WO2023182508A1 - 細胞外小胞表面分子を用いた疾患の検査方法及び検査キット - Google Patents
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Definitions
- the present invention relates to testing methods for diagnosing various diseases using extracellular vesicle surface molecules. More specifically, the present invention measures the expression level of a specific surface molecule in extracellular vesicles derived from a subject, and uses the expression level as an indicator to determine whether the subject has heart disease, type 2 diabetes, or SARS. -Relates to a testing method for CoV-2 infection to determine whether or not you are suffering from the disease, as well as kits for that purpose.
- exosomes are involved in the pathology and protection of heart diseases, metabolic diseases, and infectious diseases (for example, see Non-Patent Document 1).
- exosome surface molecules have been identified that can serve as disease biomarkers to make body fluid diagnosis of these diseases feasible.
- the purpose of the present invention is to identify surface molecules of extracellular vesicles that can serve as disease biomarkers for heart disease, type 2 diabetes, and SARS-CoV-2 infection, and to diagnose these diseases by detecting the surface molecules.
- An object of the present invention is to provide a method and a kit for detecting such surface molecules.
- the present inventors conducted an analysis using surface plasmon resonance imaging (SPRi) to find that the number of patients with heart disease, type 2 diabetes, and SARS-CoV-2 infection increased or decreased, respectively.
- SPRi surface plasmon resonance imaging
- extracellular vesicle surface molecules it is possible to diagnose heart disease, type 2 diabetes, and SARS-CoV-2 infection, and to differentiate SARS-CoV-2 infection from heart disease. I discovered something.
- the present inventors have completed the present invention.
- [Section 1] A test method for determining whether a subject is suffering from heart disease, which measures the expression level of surface molecules in extracellular vesicles derived from a biological sample collected from the subject, and the following: (a) to (c): (a) The expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of CD20, CD110, ActR, and DARC is higher than the standard value. (b) CD63, CD81, CD4, CD8, CD25, CD44, CD71, and (c) The expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of CD169 is lower than the standard value.
- the expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of CD20, CD110, ActR and DARC is , CD81, CD4, CD8, CD25, CD44, CD71, and CD169 divided by the expression level of a surface molecule selected from the group consisting of A method for determining whether a person is likely to be suffering from heart disease.
- the surface molecule in (b) is at least one selected from the group consisting of CD25, CD71, and CD169.
- a test method for determining whether a subject is suffering from type 2 diabetes comprising: measuring the expression level of surface molecules in extracellular vesicles derived from a biological sample collected from the subject; The following (a) to (c): (a) The expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of CD9, CD4, CD8, CD20, CD71, CD110, TfR, ActR, and DARC is higher than the standard value (b) CD25, EpoR, The expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of MAM-binding sugars and UEA-1-binding sugars is lower than the standard value (c) CD9, CD4, CD8, CD20, CD71, CD110, Value obtained by dividing the expression level of a surface molecule selected from the group consisting of TfR, ActR, and DARC by the expression level of a surface molecule selected from the group consisting of CD25, EpoR, MAM-binding sugar, and UEA-1-bind
- [Section 9] A test method for determining whether a subject is suffering from SARS-CoV-2 infection, the amount of expression of surface molecules in extracellular vesicles derived from a biological sample collected from the subject. is measured, and the expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of CD25, CD169, and DARC is higher than the standard value, and CD63, CD9, CD81, CD110, EpoR, TfR, ActR, LF binding If the expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of sex sugars, MAM-binding sugars, SBA-binding sugars, and UEA-1-binding sugars is lower than the standard value, the subject A method for determining that a person is likely to be infected with SARS-CoV-2 infection.
- [Section 10] A test method for differentiating between SARS-CoV-2 infection and heart disease, which measures the expression levels of surface molecules in extracellular vesicles derived from biological samples collected from subjects, and detects CD25, CD169, and The expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of DARC is higher than the standard value, and/or CD63, CD9, CD81, CD110, EpoR, TfR, ActR, LF-binding sugar, MAM-binding If the expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of sugars, SBA-binding sugars, and UEA-1-binding sugars is lower than the standard value, the subject has SARS-CoV-2 A method for identifying a person who is likely to be suffering from an infectious disease.
- [Section 13] (a) and/or (b) below: (a) A substance capable of specifically binding to at least one surface molecule selected from the group consisting of CD20, CD110, ActR, and DARC (b) From CD63, CD81, CD4, CD8, CD25, CD44, CD71, and CD169 A test kit for determining heart disease, comprising substances capable of specifically binding to at least one surface molecule selected from the group consisting of: [Section 14] A test system for determining heart disease, comprising the kit according to item 13, and a device that can detect the interaction between a substance that can specifically bind to a surface molecule contained in the kit and the surface molecule. .
- a substance capable of specifically binding to at least one surface molecule selected from the group consisting of CD9, CD4, CD8, CD20, CD71, CD110, TfR, ActR, and DARC (b) CD25, EpoR, and MAM binding 1.
- a test kit for determining type 2 diabetes which comprises substances capable of specifically binding to at least one surface molecule selected from the group consisting of glycoconjugates and UEA-1-binding saccharides.
- a test for determining type 2 diabetes comprising the kit according to item 15, and a device included in the kit that can detect the interaction between a substance that can specifically bind to a surface molecule and the surface molecule. system.
- SARS-CoV-2 infection comprising the kit according to item 17, and a device included in the kit that can detect the interaction between a substance that can specifically bind to a surface molecule and the surface molecule.
- the present invention it is possible to quickly and non-invasively diagnose heart disease, type 2 diabetes, and SARS-CoV-2 infection using body fluids, and to differentiate between SARS-CoV-2 infection and heart disease.
- Figure 1 shows the levels of CD169 and CD20 (upper left), CD169 and CD110 (upper right), CD71 and CD20 (lower left), and CD71 and CD110 (lower right) in serum EVs of heart disease patients ( ⁇ ) and healthy subjects ( ⁇ ).
- Figure 2 shows EpoR and CD110 (upper left), EpoR and DARC (upper right), CD25 and CD110 (lower left), and CD25 and DARC (lower right) in serum EVs of type 2 diabetic patients ( ⁇ ) and healthy subjects ( ⁇ ).
- a two-dimensional plot of the expression level of is shown.
- FIG. 4-1 is a graph of a surface plasmon curve showing the results of measuring the expression level of each surface molecule in EVs derived from human megakaryoblastic cells (MEG01S) using the SPRi method.
- Figure 4-2 shows the results of Figure 4-1 as a radar chart.
- FIG. 5 is a schematic diagram (upper diagram) showing an example of a biochip for detecting extracellular vesicles (EV disease ) in a specific disease specimen.
- each antibody is directed against surface molecule A whose expression increases due to the disease ( ⁇ ), surface molecule B whose expression decreases due to the disease ( ⁇ ), and surface molecule C whose expression increases due to the disease ( ⁇ ). are solid-phased in rows, and can capture extracellular vesicles expressing these surface molecules.
- FIG. 6 is a diagram showing the configuration of a microarray type SPRi device that can be used in the present invention.
- Test method for determining heart disease, kit and test system therefor is a test method for determining whether or not a subject is suffering from a heart disease, the method comprising: A method (hereinafter referred to as "method of the present invention (1)") in which the expression level of surface molecules in extracellular vesicles derived from a biological sample is measured and the expression level of one or more specific surface molecules is compared with a standard value. ).
- the subject in method (1) of the present invention is a human, there are no particular restrictions on age, gender, etc., but preferably a human suspected of suffering from heart disease, more preferably 60 years of age or younger of humans.
- heart disease include, but are not limited to, hypertension, angina pectoris, myocardial infarction, atrial fibrillation, myocarditis, and the like. Preferably it is hypertension.
- Extracellular vesicles are the term for non-replicable particles surrounded by a lipid bilayer that are actively secreted from cells.
- membrane vesicles existing outside cells have been classified as exosomes derived from endosomal membranes, microvesicles derived from plasma membranes, and apoptotic bodies derived from dead cell membranes, depending on their secretion routes. .
- these subtypes overlap in nature and size, and there is no consensus on the markers that clearly distinguish them, so the International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) recommends the use of the term “extracellular vesicles.” is recommended, and this term will also be used in this specification.
- ISV International Society for Extracellular Vesicles
- the biological sample used in method (1) of the present invention is not particularly limited as long as it is collected from a subject and contains extracellular vesicles, such as body fluid, cell or tissue culture sample.
- Examples include fluids, but body fluids are preferred.
- body fluids include blood, plasma, serum, saliva, urine, lymph fluid, cerebrospinal fluid, and the like.
- blood, plasma, serum, etc. are used.
- the extracellular vesicles to be measured in method (1) of the present invention are not particularly limited as long as they contain at least exosomes, and microvesicles and apoptotic bodies may be mixed therein.
- membrane vesicles with a diameter of about 30 to about 150 nm contained in the above-mentioned biological sample are included, but larger membrane vesicles may also be included.
- the method for isolating extracellular vesicles from a biological sample is not particularly limited, and methods known per se can be used. Examples include a collection (pellet down) method by ultracentrifugation, a sucrose cushion method, a density gradient centrifugation method, and a method using commercially available kits and reagents.
- the expression level of surface molecules in the obtained extracellular vesicles is measured.
- the surface molecules to be measured are selected from the group consisting of CD20, CD110, activin receptor (ActR), Duffy antigen chemokine receptor (DARC), CD63, CD81, CD4, CD8, CD25, CD44, CD71, and CD169. one or more surface molecules.
- the surface molecules can be measured using methods known per se, such as flow cytometry, ExoScreen, methods using ELISA such as ExoTEST, ⁇ NMR, methods using antibody arrays or lectin arrays, and surface plasmon resonance (SPR). Examples include, but are not limited to, the methods used.
- SPRi surface plasmon resonance imaging
- the SPRi method is a method in which a biochip immobilized with a ligand that specifically binds to a measurement target is irradiated with light at different angles, and the reflectance change (plasmon curve) caused by the angle changes due to the binding of the measurement target.
- This is a measurement method that analyzes the expression level of the measurement target by detecting.
- This method is advantageous in terms of time since it is possible to simultaneously measure a variety of surface molecules using one sample, and also requires a small amount of sample.
