KR20170115039A - 가와사키병의 검사 방법 및 키트 - Google Patents
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Abstract
가와사키병을 신속, 간편하게 검사하는 방법 및 키트를 제공한다.
리포다당 결합 단백질, 류신 리치 α2-당단백질, 앤지오텐시노겐 및 레티놀 결합 단백 4로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨을 측정하는 것을 포함하는, 가와사키병의 검사 방법. 리포다당 결합 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 시약, 류신 리치 α2-당단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 시약, 앤지오텐시노겐을 특이적으로 검출할 수 있는 시약 및 레티놀 결합 단백 4를 특이적으로 검출할 수 있는 시약으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 시약을 포함하는, 가와사키병의 검사 키트.
리포다당 결합 단백질, 류신 리치 α2-당단백질, 앤지오텐시노겐 및 레티놀 결합 단백 4로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨을 측정하는 것을 포함하는, 가와사키병의 검사 방법. 리포다당 결합 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 시약, 류신 리치 α2-당단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 시약, 앤지오텐시노겐을 특이적으로 검출할 수 있는 시약 및 레티놀 결합 단백 4를 특이적으로 검출할 수 있는 시약으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 시약을 포함하는, 가와사키병의 검사 키트.
Description
본 발명은 가와사키병의 검사 방법 및 키트에 관한 것이다.
가와사키병은 주로 4세 이하의 영유아에서 보이는 급성 열성 발진성 질환이고, 병태의 주체는 전신 혈관염이다. 가와사키병의 진단은 복수의 주요 증상(1.5일 이상 지속되는 발열, 2. 양쪽 안구 결막의 충혈, 3. 구순발적, 매설, 4. 부정형 발진, 5. 급성기의 손가락의 경성(硬性)·수장(手掌) 및 족저홍반(足低紅斑), 해열 후의 막양낙설(膜樣落屑), 6. 경부(頸部)의 비화농성 림프절 종창(腫脹))의 출현에 의해 행해지고 있다(가와사키병 진단의 안내서). 혈액 검사에서는 백혈구수·C 반응성 단백질·줄기세포 일탈효소의 상승, 적침(赤沈)의 항진, 백혈구 분획(호중구 비율) 등을 조사하고, 단층 심에코법이나 심혈관 조영법에 의한 관상동맥 병변의 확인 등도 행해지고 있다.
가와사키병은 저절로 경쾌(輕快)하는 질환이기는 하지만, 치료하지 않고 경과한 경우에 25∼30％의 환자에서 관상동맥 병변으로 대표되는 심합병증이 생긴다. 그 때문에, 가와사키병에서는 발병 초기에 치료를 개시하여 염증을 진정화하는 것이 중요하고, 하루라도 유열(有熱) 기간을 단축함과 아울러, 심합병증의 발생을 방지하는 것이 필요하다. 그러나, 가와사키병은 병인이나 발병 메커니즘에 대해서는 아직 분명하지 않아, 특이적 진단 검사는 없고, 주요 증상에 대해서도 개인차가 있어, 진단 기준을 충족시키지 않는 예도 다수 존재한다. 그렇기 때문에, 가와사키병의 신속한 확정 진단은 어렵다.
또한, 가와사키병의 진단에 관한 특허로는, 혈중의 VEGF(혈관내피증식인자: vascular endothelial growth factor) 농도를 측정하는 방법(특허문헌 1 : 일본 특허공개 평11-6832), 하나 또는 복수의 슈퍼 항원에 대한 IgM을 측정하는 방법(특허문헌 2 : 일본 특허공개 평3-139294), 그 외 유전자 다형의 조사(특허문헌 3 : 일본 특허공개 2009-72193) 등이 있지만, 임상의 현장에서 실제로 활용되고 있는 것은 아직 없다.
본 발명은 가와사키병을 신속, 간편하게 검사하는 방법 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 예의 노력한 결과, 리포다당 결합 단백질(Lipopolysaccharide binding protein(LBP)), 류신 리치 α2-당단백질1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1(LRG1)), 앤지오텐시노겐(Angiotensinogen(AGT)) 및, 레티놀 결합 단백 4(Retinol binding protein 4(RBP4))의 환자 혈청 중에서의 발현량 차이가 급성기(발열시)와 회복기(해열 후) 간에서 통계적으로 유의(p<0.0001)한 것을 발견했다. LBP, LRG1, AGT, RBP4에 대해서는 특이적인 항체가 이미 존재하고, 항원 항체 반응을 이용하여, 혈청 혹은 혈액 중의 이들 단백질량을 고감도면서 간편하게 측정할 수 있다. 이번에, 극히 소량의 혈청(혹은 전혈)을 사용한 면역 블랏 분석에 의해, 가와사키병 급성기에 LBP, LRG1, AGT가 많이 발현하고, RBP4의 발현은 낮은 것을 발견했다. 본 발명은 이들 지견에 기초하여 완성된 것이다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) 리포다당 결합 단백질, 류신 리치 α2-당단백질, 앤지오텐시노겐 및 레티놀 결합 단백 4로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨을 측정하는 것을 포함하는, 가와사키병의 검사 방법.
(2) 리포다당 결합 단백질, 류신 리치 α2-당단백질 및 앤지오텐시노겐으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨이 높은 경우에 가와사키병으로 이환(罹患)되었을 가능성이 높다고 판정하고, 상기 레벨이 낮은 경우에는 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 낮다고 판정하는 (1)에 기재된 방법.
(3) 레티놀 결합 단백 4에 대해서, 피험자 유래 검체 중의 레벨이 낮은 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 높다고 판정하고, 상기 레벨이 높은 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 낮다고 판정하는 (1)에 기재된 방법.
