JP2018191636A - 癌の診断デバイス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】癌細胞由来の細胞外小胞が有する表面糖鎖に特異的に結合し得るレクチンが固定化された固定化担体を、1種または2種以上の上記表面糖鎖のそれぞれに対応させて備える細胞外小胞捕捉部と、上記細胞外小胞に含まれるマイクロRNAを検出するための検出部と、を備える癌の診断デバイス。
【選択図】図1
Description
本発明の一実施形態に係る癌の診断デバイスは、癌細胞由来の細胞外小胞が有する表面糖鎖に特異的に結合し得る1種または2種以上のレクチンが固定化された固定化担体を、1種または2種以上の上記表面糖鎖のそれぞれに対応させて備え、上記表面糖鎖と、上記レクチンとの特異的な結合によって上記細胞外小胞を捕捉する細胞外小胞捕捉部と、上記細胞外小胞に含まれるマイクロRNAを検出するための検出部と、を備える。
(A)細胞外小胞、表面糖鎖、レクチン
既に述べたように、癌細胞および正常細胞は、血中等に細胞外小胞を分泌している。当該細胞外小胞としては、エクソソーム、マイクロパーティクル、アポトーシス小体等が挙げられる。癌細胞由来の細胞外小胞が有するタンパク質は、当該細胞外小胞に特異的な表面糖鎖を有する。「表面糖鎖」とは、上記タンパク質分子の表面に結合した糖鎖をいう。
クチンおよびタイプIVレクチンからなる群より選ばれる1種または2種以上のレクチンを用いることができる。図8は、高マンノース型糖鎖の構造の一例を示す図である。図中、D1〜D3は、それぞれD1アーム〜D3アームを表す。
本発明の一実施形態に係る癌の診断デバイスは、レクチンが固定化された固定化担体を備える。上記固定化担体としては、例えば、モノリスゲル、ビーズ(例えば、ガラスビーズ)等の無機質固定化担体、天然または合成高分子からなるラテックスまたはビーズ、天然または合成高分子からなる繊維、織布、不織布、中空糸等の有機質固定化担体(フィルター)等を使用することができる。これらの固定化担体は、後述する配向制御を行いやすくする観点から、一級アミノ基を有する固定化担体であることが好ましい。
上記レクチンを固定化担体に固定化する方法は特に限定されないが、上記のように高密度に固定化するためには、上記レクチンを配向制御して固定化担体に固定化することが好ましい。配向制御したレクチンの固定化とは、レクチンをペプチド鎖の一端で上記固定化担体に固定化することをいい、例えばペプチド鎖のカルボキシ末端で固定化することをいう。配向制御してレクチンを固定化する方法としては、例えば特許第2517861号公報、特開2000−119300号公報、特開2003−344396号公報に記載の方法が挙げられる。
(式中、R1は任意のアミノ酸残基を表す)
次に、一般式(2)で表されるポリペプチドに、以下の一般式(3)で表されるペプチドが結合した、以下の一般式(4)で表される融合ポリペプチドを作製し、この融合ポリペプチドのSH基をシアノ化することによって、以下の一般式(5)で示されるシアノ基含有ポリペプチドに転換し、これを、以下の一般式(6)に示される固定化担体に導入された一級アミノ基に結合させることによって、以下の一般式(1)で示されるポリペプチドとして固定化担体に固定化することができる。
(式中、R2は任意のアミノ酸残基、Xは、OHもしくは任意のアミノ酸残基を表す)
NH2 -R1 -CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SH)-CO-X・・・(4)(式中、R1及びR2は任意のアミノ酸残基、Xは、OHもしくは任意のアミノ酸残基を表す)
NH2 -R1 -CO-NH-R2-CO-NH-CH(CH2-SCN)-CO-X・・・(5)
(式中、R1及びR2は任意のアミノ酸残基、Xは、OHもしくは任意のアミノ酸残基を表す)
NH2 -Y・・・(6)
(式中、Yは任意の固定化担体を表す)
NH2 -R1-CO-NH-R2-CO-NH-Y・・・(1)
(式中、R1及びR2は任意のアミノ酸残基、Yは任意の固定化担体を表す)