- Specific ligands for each of CD20, CD110, ActR, DARC, CD63, CD81, CD4, CD8, CD25, CD44, CD71 and CD169 include molecules that can specifically recognize and bind to these surface molecules. Examples include, but are not limited to, antibodies against these surface molecules, physiological ligands such as cell adhesion factors (eg, integrins), cytokines, and chemokines, synthetic agonists or antagonists, aptamers, and the like.
- physiological ligands such as cell adhesion factors (eg, integrins), cytokines, and chemokines, synthetic agonists or antagonists, aptamers, and the like.
- Antibodies include both polyclonal and monoclonal antibodies. Further, the antibody may include antibodies derived from any mammal, and may further belong to any immunoglobulin class of IgG, IgA, IgM, IgD, or IgE, but preferably It is IgG. As the antibody, a commercially available antibody that binds to the target surface molecule or an antibody stored at a research institution may be used. Alternatively, those skilled in the art can produce antibodies according to conventionally known methods. Antibodies include natural antibodies such as polyclonal antibodies and monoclonal antibodies (mAb), chimeric antibodies that can be produced using genetic recombination technology, humanized antibodies, and single-chain antibodies, as well as these antibodies.
- mAb monoclonal antibodies
- the antibody fragment refers to a partial region of the aforementioned antibody, and specifically includes Fab, Fab', F(ab') 2 , scAb, scFv, scFv-Fc, and the like.
- Aptamer refers to a nucleic acid molecule that has binding activity to surface molecules.
- Aptamers can be RNA, DNA, modified nucleic acids or mixtures thereof. Aptamers can also be in linear or cyclic form.
- the sugar residues eg, ribose
- the sugar residues include those in which the hydroxyl group at the 2'-position, 3'-position and/or 4'-position of the sugar residue is replaced with another atom.
- Examples of the types of modification include fluorination, alkoxylation, O-allylation, S-alkylation, S-allylation, and amination.
- the sugar residue can also be BNA: Bridged nucleic acid (LNA: Linked nucleic acid), which forms a bridged structure at the 2' and 4' positions.
- Ligands for surface molecules are immobilized on the carrier. Immobilization of the ligand can be carried out by adjusting the above-mentioned ligand to an appropriate concentration with a buffer solution, spotting it on a carrier, and allowing it to stand still.
- concentration of the ligand upon immobilization may be determined as appropriate, and may be, for example, 1 mg/ml.
- the time for leaving to stand may be determined as appropriate, and may be, for example, 8 to 16 hours.
- the carrier is not particularly limited as long as it can be used in the surface plasmon resonance method, and examples include synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicone, glass, thin metal films, and nitrocellulose membranes.
- casein solution or casein decomposition product solution It is desirable to mix the casein solution or casein decomposition product solution and the test sample before contacting the carrier with the test sample containing extracellular vesicles. Thereby, a test sample with a higher concentration of extracellular vesicles can be prepared.
- the prepared test sample is mixed with a casein solution or a casein decomposition product solution (hereinafter referred to as a mixture).
- the casein solution or casein decomposition product solution may be similar to the casein solution or casein decomposition product solution for use in washing described above.
- the time, temperature, and number of times the mixture is brought into contact with the carrier surface can be appropriately determined by those skilled in the art, but for example, the mixture may be brought into contact with the carrier surface for 1 to 3 times at room temperature for 10 minutes to 2 hours. I can do it.
- method (1) of the present invention can be performed using a microarray type SPRi device and a biochip.
- the biochip consists of a prism and a metal film deposited on one side of the prism.
- the shape of the prism include a trapezoid, a triangle, and a circle (semi-column).
- the refractive index of the prism is usually 1.5 to 1.8.
- the metal deposited on one side of the prism include gold, silver, copper, and aluminum.
- the surface of the biochip is immobilized with carboxyl groups activated with succinimide.
- the microarray type SPRi device includes a sensor that detects the reflected light associated with the SPR phenomenon induced by the binding of exosomes to the biochip surface, and a device that calculates and outputs the amount of change in reflected light as reflectance (%). Be prepared.
- the microarray type SPRi device also includes a device that converts the calculated change in reflectance into a color tone image and outputs it. Since this device can also confirm the color change in areas on the biochip surface where binding molecules are not immobilized, it is possible to confirm the presence or absence of non-specific binding of extracellular vesicles.
- microarray-type SPRi device For details on the SPRi method using a microarray-type SPRi device and biochip, see, for example, WO 2019/044845. Further, the microarray type SPRi device will be described in detail in the inspection system (1) of the present invention below.
- the expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of CD20, CD110, ActR and DARC is , CD81, CD4, CD8, CD25, CD44, CD71, and CD169 divided by the expression level of a surface molecule selected from the group consisting of It can be determined that a person is likely to be suffering from heart disease. In one embodiment, at least two of the above (a) to (c) (i.e., (a) and (b), (b) and (c), (a) and (c), or (a), If (b) or (c)) apply, it can be determined that the subject is highly likely to suffer from heart disease.
- the "standard value” is a cut derived from the average and dispersion of the expression level or expression level ratio of the above surface molecules in a non-heart disease group (e.g., a healthy group) that is known to be free from heart disease. It is given as an off value (eg, mean value ⁇ 3SD, etc.).
- the standard value may be calculated by measuring the expression level or expression level ratio in a non-cardiac disease group serving as a control each time, or may be determined in advance.
- CD20 and/or CD110 can be used as the surface molecule in (a) above.
- at least one selected from the group consisting of CD25, CD71, and CD169 can be used as the surface molecule in (b).
- a preferred combination of surface molecules in (c) above is a combination of a surface molecule selected from the group consisting of CD20 and CD110 and a surface molecule selected from the group consisting of CD25, CD71 and CD169.
- method (1) of the present invention by showing the expression levels of two types of surface molecules in a two-dimensional plot, it is possible to clearly visualize a group of subjects who are likely to be suffering from heart disease. Additionally, when measuring a larger number of surface molecules, showing the expression levels of each surface molecule on a radar chart makes it possible to clearly visualize the group of subjects who are likely to be suffering from heart disease. can.
- the present invention also provides the following (a) and/or (b): (a) A substance capable of specifically binding to at least one surface molecule selected from the group consisting of CD20, CD110, ActR, and DARC (b) From CD63, CD81, CD4, CD8, CD25, CD44, CD71, and CD169
- the present invention provides a test kit for determining heart disease, which comprises substances capable of specifically binding to at least one surface molecule selected from the group consisting of:
- examples of substances that can specifically bind to each surface molecule include the above-mentioned specific ligands.
- the substance may be provided in a free state (e.g., a solution) or in a state immobilized on a carrier such as the above-mentioned biochip. It can be selected as appropriate.
- a biochip in which a substance capable of specifically binding to one or more, preferably two or more surface molecules selected from (a) and/or (b) above is immobilized on a carrier. (see, for example, FIG. 5).
- the present invention also provides a testing system for determining heart disease ( Hereinafter, also referred to as “inspection system (1) of the present invention”) is provided.
- a device known per se can be used depending on the various methods used for measuring surface molecules in method (1) of the present invention. Examples include devices using surface plasmon resonance (SPR), flow cytometers, and the like.
- FIG. 1 a microarray type SPRi device is shown in FIG. 1
- the device 1 shown in FIG. 6 is mainly composed of a measuring section 2 and a main body section 3.
- the measurement unit 2 includes a carrier 21, a sensor 22, a calculation unit 23, a waste liquid bottle 24, a mobile phase bottle 25, a liquid feed pump 26, a deaerator 27, and a test sample supply port 28. It mainly consists of
- the main body section 3 mainly includes a display section 31 and a control section 32.
- the carrier 21 is a device that causes an SPR phenomenon induced by the interaction between the surface molecules of extracellular vesicles and the substance included in the kit that can specifically bind to the surface molecules.
- the sensor 22 detects the SPR phenomenon induced by the interaction between the surface molecules and the substance as reflected light.
- a CCD camera as a sensor detects the intensity of reflected light at each reflected light detection position as a current value and a voltage value.
- the calculation unit 23 calculates the amount of change in the reflected light detected by the sensor 22 as a reflectance (%) and outputs it.
- the waste liquid bottle 24 is a bottle for discarding the test sample and buffer that have passed through the sensor chip 21 in the measurement unit 2.
- the mobile phase bottle 25 is a mobile phase bottle for allowing the sensor chip 21 to pass through the measurement unit 2 .
- the liquid feeding pump 26 is a pump for feeding the buffer in the mobile phase bottle.
- the degassing device 27 is a device for degassing the buffer.
- the test sample insertion port 28 is an insertion port for inserting a test sample into the measurement section 2 .
- the display unit 31 receives the change in reflectance calculated by the calculation unit 23, converts it into a color tone image, and outputs it. Note that the display unit 31 may display not only the color tone image but also the change in reflectance over time as it is as a graph as shown in FIG. 4-1. The display unit may display the color image and the change in reflectance over time at the same time. Furthermore, graphs summarizing marker amounts such as those shown in FIGS. 1 to 3 and FIG. 4-2 may be displayed individually or in combination.
- the control unit 32 adjusts the rotation angle of the reflecting mirror provided in the measurement unit 2 and the intensity of the irradiation light source.
- Test method for determining type 2 diabetes, kit and test system therefor The present invention also provides a test method for determining whether or not a subject is suffering from type 2 diabetes,
- the expression levels of surface molecules in extracellular vesicles derived from biological samples collected from subjects are measured, and the following (a) to (c) are carried out:
- (a) The expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of CD9, CD4, CD8, CD20, CD71, CD110, transferrin receptor (TfR), ActR, and DARC is higher than the standard value
- the expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of CD25, erythropoietin receptor (EpoR), MAM-binding sugar, and UEA-1-binding sugar is lower than the standard value
- the expression levels of surface molecules selected from the group consisting of CD9, CD4, CD8, CD20, CD71, CD110, TfR, ActR, and DARC were determined from the group consisting of CD25, Epo
- method (2) of the present invention If the value divided by the expression level of the selected surface molecule corresponds to at least one of the following values higher than the standard value, it is determined that the subject is likely to suffer from type 2 diabetes.
- a method hereinafter also referred to as “method (2) of the present invention" is provided.
