JP2020201202A - エクソソームの表面分子および内包分子を検出する方法 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
[1]以下の工程を含む、エクソソームの表面分子および内包分子を検出する方法:
(A)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iが固相化された担体を用いて被験試料に含まれるエクソソームの表面分子を検出する工程、
(B)表面分子を検出されたエクソソームを回収する工程、および
(C)エクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体を用いて回収されたエクソソームの内包分子を検出する工程;
[2](A)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iが固相化された担体を用いて被験試料に含まれるエクソソームの表面分子を検出する工程が以下の工程を含む、[1]に記載の方法:
(1)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iが固相化された担体表面をブロッキングバッファーで処理する工程、
(2)該担体を洗浄バッファーで洗浄する工程、
(3)エクソソームを含む被験試料とサンプルバッファーの混合物を該担体に接触させる工程、
(4)該担体をサンプルバッファーで洗浄する工程、および
(5)該エクソソームの表面分子と該結合性分子Iの結合を検出することによって該表面分子を検出する工程;
[3](C)エクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体を用いて表面分子を回収されたエクソソームの内包分子を検出する工程が以下の工程を含む、[1]または[2]に記載の方法:
(6)回収されたエクソソームから内包分子を含む被験試料を抽出する工程、
(7)エクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体表面をブロッキングバッファーで処理する工程、
(8)該担体を洗浄バッファーで洗浄する工程、
(9)該被験試料とサンプルバッファーの混合物を該担体に接触させる工程、
(10)該担体をサンプルバッファーで洗浄する工程、および
(11)該エクソソームの内包分子と該結合性分子IIの結合を検出することによって該内包分子を検出する工程;
[4]回収されたエクソソームから内包分子を含む被験試料を抽出する工程が、物理的手段または化学的手段によって抽出する工程である、[3]に記載の方法;
[5]以下の工程を含む、エクソソームの表面分子および内包分子を検出する方法:
(A’)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iおよびエクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体を用いて被験試料に含まれるエクソソームの表面分子を検出する工程、および
(B’)該担体を用いて該表面分子を検出されたエクソソームの内包分子を検出する工程;
[6](A’)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iおよびエクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体を用いて被験試料に含まれるエクソソームの表面分子を検出する工程が以下の工程を含む、[5]に記載の方法:
(1’)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iおよびエクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体表面をブロッキングバッファーで処理する工程、
(2’)該担体を洗浄バッファーで洗浄する工程、
(3’)エクソソームを含む被験試料とサンプルバッファーの混合物を該担体に接触させる工程、
(4’)該担体をサンプルバッファーで洗浄する工程、および
(5’)該エクソソームの表面分子と該結合性分子Iの結合を検出することによって該表面分子を検出する工程;
[7](B’)該担体を用いて該表面分子を検出されたエクソソームの内包分子を検出する工程が以下の工程を含む、[5]または[6]に記載の方法:
(6’)表面分子を検出されたエクソソームから該担体上で内包分子を含む被験試料を抽出する工程、
(7’)該被験試料とサンプルバッファーの混合物を該担体に接触させる工程、
(8’)該担体をサンプルバッファーで洗浄する工程、および
(9’)該エクソソームの内包分子と該結合性分子IIの結合を検出することによって該内包分子を検出する工程;
[8]表面分子を検出されたエクソソームから担体上で内包分子を含む被験試料を抽出する工程が、物理的手段または化学的手段によって抽出する工程である、[7]に記載の方法;
[9]表面分子の検出および内包分子の検出が免疫学的方法または表面プラズモン共鳴法による検出である、[1]〜[8]のいずれか1つに記載の方法;
[10]該結合性分子Iがタンパク質に対する抗体またはアプタマー、糖鎖に対する抗体またはレクチン、または脂質に対する抗体である、[1]〜[9]のいずれか1つに記載の方法;