(4) 피험자가 가와사키병의 치료를 받고 있는 환자이고, 리포다당 결합 단백질, 류신 리치 α2-당단백질 및 앤지오텐시노겐으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분에 대해서, 피험자 유래 검체 중의 레벨을 1회 또는 다른 시기에 복수회 측정하고, 상기 레벨이 낮거나 혹은 저하한 경우에 치료에 의해 가와사키병에서 회복했다고 판정하고, 상기 레벨이 높거나 혹은 저하하지 않은 경우에 치료에 의해 가와사키병에서 회복하지 않았거나, 또는 회복이 불충분하다고 판정하는 (1)에 기재된 방법.
(5) 피험자가 가와사키병의 치료를 받고 있는 환자이고, 레티놀 결합 단백 4에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨을 1회 또는 다른 시기에 복수회 측정하고, 상기 레벨이 높거나 혹은 상승한 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복했다고 판정하고, 상기 레벨이 낮거나 혹은 상승하지 않은 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복하지 않았거나, 또는 회복이 불충분하다고 판정하는 (1)에 기재된 방법.
(6) 피험자 유래의 검체가 혈청 또는 전혈인 (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(7) 리포다당 결합 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 시약, 류신 리치 α2-당단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 시약, 앤지오텐시노겐을 특이적으로 검출할 수 있는 시약 및 레티놀 결합 단백 4를 특이적으로 검출할 수 있는 시약으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 시약을 포함하는, 가와사키병의 검사 키트.
(8) 시약이 항체인 (7)에 기재된 키트.
가와사키병으로 진단되는 환자는 연간 1만 명 정도이다. 그 외 원인 불명의 소아의 열성 질환 환자 수도 매우 많고, 이들 환자에 대하여 초기 스크리닝 검사로서 가와사키병 진단을 실시하도록 하게 되면 시장 규모는 크다. 또한, 중증도의 판정에도 응용할 수 있다면, 치료약으로서 고가인 감마 글로불린 제제를 무위로 사용하는 것도 회피할 수 있어, 의료비의 절약으로도 이어진다.
본 발명에 의해, 주요 증상에 의한 진단뿐만 아니라, 환자 부담이 적은 검사 방법으로, 매우 높은 확률로 신속하게 가와사키병을 진단할 수 있다. 또한, 가와사키병의 치료 효과의 확인도 가능하다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허출원 2015-024506의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.
도 1. 항-LBP 항체를 사용한 웨스턴 블랏 그림. 동일한 번호는 동일한 환자의 혈청에서 급성기와 회복기가 대응하고 있다.
도 2. 항-LRG1[EPR 12362] 항체를 사용한 웨스턴 블랏 그림. 동일한 번호는 동일한 환자의 혈청에서 급성기와 회복기가 대응하고 있다.
도 3. 항-LBP 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 검출된 밴드의 강도를 수치화하여 플롯한 그래프. 표준 단백질(2.5 ng)을 100으로 했을 때의 각 상대량을 플롯했다.
도 4. 항-LRG1[EPR 12362] 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 검출된 밴드의 강도를 수치화하여 플롯한 그래프. 표준 단백질(10 ng)을 100으로 했을 때의 각 상대량을 플롯했다.
도 5. 항-ATG 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 그림. 동일한 환자의 혈청에서 급성기와 회복기가 대응하고 있다.
도 6. 항-ATG 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 검출된 밴드의 강도를 수치화하여 플롯한 그래프. 검출한 밴드의 강도를 그대로 사용해서 그래프화했다.
도 7. 항-LBP, LRG1, AGT, RBP4 항체를 사용한 웨스턴 블랏(왼쪽). 가와사키병 환자 10명(No. 1∼10)의 혈청(동일한 환자의 급성기·회복기)을 사용. 웨스턴 블랏으로 검출된 밴드의 강도를 수치화하여, 강도를 그대로 플롯한 그래프(오른쪽). NS: non-significant(유의성 없음)
도 8. LBP, LRG1, AGT, RBP4의 ELISA의 결과. 가와사키병 급성기와 회복기, 소아 건강인(알레르기 검사 시)과의 사이에서의 발현량의 비교. 세로축은 혈청 중 단백질 농도를 나타낸다. ***: p<0.001, **: p<0.01, *: p<0.1, NS: non-significant
도 9. ELISA 결과에 기초한 LBP, LRG1, AGT, RBP4의 변동. 동일한 환자 42명의 가와사키병 급성기와 회복기, 기타 소아 건강인(알레르기 검사 시)과의 사이에서의 발현량 변동. 세로축은 혈청 중 단백질 농도를 나타내고, 급성기와 회복기를 선으로 연결했다. ***: p<0.001, **: p<0.01, *: p<0.1, NS: non-significant
도 10. LBP, LRG1, AGT, RBP4의 ELISA 결과. 가와사키병 급성기와 기타 소아질환 환자와의 사이에서의 발현량 비교. 세로축은 혈청 중 단백질 농도를 나타낸다. ***: p<0.001, **: p<0.01, *: p<0.1, NS: non-significant
도 11. LBP, LRG1, AGT, RBP4의 ROC(Receiver Operatorating Characteristic curve, 수신자 오퍼레이터 특성 커브) 해석의 결과. 세로축에 감도％(진짜 가와사키병인 사람을 검사했을 때에 양성이 되는 비율), 가로축에 100％-특이도％(가와사키병 이외의 질환을 가와사키병으로 오진하는 비율)를 취했다.
도 2. 항-LRG1[EPR 12362] 항체를 사용한 웨스턴 블랏 그림. 동일한 번호는 동일한 환자의 혈청에서 급성기와 회복기가 대응하고 있다.