- the measurement of extracellular vesicle surface molecules can be performed in the same manner as in the method (1) of the present invention.
- Specific ligands for CD9, CD4, CD8, CD20, CD71, CD110, TfR, ActR, DARC, CD25, and EpoR include, as mentioned above, antibodies against their surface molecules, cell adhesion factors (e.g., integrins) Examples include physiological ligands such as cytokines, chemokines, and hormones, synthetic agonists or antagonists, and aptamers.
- examples of ligands for MAM-binding sugars and UEA-1-binding sugars include lectins such as MAM and UEA-1.
- the standard value is derived from the average and dispersion of the expression level or expression level ratio of the above surface molecules in a non-type 2 diabetic group (e.g., a healthy group) that is known not to be suffering from type 2 diabetes. It is given as a cutoff value (e.g. mean ⁇ 3SD).
- the standard value may be calculated by measuring the expression level or expression level ratio in a non-type 2 diabetic group serving as a control each time, or may be determined in advance.
- At least one selected from the group consisting of CD110, ActR, and DARC can be used as the surface molecule in (a).
- CD25 and/or EpoR can be used as the surface molecule in the above (b).
- a preferred combination of surface molecules in (c) above is a combination of a surface molecule selected from the group consisting of CD110, ActR and DARC, and a surface molecule selected from the group consisting of CD25 and EpoR.
- method (2) of the present invention by showing the expression levels of two types of surface molecules in a two-dimensional plot, it is possible to clearly visualize a group of subjects who are likely to be suffering from type 2 diabetes. .
- the present invention also provides the following (a) and/or (b): (a) A substance capable of specifically binding to at least one surface molecule selected from the group consisting of CD9, CD4, CD8, CD20, CD71, CD110, TfR, ActR, and DARC (b) CD25, EpoR, and MAM binding
- the present invention provides a test kit for determining type 2 diabetes, which comprises substances capable of specifically binding to at least one surface molecule selected from the group consisting of UEA-1-binding sugars and UEA-1-binding sugars.
- examples of substances that can specifically bind to each surface molecule include the above-mentioned specific ligands.
- the substance may be provided in a free state (e.g., a solution), or in a solid-phase state on a carrier such as the above-mentioned biochip in method (1) of the present invention. may be selected as appropriate depending on the method for measuring surface molecules.
- a biochip in which a substance capable of specifically binding to one or more, preferably two or more surface molecules selected from (a) and/or (b) above is immobilized on a carrier. (see, for example, FIG. 5).
- the present invention also provides a testing system for determining type 2 diabetes, comprising the above kit and a device capable of detecting the binding between a substance contained in the kit and a surface molecule to which the substance can specifically bind.
- a device capable of detecting the binding between a substance contained in the kit and a surface molecule to which the substance can specifically bind.
- inspection system (2) of the present invention a device known per se can be used depending on the various methods used for measuring surface molecules in method (1) of the present invention. Examples include devices using surface plasmon resonance (SPR), flow cytometers, and the like.
- SPR surface plasmon resonance
- flow cytometers and the like.
- the microarray type SPRi device described in detail in the inspection system (1) of the present invention can be used as the device.
- Test method and kit for determining SARS-CoV-2 infection (COVID-19)
- the present invention also provides a test method for determining whether or not a subject is suffering from SARS-CoV-2 infection.
- a testing method comprising measuring the expression level of surface molecules in extracellular vesicles derived from a biological sample collected from the subject, and determining whether at least one surface molecule selected from the group consisting of CD25, CD169, and DARC Higher than standard value, and CD63, CD9, CD81, CD110, EpoR, TfR, ActR, Lectin, Fucose specific from Aspergillusoryzae (LF) binding sugar, MAM binding sugar, SBA binding sugar, and UEA-1 binding
- a method hereinafter referred to as "method (3) of the present invention”
- the measurement of extracellular vesicle surface molecules can be performed in the same manner as in the method (1) of the present invention.
- Specific ligands for CD25, CD169, DARC, CD63, CD9, CD81, CD110, EpoR, TfR, and ActR include, as mentioned above, antibodies against their surface molecules, cell adhesion factors (e.g., integrins), and cytokines. , chemokines, physiological ligands such as hormones, synthetic agonists or antagonists, aptamers, and the like.
- examples of ligands for LF-binding sugars, MAM-binding sugars, SBA-binding sugars, and UEA-1-binding sugars include lectins such as LF, MAM, SBA, and UEA-1, respectively.
- the expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of CD25, CD169, and DARC is higher than the standard value, and CD63, CD9, CD81, CD110, EpoR,
- the expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of TfR, ActR, LF-binding sugar, MAM-binding sugar, SBA-binding sugar, and UEA-1-binding sugar is lower than the standard value
- the "standard value” refers to the average expression level of the above surface molecules in a non-SARS-CoV-2 infection group (e.g., a healthy group) that is known to be free from SARS-CoV-2 infection. It is given as a cutoff value (e.g., mean value ⁇ 3SD, etc.) derived from the and dispersion.
- the standard value may be calculated by measuring the expression level in a non-SARS-CoV-2 infection group that serves as a control each time, or it may be determined in advance.
- method (3) of the present invention by showing the expression levels of two types of surface molecules in a two-dimensional plot, it is possible to clearly visualize a group of subjects who are likely to be suffering from SARS-CoV-2 infection. can do.
- a radar chart by showing the expression level of each surface molecule on a radar chart, it is possible to clearly identify the group of subjects who are likely to be infected with SARS-CoV-2 infection. can be visualized.
- the present invention also provides the following (a) and (b): (a) A substance capable of specifically binding to at least one surface molecule selected from the group consisting of CD25, CD169, and DARC (b) CD63, CD9, CD81, CD110, EpoR, TfR, ActR, LF-binding sugar , a substance capable of specifically binding to at least one surface molecule selected from the group consisting of MAM-binding sugars, SBA-binding sugars, and UEA-1-binding sugars, respectively, for SARS-CoV-2 infection.
- examples of substances that can specifically bind to each surface molecule include the above-mentioned specific ligands.
- the substance may be provided in a free state (e.g., a solution), or in a solid-phase state on a carrier such as the above-mentioned biochip in method (1) of the present invention. may be selected as appropriate depending on the method for measuring surface molecules.
- a biochip for example, as shown in FIG. ) can be used.
- the present invention also provides a method for preventing SARS-CoV-2 infection, comprising the above kit and a device capable of detecting the binding between a substance contained in the kit and a surface molecule to which the substance can specifically bind.
- a determination inspection system (hereinafter also referred to as "inspection system (3) of the present invention") is provided.
- the device a device known per se can be used depending on the various methods used for measuring surface molecules in method (1) of the present invention. Examples include devices using surface plasmon resonance (SPR), flow cytometers, and the like.
- the microarray type SPRi device described in detail in the inspection system (1) of the present invention can be used as the device.
- Test method for differentiating between SARS-CoV-2 infection (COVID-19) and heart disease and kit therefor The present invention also provides a test method for differentiating between SARS-CoV-2 infection and heart disease.
- the expression level of surface molecules in extracellular vesicles derived from a biological sample collected from a subject is measured, and the expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of CD25, CD169, and DARC is determined as a standard. and/or selected from the group consisting of CD63, CD9, CD81, CD110, EpoR, TfR, ActR, LF-binding sugar, MAM-binding sugar, SBA-binding sugar, and UEA-1-binding sugar.
- a method hereinafter referred to as , referred to as "method (4) of the present invention”).
- ligands for CD25, CD169, DARC, CD63, CD9, CD81, CD110, EpoR, TfR, and ActR include, as mentioned above, antibodies against their surface molecules, cell adhesion factors (e.g., integrins), and cytokines. , chemokines, physiological ligands such as hormones, synthetic agonists or antagonists, aptamers, and the like.
- examples of ligands for LF-binding sugars, MAM-binding sugars, SBA-binding sugars, and UEA-1-binding sugars include lectins such as LF, MAM, SBA, and UEA-1, respectively.
- the expression level of at least one surface molecule selected from the group consisting of CD25, CD169, and DARC was higher than the standard value, and CD63, CD9, CD81, CD110, EpoR, TfR, and ActR.
- LF-binding sugar, MAM-binding sugar, SBA-binding sugar, and UEA-1-binding sugar when the value of at least one surface molecule selected from the group consisting of sugar binding to LF is lower than the standard value, the subject can be determined to be highly likely to be infected with SARS-CoV-2 infection.
- the "standard value” refers to a cutoff value (e.g., average value ⁇ 3SD, etc.).
- the standard value may be calculated by measuring the expression level in a non-SARS-CoV-2 infected heart disease group that serves as a control each time, or it may be determined in advance.
- method (4) of the present invention by showing the expression levels of two types of surface molecules in a two-dimensional plot, it is possible to identify a group of subjects who are likely to be suffering from SARS-CoV-2 infection rather than heart disease. can be clearly visualized.
- the expression level of each surface molecule can be shown on a radar chart to identify subjects who are likely to be suffering from SARS-CoV-2 infection rather than heart disease. group of people can be clearly visualized.
- the present invention also provides the following (a) and/or (b): (a) A substance capable of specifically binding to at least one surface molecule selected from the group consisting of CD25, CD169, and DARC (b) CD63, CD9, CD81, CD110, EpoR, TfR, ActR, LF-binding sugar , a substance capable of specifically binding to at least one surface molecule selected from the group consisting of MAM-binding sugars, SBA-binding sugars, and UEA-1-binding sugars, respectively, for SARS-CoV-2 infection.
- examples of substances that can specifically bind to each surface molecule include the above-mentioned specific ligands.
- the substance may be provided in a free state (e.g., a solution), or in a solid-phase state on a carrier such as the above-mentioned biochip in method (1) of the present invention. may be selected as appropriate depending on the method for measuring surface molecules.
- a biochip in which a substance capable of specifically binding to one or more, preferably two or more surface molecules selected from (a) and/or (b) above is immobilized on a carrier. (see, for example, FIG. 5).
- the present invention also provides a method for combating SARS-CoV-2 infection, comprising the above kit and a device capable of detecting the binding between a substance contained in the kit and a surface molecule to which the substance can specifically bind.