一般式(1)に示すように、R2は、固定化しようとする一般式(2)で表されるポリペプチドと、一級アミノ基との間のリンカーペプチド(リンカー配列)となる。R2は任意のアミノ酸残基であり、アミノ酸の種類、数ともに特に限定されないが、例えば、グリシン5残基からなる配列、グリシン6残基からなる配列などを用いることができる。なお、R1も任意のアミノ酸残基であり、アミノ酸の種類、数ともに特に限定されない。
& Catsipoolas, J.Biol.Chem. 233, 2887(196
3))に記載の方法に従っても行うことができる。
上記細胞外小胞捕捉部は、癌細胞由来の細胞外小胞が有するタンパク質の表面糖鎖に特異的に結合し得るレクチンを用いることにより、上記細胞外小胞を正常細胞由来の細胞外小胞と区別して選択的に捕捉することができる。捕捉された細胞外小胞に含有されるマイクロRNAを抽出し、上記表面糖鎖のパターンと、細胞外小胞に含有されるマイクロRNAの存在パターンとを解析することにより、初期の癌種の特定や、再発・転移を初期の段階で診断することが可能となる。そこで、以下、上記固定化担体からマイクロRNAを抽出する方法について説明する。
本発明の一実施形態に係る癌の診断デバイスは、上記細胞外小胞に含まれるマイクロRNAを検出するための検出部を備える。上記検出部としては、例えば、細胞外小胞に含まれ得るマイクロRNAのcDNAをプローブとして固定したアレイ、マイクロRNAを増幅するためのウェル等を挙げることができる。
次に、図1〜3を参照して、本発明の一実施形態に係る癌の診断デバイス、およびこれを用いた癌の診断について説明する。
スピンカラムに充填された固定化担体であるシリカモノリスに、タイプIのレクチンであるOAAを固定化することによって得られたOAA固定化スピンカラムを用いて、エクソソーム(およびエクソソームに発現したタンパク質)の捕捉を行った。実験は3回繰り返し、結果をその平均として示した。
メラノーマ細胞としては、ATCCから購入したA375(ATCC(登録商標) CRL−1619)を用いた。
上記超遠心画分1、溶出液2a、3a、4を、SDS−PAGEに供した。SDS−PAGEは、低分子量タンパク質測定用に改善されたSchaggerとJagowの方法(1987)に順じ、トリス-トリシン系緩衝液(3.0M Tris−HCl、0.3%SDS、pH8.45)中で、12%アクリルアミドゲルを用いて行った。下部電極液に陽極緩衝液(0.2M Tris−HCl、pH8.9)、上部電極液に陰極緩衝液(0.1M Tris−HCl、0.1Mトリシン, 0.1%SDS、 pH8.25)を使用した。試料にSDS−PAGE試料用緩衝液を添加後、100℃で5分間加熱処理して、泳動用試料とした。電気泳動装置(AE−6530、ATTO)にゲルをセットして、定電圧(CV)100V、90分間通電した。泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルーを用いてタンパク質染色した。上記超遠心画分1、溶出液2a、3a、4の添加量は、培養液の遠心上清1mlに相当する量とした。
次に、上記超遠心画分1、溶出液2a、3a、4を、一次抗体として、5000倍希釈したマウス抗CD9抗体(BD Pharmagen製)を用い、二次抗体として、10000倍希釈したHRP(horseradish peroxidase)標識ヤギ抗マウスIgG抗体(Santa Cruz Biotechnology製)を用いたウエスタンブロットに供した。超遠心画分1、溶出液2a、3a、4の添加量は、培養液の遠心上清1mlに相当する量とした。
上記超遠心画分1、溶出液2a、3a、4を、一次抗体としてマウス抗CD63抗体(Santa Cruz Biotechnology製)を用い、二次抗体としてHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(Santa Cruz Biotechnology製)を用いたウエスタンブロットに供した。超遠心画分1、溶出液2a、3a、4の添加量は、培養液の遠心上清1mlに相当する量とした。抗CD63抗体とは、抗CD9抗体同様、エクソソームに共通する抗原CD63に対する抗体である。CD63は、34〜55kDaの分子量を有している。