도 3. 항-LBP 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 검출된 밴드의 강도를 수치화하여 플롯한 그래프. 표준 단백질(2.5 ng)을 100으로 했을 때의 각 상대량을 플롯했다.
도 4. 항-LRG1[EPR 12362] 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 검출된 밴드의 강도를 수치화하여 플롯한 그래프. 표준 단백질(10 ng)을 100으로 했을 때의 각 상대량을 플롯했다.
도 5. 항-ATG 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 그림. 동일한 환자의 혈청에서 급성기와 회복기가 대응하고 있다.
도 6. 항-ATG 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 검출된 밴드의 강도를 수치화하여 플롯한 그래프. 검출한 밴드의 강도를 그대로 사용해서 그래프화했다.
도 7. 항-LBP, LRG1, AGT, RBP4 항체를 사용한 웨스턴 블랏(왼쪽). 가와사키병 환자 10명(No. 1∼10)의 혈청(동일한 환자의 급성기·회복기)을 사용. 웨스턴 블랏으로 검출된 밴드의 강도를 수치화하여, 강도를 그대로 플롯한 그래프(오른쪽). NS: non-significant(유의성 없음)
도 8. LBP, LRG1, AGT, RBP4의 ELISA의 결과. 가와사키병 급성기와 회복기, 소아 건강인(알레르기 검사 시)과의 사이에서의 발현량의 비교. 세로축은 혈청 중 단백질 농도를 나타낸다. ***: p<0.001, **: p<0.01, *: p<0.1, NS: non-significant
도 9. ELISA 결과에 기초한 LBP, LRG1, AGT, RBP4의 변동. 동일한 환자 42명의 가와사키병 급성기와 회복기, 기타 소아 건강인(알레르기 검사 시)과의 사이에서의 발현량 변동. 세로축은 혈청 중 단백질 농도를 나타내고, 급성기와 회복기를 선으로 연결했다. ***: p<0.001, **: p<0.01, *: p<0.1, NS: non-significant
도 10. LBP, LRG1, AGT, RBP4의 ELISA 결과. 가와사키병 급성기와 기타 소아질환 환자와의 사이에서의 발현량 비교. 세로축은 혈청 중 단백질 농도를 나타낸다. ***: p<0.001, **: p<0.01, *: p<0.1, NS: non-significant
도 11. LBP, LRG1, AGT, RBP4의 ROC(Receiver Operatorating Characteristic curve, 수신자 오퍼레이터 특성 커브) 해석의 결과. 세로축에 감도％(진짜 가와사키병인 사람을 검사했을 때에 양성이 되는 비율), 가로축에 100％-특이도％(가와사키병 이외의 질환을 가와사키병으로 오진하는 비율)를 취했다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은, 리포다당 결합 단백질, 류신 리치 α2-당단백질, 앤지오텐시노겐 및 레티놀 결합 단백 4로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨을 측정하는 것을 포함하는, 가와사키병의 검사 방법을 제공한다.
리포다당 결합 단백질, 류신 리치 α2-당단백질 및 앤지오텐시노겐으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨이 높은 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 높다고 판정하고, 상기 레벨이 낮은 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 낮다고 판정할 수 있다. 본 발명자들은 가와사키병 급성기에, 이들 단백질이 많이 발현하는 것을 확인했다(후술하는 실시예 참조).
레티놀 결합 단백 4에 대해서는 피험자 유래의 검체 중의 레벨이 낮은 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 높다고 판정하고, 상기 레벨이 높은 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 낮다고 판정할 수 있다. 본 발명자들은 가와사키병 급성기에, 이 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인했다(후술하는 실시예 참조).
따라서, 본 발명의 방법은 가와사키병의 진단(가와사키병으로의 이환 유무의 판정)에 이용할 수 있다.
가와사키병으로의 이환 유무, 특히 다른 질환과 구별해서 진단하는 그 판단에는 후술하는 실시예의 표 1 아래의 컷오프값(acute vs control)을 사용할 수 있다. 예를 들면, 리포다당 결합 단백질(LBP)의 혈청 농도가 40.49 ㎍/mL(특이도가 95％일 때의 농도) 이상인 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 높다고 판정하고, 상기 혈청 농도가 40.49 ㎍/mL 미만인 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 낮다고 판정할 수 있다. 류신 리치 α2-당단백질(LRG1)에 대해서는 혈청 농도가 391.3 ㎍/mL(특이도가 95％일 때의 농도) 이상인 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 높다고 판정하고, 상기 혈청 농도가 391.3 ㎍/mL 미만인 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 낮다고 판정할 수 있다. 앤지오텐시노겐(AGT)에 대해서는 혈청 농도가 68.83 ㎍/mL(특이도가 95％일 때의 농도) 이상인 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 높다고 판정하고, 상기 혈청 농도가 68.83 ㎍/mL 미만인 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 낮다고 판정할 수 있다. 레티놀 결합 단백 4(RBP4)에 대해서는 혈청 농도가 4.575 ㎍/mL(특이도가 95％일 때의 농도) 이하인 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 높다고 판정하고, 상기 혈청 농도가 4.574 ㎍/mL보다 높은 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 낮다고 판정할 수 있다. 단, 상기 컷오프값은 표 1 아래를 참조하고, ROC 곡선을 기초로, 특이도가 95％일 때를 best, 특이도가 90％일 때를 better, 특이도가 80％일 때를 good으로서 변경할 수 있다.
또한, 피험자가 가와사키병의 치료를 받고 있는 환자라면, 리포다당 결합 단백질, 류신 리치 α2-당단백질 및 앤지오텐시노겐으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨을 1회 또는 다른 시기에 복수회 측정하고, 상기 레벨이 낮거나 혹은 저하한 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복했다고 판정하고, 상기 레벨이 높거나 혹은 저하하지 않은 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복하지 않았거나, 또는 회복이 불충분하다고 판정할 수 있다. 본 발명자들은 가와사키병의 급성기와 회복기를 비교하고, 회복에 따라 이들 단백질이 감소하는 것을 확인했다(후술하는 실시예 참조).