[11]該結合性分子IIが核酸に対するアンチセンス核酸、タンパク質に対する抗体またはアプタマー、または脂質に対する抗体である、[1]〜[10]のいずれか1つに記載の方法;
[12][1]〜[11]のいずれか1つに記載の方法を実施するためのエクソソーム表面分子および内包分子の検出装置;
[13][1]に記載の方法を実施するための表面分子を検出されたエクソソームの分離装置;
を提供する。
タンパク質としては、例えば、膜タンパク質(内在性膜タンパク質、表在性膜タンパク質)が挙げられる。エクソソームの表面に露出したタンパク質のエクソソームマーカーとしては、例えば、CD9、CD63、CD81などが挙げられる。エクソソームの表面に露出したタンパク質の疾患マーカーとしては、例えば、膀胱がんマーカーであるTACSTD2、EDIL-3、Mucin4、EPS8L2、α6-integrin、MUC-1、Basigin、乳がんマーカーであるSurvivin、Survivin-2B、CEA、Tumor antigen15-3、大腸がんマーカーであるCEA、肺がんマーカーであるEpCAM、EGFR、CEA、LRG-1、CD151、CD171、tetraspanin 8、初期大腸がんマーカーであるannexinファミリータンパク質(annexin A3、A4およびA11)、メラノーママーカーであるCD63、Caveolin1、TYRP2、VLA-4、HSP70、咽頭がんマーカーであるLMP1、Galectin-9、BARF-1、子宮がんマーカーであるClaudin-4、L1CAM、CD24、ADAM10、EMMPRIN、TGFβ1、MAGE3/6、膵臓がんマーカーであるGPC1、MIF、前立腺がんマーカーであるTransmembrane protease Serine2-ETS、β-catenin、PCA3、PSA、ガン転移マーカーであるcasein kinase II α、annexin A2、白血病マーカーであるNKG2D、NKp46などが挙げられる。
糖鎖としては、例えば、N-グリコシド結合糖鎖、O-グリコシド結合糖鎖などが挙げられる。エクソソームの表面に露出した糖鎖のエクソソームマーカーとしては、例えば、高マルノース、シアル酸、フコースなどが挙げられる。エクソソームの表面に露出した糖鎖の疾患マーカーとしては、例えば、胆管癌マーカーであるCA19-9、N-アセチルガラクトサミン、シアル酸などが挙げられる。エクソソームの表面に露出した糖鎖の疾患促進因子としては、例えば、胆管癌マーカーであるCA19-9、N-アセチルガラクトサミン、シアル酸などが挙げられる。
脂質としては、例えば、リン脂質、スフィンゴミエリン、コレステロール、セラミド、脂質ラフト、糖脂質などが挙げられる。糖脂質としては、例えば、スフィンゴ糖脂質などが挙げられる。エクソソームの表面に露出した脂質のエクソソームマーカーとしては、例えば、bismonoacyl glycerophosphate、cholesteryl ester、cholesterol、ceramide、diacylglycerol、globotriaosylceramide、hexosylceramide、hexadecylglycerol、lactosylceramide、lysobisphosphatic acid、phosphatidic acid、phosphatidylcholine; PC ethers (alkyl or alkenyl)、phosphatidylethanolamine、PE ethers (alkyl or alkenyl) 、phosphatidylglycerol、phosphatidylinositol、phosphatidylserine、sphingomyelin、Triacylglycerolなどが挙げられる。エクソソームの表面に露出した脂質の疾患マーカーとしては、例えば、前立腺がんマーカーであるPhosphatidylglycerol、diacylglycerol、triacylglycerol、乳がんマーカーである27-hydroxychlesterolなどが挙げられる。エクソソームの表面に露出した脂質の疾患促進因子としては、例えば、前立腺がん促進因子であるPhosphatidylglycerolなどが挙げられる。エクソソームの表面に露出した脂質の疾患抑制因子としては、例えば、前立腺がん抑制因子であるdiacylglycerol、triacylglycerolなどが挙げられる。
核酸としては、DNA (例えば、核DNA、ミトコンドリアDNA)およびRNA (例えば、mRNA、miRNA、ウイルスRNA)が挙げられる。エクソソームに内包される核酸の疾患マーカーとしては、例えば、子宮頸がんマーカーであるmir-21、mir-146a、大腸がんマーカーであるlet7a、mir-21、mir-192、mir-221、肝臓がんマーカーであるmir-18a、mir-221、mir-222、mir-224、mir-101、mir-106b、mir-122、mir-195、肺がんマーカーであるmir-21、mir-15、mir-200b5p