実施例1において得られたエクソソームに内包されるマイクロRNAを、RT−PCR法により定量した。エクソソームからのマイクロRNAの抽出は、RNA結合スピンカラム(Qiagen製、miRNeasy Serum/Plasma Kit)を用いて、当該カラムに捕捉されたマイクロRNAをRNase free waterで溶出させることによって行った。また、RT−PCRは、high-capacity逆転写酵素で反応を行った後に、real time PCRにてマイクロRNAのレベルを検出し、定量することによって行った。
実施例1において得られた溶出液2cに、10倍容の10%TCA/アセトン溶液を添加し、−20℃で1時間静置後、遠心分離(4℃、15,000×g、10分)した。上清を除去後、沈殿に1mlの氷冷アセトンを加え、−20℃で10分間静置後、遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作をさらに9回繰り返した後、沈殿を風乾して得た乾固試料を、−20℃で保存した。
実施例1で用いたAIST−OAA1固定スピンカラムを用いて、メラノーマ細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞、乳癌細胞および前立腺癌細胞の培養上清から、エクソソーム(およびエクソソームに発現したタンパク質)の捕捉を行った。実験は3回繰り返し、結果をその平均として示した。AIST−OAA1固定スピンカラムのブランクカラムとしては、AIST−OAA1を固定していないこと以外はAIST−OAA1固定スピンカラムと同じであるポリリジンコーティングカラム(京都モノテック製)を、実施例1に記載した平衡化を行った後に用いた。
(1)ヒト癌由来細胞株
メラノーマ細胞としては実施例1で用いたA375を用いた。大腸癌細胞としてはATCCから購入したHT−29(ATCC(登録商標) HTB−38)を用いた。肝癌細胞(HepG2:JCRB1054)、脾臓癌細胞(MIAPaCa−2:JCRB0070)、乳癌細胞(MCF−7:JCRB0134)および前立腺癌細胞(PC−3:JCRB9110)は、JCRB細胞バンクから購入した。
A375、HT−29およびHepG2細胞は、 10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS, Biowest)および 1%(v/v)ペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco)を含有するDMEM培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium(Sigma)を用いて培養した。
15ml容ファルコンチューブに、37℃のウォーターバスで温めたFBS添加培地(上記(2)で述べた各培地)10mlを加えた。並行して、上記(1)に記載したヒト癌由来細胞株の凍結標品が入った保存チューブを37℃のウォーターバスに浸した。凍結細胞が半解凍したところで、それぞれの細胞を、先に用意したFBS添加培地10mlに添加した。
清澄化癌細胞培養上清を、表1の「供試量(ml)」に示した量、超遠心分離機(Himac)に供して、超遠心(4℃, 100,000×g, 70分)を行い、上清を廃棄した。細胞外小胞を含む残渣にリン酸緩衝液10mlを加えてピペッティング後、更に同様の超遠心処理に付し、洗浄した。上清を除去後、残渣をリン酸緩衝液中に懸濁させ、回収した。この懸濁液を超遠心画分とした。以下、超遠心画分を「細胞外小胞画分」または「EVs画分」と記載する場合がある。
上記1.(4)で得られた6種の癌細胞由来の超遠心画分に含まれるタンパク質の量は、Micro BCA protein assay kit(Thermo Fischer Scientific)を用いて測定した。上記1.(3)にて回収した清澄化癌細胞培養上清について、表1に示した「供試量(ml)」から得られた超遠心画分に含まれるタンパク質の量は、A375が82.5μg、MCF−7が59.4μg、HT−29が32.5μg、PC−3が25.0μg、HepG2が10.0μg、MIA−PaCa2が42.0μgであった。
まず、HT−29およびMIA−PaCa2について、清澄化癌細胞培養上清(上記1.(3))と、当該清澄化癌細胞培養上清から調製した超遠心画分(上記1.(4))とをそれぞれ用意し、AIST−OAA1カラムに添加し、細胞外小胞の捕捉を行った。手順を図9に示す。