- a testing system for differentiation from heart disease (hereinafter also referred to as "testing system (4) of the present invention") is provided.
- the device a device known per se can be used depending on the various methods used for measuring surface molecules in method (1) of the present invention. Examples include devices using surface plasmon resonance (SPR), flow cytometers, and the like.
- the microarray type SPRi device described in detail in the inspection system (1) of the present invention can be used as the device.
- Example 1 Identification of disease marker surface molecules of patient serum-derived extracellular vesicles (EVs) [Subjects and methods]
- extracellular vesicles (EVs) were extracted from 15 healthy human serum samples, 70 type 2 diabetes patient serum samples, 70 hypertensive patient serum samples, 14 COVID-19 patient serum samples (Table 1), and pooled serum samples. , we performed intermolecular interaction analysis using SPRi measurements.
- Serum treatment Normally, venous blood was collected using a biochemical blood collection tube that did not contain an anticoagulant, and after being allowed to stand for 30 minutes, it was centrifuged at 3500 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected as serum. The collected serum was filtered with a 0.20 ⁇ m filter (Minisart-plus: Sartrius Stedim Biotech) to remove debris. When storing serum, it was stored at -80°C after sterilization by filtration.
- OpenPlex and Xelplex were used for SPRi analysis.
- OpenPlex measurements were performed by pouring the sample solution into OpenPlex using a 1 ml syringe (TERUMO).
- TERUMO 1 ml syringe
- XelPleX this was carried out using the autosampler that comes with the equipment.
- the biochip was washed with a regenerating solution (4M MgCl 2 ) at the start of the measurement and after the sample measurement.
- the flow rate of the regenerating solution was 4000 ⁇ L/min or more, and the flow rate of the sample (EV solution) was 25 ⁇ L/min, and the measurements were repeated.
- FIG. 1 shows two-dimensional plots of the expression levels of CD169 and CD20 (upper left), CD169 and CD110 (upper right), CD71 and CD20 (lower left), and CD71 and CD110 (lower right).
- FIG. 2 shows two-dimensional plots of the expression levels of EpoR and CD110 (upper left), EpoR and DARC (upper right), CD25 and CD110 (lower left), and CD25 and DARC (lower right).
- CD25 CD169 and DARC were significantly higher than those of heart disease patients, and CD63 CD9 CD81 CD110 EpoR TfR ActR LF MAM SBA and UEA-1 were significantly lower.
- CD4 was not significantly different between type 2 diabetic patients and heart disease patients (Table 4).
- Figure 3 shows the expression levels of CD9 and DARC (upper left), CD81 and DARC (upper middle), ActR and DARC (upper right), CD9 and CD169 (lower left), CD81 and CD169 (lower middle), and ActR and CD169 (lower right). Shows a two-dimensional plot of
- Example 2 Visualization example of surface molecule marker expression of cultured cell-derived EVs using a radar chart
- the expression levels of various surface molecules in EVs derived from human megakaryoblastic cells (MEG01S; Accession: CVCL_3022) were measured by the SPRi method.
- Figure 4-1 shows a diagram showing the change in reflectance over time for each surface molecule
- Figure 4-2 shows a radar chart.
Landscapes
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Abstract
本発明は、被検者が心疾患、２型糖尿病又はSARS-CoV-2感染症に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、各疾患において有意に増加又は減少する特定の表面因子を検出することを特徴とする、方法を提供する。
Description
本発明は、細胞外小胞表面分子を用いた各種疾患の診断のための検査方法等に関する。より詳細には、本発明は、被検者由来の細胞外小胞における特定の表面分子の発現量を測定し、該発現量を指標として、該被検者が心疾患、２型糖尿病又はSARS-CoV-2感染症に罹患しているか否かを判定する当該疾患の検査方法、並びにそのためのキット等に関する。
近年、リキッドバイオプシーと呼ばれる体液に含まれる疾患由来の情報を解析して患者の状態を把握する診断法が注目されている。この疾患由来の情報として、エクソソームに代表される細胞外小胞を利用する研究が飛躍的に進展し、細胞外小胞の特定の表面分子や内包分子が、がんなどの疾患バイオマーカーとして利用し得ることが報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献１、２参照）。
心疾患や代謝性疾患、感染症についても、それらの病態や防御へのエクソソームの関与が示唆されている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、これらの疾患の体液診断を実現可能にする疾患バイオマーカーとなり得る具体的なエクソソーム表面分子は同定されていない。
Shah et al., N. Engl. J. Med. (2018) 379: 958-966.
Hoshino et al., Cell (2020) 182: 1044-1061.
本発明の課題は、心疾患、２型糖尿病及びSARS-CoV-2感染症の疾患バイオマーカーとなり得る細胞外小胞の表面分子を同定し、当該表面分子を検出することによる、それら疾患の診断方法、並びに当該表面分子を検出するためのキットを提供することにある。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、表面プラズモン共鳴イメージング（SPRi）法を用いた解析により、心疾患、２型糖尿病及びSARS-CoV-2感染症の患者において、それぞれ増加又は減少している細胞外小胞表面分子を同定することに成功した。また、心疾患患者と比較してSARS-CoV-2感染症患者において増加又は減少している細胞外小胞表面分子も同定した。即ち、これらの細胞外小胞表面分子を測定することにより、心疾患、２型糖尿病及びSARS-CoV-2感染症の診断、並びにSARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別が可能であることを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［項１］
被検者が心疾患に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、以下の（ａ）ないし（ｃ）：
（ａ）CD20、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である
（ｂ）CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である
（ｃ）CD20、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子の発現量を、CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される表面分子の発現量で除した値が標準値より高値である
の少なくとも１つに該当する場合に、該被検者は心疾患に罹患している可能性が高いと判定する、方法。
［項２］
前記（ａ）における表面分子がCD20及び／又はCD110である、項１に記載の方法。
［項３］
前記（ｂ）における表面分子がCD25、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つである、項１又は２に記載の方法。
［項４］
前記（ｃ）における表面分子の組み合わせが、CD20及びCD110からなる群より選択される表面分子と、CD25、CD71及びCD169からなる群より選択される表面分子との組み合わせである、項１～３のいずれか1項に記載の方法。
［項５］
被検者が２型糖尿病に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、以下の（ａ）ないし（ｃ）：
（ａ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である
（ｂ）CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である
（ｃ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子の発現量を、CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される表面分子の発現量で除した値が標準値より高値である
の少なくとも１つに該当する場合に、該被検者は２型糖尿病に罹患している可能性が高いと判定する、方法。
［項６］
前記（ａ）における表面分子がCD110、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つである、項５に記載の方法。
［項７］
前記（ｂ）における表面分子がCD25及び／又はEpoRである、項５又は６に記載の方法。
［項８］
前記（ｃ）における表面分子の組み合わせが、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子と、CD25及びEpoRからなる群より選択される表面分子との組み合わせである、項５～７のいずれか１項に記載の方法。
［項９］
被検者がSARS-CoV-2感染症に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値であり、かつCD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である場合に、該被検者はSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高いと判定する、方法。
［項１０］
SARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別のための検査方法であって、被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である、及び／又はCD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である場合に、該被検者はSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高いと鑑別する、方法。
［項１１］
表面分子の発現量の測定が、該表面分子と特異的に結合し得る物質との結合を検出することによる、項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
［項１２］
表面分子の発現量の測定が、表面プラズモン共鳴法により実施される、項１１に記載の方法。
［項１３］
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）CD20、CD110、ActR、DARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、心疾患の判定用検査キット。
［項１４］
項１３に記載のキットと、該キットに含まれる表面分子に特異的に結合し得る物質と該表面分子との相互作用を検出し得る装置と、を含んでなる、心疾患の判定用検査システム。
［項１５］