w、mir-190b、mir-376a-5p、mir-378a、mir-379、mir-139-5p、mir-30a-3p、mir-629、mir-502-5p、mir-1974、mir-17、mir-100、mir-154-3p、mir-139-5p、mir-30a-3p、mir-378a、メラノーママーカーであるmir-17、mir-19a、mir-21、mir-126、mir-149、子宮がんマーカーであるmir-214、mir-140、mir-147、mir-135b、mir-205、mir-150、mir-149、mir-370、mir-206、mir-197、mir-634、mir-485-5p、mir-612、mir-608、mir-202、mir-373、mir-324-3p、mir-103、mir-593、mir-574、mir-483、mir-527、mir-603、mir-649、mir-18a、mir-595、mir-193b、mir-642、mir-557、mir-801、slet-7e、mir-21、mir-141、mir-200、前立腺がんマーカーであるmir-409、mir-14、mir-196a-5p、mir-34a-5p、mir-143-3p、mir-501-3p 、mir-92a-1-5p、不特定のがんマーカーである、p53、NOTCH1、ダウン症マーカーであるmir-196a-5p、mir-501-3p、mir-193b、がんの進行マーカーであるmir-21、アルツハイマー病マーカーであるmir-135、mir-384などが挙げられる。エクソソームに内包される核酸の疾患促進因子としては、例えば、子宮頸がん促進因子であるmir-21、mir-146a、大腸がん促進因子であるlet7a、mir-21、mir-192、mir-221、肝臓がん促進因子であるmir-18a、mir-221、mir-222、mir-224、肺がんに対してmir-21、mir-15、mir-200b5p w、mir-190b、mir-376a-5p、mir-378a、mir-379、mir-139-5p、mir-30a-3p、mir-629、mir-502-5p、mir-1974、mir-17、mir-100、mir-154-3p、メラノーマ促進因子であるmir-17、mir-19a、mir-21、mir-126、mir-149、子宮がん促進因子であるmir-214、mir-140、mir-147、mir-135b、mir-205、mir-150、mir-149、mir-370、mir-206、mir-197、mir-634、mir-485-5p、mir-612、mir-608、mir-202、mir-373、mir-324-3p、mir-103、mir-593、mir-574、mir-483、mir-527、mir-603、mir-649、mir-18a、mir-595、mir-193b、mir-642、mir-557、mir-801s、let-7e、mir-21、mir-141、mir-200、前立腺がんに対してmir-409、mir-141、mir-196a-5p、mir-34a-5p、mir-143-3p、mir-501-3p、mir-92a-1-5p、がんの進行促進因子であるmir-21、アルツハイマー病促進因子であるmir-135、mir-384などが挙げられる。エクソソームに内包される核酸の疾患抑制因子としては、例えば、肝臓がん抑制因子であるmir-101、mir-106b、mir-122、mir-195、肺がんに対してmir-139-5p、mir-30a-3p、mir-378a、前立腺がんに対してmir-196a-5p、mir-501-3p、アルツハイマー病に対してmir-193bなどが挙げられる。
タンパク質としては、細胞内タンパク質であれば特に制限されない。エクソソームに内包されるタンパク質の疾患マーカーとしては、例えば、CD9、PDCD6I、HSPA8、GAPDH、ACTB、ANXA2、CD63、SDCBP、ENO1、HSP90AA1、TSG101、PKM、LDHA、EEF1A1、YWHAZ、PGK1、EEF2、ALDOA、HSP90AB1、ANXA5、FASN、YWHAE、CLTC、CD8、ALB、VCP、TPI1、PPIA、MSN、CFL1 、PRDX1、PFN1、RAP1B、ITGB1、HSPA5、SLC3A2、HIST1H4A、GNB2、ATP1A1、YWHAQ、FLOT1、FLNA、CLIC1、CCT2、CDC42、YWHAG、A2M、TUBA1B、RAC1、LGALS3BP、p53、NOTCH1などが挙げられる。エクソソームに内包されるタンパク質の疾患促進因子としては、例えば、慢性外傷性脳症に対してTau、結腸直腸がんに対してALIX-, TSG101-, CD63, CD9などが挙げられる。
脂質としては、細胞内脂質であれば特に制限されない。エクソソームに内包される脂質の疾患マーカーとしては、例えば、エイコサノイドなどが挙げられる。エクソソームに内包されるタンパク質の疾患促進因子としては、例えば、炎症におけるプロスタグランジン、ロイコトリエンなどが挙げられる。エクソソームに内包される脂質の疾患抑制因子としては、例えば、炎症反応後、回復時におけるリポキシンなどが挙げられる。
(A)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iが固相化された担体を用いて被験試料に含まれるエクソソームの表面分子を検出する工程。
(B)表面分子を検出されたエクソソームを回収する工程。
(C)エクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体を用いて回収されたエクソソームの内包分子を検出する工程。