SDS−PAGEは、実施例1と同じ条件で行った。ウエスタンブロッティングは、一次抗体として、5000倍希釈したマウス抗CD9抗体(BD Pharmagen製)の他に、5000倍希釈したマウス抗CD81抗体(Thermo Fisher Scientific製)をも用いたこと以外は、実施例1と同じ条件で行った。抗CD9抗体および抗CD81抗体は、それぞれ、エクソソームに共通する抗原であるCD9およびCD81に対する抗体である。
図11に示された抗CD9抗体陽性バンドの染色強度に基づいて、捕捉回収されたEVsの相対的定量解析を行った。上記バンドは、エクソソームに共通する抗原であるCD9の存在を示すため、エクソソームの存在を示すと考えられる。
A375につき、超遠心法で得られた超遠心画分(図11のレーン1)、および、清澄化癌細胞培養上清をAIST−OAA1カラムに添加した後に得られたAIST−OAA1カラム溶出画分(図11のレーン5)に含まれるmiRNAのプロファイル解析を行った。使用機器は、AgilentのSurePrint G3 Human miRNA Microarrayである。このアレイ解析は、2588種のmiRNAの検出に対応しており、サンプルに含まれるmiRNAを半網羅的に検出し、定量することができる。
(1)A375からの細胞外小胞の調製
メラノーマ由来の細胞外小胞の表面糖鎖の解析を行うために、まず、A375から超遠心画分を調製した。図13は、A375の細胞外小胞の特性を示す図であり、図13の(a)は超遠心画分の調製の手順を示す図である。
ウエスタンブロットは、一次抗体として、マウス抗Alix抗体(Santa Cruz Biotechnology製)、マウス抗Hsp70抗体(Santa Cruz Biotechnology製)、ラビット抗Flotillin-1抗体(Santa Cruz Biotechnology製)、マウス抗CD63抗体(Santa Cruz Biotechnology製)およびマウス抗CD81抗体(Santa Cruz Biotechnology製)を用いたこと以外は、実施例1と同じ条件で行った。Alix、Hsp70、Flotillin-1、CD63およびCD81は、エクソソームに共通する抗原である。
上記(1)で得た超遠心画分(細胞外小胞画分)を、上記最終継代培養を行った培養液に含まれる細胞外小胞の濃度となるようにPBSで希釈した。
上記(1)で得た超遠心画分を、ラベルせずにTEMを用いて観察した結果を図13の(d)の左図に示し、上記(1)で得た超遠心画分を免疫金標識し、TEMを用いて観察した結果を図13のd)の右図に示す。抗体としては抗マウスAlix抗体(Santa Cruz Biotechnology製)を用いた。図13のd)の右図に示すように、上記超遠心画分には、エクソソームが矢印で示す位置に存在することが明らかとなった。
上記(1)で得た超遠心画分中の細胞外小胞の表面に発現する高マンノース型N型糖鎖を、HPLCを用いて解析した。まず、上記(1)で得た超遠心画分100μgを、エンドグリコシダーゼH(Endo H、Roche製)3.8(v/v)%と37℃で反応させ、細胞外小胞から糖鎖を切断した。当該糖鎖画分をエタノール沈殿することによって回収し、凍結乾燥した。
上記(5)にてエンドグリコシダーゼHで処理した超遠心画分、および、エンドグリコシダーゼHの代わりにPBSで処理した対照の超遠心画分を、SDS-PAGEに供した。電気泳動の条件は実施例1と同じである。泳動したSDSポリアクリルアミドゲルをニトロセルロース膜に転写し、ブロッキングした後、5μg/mlのOAA溶液(溶媒は1% BSA/リン酸緩衝液(pH7.4)、0.02%Tween20(以下「PBS−T」と称する))と室温で2時間反応させ、OAAを細胞外小胞の表面糖鎖と反応させた。
上記(5)にてエンドグリコシダーゼHで処理した超遠心画分30μgを、OAA1.2μgと共にインキュベート(室温、2時間)し、次いで超遠心(100,000g、70分、4℃)を行った。得られた沈殿および上清(Sup)を、マウス抗6xHis抗体(和光純薬製)、マウス抗Alix抗体(Santa Cruz Biotechnology製)、ラビット抗flotillin−1抗体(Santa Cruz Biotechnology製)、およびラビット抗CD9抗体(SBI製)を用いたウエスタンブロットに供した。ウエスタンブロットは、上記(2)と同様の手順で行った。
