエキソソームを固定した場合の７４%であることから、メトキシＰＥＧが非特異吸着の抑制に寄与していると考えられる。
［エキソソームの破砕］
　エキソソームの破砕効率は、エキソソームから放出されたｍｉＲＮＡ量を定量することにより評価した。
　精製されたエキソソームを破砕液と接触させて、エキソソームから放出されたｍｉＲＮＡ量を定量リアルタイムＰＣＲにより求めた。また、破砕効率の比較として、細胞からｍｉＲＮＡを抽出する製品であるＱＩＡＧＥＮ社ｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔを用いた。破砕効率の比較結果を図６に示す。
［ｍｉＲＮＡ精製］
　流路内に小型化したシリカメンブレンを固定し、ｍｉＲＮＡの精製を行った。ｍｉＲＮＡを含むエキソソーム破砕液を吸引操作し、シリカメンブレンを通過させた。続いてシリカメンブレンの洗浄、乾燥を行った後、ｍｉＲＮＡ溶出液を導入しｍｉＲＮＡを回収した。ｍｉＲＮＡ回収量は定量リアルタイムＰＣＲにより求めた。また、一般的なスピンカラム法との比較として、ＱＩＡＧＥＮ社ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いた。
　ｍｉＲＮＡの回収結果を図６に示す。本ユニットではシリカメンブレンのサイズを小型化することによって、所要時間の短縮と使用試薬の低減が達成された。また、サイズの小型化に伴い、少量の溶出液でｍｉＲＮＡを回収することできるようになり、ｍｉＲＮＡ溶液の濃縮が可能となった。
［ｍｉＲＮＡ検出］
　本デバイスは、標的ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１４１、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１２７５、ｍｉＲ－１０７、ｍｉＲ－１８１ａ－２＊、ｍｉＲ－４８４、ｍｉＲ－２１、ｌｅｔ－７ａ，ｌｅｔ－７ｂ，ｌｅｔ－７ｄ，ｌｅｔ－７ｆを検出する。それぞれの標的ｍｉＲＮＡに相補的な配列を有する検出プローブ合計１２種の核酸プローブを設計・合成した。一方、それぞれの標的ｍｉＲＮＡに相補的な配列を有する捕捉プローブをガラス基板上で合成し、スポット状に配置した。
　なお、ｍｉＲ－１４１は前立腺がんまたは卵巣がん由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ－１４３は慢性心疾患由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ－１２７５は乳がん由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ－１０７は前立腺がんまたは卵巣がん由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ－１８１ａ－２＊は前立腺がん由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ－４８４は前立腺がんまたは卵巣がん由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ－２１は前立腺がん、肝臓がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、または肺がん由来のエキソソームに内包される。ｌｅｔ－７ａ、ｌｅｔ－７ｂは大腸がん、肺がん、胃がん、卵巣がん由来のエキソソームに内包される。ｌｅｔ－７ｄ，ｌｅｔ－７ｆは胃がん、卵巣がん由来のエキソソームに内包される。ｍｉＲ－３９は線虫由来のコントロールスポットである。
　標的ｍｉＲＮＡ、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。
（１）標的ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－１４１
［配列：５’－ＵＡＡＣＡＣＵＧＵＣＵＧＧＵＡＡＡＧＡＵＧＧ－３’］ （配列番号１：２２ｍｅｒ）
標的ｍｉＲＮＡ２：ｍｉＲ－１４３
［配列：５’－ＵＧＡＧＡＵＧＡＡＧＣＡＣＵＧＵＡＧＣＵＣ－３’］ （配列番号２：２１ｍｅｒ）

標的ｍｉＲＮＡ３：ｍｉＲ－１２７５
［配列：５’－ ＧＵＧＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＵＧＵＣ－３’］ （配列番号３：１７ｍｅｒ）

標的ｍｉＲＮＡ４：ｍｉＲ－１０７
［配列：５’－ ＡＧＣＡＧＣＡＵＵＧＵＡＣＡＧＧＧＣＵＡＵＣＡ－３’］ （配列番号４：２３ｍｅｒ）

標的ｍｉＲＮＡ５：ｍｉＲ－１８１ａ－２＊
［配列：５’－ ＡＣＣＡＣＵＧＡＣＣＧＵＵＧＡＣＵＧＵＡＣＣ－３’］ （配列番号５：２２ｍｅｒ）

標的ｍｉＲＮＡ６：ｍｉＲ－４８４
［配列：５’－ ＵＣＡＧＧＣＵＣＡＧＵＣＣＣＣＵＣＣＣＧＡＵ－３’］ （配列番号６：２２ｍｅｒ）

標的ｍｉＲＮＡ７：ｍｉＲ－２１
［配列：５’－ ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ－３’］ （配列番号７：２２ｍｅｒ）