레티놀 결합 단백 4에 대해서는 피험자 유래의 검체 중의 레벨을 1회 또는 다른 시기에 복수회 측정하고, 상기 레벨이 높거나 혹은 상승한 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복했다고 판정하고, 상기 레벨이 낮거나 혹은 상승하지 않은 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복하지 않았거나, 또는 회복이 불충분하다고 판정할 수 있다. 본 발명자들은 가와사키병의 급성기와 회복기를 비교하고, 회복에 따라 이 단백질이 증가하는 것을 확인했다(후술하는 실시예 참조).
따라서, 본 발명의 방법은 가와사키병 환자의 병상의 변화, 현재의 병상, 예후의 검사나 가와사키병의 치료 효과의 확인에도 이용할 수 있다.
가와사키병으로부터의 회복을 판단하기 위해서는, 후술하는 실시예의 표 1 아래의 컷오프값(acute vs recovery)을 사용할 수 있다. 예를 들면, 피험자가 가와사키병의 치료를 받고 있는 환자라면, 리포다당 결합 단백질(LBP)에 대해서 피험자 유래의 검체 중의 혈청 농도를 1회 또는 다른 시기에 복수회 측정하고, 상기 혈청 농도가 56.54 ㎍/mL(특이도가 95％일 때의 농도) 이하인 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복했다고 판정하고, 상기 혈청 농도가 56.54 ㎍/mL보다 높은 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복하지 않았거나, 또는 회복이 불충분하다고 판정할 수 있다. 류신 리치 α2-당단백질(LRG1)에 대해서는 피험자 유래의 검체 중의 혈청 농도를 1회 또는 다른 시기에 복수회 측정하고, 상기 혈청 농도가 369.7 ㎍/mL(특이도가 95％일 때의 농도) 이하인 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복했다고 판정하고, 상기 혈청 농도가 369.7 ㎍/mL보다 높은 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복하지 않았거나, 또는 회복이 불충분하다고 판정할 수 있다. 앤지오텐시노겐(AGT)에 대해서는 피험자 유래의 검체 중의 혈청 농도를 1회 또는 다른 시기에 복수회 측정하고, 상기 혈청 농도가 101.9 ㎍/mL(특이도가 95％일 때의 농도) 이하인 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복했다고 판정하고, 상기 혈청 농도가 101.9 ㎍/mL보다 높은 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복하지 않았거나, 또는 회복이 불충분하다고 판정할 수 있다. 레티놀 결합 단백 4(RBP4)에 대해서는 피험자 유래의 검체 중의 혈청 농도를 1회 또는 다른 시기에 복수회 측정하고, 상기 혈청 농도가 6.759 ㎍/mL(특이도가 95％일 때의 농도) 이상인 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복했다고 판정하고, 상기 혈청 농도가 6.759 ㎍/mL보다 낮은 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복하지 않았거나, 또는 회복이 불충분하다고 판정할 수 있다. 단, 상기 컷오프값은 표 1 아래를 참조하고, ROC 곡선을 기초로, 특이도가 95％일 때를 best, 특이도가 90％일 때를 better, 특이도가 80％일 때를 good으로서 변경할 수 있다.
피험자 유래의 검체로서는 혈청, 전혈 등을 예시할 수 있다.
본 발명은 리포다당 결합 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 시약, 류신 리치 α2-당단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 시약, 앤지오텐시노겐을 특이적으로 검출할 수 있는 시약 및 레티놀 결합 단백 4를 특이적으로 검출할 수 있는 시약으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 시약을 포함하는, 가와사키병의 검사 키트도 제공한다.
시약으로는 항체가 바람직하고, 리포다당 결합 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 류신 리치 α2-당단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 앤지오텐시노겐에 특이적으로 결합하는 항체, 레티놀 결합 단백 4에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 이와 같은 항체는 시판되고 있어 이용 가능하다. 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 중 하나일 수 있다. 항체는 방사성 동위원소, 효소, 발광 물질, 형광 물질, 비오틴 등으로 표지될 수도 있다. 또한, 표적 분자(본 발명에서는 LBP, LRG1, ATG, RBP4)에 특이적으로 결합하는 1차 항체의 반응 후, 이 1차 항체에 결합하는 2차 항체를 반응시키고, 표적 분자의 검출을 실시하는 경우에는, 2차 항체를 표지하면 된다(1차 항체는 표지하지 않는다).
이 외에, 본 발명의 키트에는 표준 단백질(LBP, LRG1, ATG, RBP4), 버퍼, 기질(항체가 효소 표지되어 있는 경우), 반응 정지액, 세정액, 반응 용기, 사용 안내서 등을 포함해도 된다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
[실시예 1]
(방법)
가와사키병 환자 급성기 55증례와 회복기 51증례의 혈청(요코하마시립대학 부속 병원, 요코하마시립대학 부속 시민 종합의료센터, 카나가와현립 어린이 의료 센터, 공립 쇼와 병원으로부터 공여)을 사용하고, 2종류의 단백질에 대해서 이하의 조작을 실시했다.