ここでは、実施例1等で用いたAIST−OAAスピンカラムの代わりに、OAAをプロテインG固相化磁性ビーズに固相化したOAA固相化磁性ビーズを用いて、A375由来細胞外小胞の精製を行った。
11・・・送液システム
12・・・プレート
13、15a〜15c、19a〜19c、21a〜21c・・・流路(第1〜第4の流路)
14・・・導入部
16〜18・・・細胞外小胞捕捉部
16’〜18’ ・・・細胞外小胞捕捉部の収容部
20a〜20c・・・排出部
22・・・マイクロRNA収容部
23・・・廃液収容部
24・・・マイクロパーティクルから抽出されたマイクロRNAの収容部
25・・・エクソソームから抽出されたマイクロRNAの収容部
Claims (10)
- 癌細胞由来の細胞外小胞が有する表面糖鎖に特異的に結合し得る1種または2種以上のレクチンが固定化された固定化担体を、1種または2種以上の上記表面糖鎖のそれぞれに対応させて備え、上記表面糖鎖と、上記レクチンとの特異的な結合によって上記細胞外小胞を捕捉する細胞外小胞捕捉部と、
上記細胞外小胞に含まれるマイクロRNAを検出するための検出部と、
を備えることを特徴とする、癌の診断デバイス。 - 上記細胞外小胞が、エクソソームおよび/またはマイクロパーティクルであることを特徴とする、請求項1に記載の癌の診断デバイス。
- 上記固定化担体が、モノリスゲルまたはレクチン固相化磁性ビーズであることを特徴とする、請求項1または2に記載の癌の診断デバイス。
- 上記モノリスゲルがシリカモノリスであることを特徴とする、請求項3に記載の癌の診断デバイス。
- 試料を上記細胞外小胞捕捉部に導入する導入部と、上記細胞外小胞捕捉部から溶出されたマイクロRNAを含む液を排出する排出部とを備え、
上記導入部と上記排出部との間に上記細胞外小胞捕捉部が配置され、上記導入部と、上記細胞外小胞捕捉部との間、および、上記細胞外小胞捕捉部と上記排出部との間に流路を備え、
上記排出部が、上記固定化担体の数に対応させて設けられていることを特徴とする、請求項1から4のいずれか1項に記載の癌の診断デバイス。 - 上記1種または2種以上のレクチンは、
上記表面糖鎖が高マンノース型糖鎖である場合は、1種または2種以上の高マンノース型糖鎖結合性レクチンであり、
上記表面糖鎖がシアリルルイス型糖鎖である場合は、1種または2種以上のシアリルルイス型糖鎖結合性レクチンであり、
上記表面糖鎖がコアα1‐6フコースである場合は、1種または2種以上のコアα1‐6フコース結合性レクチンであることを特徴とする、請求項1から5のいずれか1項に記載の癌の診断デバイス。 - 上記高マンノース型糖鎖結合性レクチンが、SolninA、SolninB、SolninC、ESA−1、ESA−2、EAA−1、EAA−2、EAA−3、EDA−1、EDA−2、EDA−3、ECA−1(KAA−1)、ECA−2(KAA−2)、KAA−3、KSA−1、KSA−2、MPA−1、MPA−2、Granin−BP、ASL−1、ASL−2、OAA、BCA、BPL17、BML17、BCL17、およびMPL−1からなる群より選ばれる1種または2種以上のレクチンであることを特徴とする、請求項6に記載の癌の診断デバイス。
- 上記シアリルルイス型糖鎖結合性レクチンがセレクチンであることを特徴とする、請求項6に記載の癌の診断デバイス。
- 上記コアα1‐6フコース結合性レクチンが、HypninA−1、HypninA−2、およびHypninA−3からなる群より選ばれる1種または2種以上のレクチンであることを特徴とする、請求項6に記載の癌の診断デバイス。
- 上記細胞外小胞が、血液、血漿、血清、唾液、涙、拭い液、痰、尿、髄液、羊水、関節液、腹水、および胸水からなる群より選ばれる1種または2種以上の試料に含まれることを特徴とする、請求項1から9のいずれか1項に記載の癌の診断デバイス。
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