また、本発明の検出方法Iにおいて、エクソソームの内包分子に対する結合性分子II(以下、単に結合性分子IIと記載する場合もある)は、該内包分子を特異的に認識し、結合できる分子であれば特に制限はないが、例えば、核酸に対するアンチセンス核酸、タンパク質に対する抗体またはアプタマー、脂質に対する抗体などが挙げられる。1つのエクソソームに内包される分子は複数存在するため、それらを同時に検出するためには結合性分子IIも複数選択して使用することが望ましい。従って、本発明の検出方法Iにおいて、結合性分子IIは、核酸に対するアンチセンス核酸、タンパク質に対する抗体またはアプタマー、および脂質に対する抗体からなる群から選択される少なくとも1種類である。
また、抗体には、前記のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体に加えて、これらの抗体の断片が含まれる。抗体の断片とは、前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはFab、Fab’、F(ab’)2、scAb、scFv、またはscFv-Fc等を包含する。
本発明の検出方法Iにおいて、表面分子に結合するレクチンとしては、例えば、SBA(Soybean Agglutinin)、LCA(Lens culinaris Agglutinin)、AAL(Aleuria aurantia Lectin)、UEA(Ulex europaeus Agglutinin)、PNA(Peanut Agglutinin)、WGA(Wheat Germ Agglutinin)、Con A(Concanavalin A)などが挙げられる。
アプタマーがRNAである場合、安定性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基(例、リボース)が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の2’位、3’位及び/又は4’位のヒドロキシル基を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、アルコキシ化、O-アリル化、S-アルキル化、S-アリル化、アミノ化が挙げられる。
また糖残基については、2’位及び4’位で架橋構造を形成したBNA:Bridged nucleic acid (LNA:Linked nucleic acid)とすることもできる。
(1)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iが固相化された担体表面をブロッキングバッファーで処理する工程。
(2)該担体を洗浄バッファーで洗浄する工程。
(3)エクソソームを含む被験試料とサンプルバッファーの混合物を該担体に接触させる工程。
(4)該担体をサンプルバッファーで洗浄する工程。
(5)該エクソソームの表面分子と該結合性分子Iの結合を検出することによって該表面分子を検出する工程。
(6)回収されたエクソソームから内包分子を含む被験試料を抽出する工程。
(7)エクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体表面をブロッキングバッファーで処理する工程。
(8)該担体を洗浄バッファーで洗浄する工程。
(9)該被験試料とサンプルバッファーの混合物を該担体に接触させる工程。
(10)該担体をサンプルバッファーで洗浄する工程。
(11)該エクソソームの内包分子と該結合性分子IIの結合を検出することによって該内包分子を検出する工程。
(A’)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iおよびエクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体を用いて被験試料に含まれるエクソソームの表面分子を検出する工程。
(B’)該担体を用いて該表面分子を検出されたエクソソームの内包分子を検出する工程。
(1’)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iおよびエクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体表面をブロッキングバッファーで処理する工程。
(2’)該担体を洗浄バッファーで洗浄する工程。
(3’)エクソソームを含む被験試料とサンプルバッファーの混合物を該担体に接触させる工程。
(4’)該担体をサンプルバッファーで洗浄する工程。
(5’)該エクソソームの表面分子と該結合性分子Iの結合を検出することによって該表面分子を検出する工程。
(6’)表面分子を検出されたエクソソームから該担体上で内包分子を含む被験試料を抽出する工程。
(7’)該被験試料とサンプルバッファーの混合物を該担体に接触させる工程。
(8’)該担体をサンプルバッファーで洗浄する工程。
(9’)該エクソソームの内包分子と該結合性分子IIの結合を検出することによって該内包分子を検出する工程。