웨스턴
블랏에
의한 혈청 중의 각 단백질 발현량의 확인
각 혈청 0.1 μL를 시료용 완충액과 혼합하고, 95℃에서 5분간 가열 후, 15,000 rpm, 실온에서 5분간 원심한 것을 시료로 했다. 퍼펙트 NT 젤 (Perfect NT Gel, DRC)을 사용하여 300V의 정전압으로 전기영동하고, 단백질을 분리했다. 전기영동 후, 퍼펙트 NT 젤로부터 세미드라이 블로팅 장치(Trans-Blot Turbo System(BioRad))를 사용하여, PVDF막에 전사했다. 전사 후의 PVDF막을 블로킹 용액에 담근 후, 실온에서 1시간 진탕하여, 블로킹 처리를 실시했다. 블로킹 처리를 실시한 PVDF막은 항체 희석용 완충액으로 희석한 항체(항-LBP 항체(GeneTex)는 3,000배 희석, 항-LRG1[EPR 12362] 항체(abcam)는 5,000배 희석)와 실온에서 16∼18시간 반응시켰다. 반응 후, 각각의 PVDF막을 10분간, 3회, 0.05％[v/v] Tween20을 포함하는 TBS(TBS-T)로 세정하고, 항체 희석용 완충액으로 5,000배 희석한 표준 항래빗 IgG-HRP와 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 재차 10분간, 3회, TBS-T로 세정하고, ECL 셀렉트 웨스턴 블랏팅 검출 시약(GE Healthcare)를 기질로서 사용하고, LAS-4000 EP UV 미니 PRH(후지 필름)로 검출했다.
그 후, 얻어진 화상으로부터 MultiGauge 분석 소프트웨어(ver. 3.11, 후지 필름)에 의해 밴드의 강도를 수치화하고, 시판의 재조합 단백질(Recombinant Human LBP(R&D Systems)[2.5 ng], 재조합 인간 LRG1(Novoprotein)[10 ng])을 정량 해석용의 표준 단백질로서 사용하고, 표준 단백질의 밴드의 강도를 100으로 했을 때의 각 밴드의 상대량을 계산했다. 얻어진 수치를 그래프화함과 동시에, GraphPad Prism(ver. 5, MDF)을 사용하여 급성기와 회복기에서 만휘트니(Mann Whitney) 검정을 실시했다.
(결과)
LBP와 LRG1에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블랏법에 의해, 이들 단백질이 가와사키병의 급성기에 특이적으로 발현하고 있는지의 여부를 검증했다. 통상, 전기영동에 있어서도 고농도 단백질은 다른 단백질 분리의 장애가 된다. 그러나, 이번에 착안한 LBP와 LRG1은 발현량도 많고, 특이성이 높은 항체가 존재했기 때문에, 2개의 단백질을 검출하기 위해서 사용하는 혈청량이 모두 0.1 μL로 적었다. 그렇기 때문에, 본 실험에서는 고농도 단백질을 제거하지 않고, 가와사키병 환자 급성기 55증례와 회복기 51증례의 혈청 전부를 SDS-PAGE 겔로 분리하고, 발현량을 조사했다(도 1, 2). 그 결과, LBP와 LRG1의 발현량에 대해서, 급성기와 회복기에서 모두 p<0.0001로 유의한 차이가 보였다. 그 결과를 LBP를 도 3에 LRG1을 도 4에 나타냈다.
(고찰)
LBP는 세균 감염 시에 혈액 중에 고농도로 존재하는 단백질이고[International Immunology, 22:271-280, 2010.], 그람 음성균 세포막의 구성 성분인 리포다당(LPS)과 높은 친화성을 갖고, 복합체를 형성한다. 이 LBP-LPS 복합체가 매크로파지 등의 세포막 상에 존재하는 CD14로 운반되고, Toll 유사 수용체4에 결합하고[Journal of Periodontal Research, 49:1-9, 2014.], 시그널 전달 경로를 작용시켜 다양한 염증성 사이토카인의 분비를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, LBP는 소아기의 유열성 요로 감염증이나 패혈증에서 발현 상승이 보고된 바 있다[Pediatric Nephrology, 28, 1091-1097, 2013.]. 따라서, 가와사키병에서도 세균 등이 감염되고, 그 결과로서 LBP의 발현이 증가했을 가능성이 생각되었다.
한편, LRG1도 혈액 중에 존재하고, 신규 염증 마커 단백질로서 동정되었으며, 관절 류머티즘이나 암, 염증성 장질환, LPS 투여에 의한 매크로파지의 활성화 등에 의해 발현이 상승한다는 보고가 있다[Annals of the Rheumatic Diseases, 69:770-774, 2010., Biochem Biophys Res Commun, 382:776-779, 2009., Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E2332-E2341, 2013.]. 또한, 최근 트랜스퍼밍 증식 인자-β(TGF-β)의 시그널 전달의 조절을 통하여, 혈관 신생을 촉진하고 있는 것이 보고된 바 있다[Nature, 499:306-311, 2013.]. TGF-β는 VEGF의 발현에도 관여하고 있고, VEGF는 가와사키병 급성기 환자의 혈청 중에 고농도로 존재하는 것으로 알려져 있다[Pediatric Research, 44:596-599, 1998.]. 가와사키병 환자의 관동맥류와 심근에서, 염증과 혈관 신생이 발견된다는 보고도 있다[Pediatric Cardiology, 26:578-584, 2005.]. 따라서, LRG1이 심근의 관동맥류 형성 또는 심근의 염증에 관여하고 있을 가능성이 시사된다.
또한 LBP와 LRG1은 혈액 중에서의 농도가 높아 용이하게 검출할 수 있다. 그러므로, 이 2개의 단백질의 발현량, 그 양쪽 모두를 진단의 기준으로 함으로써, 의사의 주관이나 경험에 영향을 받아 오진이나 간과의 우려가 있는 주요 증상에 근거하는 진단 방법 뿐만 아니라, 정확하고 신속하게 진단할 수 있을 가능성이 있다고 생각한다.