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR、DARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、２型糖尿病の判定用検査キット。
［項１６］
項１５に記載のキットと、該キットに含まれる表面分子に特異的に結合し得る物質と該表面分子との相互作用を検出し得る装置と、を含んでなる、２型糖尿病の判定用検査システム。
［項１７］
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、SARS-CoV-2感染症の判定用又はSARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別用検査キット。
［項１８］
項１７に記載のキットと、該キットに含まれる表面分子に特異的に結合し得る物質と該表面分子との相互作用を検出し得る装置と、を含んでなる、SARS-CoV-2感染症の判定用又はSARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別用検査システム。
［項１］
被検者が心疾患に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、以下の（ａ）ないし（ｃ）：
（ａ）CD20、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である
（ｂ）CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である
（ｃ）CD20、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子の発現量を、CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される表面分子の発現量で除した値が標準値より高値である
の少なくとも１つに該当する場合に、該被検者は心疾患に罹患している可能性が高いと判定する、方法。
［項２］
前記（ａ）における表面分子がCD20及び／又はCD110である、項１に記載の方法。
［項３］
前記（ｂ）における表面分子がCD25、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つである、項１又は２に記載の方法。
［項４］
前記（ｃ）における表面分子の組み合わせが、CD20及びCD110からなる群より選択される表面分子と、CD25、CD71及びCD169からなる群より選択される表面分子との組み合わせである、項１～３のいずれか1項に記載の方法。
［項５］
被検者が２型糖尿病に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、以下の（ａ）ないし（ｃ）：
（ａ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である
（ｂ）CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である
（ｃ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子の発現量を、CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される表面分子の発現量で除した値が標準値より高値である
の少なくとも１つに該当する場合に、該被検者は２型糖尿病に罹患している可能性が高いと判定する、方法。
［項６］
前記（ａ）における表面分子がCD110、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つである、項５に記載の方法。
［項７］
前記（ｂ）における表面分子がCD25及び／又はEpoRである、項５又は６に記載の方法。
［項８］
前記（ｃ）における表面分子の組み合わせが、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子と、CD25及びEpoRからなる群より選択される表面分子との組み合わせである、項５～７のいずれか１項に記載の方法。
［項９］
被検者がSARS-CoV-2感染症に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値であり、かつCD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である場合に、該被検者はSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高いと判定する、方法。
［項１０］
SARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別のための検査方法であって、被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である、及び／又はCD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である場合に、該被検者はSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高いと鑑別する、方法。
［項１１］
表面分子の発現量の測定が、該表面分子と特異的に結合し得る物質との結合を検出することによる、項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
［項１２］
表面分子の発現量の測定が、表面プラズモン共鳴法により実施される、項１１に記載の方法。
［項１３］
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）CD20、CD110、ActR、DARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、心疾患の判定用検査キット。
［項１４］
項１３に記載のキットと、該キットに含まれる表面分子に特異的に結合し得る物質と該表面分子との相互作用を検出し得る装置と、を含んでなる、心疾患の判定用検査システム。
［項１５］
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR、DARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、２型糖尿病の判定用検査キット。
［項１６］
項１５に記載のキットと、該キットに含まれる表面分子に特異的に結合し得る物質と該表面分子との相互作用を検出し得る装置と、を含んでなる、２型糖尿病の判定用検査システム。
［項１７］
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、SARS-CoV-2感染症の判定用又はSARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別用検査キット。
［項１８］
項１７に記載のキットと、該キットに含まれる表面分子に特異的に結合し得る物質と該表面分子との相互作用を検出し得る装置と、を含んでなる、SARS-CoV-2感染症の判定用又はSARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別用検査システム。
本発明によれば、迅速かつ非侵襲的に心疾患、２型糖尿病及びSARS-CoV-2感染症の体液診断、並びにSARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別が可能となる。
１．心疾患の判定のための検査方法、そのためのキット及び検査システム
本発明は、被検者が心疾患に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、１以上の特定の表面分子の発現量を標準値と比較することによる、方法（以下、「本発明の方法（１）」ともいう。）を提供する。
本発明は、被検者が心疾患に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、１以上の特定の表面分子の発現量を標準値と比較することによる、方法（以下、「本発明の方法（１）」ともいう。）を提供する。
本発明の方法（１）における被検者はヒトであれば、年齢、性別等に特に制限はないが、好ましくは心疾患に罹患していることが疑われるヒト、より好ましくは、60歳以下のヒトである。ここで「心疾患」としては、例えば、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、心房細動、心筋炎等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、高血圧症である。
「細胞外小胞（EVs）」とは、細胞から能動的に分泌される、脂質二重層で囲まれた複製できない粒子の相称である。従来より、細胞外に存在する膜小胞は、例えばその分泌経路の違いにより、エンドソーム膜由来のエクソソーム、形質膜由来のマイクロベシクル、死細胞の膜由来のアポトーシス小体などと呼び分けられてきた。しかし、これらのサブタイプは性質やサイズにおいてオーバーラップし、それらを明確に区別するマーカーについてのコンセンサスも得られていないため、国際細胞外小胞学会（ISEV）は「細胞外小胞」の使用を推奨しており、本明細書においてもこの用語を用いることとする。
本発明の方法（１）に用いられる生体試料としては、被検者から採取したものであって細胞外小胞を含むものであれば特に制限されず、例えば、体液、細胞又は組織の培養上清等が挙げられるが、好ましくは体液である。体液としては、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、リンパ液、脳脊髄液等が挙げられる。好ましくは、血液、血漿、血清等である。
本発明の方法（１）において測定対象となる細胞外小胞は、少なくともエクソソームを含むものであれば特に制限はなく、マイクロベシクルやアポトーシス小体が混在していてもよい。好ましくは、上記の生体試料中に含まれる直径約30～約150nmの膜小胞が挙げられるが、さらに大きな膜小胞を含んでもよい。
生体試料から細胞外小胞を単離する方法は特に制限されず、自体公知の方法を用いることができる。例えば、超遠心分離による回収（ペレットダウン）法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法、市販のキット・試薬を用いる方法等が挙げられる。
本発明の方法（１）においては、得られた細胞外小胞における表面分子の発現量を測定する。測定対象となる表面分子としては、CD20、CD110、アクチビン受容体（ActR）、Duffy抗原ケモカイン受容体（DARC）、CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される１以上の表面分子が挙げられる。
当該表面分子の測定は、自体公知の方法、例えば、フローサイトメトリー法、ExoScreen法、ExoTEST等のELISAを利用した方法、μNMR法、抗体アレイやレクチンアレイを用いる方法、表面プラズモン共鳴（SPR）を利用した方法などが挙げられるが、それらに限定されない。
好ましい一実施態様においては、表面プラズモン共鳴イメージング（SPRi）法を用いて細胞外小胞表面分子を測定することができる。SPRi法とは、測定対象に特異的に結合するリガンドを固定化したバイオチップに光を角度を変えて照射し、角度によって生じる反射率変化（プラズモン曲線）が、測定対象の結合により変化するのを検出することによって測定対象の発現量を解析する測定法である。本方法は、１つの試料で多種の表面分子を同時に測定することができるので、時間的に有利であるとともに、サンプル量が少量ですむ等の利点がある。
CD20、CD110、ActR、DARC、CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169のそれぞれに対する特異的リガンドとしては、これらの表面分子を特異的に認識し、結合できる分子であれば特に制限はないが、例えば、それらの表面分子に対する抗体、細胞接着因子（例えば、インテグリン）やサイトカイン、ケモカイン等の生理的リガンド、合成のアゴニスト又はアンタゴニスト、アプタマーなどが挙げられる。
抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体をともに包含する。また、当該抗体は、あらゆる哺乳動物由来の抗体を包含するものであってよく、さらに、IgG、IgA、IgM、IgDまたはIgEのいずれの免疫グロブリンクラスに属するものであってもよいが、好ましくはIgGである。当該抗体は目的の表面分子に結合する市販の抗体や研究機関に保存されている抗体を使用してもよい。あるいは、当業者であれば、従来公知の方法に従って、抗体を作製することができる。
また、抗体には、前記のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体に加えて、これらの抗体の断片が含まれる。抗体の断片とは、前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはFab、Fab’、F(ab’)2、scAb、scFv、またはscFv-Fc等を包含する。
また、抗体には、前記のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体に加えて、これらの抗体の断片が含まれる。抗体の断片とは、前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはFab、Fab’、F(ab’)2、scAb、scFv、またはscFv-Fc等を包含する。
アプタマーは、表面分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、RNA、DNA、修飾核酸又はそれらの混合物であり得る。アプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態であり得る。
アプタマーがRNAである場合、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位のヒドロキシル基を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、アルコキシ化、Ｏ－アリル化、Ｓ－アルキル化、Ｓ－アリル化、アミノ化が挙げられる。
また糖残基については、２’位及び４’位で架橋構造を形成したBNA:Bridged nucleic acid(LNA:Linked nucleic acid)とすることもできる。
アプタマーがRNAである場合、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位のヒドロキシル基を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、アルコキシ化、Ｏ－アリル化、Ｓ－アルキル化、Ｓ－アリル化、アミノ化が挙げられる。
また糖残基については、２’位及び４’位で架橋構造を形成したBNA:Bridged nucleic acid(LNA:Linked nucleic acid)とすることもできる。
表面分子に対するリガンドは担体に固相化される。リガンドの固相化は、上記リガンドを緩衝液で適当な濃度に調整し、担体にスポットし、静置することによって実施することができる。固相化する際のリガンドの濃度は適宜決定してよいが、例えば、1 mg/mlでよい。静置する時間は適宜決定してよいが、例えば、8～16時間でよい。
担体は、表面プラズモン共鳴法で使用されうる担体であれば特に制限はないが、例えば、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、ガラス、金属薄膜、ニトロセルロース膜等が挙げられる。