標的ｍｉＲＮＡ８：ｌｅｔ－７ａ
［配列：５’－ ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ－３’］ （配列番号８：２２ｍｅｒ）

標的ｍｉＲＮＡ９：ｌｅｔ－７ｂ
［配列：５’－ ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＵＧＵＧＧＵＵ－３’］ （配列番号９：２２ｍｅｒ）

標的ｍｉＲＮＡ１０：ｌｅｔ－７ｄ
［配列：５’－ ＡＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＧＵＵＧＣＡＵＡＧＵＵ－３’］ （配列番号１０：２２ｍｅｒ）

標的ｍｉＲＮＡ１１：ｌｅｔ－７ｆ
［配列：５’－ ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＡＵＵＧＵＡＵＡＧＵＵ－３’］ （配列番号１１：２２ｍｅｒ）

標的ｍｉＲＮＡ１２：ｍｉＲ－３９
［配列：５’－ ＵＣＡＣＣＧＧＧＵＧＵＡＡＡＵＣＡＧＣＵＵＧ－３’］ （配列番号１２：２２ｍｅｒ）
（２）捕捉プローブ１（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ１）
［配列：５’－ｐ－Ｘ１－ｆＳ－３’］
　Ｘ１は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、Ｓはチオール基を表し、ｆは６－ＦＡＭ（６－フルオロセイン）を表す。
Ｘ１：ＡＣＣＡＧＡＣＡＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号１３：６０ｍｅｒ）

捕捉プローブ２（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ２）
Ｘ１：ＧＴＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ（配列番号１４：６０ｍｅｒ）

捕捉プローブ３（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ３）
Ｘ１：ＣＴＣＣＣＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号１５：６０ｍｅｒ）

捕捉プローブ４（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ４）
Ｘ１：ＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡ（配列番号１６：６０ｍｅｒ）

捕捉プローブ５（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ５）
Ｘ１：ＣＡＡＣＧＧＴＣＡＧＴＧＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号１７：６０ｍｅｒ）

捕捉プローブ６（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ６）
Ｘ１：ＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号１８：６０ｍｅｒ）

捕捉プローブ７（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ７）
Ｘ１：ＡＧＴＣＴＧＡＴＡＡＧＣＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号１９：６０ｍｅｒ）

捕捉プローブ８（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ８）
Ｘ１：ＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２０：６０ｍｅｒ）

捕捉プローブ９（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ９）
Ｘ１：ＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ（配列番号２１：６０ｍｅｒ）

捕捉プローブ１０（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ１０）
Ｘ１：ＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２２：６０ｍｅｒ）

捕捉プローブ１１（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ１１）
Ｘ１：ＡＴＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ（配列番号２３：６０ｍｅｒ）

捕捉プローブ１２（Ｃａｐｔｕｒｅ　ｐｒｏｂｅ１２）
Ｘ１：ＴＴＴＡＣＡＣＣＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡ（配列番号２４：６０ｍｅｒ）
（３）検出プローブ１（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ１）
［配列：５’－ｐ－Ｘ２－Ａｌ－Ｘ３－３’］
　Ｘ２、Ｘ３は以下の配列を表し、ｐはリン酸を表し、ＡｌはＡｌｅｘａ６４７－ＡｍｉｎｏＣ６－ｄＡを表す。
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＴ（配列番号２６：２６ｍｅｒ）

検出プローブ２（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ２）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＧＣＴＡＣＡ（配列番号２７：２６ｍｅｒ）

検出プローブ３（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ３）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴ（配列番号２８：２６ｍｅｒ）

検出プローブ４（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ４）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＧＡＴＡＧＣＣ（配列番号２９：２６ｍｅｒ）

検出プローブ５（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ５）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＧＧＴＡＣＡＧＴ（配列番号３０：２６ｍｅｒ）

検出プローブ６（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ６）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＴＣＧＧＧＡＧ（配列番号３１：２６ｍｅｒ）

検出プローブ７（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ７）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＣＡＡＣＡＴＣ（配列番号３２：２６ｍｅｒ）

検出プローブ８（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ８）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＡＣ（配列番号３３：２６ｍｅｒ）

検出プローブ９（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ９）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＣＡ（配列番号３４：２７ｍｅｒ）

検出プローブ１０（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ１０）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＧＣ（配列番号３５：２６ｍｅｒ）

検出プローブ１１（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ１１）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：)ＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＴＡＣＡ（配列番号３６：２７ｍｅｒ）