[실시예 2]
(방법)
가와사키병 환자 급성기 20증례와 회복기 20증례의 혈청(요코하마시립대학 부속 병원, 요코하마시립대학 부속 시민 종합의료센터, 가나가와현립 어린이 의료 센터, 공립 쇼와 병원으로부터 공여)을 사용하고, 2종류의 단백질에 대해서 이하의 조작을 실시했다.
웨스턴
블랏에
의한 혈청 중의 각 단백질 발현량의 확인
각 혈청 0.05 μL를 시료용 완충액과 혼합하고, 95℃에서 5분간 가열 후, 15,000 rpm, 실온에서 5분간 원심한 것을 시료로 했다. 퍼펙트 NT 젤을 사용하여 300V의 정전압으로 전기영동을 실시하고, 단백질을 분리했다. 전기영동 후, 퍼펙트 NT 젤로부터 세미드라이 블로팅 장치(Trans-Blot Turbo System)를 사용하여, PVDF막에 전사했다. 전사 후의 PVDF막을 블로킹 용액에 담근 후, 실온에서 1시간 진탕하여, 블로킹 처리를 행했다. 블로킹 처리를 행한 PVDF막은 항체 희석용 완충액으로 100배 희석한 항-AGT 항체(IBL)와 실온에서 16∼18시간 반응시켰다. 반응 후, 각각의 PVDF막을 10분간, 3회, TBS-T로 세정하고, 항체 희석용 완충액으로 5,000배 희석한 표준 항마우스 IgG-HRP와 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 재차 10분간, 3회, TBS-T로 세정하고, ECL 셀렉트 웨스턴 블랏팅 검출 시약을 기질로 사용하고, LAS-4000 EP UV 미니 PRH로 검출했다. 그 후, 얻어진 화상으로부터 MultiGauge 분석 소프트웨어로 밴드의 강도를 수치화하고, 얻어진 수치를 그래프화함과 동시에, GraphPad Prism(ver. 5, MDF)을 사용하여 급성기와 회복기에서 만휘트니 검정을 실시했다.
(결과)
AGT에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블랏법에 의해, 이 단백질이 가와사키병의 급성기에 특이적으로 발현하고 있는지의 여부를 검증했다. AGT는 LBP와 LRG1과 마찬가지로 발현량도 많고, 특이성이 높은 항체가 존재했기 때문에, 검출하기 위해서 사용하는 혈청량은 0.05 μL로 적었다. 따라서, 본 실험에서는 고농도 단백질을 제거하지 않고, 가와사키병 환자 급성기 20증례와 회복기 20증례의 혈청 전부를 SDS-PAGE 겔에서 분리하고, 발현량을 조사했다(도 5). 그 결과, AGT의 발현량에 대해서 급성기와 회복기에서 p<0.0006으로 유의한 차가 보였다(도 6).
(고찰)
AGT는 앤지오텐신의 전구체이고, 레닌-앤지오텐신계에서 앤지오텐신I, II로 분해된다. AGT는 고혈압이나 당뇨병, 만성신염에서 증가하고, 고혈압 및 신장병의 발증과 진전에 관해서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 그러나, 가와사키병과의 관련에 대해서는 알려져 있지 않으며, 본 발명에서 처음으로 얻어진 지견이다.
[실시예 3]
(방법)
혈청은 요코하마시립대학 부속 병원, 가나가와현립 어린이 의료 센터, 공립 쇼와 병원, 국립 감염증 연구소, 코베대학 부속 병원, 일본 적십자사 와카야마 의료 센터, 요코하마시립대학 부속 시민 종합의료센터로부터 제공된 것이다(표 1 위). 검체는 모두 제공자로부터의 포괄 동의를 얻었다.
·가와사키병 환자 급성기 혈청(acute): 55명 환자의 발열시의 혈청
·가와사키병 환자 회복기 혈청(recovery): 51명 환자의 해열 후의 혈청
·바이러스 감염증 환자 혈청(G1): 106명
(RS 바이러스 21명, 인플루엔자 A 바이러스 23명, 인플루엔자 B 바이러스 20명, 로타 바이러스 20명, 노로 바이러스 7명, 아데노 바이러스 3명, 인두 아데노 바이러스 12명)
·세균 감염증 환자 혈청(G2): 21명
(폐렴구균 1명, 폐렴간균 1명, 그람음성간균 1명, 그람음성간균 1명, 용련균 7명, 대장균 3명, 황색 포도상구균 2명, 표피 포도상구균 1명, 마이크로코커스 1명, 세라티아 1명, 디피실균 1명)
·자기면역질환 환자 혈청(G3): 24명
(특발성 혈소판 감소성 자반병 3명, 소아 류머티즘 2명, GVHD(이식대숙주병) 1명, VAHS(바이러스 관련 혈구 탐식 증후군) 1명, 약년성 특발성 관절염 17명)
·건강인 혈청(알레르기 검사 시의 채혈에 의함)(Healthy): 13명
웨스턴
블랏에
의한 혈청 중의 각 단백질 발현량의 확인
혈청은 가와사키병 환자 10명(동일한 환자의 급성기·회복기에 있어서의 혈청)으로부터 얻어졌다. 이것들을 PBS-T로 희석하고, 1웰당 혈청이 0.1 μL 포함되도록 희석한 혈청과 2×시료용 완충액과 같은양으로 혼합하고 밀리Q수로 총액량을 10 μL로 했다. LRG1 정량 해석용 시료는 95℃에서 5분간 가열하고 나서 사용했다. 그 후, 21,600×g, 실온에서 5분간 원심한 상청을 영동용 시료로 했다. 제작한 겔을 전기영동조에 설치하고, 전극액을 채웠다. 시료를 각 웰에 넣고 300V의 정전압으로 전기영동을 실시하고, 혈청 중의 단백질을 분리했다.