担体と細胞外小胞を含む被検試料との接触前に、カゼイン溶液またはカゼイン分解物溶液と被検試料を混合することが望ましい。それにより細胞外小胞の濃度がより高い被検試料を調製することができる。調製された被験試料は、カゼイン溶液またはカゼイン分解物溶液と混合（以下、混合物）される。カゼイン溶液またはカゼイン分解物溶液は、上記の洗浄に用いるためのカゼイン溶液またはカゼイン分解物溶液と同様であってよい。また、該混合物を担体に接触させる際は、担体表面上に接触させる時間、温度、回数は当業者が適宜決定できるが、例えば、10分～2時間、室温、1～3回で接触させることができる。
好ましい一実施態様において、本発明の方法（１）は、マイクロアレイ型SPRi装置およびバイオチップを用いて行うことができる。バイオチップは、プリズムと該プリズムの一側面に成膜される金属から構成されている。プリズムの形状は台形、三角形および円形（半柱形）などが挙げられる。また、プリズムの屈折率は通常1.5～1.8である。プリズムの一側面に成膜される金属としては、金、銀、銅、アルミニウムなどが挙げられる。また、バイオチップはその表面をスクシンイミドで活性化されたカルボキシ基が固相化されていることが好ましい。また、マイクロアレイ型SPRi装置は、バイオチップ表面へのエクソソームの結合によって誘起されるSPR現象に伴う反射光を検出するセンサーおよび反射光の変化量を反射率(％)として計算し、出力する装置を備える。また、上記マイクロアレイ型SPRi装置は、計算された反射率の変化を色調イメージに変換して出力する装置も備える。当該装置は、バイオチップ表面における結合性分子が固相化されていない箇所の色調変化も確認できるため、細胞外小胞の非特異的結合の有無を確認することができる。
マイクロアレイ型SPRi装置およびバイオチップを用いたSPRi法の詳細については、例えば、WO 2019/044845を参照することができる。また、マイクロアレイ型SPRi装置については、下記本発明の検査システム（１）において詳述する。
表面分子の発現量の測定の結果、以下の（ａ）ないし（ｃ）：
（ａ）CD20、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である
（ｂ）CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である
（ｃ）CD20、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子の発現量を、CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される表面分子の発現量で除した値が標準値より高値である
の少なくとも１つに該当する場合に、該被検者は心疾患に罹患している可能性が高いと判定することができる。一実施態様においては、前記（ａ）ないし（ｃ）の少なくとも２つ（即ち、（ａ）と（ｂ）、（ｂ）と（ｃ）、（ａ）と（ｃ）、あるいは（ａ）、（ｂ）及び（ｃ））に該当する場合に、該被検者は心疾患に罹患している可能性が高いと判定することができる。
ここで「標準値」とは、心疾患に罹患していないことが既知の非心疾患群（例、健常者群）における上記表面分子の発現量又は発現量比の平均とばらつきから導かれるカットオフ値（例、平均値±3SDなど）として与えられる。標準値は、その都度対照となる非心疾患群における発現量又は発現量比を測定して算出してもよいし、予め決定しておくこともできる。
（ａ）CD20、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である
（ｂ）CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である
（ｃ）CD20、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子の発現量を、CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される表面分子の発現量で除した値が標準値より高値である
の少なくとも１つに該当する場合に、該被検者は心疾患に罹患している可能性が高いと判定することができる。一実施態様においては、前記（ａ）ないし（ｃ）の少なくとも２つ（即ち、（ａ）と（ｂ）、（ｂ）と（ｃ）、（ａ）と（ｃ）、あるいは（ａ）、（ｂ）及び（ｃ））に該当する場合に、該被検者は心疾患に罹患している可能性が高いと判定することができる。
ここで「標準値」とは、心疾患に罹患していないことが既知の非心疾患群（例、健常者群）における上記表面分子の発現量又は発現量比の平均とばらつきから導かれるカットオフ値（例、平均値±3SDなど）として与えられる。標準値は、その都度対照となる非心疾患群における発現量又は発現量比を測定して算出してもよいし、予め決定しておくこともできる。
好ましくは、前記（ａ）における表面分子として、CD20及び／又はCD110を用いることができる。また、好ましくは、前記（ｂ）における表面分子として、CD25、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つを用いることができる。あるいは、前記（ｃ）における表面分子の好ましい組み合わせは、CD20及びCD110からなる群より選択される表面分子と、CD25、CD71及びCD169からなる群より選択される表面分子との組み合わせである。
本発明の方法（１）において、２種の表面分子の発現量を２次元プロットで示すことにより、心疾患に罹患している可能性が高い被検者群を明確に可視化することができる。また、さらに多数の表面分子を測定対象とする場合、各表面分子の発現量をレーダーチャートで示すことにより、心疾患に罹患している可能性が高い被検者群を明確に可視化することができる。
本発明はまた、以下の（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）CD20、CD110、ActR、DARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、心疾患の判定用検査キットを提供する。
（ａ）CD20、CD110、ActR、DARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、心疾患の判定用検査キットを提供する。
ここで、各表面分子に特異的に結合し得る物質としては、上記した特異的リガンドが挙げられる。当該物質は、遊離した状態（例、溶液）で提供されてもよいし、あるいは、上記バイオチップ等のように担体に固相化された状態で提供されてもよく、表面分子の測定方法に応じて適宜選択され得る。好ましい一実施態様においては、上記（ａ）及び／又は（ｂ）から選択される１以上、好ましくは２以上の表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質が担体に固相化されたバイオチップ（例えば、図５を参照）を用いることができる。
本発明はまた、上記キットと、該キットに含まれる物質と該物質が特異的に結合し得る表面分子との結合を検出し得る装置と、を含んでなる、心疾患の判定用検査システム（以下、「本発明の検査システム（１）」ともいう。）を提供する。当該装置としては、本発明の方法（１）において表面分子の測定に用いられる各種方法に応じて自体公知の装置を用いることができる。例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）を利用した装置、フローサイトメーター等を挙げることができる。
より具体的な本発明の検出装置の一例として、マイクロアレイ型SPRi装置を図６に示す。
図６に示された装置１は、計測部２と、本体部３とから主として構成されている。計測部２は、担体２１と、センサー２２と、演算部２３と、廃液用ボトル２４と、移動相用ボトル２５と、送液ポンプ２６と、脱気装置２７と、被験試料供給口２８とから主として構成されている。本体部３は、表示部３１と、制御部３２とから主として構成されている。
担体２１は、細胞外小胞の表面分子と、上記キットに含まれる該表面分子と特異的に結合し得る物質との相互作用によって誘起されるSPR現象を生じさせるデバイスである。センサー２２は、該表面分子と該物質との相互作用によって誘起されるSPR現象を反射光として検出する。具体的にはセンサーとしてCCDカメラが、各反射光検出位置における反射光強度を電流値と電圧値として検出する。演算部２３は、上記センサー２２によって検出した反射光の変化量を反射率(％)として計算し、出力する。廃液用ボトル２４は、計測部２でセンサーチップ２１を通過した被験試料やバッファーの廃棄用ボトルである。移動相用ボトル２５は、計測部２でセンサーチップ２１を通過させるための移動相用ボトルである。送液ポンプ２６は、移動相用ボトルのバッファーを送液するためのポンプである。脱気装置２７は、バッファーを脱気するための装置である。被験試料挿入口２８は、被験試料を計測部２に投入するための挿入口である。
表示部３１は、演算部２３によって計算された反射率の変化を受け付けて色調イメージに変換して出力する。なお、表示部３１は色調イメージだけでなく、図４－１のように反射率の経時変化をそのままグラフとして表示してもよい。これら色調イメージと反射率の経時変化を表示部で同時に表示するように構成してもよい。さらに、図１～３、図４－２のようなマーカー量をまとめたグラフを個別に、または組み合わせて表示してもよい。制御部３２は、計測部２に備え付けられた反射鏡の回転角度や照射光源の強度を調整する。
２．２型糖尿病の判定のための検査方法、そのためのキット及び検査システム
本発明はまた、被検者が２型糖尿病に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、以下の（ａ）ないし（ｃ）：
（ａ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、トランスフェリン受容体（TfR）、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である
（ｂ）CD25、エリスロポイエチン受容体（EpoR）、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である
（ｃ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子の発現量を、CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される表面分子の発現量で除した値が標準値より高値である
の少なくとも１つに該当する場合に、該被検者は２型糖尿病に罹患している可能性が高いと判定する、方法（以下、「本発明の方法（２）」ともいう。）を提供する。
本発明はまた、被検者が２型糖尿病に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、以下の（ａ）ないし（ｃ）：
（ａ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、トランスフェリン受容体（TfR）、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である
（ｂ）CD25、エリスロポイエチン受容体（EpoR）、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である
（ｃ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子の発現量を、CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される表面分子の発現量で除した値が標準値より高値である
の少なくとも１つに該当する場合に、該被検者は２型糖尿病に罹患している可能性が高いと判定する、方法（以下、「本発明の方法（２）」ともいう。）を提供する。
本発明の方法（２）において、細胞外小胞表面分子の測定は、本発明の方法（１）と同様に行うことができる。CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR、DARC、CD25、EpoRに対する特異的リガンドとしては、上記と同様に、例えば、それらの表面分子に対する抗体、細胞接着因子（例えば、インテグリン）やサイトカイン、ケモカイン、ホルモン等の生理的リガンド、合成のアゴニスト又はアンタゴニスト、アプタマーなどが挙げられる。また、MAM結合性糖やUEA-1結合性糖に対するリガンドとしては、MAM、UEA-1等のレクチンを挙げることができる。
表面分子の発現量の測定の結果、以下の（ａ）ないし（ｃ）：
（ａ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である
（ｂ）CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である
（ｃ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子の発現量を、CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される表面分子の発現量で除した値が標準値より高値である
の少なくとも１つに該当する場合に、該被検者は２型糖尿病に罹患している可能性が高いと判定することができる。一実施態様においては、前記（ａ）ないし（ｃ）の少なくとも２つ（即ち、（ａ）と（ｂ）、（ｂ）と（ｃ）、（ａ）と（ｃ）、あるいは（ａ）、（ｂ）及び（ｃ））に該当する場合に、該被検者は２型糖尿病に罹患している可能性が高いと判定することができる。
ここで「標準値」とは、２型糖尿病に罹患していないことが既知の非２型糖尿病群（例、健常者群）における上記表面分子の発現量又は発現量比の平均とばらつきから導かれるカットオフ値（例、平均値±3SDなど）として与えられる。標準値は、その都度対照となる非２型糖尿病群における発現量又は発現量比を測定して算出してもよいし、予め決定しておくこともできる。
（ａ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である
（ｂ）CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である
（ｃ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子の発現量を、CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される表面分子の発現量で除した値が標準値より高値である
の少なくとも１つに該当する場合に、該被検者は２型糖尿病に罹患している可能性が高いと判定することができる。一実施態様においては、前記（ａ）ないし（ｃ）の少なくとも２つ（即ち、（ａ）と（ｂ）、（ｂ）と（ｃ）、（ａ）と（ｃ）、あるいは（ａ）、（ｂ）及び（ｃ））に該当する場合に、該被検者は２型糖尿病に罹患している可能性が高いと判定することができる。
ここで「標準値」とは、２型糖尿病に罹患していないことが既知の非２型糖尿病群（例、健常者群）における上記表面分子の発現量又は発現量比の平均とばらつきから導かれるカットオフ値（例、平均値±3SDなど）として与えられる。標準値は、その都度対照となる非２型糖尿病群における発現量又は発現量比を測定して算出してもよいし、予め決定しておくこともできる。
好ましくは、前記（ａ）における表面分子として、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つを用いることができる。また、好ましくは、前記（ｂ）における表面分子として、CD25及び／又はEpoRを用いることができる。あるいは、前記（ｃ）における表面分子の好ましい組み合わせは、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子と、CD25及びEpoRからなる群より選択される表面分子との組み合わせである。