表面プラズモン共鳴(SPR)によるエクソソームの表面分子および内包分子検出バイオセンサーは、マイクロアレイ型SPRi装置((株)堀場製作所:OpenPlex)と装置専用のバイオチップ((株)堀場製作所:CS-HD; スクシンイミドで活性化されたカルボキシ基を固相化したバイオチップ)を用いて構築する。構築したセンサーは、チップ表面に固相化されたリガンドへのエクソソームの表面分子または内包分子の結合によって誘起されるSPR現象に伴う反射光の変化量を反射率(%)として、3秒毎に測定することができる。同時に、SPRの反射率変化をスポットイメージとして観察することができる。またチップは12 mm×23 mmの表面積があるので、固相化されるリガンドのスポット径(スポット量)を調整することで多数のスポットを並列できる特徴がある。本実施例で用いるマイクロアレイ型SPRi装置は、エクソソームの表面分子または内包分子の検出を行うバイオセンサーを含む計測部、エクソソームの表面分子または内包分子の検出用バッファーを貯留する移動相用ボトル、検出終了後の被験試料を含む廃液を貯留する廃液用ボトル、被験試料やバッファーを送液する送液ポンプ、バッファーを脱気する脱気装置および被験試料挿入口を備える。
エクソソームの表面分子を検出するためのバイオチップの例を図5〜8に示す。エクソソームの表面分子を検出するためにチップに固相化されるリガンドは、検出対象となる表面分子によって異なる。例えば、被験試料に含まれるエクソソームが保有する癌マーカーを検出する場合、エクソソームマーカーに対する抗体またはアプタマー、検出対象となる癌マーカーに対する抗体またはアプタマー、検出対象となる糖鎖に対する抗体またはレクチン、検出対象となる脂質に対する抗体から選択される。リガンドは、スポッターを用いてチップ表面に10 nLスポットし、16時間静置することで固相化できる。ブロッキングは1%カゼインを溶解したPBSをチップ表面に満たして1時間室温で静置することによって実施する。ダルベコのPBS(-)(以下、PBSと略記)で洗浄し、1%BSAを溶解したPBSをチップ表面に満たして1時間室温で静置することによって、ブロッキングを実施する。ブロッキングしたチップは、PBSで3回洗浄後、装置に装着する。チップ表面へのバッファー、エクソソームを含むサンプルの接触は、Flow-cell(図9)を介して行う。Flow-cellは、Gasket全体がチップに完全に覆われるような位置(図10)で、チップと接触固定する。また、Flow-cellの平面のうち、Gasketの枠に囲まれた平面は、Gasketの枠の周囲の平面よりも、80 μm凹んでいる。結果的に、Flow-cellと接触したチップは、Flow-cellのGasketの枠に囲まれた平面とチップ表面の間に幅80 μmの空間的隙間が生じる。従って、Flow-cellにFittingを介して連結された片方のポリ塩化ビニルチューブ(内径380 μm)から送液されたバッファー等は、幅80 μmの空間的隙間を満たすことによってチップ表面に接触し、もう片方のポリ塩化ビニルチューブから排出される。チップを装着した装置には、ランニングバッファーとして0.1%カゼインを含む PBS(バッファーA)を25 μL/分の流速で送液し、チップ表面をコンディショニングする。安定化した時点の反射率を0%として、エクソソームを含むサンプルをバッファーAに懸濁して480秒間送液し、その後ただちにバッファーAのみを220秒間送液し、リガンド反射率を継時的に計測する。
次いで、チップに結合したエクソソームを回収し、物理的処理(例えば、超音波処理)または化学的処理(例えば、界面活性剤処理)によってエクソソームの構造膜を破壊し、エクソソームの内包分子を抽出する。エクソソームの内包分子を検出するための1つの態様としては、エクソソームの表面分子を検出するためのバイオチップとは別のバイオチップにエクソソームの内包分子を検出するためのリガンドが固相化され、該チップによってエクソソームに含まれる各内包分子が検出される。チップに固相化されるリガンドとしては例えば、検出対象となる核酸(DNA、RNA (mRNA、miRNA))に対するアンチセンス核酸、検出対象となるタンパク質に対する抗体またはアプタマーがあげられる。エクソソームの内包分子を検出するための別の態様としては、エクソソームの内包分子はエクソソームの表面分子を検出するためのバイオチップから回収されずに、該チップ上で直接に物理的処理または化学的処理によってエクソソームの構造膜が破壊され、エクソソームの内包分子が抽出されてもよい。その場合、エクソソームの内包分子を検出するための上記のリガンドはエクソソームの表面分子を検出するためのバイオチップと同一チップ上の異なる領域に固相化される。リガンドのスポット、チップのブロッキングおよび洗浄、エクソソームの内包分子を含むサンプルとチップの接触等の条件は、エクソソームの表面分子を検出する際の上記の条件と同じである。検出対象となる核酸(miRNA、DNA、RNA)を検出する場合、アンチセンス核酸が固相化されたチップにおけるSPRイメージから検出対象となる核酸の結合を確認する。アンチセンス核酸に対して完全に相補的ではない核酸、即ち、検出対象となる核酸と相同性の高い塩基配列を含む核酸の相補的結合は、結合および解離速度定数から得られる結合定数から決定する。検出対象となるタンパク質を検出する場合、そのタンパク質に対する抗体またはアプタマーが固相化されたチップにおけるSPRイメージからタンパク質の結合を確認する。
Claims (13)
- 以下の工程を含む、エクソソームの表面分子および内包分子を検出する方法:
(A)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iが固相化された担体を用いて被験試料に含まれるエクソソームの表面分子を検出する工程、