전기영동 후, 전사 장치를 사용하여 PVDF막에 전사했다. 전사 후의 PVDF막을 블로킹 용액에 담근 후, 실온에서 1시간 진탕하여, 블로킹 처리를 실시했다. 블로킹 처리를 실시한 PVDF막은 항체 희석용 완충액으로 희석한 1차 항체를 16∼18시간 반응시켰다(각 항체 희석 배율은 각각 다음과 같다. 항-LRG1 항체: 5,000배, 항-AGT 항체: 100배, 항-RBP4 항체: 1,000배). 반응 후, 각각의 PVDF막을 10분간, 3회, TBS-T로 세정하고, 항체 희석용 완충액으로 5,000배 희석한 항-래빗 IgG-HRP 또는 항-마우스 IgG-HRP와 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 재차 10분간, 3회, TBS-T로 세정하고, 2차 표지 항체 검출 시약을 기질로 하여 LAS-4000 EP UV 미니 PRH로 촬영을 실시했다. 밴드의 강도를 MultiGauge 분석 소프트웨어로 수치화했다.
ELISA법에 의한 가와사키병 특이성의 검증
가와사키병 관련 단백질 LBP, LRG1, AGT, RBP4에 대해서, 가와사키병 및 가와사키병 이외의 소아질환 환자, 건강인 혈청 중의 농도를 ELISA법으로 측정하고, 각 군 사이에서의 유의차 검정을 실시했다. 가와사키병 환자 혈청(급성기 55검체, 회복기 51검체), 대조군으로서 소아 건강인 혈청 13검체, 그 밖의 소아질환 환자 혈청(바이러스 감염증 106검체, 세균 감염증 21검체, 자기면역질환 24검체)을 사용했다. 혈청은 각각, LBP는 4,000배 희석, LRG1은 5,000배 희석, AGT는 10,000배 희석, RBP4는 2,500배 희석한 것을 사용했다. 희석 용액, 세정 용액, 검출 시약 등의 시약과 반응 시간 등의 방법은 각 단백질의 ELISA 키트의 프로토콜에 따랐다.
통계 해석
웨스턴 블랏법의 결과로부터 얻어진 환자 혈청 중에서의 발현량에 관한 가와사키병 급성기와 회복기 사이에서의 유의차 검정, 및 ELISA법의 결과로부터 얻어진 각 단백질의 혈청 중 농도에 관한 가와사키병 급성기와 각 군(가와사키병 회복기, 소아 건강인, 다른 소아질환) 사이에서의 유의차 검정은 통계 해석 소프트 Graph Pad Prism을 사용하여 실시했다. 또한, 가와사키병 바이오마커로서의 유용성 검증을 위하여, 가와사키병 급성기(55 검체)와 회복기(51 검체) 간 및 가와사키병 급성기와 가와사키병 이외의 다른 소아질환(전항 144검체) 과의 사이에서 ROC 해석을 실시하고, AUC를 산출했다.
(결과)
웨스턴
블랏법에
의한 신규 가와사키병 관련 단백질 후보의 검출
혈청 프로테옴 해석의 결과로부터 얻어진 가와사키병 관련 단백질 후보 중에서, 웨스턴 블랏법을 사용하여 가와사키병 급성기 혈청 중에서 특이적으로 발현량이 변동하는 단백질을 조사했다. 그 결과, 새롭게 1종류의 단백질 RBP4가 급성기에서 혈청 중 발현량이 유의하게 감소하는 것을 알 수 있었다(p<0.002)(도 7).
ELISA법에 의한 가와사키병 관련 단백질의 특이성 검증
앞선 결과로부터 가와사키병 관련 단백질로서 발견한 LBP, LRG1, AGT와 새롭게 발견한 RBP4에 대해서, 가와사키병 환자 혈청(급성기, 회복기)과 소아 건강인 혈청, 가와사키병 이외의 소아질환 환자 혈청(바이러스 감염증, 세균 감염증, 자기면역질환)을 사용하여 ELISA법으로 혈청 중 단백질 농도를 측정했다(표 1 위). 가와사키병 환자 및 건강인의 혈청 중의 각 단백질 농도를 비교한 결과, LBP, LRG1, AGT, RBP4는 모두 가와사키병 급성기와 회복기 간에 혈청 중 발현량이 유의하게 변동하는 것을 나타냈다(p<0.001)(도 8). 특히, LRG1에 대해서는 모든 환자에서 회복에 따라 감소하는 것이 확인되었다(도 9). 또한, LBP, LRG1, RBP4에 대해서는 가와사키병 급성기 환자와 건강인을 비교했을 때에도 유의한 차가 보였다(p<0.001)(도 9).
또한, ELISA법으로 가와사키병 이외의 소아질환 환자 혈청 중에서의 LBP, LRG1, AGT, RBP4의 농도를 조사했다(도 10, 표 1 위). 그 결과, 가와사키병 급성기와 바이러스 감염증 또는 면역질환 환자 간에서 모든 단백질에 대해 유의한 차이를 보였다. 한편, 가와사키병 급성기와 세균 감염증 간에는 LRG1과 RBP4에 대해서는 유의한 차가 보였지만, LBP, AGT에 대해서는 유의한 차를 보이지 않았다.