本発明の方法（２）において、２種の表面分子の発現量を２次元プロットで示すことにより、２型糖尿病に罹患している可能性が高い被検者群を明確に可視化することができる。また、さらに多数の表面分子を測定対象とする場合、各表面分子の発現量をレーダーチャートで示すことにより、２型糖尿病に罹患している可能性が高い被検者群を明確に可視化することができる。
本発明はまた、以下の（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR、DARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、２型糖尿病の判定用検査キットを提供する。
（ａ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR、DARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、２型糖尿病の判定用検査キットを提供する。
ここで、各表面分子に特異的に結合し得る物質としては、上記した特異的リガンドが挙げられる。当該物質は、遊離した状態（例、溶液）で提供されてもよいし、あるいは、本発明の方法（１）において上記したバイオチップ等のように担体に固相化された状態で提供されてもよく、表面分子の測定方法に応じて適宜選択され得る。好ましい一実施態様においては、上記（ａ）及び／又は（ｂ）から選択される１以上、好ましくは２以上の表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質が担体に固相化されたバイオチップ（例えば、図５を参照）を用いることができる。
本発明はまた、上記キットと、該キットに含まれる物質と該物質が特異的に結合し得る表面分子との結合を検出し得る装置と、を含んでなる、２型糖尿病の判定用検査システム（以下、「本発明の検査システム（２）」ともいう。）を提供する。当該装置としては、本発明の方法（１）において表面分子の測定に用いられる各種方法に応じて自体公知の装置を用いることができる。例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）を利用した装置、フローサイトメーター等を挙げることができる。好ましい一実施態様においては、当該装置として、本発明の検査システム（１）において詳述したマイクロアレイ型SPRi装置を用いることができる。
３．SARS-CoV-2感染症（COVID-19）の判定のための検査方法及びそのためのキット
本発明はまた、被検者がSARS-CoV-2感染症に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子が標準値よりも高値であり、かつCD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、Lectin, Fucose specific from Aspergillusoryzae（LF）結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子が標準値よりも低値である場合に、該被検者はSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高いと判定する、方法（以下、「本発明の方法（３）」という。）を提供する。
本発明はまた、被検者がSARS-CoV-2感染症に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子が標準値よりも高値であり、かつCD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、Lectin, Fucose specific from Aspergillusoryzae（LF）結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子が標準値よりも低値である場合に、該被検者はSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高いと判定する、方法（以下、「本発明の方法（３）」という。）を提供する。
本発明の方法（３）において、細胞外小胞表面分子の測定は、本発明の方法（１）と同様に行うことができる。CD25、CD169、DARC、CD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActRに対する特異的リガンドとしては、上記と同様に、例えば、それらの表面分子に対する抗体、細胞接着因子（例えば、インテグリン）やサイトカイン、ケモカイン、ホルモン等の生理的リガンド、合成のアゴニスト又はアンタゴニスト、アプタマーなどが挙げられる。また、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖、UEA-1結合性糖に対するリガンドとしては、それぞれLF、MAM、SBA、UEA-1等のレクチンを挙げることができる。
表面分子の発現量の測定の結果、CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値であり、かつCD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である場合に、該被検者はSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高いと判定することができる。
ここで「標準値」とは、SARS-CoV-2感染症に罹患していないことが既知の非SARS-CoV-2感染症群（例、健常者群）における上記表面分子の発現量の平均とばらつきから導かれるカットオフ値（例、平均値±3SDなど）として与えられる。標準値は、その都度対照となる非SARS-CoV-2感染症群における発現量を測定して算出してもよいし、予め決定しておくこともできる。
ここで「標準値」とは、SARS-CoV-2感染症に罹患していないことが既知の非SARS-CoV-2感染症群（例、健常者群）における上記表面分子の発現量の平均とばらつきから導かれるカットオフ値（例、平均値±3SDなど）として与えられる。標準値は、その都度対照となる非SARS-CoV-2感染症群における発現量を測定して算出してもよいし、予め決定しておくこともできる。
本発明の方法（３）において、２種の表面分子の発現量を２次元プロットで示すことにより、SARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高い被検者群を明確に可視化することができる。また、さらに多数の表面分子を測定対象とする場合、各表面分子の発現量をレーダーチャートで示すことにより、SARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高い被検者群を明確に可視化することができる。
本発明はまた、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、SARS-CoV-2感染症の判定用検査キットを提供する。
（ａ）CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、SARS-CoV-2感染症の判定用検査キットを提供する。
ここで、各表面分子に特異的に結合し得る物質としては、上記した特異的リガンドが挙げられる。当該物質は、遊離した状態（例、溶液）で提供されてもよいし、あるいは、本発明の方法（１）において上記したバイオチップ等のように担体に固相化された状態で提供されてもよく、表面分子の測定方法に応じて適宜選択され得る。好ましい一実施態様においては、上記（ａ）及び（ｂ）からそれぞれ選択される１以上の表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質が担体に固相化されたバイオチップ（例えば、図５を参照）を用いることができる。
本発明はまた、上記キットと、該キットに含まれる物質と該物質が特異的に結合し得る表面分子との結合を検出し得る装置と、を含んでなる、SARS-CoV-2感染症の判定用検査システム（以下、「本発明の検査システム（３）」ともいう。）を提供する。当該装置としては、本発明の方法（１）において表面分子の測定に用いられる各種方法に応じて自体公知の装置を用いることができる。例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）を利用した装置、フローサイトメーター等を挙げることができる。好ましい一実施態様においては、当該装置として、本発明の検査システム（１）において詳述したマイクロアレイ型SPRi装置を用いることができる。
４．SARS-CoV-2感染症（COVID-19）と心疾患との鑑別のための検査方法及びそのためのキット
本発明はまた、SARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別のための検査方法であって、被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である、及び／又はCD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である場合に、該被検者はSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高いと鑑別する、方法（以下、「本発明の方法（４）」という。）を提供する。
本発明はまた、SARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別のための検査方法であって、被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である、及び／又はCD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である場合に、該被検者はSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高いと鑑別する、方法（以下、「本発明の方法（４）」という。）を提供する。
本発明の方法（４）において、細胞外小胞表面分子の測定は、本発明の方法（１）と同様に行うことができる。CD25、CD169、DARC、CD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActRに対する特異的リガンドとしては、上記と同様に、例えば、それらの表面分子に対する抗体、細胞接着因子（例えば、インテグリン）やサイトカイン、ケモカイン、ホルモン等の生理的リガンド、合成のアゴニスト又はアンタゴニスト、アプタマーなどが挙げられる。また、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖、UEA-1結合性糖に対するリガンドとしては、それぞれLF、MAM、SBA、UEA-1等のレクチンを挙げることができる。
表面分子の発現量の測定の結果、CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子が標準値よりも高値であり、かつCD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子が標準値よりも低値である場合に、該被検者はSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高いと判定することができる。
ここで「標準値」とは、SARS-CoV-2感染症に罹患していないことが既知の心疾患群における上記表面分子の発現量の平均とばらつきから導かれるカットオフ値（例、平均値±3SDなど）として与えられる。標準値は、その都度対照となる非SARS-CoV-2感染心疾患群における発現量を測定して算出してもよいし、予め決定しておくこともできる。
ここで「標準値」とは、SARS-CoV-2感染症に罹患していないことが既知の心疾患群における上記表面分子の発現量の平均とばらつきから導かれるカットオフ値（例、平均値±3SDなど）として与えられる。標準値は、その都度対照となる非SARS-CoV-2感染心疾患群における発現量を測定して算出してもよいし、予め決定しておくこともできる。
本発明の方法（４）において、２種の表面分子の発現量を２次元プロットで示すことにより、心疾患ではなくSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高い被検者群を明確に可視化することができる。また、さらに多数の表面分子を測定対象とする場合、各表面分子の発現量をレーダーチャートで示すことにより、心疾患ではなくSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高い被検者群を明確に可視化することができる。
本発明はまた、以下の（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、SARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別用検査キットを提供する。
（ａ）CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、SARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別用検査キットを提供する。
ここで、各表面分子に特異的に結合し得る物質としては、上記した特異的リガンドが挙げられる。当該物質は、遊離した状態（例、溶液）で提供されてもよいし、あるいは、本発明の方法（１）において上記したバイオチップ等のように担体に固相化された状態で提供されてもよく、表面分子の測定方法に応じて適宜選択され得る。好ましい一実施態様においては、上記（ａ）及び／又は（ｂ）から選択される１以上、好ましくは２以上の表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質が担体に固相化されたバイオチップ（例えば、図５を参照）を用いることができる。
本発明はまた、上記キットと、該キットに含まれる物質と該物質が特異的に結合し得る表面分子との結合を検出し得る装置と、を含んでなる、SARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別用検査システム（以下、「本発明の検査システム（４）」ともいう。）を提供する。当該装置としては、本発明の方法（１）において表面分子の測定に用いられる各種方法に応じて自体公知の装置を用いることができる。例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）を利用した装置、フローサイトメーター等を挙げることができる。好ましい一実施態様においては、当該装置として、本発明の検査システム（１）において詳述したマイクロアレイ型SPRi装置を用いることができる。
以下に実施例等を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例等により限定されるものではない。
実施例１ 患者血清由来細胞外小胞（EV）の疾患マーカー表面分子の同定
［対象および方法］
本実施例では、健常人血清15例、２型糖尿病患者血清70例、高血圧患者血清70例、COVID-19患者血清14例（表１）及びプール血清から細胞外小胞（EV）を抽出し、SPRi測定による分子間相互作用解析を行った。
［対象および方法］