検出プローブ１２（Ｄｅｔｅｃｔ　ｐｒｏｂｅ１２）
Ｘ２：ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧ（配列番号２５：１７ｍｅｒ）
Ｘ３：（配列番号３７：２６ｍｅｒ）
　上述した捕捉プローブを固定したＤＮＡマイクロアレイ基板を、表１の溶液に接触させながら室温で９０分放置した。ＤＮＡマイクロアレイ基板を超純水で洗浄・乾燥後、回転式混合器（生体分子検出部）に設置した。
　表１中、Ｔａｋａｒａ　１０×ｂｕｆｆｅｒの組成は、５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　ＤＴＴである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　さらに、任意の濃度のｍｉＲＮＡ溶液を表２のように調製し、検出プローブ１を含有するハイブリダイゼーション反応溶液を表３のように調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　調製したｍｉＲＮＡ溶液とハイブリダイゼーション反応溶液とをそれぞれ別のインレットから導入し、回転式混合器で１０分間循環させてハイブリダイゼーションさせた。
　ハイブリダイゼーション反応終了後、上記のインレットから０．３Ｍ　ＮａＣｌと３０ｍＭ　クエン酸ナトリウムを含む洗浄液を５００μｌ流してＤＮＡマイクロアレイ基板を洗浄し、蛍光顕微鏡で観察し、蛍光強度を測定した。
　結果を図７（Ａ）及び図７（Ｂ）に示す。図７（Ａ）は、ｍｉＲＮＡ検出結果を示す基板の画像である。図７（Ｂ）は、左の画像のスポットに対応しており、網掛けで示したスポットが、標的ｍｉＲＮＡに対応するスポットで、蛍光が観察されるべきスポットである。各アルファベットは下記のｍｉＲＮＡに対応している。
　A：141、B：143、C：1275、D：107、E：181a-2*、F：484、S：let-7a、T：let-7b、U：let-7d。
　導入したｍｉＲＮＡに対応するプローブを固定した各スポットにおいて、Ａｌｅｘａ６４７標識された検出プローブの蛍光像が観察された。なお、「C」のｍｉＲ-１２７５は、検出限界濃度を確認するため他のｍｉＲＮＡの１０００分の１の濃度で入れたため、蛍光が暗くなっている。また、プローブの配列ごとに明るさが異なるのは、プローブの親和性が異なるためである。
　このことから、ｍｉＲＮＡを配列依存的に検出できることが確認された。
［流体デバイスにおけるバルブの開閉］
　本実施例におけるバルブの開閉動作を説明するための流体デバイスの模式図を図９（Ａ）に示す。本デバイスは、エキソソーム精製ユニット（エキソソーム精製部２）、ｍｉＲＮＡ精製ユニット（生体分子精製部３）、ＤＮＡチップ（生体分子検出部４）、廃液槽７、廃液槽８、廃液槽９を備える。廃液槽は吸引口を備える。
　図９（Ｂ）に示すような、各工程におけるバルブの開閉制御により、流体の流れを制御できることが確認された。たとえば、上清導入の際には、図９（Ａ）のバルブ１番（１）、バルブ３番（３）、バルブ５番（５）、バルブ７番（７）、バルブ８番（８）、バルブ１０番（１０）、バルブ１３番（１３）を開き、上清廃液槽の吸引口Ａから溶液を吸引する。
　以上の結果から、本実施形態によれば、サンプルをデバイスに導入することで一連の流れでエキソソーム内容物まで分析できる。
　１，２０…流体デバイス、２…エキソソーム精製部、２ａ…洗浄液導入用インレット、２ｂ…サンプル導入用インレット、２ｃ…破砕液導入用インレット、２ｄ…エキソソーム固定部、２ｅ，２ｆ，２ｇ，３ｄ，３ｆ，５ａ，１０ａ，１１ａ，…バルブ、２ｈ，２ｉ，２ｊ，３ｅ，３ｇ…流路、３…生体分子精製部、３ｂ…生体分子回収液導入用インレット、３ｃ…生体分子固定部、４…生体分子検出部、４ａ…検出プローブ導入用インレット、４ｂ…洗浄液導入用インレット、４ｃ…基板、５…第一の流路、６…第二の流路、７…第一の廃液槽、８…第二の廃液槽、９…第三の廃液槽、１０…第三の流路、１１…第四の流路、１２…第五の流路、３３…ｍｉＲＮＡ、３１…第一の部分、３２…第二の部分、３４…捕捉プローブ、３４ａ…スペーサー、３５…検出プローブ、３５ａ…標識物質、３５ｂ…配列、３５ｃ，３５ｄ…ステム部、３６…基板。

Claims (20)