(B)表面分子を検出されたエクソソームを回収する工程、および
(C)エクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体を用いて回収されたエクソソームの内包分子を検出する工程。 - (A)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iが固相化された担体を用いて被験試料に含まれるエクソソームの表面分子を検出する工程が以下の工程を含む、請求項1に記載の方法:
(1)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iが固相化された担体表面をブロッキングバッファーで処理する工程、
(2)該担体を洗浄バッファーで洗浄する工程、
(3)エクソソームを含む被験試料とサンプルバッファーの混合物を該担体に接触させる工程、
(4)該担体をサンプルバッファーで洗浄する工程、および
(5)該エクソソームの表面分子と該結合性分子Iの結合を検出することによって該表面分子を検出する工程。 - (C)エクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体を用いて回収されたエクソソームの内包分子を検出する工程が以下の工程を含む、請求項1または2に記載の方法:
(6)回収されたエクソソームから内包分子を含む被験試料を抽出する工程、
(7)エクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体表面をブロッキングバッファーで処理する工程、
(8)該担体を洗浄バッファーで洗浄する工程、
(9)該被験試料とサンプルバッファーの混合物を該担体に接触させる工程、
(10)該担体をサンプルバッファーで洗浄する工程、および
(11)該エクソソームの内包分子と該結合性分子IIの結合を検出することによって該内包分子を検出する工程。 - 回収されたエクソソームから内包分子を含む被験試料を抽出する工程が、物理的手段または化学的手段によって抽出する工程である、請求項3に記載の方法。
- 以下の工程を含む、エクソソームの表面分子および内包分子を検出する方法:
(A’)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iおよびエクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体を用いて被験試料に含まれるエクソソームの表面分子を検出する工程、および
(B’)該担体を用いて該表面分子を検出されたエクソソームの内包分子を検出する工程。 - (A’)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iおよびエクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体を用いて被験試料に含まれるエクソソームの表面分子を検出する工程が以下の工程を含む、請求項5に記載の方法:
(1’)エクソソームの表面分子に対する1種類以上の結合性分子Iおよびエクソソームの内包分子に対する1種類以上の結合性分子IIが固相化された担体表面をブロッキングバッファーで処理する工程、
(2’)該担体を洗浄バッファーで洗浄する工程、
(3’)エクソソームを含む被験試料とサンプルバッファーの混合物を該担体に接触させる工程、
(4’)該担体をサンプルバッファーで洗浄する工程、および
(5’)該エクソソームの表面分子と該結合性分子Iの結合を検出することによって該表面分子を検出する工程。 - (B’)該担体を用いて該表面分子を検出されたエクソソームの内包分子を検出する工程が以下の工程を含む、請求項5または6に記載の方法:
(6’)表面分子を検出されたエクソソームから該担体上で内包分子を含む被験試料を抽出する工程、
(7’)該被験試料とサンプルバッファーの混合物を該担体に接触させる工程、
(8’)該担体をサンプルバッファーで洗浄する工程、および
(9’)該エクソソームの内包分子と該結合性分子IIの結合を検出することによって該内包分子を検出する工程。 - 表面分子を検出されたエクソソームから担体上で内包分子を含む被験試料を抽出する工程が、物理的手段または化学的手段によって抽出する工程である、請求項7に記載の方法。
- 表面分子の検出および内包分子の検出が免疫学的方法または表面プラズモン共鳴法による検出である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 該結合性分子Iがタンパク質に対する抗体またはアプタマー、糖鎖に対する抗体またはレクチン、または脂質に対する抗体である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 該結合性分子IIが核酸に対するアンチセンス核酸、タンパク質に対する抗体またはアプタマー、または脂質に対する抗体である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法を実施するためのエクソソーム表面分子および内包分子の検出装置。
- 請求項1に記載の方法を実施するための表面分子を検出されたエクソソームの分離装置。
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