本実施例では、健常人血清15例、２型糖尿病患者血清70例、高血圧患者血清70例、COVID-19患者血清14例（表１）及びプール血清から細胞外小胞（EV）を抽出し、SPRi測定による分子間相互作用解析を行った。
（１）血清処理
抗凝固剤の含まれていない生化学用採血管で通常静脈下採血を行い30分静置後3500rpm、10min遠心し、上清を血清として回収した。回収した血清を0.20μmのフィルタ（Minisart-plus: sartrius stedim biotech）で濾過し、デブリスを除去した。血清を保存する際は濾過滅菌後-80℃で保存した。
抗凝固剤の含まれていない生化学用採血管で通常静脈下採血を行い30分静置後3500rpm、10min遠心し、上清を血清として回収した。回収した血清を0.20μmのフィルタ（Minisart-plus: sartrius stedim biotech）で濾過し、デブリスを除去した。血清を保存する際は濾過滅菌後-80℃で保存した。
（２）ExoQuickによるEV抽出
濾過滅菌した血清100μLとExoQuick（SBI）25μLを混合し、よくボルテックスした後、4℃で30min静置した。その後1500Gで30min遠心し、上清を除去した（この際EVは白色～薄黄色のペレットとして沈殿する）。さらに1500Gで5min遠心して上清を除去し、EVペレットを得た。300μLの0.1％カゼインでペレットを懸濁しEV溶液とした。
濾過滅菌した血清100μLとExoQuick（SBI）25μLを混合し、よくボルテックスした後、4℃で30min静置した。その後1500Gで30min遠心し、上清を除去した（この際EVは白色～薄黄色のペレットとして沈殿する）。さらに1500Gで5min遠心して上清を除去し、EVペレットを得た。300μLの0.1％カゼインでペレットを懸濁しEV溶液とした。
（３）SPRi測定のためのEV溶液処理
得られたEV溶液を、0.1％カゼインを用いて40倍希釈し、測定用サンプルとした。測定に200μLのサンプルを使用するため、デッドボリュームを考慮し300μL以上サンプルを作製した。
得られたEV溶液を、0.1％カゼインを用いて40倍希釈し、測定用サンプルとした。測定に200μLのサンプルを使用するため、デッドボリュームを考慮し300μL以上サンプルを作製した。
（４）SPRi測定
SPRi解析は、OpenPlex及びXelplex（株式会社堀場製作所）を使用した。OpenPlexでは、1 mlシリンジ（TERUMO）を用いてサンプル溶液をOpenPlexに流し込んで測定を行った。XelPleXでは装置付属機能のオートサンプラーで実施した。サンプルを測定後のバイオチップ上残存EVを剥離させるため、測定開始時およびサンプル測定後は再生液（4M MgCl2）で洗浄した。再生液の流速は4000μL/min以上、サンプル（EV溶液）の流速は25μL/minで繰り返し測定した。
SPRi解析は、OpenPlex及びXelplex（株式会社堀場製作所）を使用した。OpenPlexでは、1 mlシリンジ（TERUMO）を用いてサンプル溶液をOpenPlexに流し込んで測定を行った。XelPleXでは装置付属機能のオートサンプラーで実施した。サンプルを測定後のバイオチップ上残存EVを剥離させるため、測定開始時およびサンプル測定後は再生液（4M MgCl2）で洗浄した。再生液の流速は4000μL/min以上、サンプル（EV溶液）の流速は25μL/minで繰り返し測定した。
（５）解析
SPR専用の解析ソフトであるScrubber Genを用いて解析を行った。解析ソフト上でBlank（抗体等を乗せていないスポット）の値で補正を行い、サンプル結合時間経過による分子間相互反応の変化を算出した。その後、
（サンプル結合ピーク時の結合の強さ）-（サンプル結合開始時の結合の強さ）
により、リガンド毎の結合の強さを計測した。計測した各リガンドの結合の強さをCD63の結合の強さで割ることで粒子数の補正を行い、最終的なリガンドの相対発現量とした。
SPR専用の解析ソフトであるScrubber Genを用いて解析を行った。解析ソフト上でBlank（抗体等を乗せていないスポット）の値で補正を行い、サンプル結合時間経過による分子間相互反応の変化を算出した。その後、
（サンプル結合ピーク時の結合の強さ）-（サンプル結合開始時の結合の強さ）
により、リガンド毎の結合の強さを計測した。計測した各リガンドの結合の強さをCD63の結合の強さで割ることで粒子数の補正を行い、最終的なリガンドの相対発現量とした。
［結果］
解析の結果、心疾患患者の血清中EVにおいて、CD20 CD110 ActR及びDARCが健常者と比較して有意に高値であり、CD63 CD81 CD4 CD8 CD25 CD44 CD71及びCD169が有意に低値であることが明らかとなった。CD9 EpoR及びTfR2は心疾患患者と健常者との間で有意差はなかった（表２）。図１にCD169とCD20（左上）、CD169とCD110（右上）、CD71とCD20（左下）、CD71とCD110（右下）の発現量の2次元プロットを示す。
解析の結果、心疾患患者の血清中EVにおいて、CD20 CD110 ActR及びDARCが健常者と比較して有意に高値であり、CD63 CD81 CD4 CD8 CD25 CD44 CD71及びCD169が有意に低値であることが明らかとなった。CD9 EpoR及びTfR2は心疾患患者と健常者との間で有意差はなかった（表２）。図１にCD169とCD20（左上）、CD169とCD110（右上）、CD71とCD20（左下）、CD71とCD110（右下）の発現量の2次元プロットを示す。
また、２型糖尿病患者の血清中EVにおいて、CD9 CD4 CD8 CD20 CD71 CD110 TfR ActR及びDARCが健常者と比較して有意に高値であり、CD25 EｐｏR MAM及びUEA-1が有意に低値であることが明らかとなった。CD63 CD81 CD44 CD169 LF及びSBAは２型糖尿病患者と健常者との間で有意差はなかった（表３）。図２にEpoRとCD110（左上）、EpoRとDARC（右上）、CD25とCD110（左下）、CD25とDARC(右下)の発現量の2次元プロットを示す。
また、COVID-19患者の血清中EVにおいて、CD25 CD169及びDARCが心疾患患者と比較して有意に高値であり、CD63 CD9 CD81 CD110 EpoR TfR ActR LF MAM SBA及びUEA-1が有意に低値であることが明らかとなった。CD4は２型糖尿病患者と心疾患患者との間で有意差はなかった（表４）。図３にCD9とDARC（左上）、CD81とDARC（中上）、ActRとDARC（右上）、CD9とCD169（左下）、CD81とCD169（中下）、ActRとCD169（右下）の発現量の2次元プロットを示す。
実施例２ 培養細胞由来EVの表面分子マーカー発現のレーダーチャートによる視覚化例
ヒト巨核芽球細胞（MEG01S; Accession: CVCL_3022）由来EVにおける種々の表面分子の発現量をSPRi法により測定した。各表面分子について反射率変化の経時変化を示した図を図４－１に、レーダーチャートで示した図を図４－２にそれぞれ示す。レーダーチャート化することにより、臨床的に関連するマーカー同士を近い位置に配置して各マーカー量の大小を見ることで、複数マーカーの相関関係を見ることができる。
ヒト巨核芽球細胞（MEG01S; Accession: CVCL_3022）由来EVにおける種々の表面分子の発現量をSPRi法により測定した。各表面分子について反射率変化の経時変化を示した図を図４－１に、レーダーチャートで示した図を図４－２にそれぞれ示す。レーダーチャート化することにより、臨床的に関連するマーカー同士を近い位置に配置して各マーカー量の大小を見ることで、複数マーカーの相関関係を見ることができる。
これまで、心疾患、２型糖尿病及びSARS-CoV-2感染症の疾患バイオマーカーとなり得る細胞外小胞表面分子はほとんど報告されていない。本発明で同定された特定の細胞外小胞表面分子は、これらの疾患に対する高感度・高確度なバイオマーカーとなり得るので、これらの疾患の体液診断が可能となり、早期発見・早期治療が期待できる。
本願は、日本で出願された特願２０２２－０５０３３６号を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含される。
Claims (18)
- 被検者が心疾患に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、以下の（ａ）ないし（ｃ）：
（ａ）CD20、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である
（ｂ）CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である
（ｃ）CD20、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子の発現量を、CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される表面分子の発現量で除した値が標準値より高値である
の少なくとも１つに該当する場合に、該被検者は心疾患に罹患している可能性が高いと判定する、方法。 - 前記（ａ）における表面分子がCD20及び／又はCD110である、請求項１に記載の方法。
- 前記（ｂ）における表面分子がCD25、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つである、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記（ｃ）における表面分子の組み合わせが、CD20及びCD110からなる群より選択される表面分子と、CD25、CD71及びCD169からなる群より選択される表面分子との組み合わせである、請求項１～３のいずれか1項に記載の方法。
- 被検者が２型糖尿病に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、以下の（ａ）ないし（ｃ）：
（ａ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である
（ｂ）CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である
（ｃ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子の発現量を、CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される表面分子の発現量で除した値が標準値より高値である
の少なくとも１つに該当する場合に、該被検者は２型糖尿病に罹患している可能性が高いと判定する、方法。 - 前記（ａ）における表面分子がCD110、ActR及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項５に記載の方法。
- 前記（ｂ）における表面分子がCD25及び／又はEpoRである、請求項５又は６に記載の方法。
- 前記（ｃ）における表面分子の組み合わせが、CD110、ActR及びDARCからなる群より選択される表面分子と、CD25及びEpoRからなる群より選択される表面分子との組み合わせである、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
- 被検者がSARS-CoV-2感染症に罹患しているか否かを判定するための検査方法であって、該被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値であり、かつCD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である場合に、該被検者はSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高いと判定する、方法。
- SARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別のための検査方法であって、被検者から採取した生体試料由来の細胞外小胞における表面分子の発現量を測定し、CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも高値である、及び／又はCD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子の発現量が標準値よりも低値である場合に、該被検者はSARS-CoV-2感染症に罹患している可能性が高いと鑑別する、方法。
- 表面分子の発現量の測定が、該表面分子と特異的に結合し得る物質との結合を検出することによる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
- 表面分子の発現量の測定が、表面プラズモン共鳴法により実施される、請求項１１に記載の方法。
- 以下の（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）CD20、CD110、ActR、DARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD63、CD81、CD4、CD8、CD25、CD44、CD71及びCD169からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、心疾患の判定用検査キット。 - 請求項１３に記載のキットと、該キットに含まれる表面分子に特異的に結合し得る物質と該表面分子との相互作用を検出し得る装置と、を含んでなる、心疾患の判定用検査システム。
- 以下の（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）CD9、CD4、CD8、CD20、CD71、CD110、TfR、ActR、DARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD25、EpoR、MAM結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、２型糖尿病の判定用検査キット。 - 請求項１５に記載のキットと、該キットに含まれる表面分子に特異的に結合し得る物質と該表面分子との相互作用を検出し得る装置と、を含んでなる、２型糖尿病の判定用検査システム。
- 以下の（ａ）及び／又は（ｂ）：
（ａ）CD25、CD169及びDARCからなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
（ｂ）CD63、CD9、CD81、CD110、EpoR、TfR、ActR、LF結合性糖、MAM結合性糖、SBA結合性糖及びUEA-1結合性糖からなる群より選択される少なくとも1つの表面分子にそれぞれ特異的に結合し得る物質
を含んでなる、SARS-CoV-2感染症の判定用又はSARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別用検査キット。 - 請求項１７に記載のキットと、該キットに含まれる表面分子に特異的に結合し得る物質と該表面分子との相互作用を検出し得る装置と、を含んでなる、SARS-CoV-2感染症の判定用又はSARS-CoV-2感染症と心疾患との鑑別用検査システム。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| PCT/JP2023/011891 WO2023182508A1 (ja) | 2022-03-25 | 2023-03-24 | 細胞外小胞表面分子を用いた疾患の検査方法及び検査キット |
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