  1. 　サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を検出する流体デバイスであって、
    　疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部と、
    　生体分子精製部と、
    　生体分子検出部と、
    　前記エキソソーム精製部と前記生体分子精製部を繋ぐ第一の流路と、
    　前記生体分子精製部と前記生体分子検出部を繋ぐ第二の流路と、
    　を備えたことを特徴とする流体デバイス。
  2. 　前記エキソソーム精製部は、前記エキソソームの固定と、前記エキソソームの破砕とを行う請求項１に記載の流体デバイス。
  3. 　前記エキソソーム精製部は、
    　インレットと、
    　前記疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム固定部と、
    　を備えた請求項１又は２に記載の流体デバイス。
  4. 　前記インレットは、
    　サンプル導入用インレット及びエキソソーム破砕液導入用インレット
    　を備えた請求項１～３のいずれか一項に記載の流体デバイス。
  5. 　前記第一の流路は、前記生体分子を含む前記エキソソームの破砕液を前記エキソソーム精製部から前記生体分子精製部に送液する流路であり、
    　前記第二の流路は、精製された前記生体分子を含む溶液を前記生体分子検出部に送液する流路である請求項１～４のいずれか一項に記載の流体デバイス。
  6. 　更に廃液槽と、
    　前記廃液槽と前記エキソソーム精製部を繋ぐ第三の流路と、
    　前記廃液槽と前記生体分子精製部を繋ぐ第四の流路と、
    　前記廃液槽と前記生体分子検出部を繋ぐ第五の流路と、
    　を備えた請求項１～５のいずれか一項に記載の流体デバイス。
  7. 　前記生体分子精製部は、
    　生体分子回収液導入用インレットと、
    　生体分子固定部と、
    　を備えた請求項１～６のいずれか一項に記載の流体デバイス。
  8. 　前記生体分子検出部は、前記生体分子に親和性を有する物質が固定されてなる基板を備えた請求項１～７のいずれか一項に記載の流体デバイス。
  9. 　前記生体分子はｍｉＲＮＡであり、前記生体分子検出部は、標的ｍｉＲＮＡに相補的なプローブが固定されてなる基板を備えた請求項１～８のいずれか一項に記載の流体デバイス。
  10. 　前記生体分子検出部は、
    　標的ｍｉＲＮＡを第一の部分と第二の部分に分割した場合に、前記第一の部分とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブが固定されてなる基板と、
    　検出プローブ導入用インレットと、を備え、
    　前記検出プローブは、二本鎖を形成する二つのステム部と、該二つのステム部間の領域であり、標識物質により標識されているループ部と、
    　標的ｍｉＲＮＡを第一の部分と第二の部分に分割した場合に、前記第二の部分とハイブリダイズし得る配列を有し、５’突出末端又は３’突出末端を有する請求項１～９のいずれか一項に記載の流体デバイス。
  11. 　前記エキソソーム精製部は、前記エキソソームを固定後、前記エキソソームの表面に存在する生体分子の検出を行う、請求項２～１０のいずれか一項に記載の流体デバイス。
  12. 　前記インレットは、エキソソーム表面の生体分子を検出する検出溶液の導入用インレットを含む、請求項３～１１のいずれか一項に記載の流体デバイス。
  13. 　サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を精製する流体デバイスであって、
    　サンプル導入用インレット及びエキソソーム破砕液導入用インレットと、
    　前記疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム固定部と、
    　を備えたことを特徴とする流体デバイス。
  14. 　疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部上でエキソソームを精製し、破砕する工程を有することを特徴とするエキソソームの分析方法。
  15. 　更に、前記破砕されたエキソソームから流出する生体分子を精製し、検出する工程を有する請求項１４に記載のエキソソームの分析方法。
  16. 　（ａ）流体デバイス中の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板に、エキソソーム含有試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物にエキソソームを結合させる工程と、
    　（ｂ）前記エキソソームが結合した基板に破砕液を流入して前記エキソソームを破砕し、内包される生体分子を放出させる工程と、
    　（ｃ）前記生体分子を精製する工程と、
    　（ｄ）前記生体分子を検出する工程と、
    を有することを特徴とする生体分子分析方法。
  17. 　前記精製工程（ｃ）は、
    　（ｃ１）前記生体分子を捕捉部に捕捉する工程と、
    　（ｃ２）前記生体分子を捕捉部から溶出させる工程と、
    　を有する請求項１６に記載の生体分子分析方法。
  18. 　工程ｃ１において、前記生体分子を含む前記破砕液を前記捕捉部に送液し、前記破砕液に含まれる前記生体分子を捕捉する請求項１７に記載の生体分子分析方法。
  19. 　前記工程（ａ）の後、前記エキソソームが結合した基板上で、前記エキソソームの表面に存在する生体分子の検出を行う工程を有する、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の生体分子分析方法。
  20. 　（ａ）疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された基板に脂質二重層で囲まれた構造体を含有する試料を接触させて、前記基板上の疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物に前記脂質二重層で囲まれた構造体を結合させる工程と、
    　（ｂ）前記膜小胞体を破砕し、内包される生体分子を放出させる工程と、
    　（ｄ）前記生体分子を検出する工程と、
    を有することを特徴とする生体分子検出方法。
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