ROC 해석에 의한 바이오마커 특이성·감도의 검증
가와사키병 관련 단백질 LBP, LRG1, AGT, RBP4에 대해서, 가와사키병 진단에 있어서의 질환 특이성 및 유용성을 분명하게 하기 위해서, 가와사키병 급성기와 회복 기간, 및 가와사키병 급성기와 다른 소아질환과의 사이에 ROC 곡선을 작성하였다(도 11). 진단 성능은 AUC값의 크기에 의해 판단했다. 그 결과, LRG1의 AUC의 값이 가와사키병 급성기와 회복기 사이에서 0.9615, 가와사키병 급성기와 다른 질환과의 사이에서 0.9636이고, 4종류의 단백질 중에서도 LRG1이 가와사키병의 진단, 및 다른 질환과의 감별에 가장 우수한 것으로 나타났다. 또한, LBP의 AUC값이 가와사키병 급성기와 회복기 사이에서 0.8966, 가와사키병 급성기와 다른 질환과의 사이에서 0.8497이고, LRG1에 이어서 LBP가 진단에 유용하다는 것을 나타냈다.
또한, 도 11의 데이터를 기초로 통계 해석 소프트 Graph Pad Prism을 사용하여, 컷오프값, 감도 및 특이도를 산출했다(표 1 아래).
컷오프값(best); 특이도가 95％가 될 때의 농도.
컷오프값(better); 특이도가 90％가 될 때의 농도.
컷오프값(good); 특이도가 80％가 될 때의 농도.
감도; 진짜 가와사키병 환자를 양성이라고 진단하는 비율.
100％-특이도; 가와사키병 이외의 환자를 가와사키병이라고 오진하는 비율.
(고찰)
레티놀 결합 단백(Retinol-binding protein: RBP)은 간장에서 합성되는 분자량 21 kDa의 단백질로, 간장에 축적되어 있는 비타민 A(레티놀)를 결합·분비하여 표적 장기(세포)로 수송하는 기능이 있다. RRBP4는 간장 또는 지방 세포에서 생성되는 RBP로, 혈액(혈장) 중에 분비되는 점에서 플라즈마 RBP(PRBP)로도 표기된다. RBP4는 당뇨병이나 인슐린 저항성에 관여는 것으로 지적되고 있으며, 영양 상태나 간장의 단백질 합성능을 신속하게 반영하는 마커로서 이용되고 있다. 그러나, 가와사키병과의 관련에 대해서는 알려져 있지 않다.
가와사키병의 병인은 아직 분명하지 않고, 면역계에 어떤 이상이 생겨서 병태가 발생되었을 가능성이 시사되고 있다. 또한, 환자 급성기 혈청 중에는 CRP나 SAA 등의 염증성 단백질이 과잉으로 존재하고 있고, 일반 혈액 검사에서도 참고 항목으로서 혈청 중 농도가 조사된다. 그러나, 그러한 염증성 단백질의 대부분은 비특이적인 전신성의 염증·혈관염을 반영한 것이고, 가와사키병을 특이적으로 감별하는 것은 아니다.
따라서, 그러한 단백질 외에서, 다른 질환과 구별할 수 있는 진단 마커를 개발하는 것이 중요하다. 본 연구에 의해, 가와사키병 관련 단백질 LBP, LRG1, AGT, RBP4의 환자 혈청 중 농도를 조사함으로써 가와사키병을 특이적으로 진단할 수 있음이 시사되었다. 특히, LBP, LRG1의 진단 성능이 양호한 것을 알 수 있었다. 가와사키병의 병태는 매우 광범위하게 걸쳐 있고, 발병에는 여러 기전이 관여하고 있다고 예상된다. 본 연구에서 발견한 4종류의 단백질은 모두 혈액 중에 고농도로 존재하므로, 이들 단백질을 지표로 함으로써 간편하고 정밀도가 높은 가와사키병 진단법의 개발이 가능하다고 생각한다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 통합하는 것으로 한다.
산업상 이용 가능성
본 발명은 가와사키병의 진단이나 치료 효과의 확인에 이용할 수 있다.
Claims (8)
- 리포다당 결합 단백질, 류신 리치 α2-당단백질, 앤지오텐시노겐 및 레티놀 결합 단백 4로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨을 측정하는 것을 포함하는, 가와사키병의 검사 방법.
- 제 1 항에 있어서,
리포다당 결합 단백질, 류신 리치 α2-당단백질 및 앤지오텐시노겐으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨이 높은 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 높다고 판정하고, 상기 레벨이 낮은 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 낮다고 판정하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
레티놀 결합 단백 4에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨이 낮은 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 높다고 판정하고, 상기 레벨이 높은 경우에 가와사키병으로 이환되었을 가능성이 낮다고 판정하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
피험자가 가와사키병의 치료를 받고 있는 환자이고, 리포다당 결합 단백질, 류신 리치 α2-당단백질 및 앤지오텐시노겐으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 성분에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨을 1회 또는 다른 시기에 복수회 측정하고, 상기 레벨이 낮거나 혹은 저하한 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복했다고 판정하고, 상기 레벨이 높거나 혹은 저하하지 않은 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복하지 않았거나, 또는 회복이 불충분하다고 판정하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
피험자가 가와사키병의 치료를 받고 있는 환자이고, 레티놀 결합 단백 4에 대해서, 피험자 유래의 검체 중의 레벨을 1회 또는 다른 시기에 복수회 측정하고, 상기 레벨이 높거나 혹은 상승한 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복했다고 판정하고, 상기 레벨이 낮거나 혹은 상승하지 않은 경우에 치료에 의해 가와사키병으로부터 회복하지 않았거나, 또는 회복이 불충분하다고 판정하는 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
피험자 유래의 검체가 혈청 또는 전혈인 것인, 방법. - 리포다당 결합 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 시약, 류신 리치 α2-당단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 시약, 앤지오텐시노겐을 특이적으로 검출할 수 있는 시약 및 레티놀 결합 단백 4를 특이적으로 검출할 수 있는 시약으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 시약을 포함하는, 가와사키병의 검사 키트.
- 제 7 항에 있어서,
시약이 항체인 것인, 키트.
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