CN118130802A - 胞外syk在用于制备选择性诊断aav活动期/缓解期的诊断试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及物医学检测技术领域，具体涉及胞外SYK作为选择性诊断AAV疾病活动、病情缓解的诊断标志物的应用。此外，本发明还涉及检测胞外SYK含量的试剂在制备选择性诊断AAV疾病活动、病情缓解的诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。本发明中，通过检测胞外SYK水平，不仅可以准确地鉴别出活动期AAV和缓解期AAV，其敏感性和特异性分别为83.3％和85.7％，而且其对AAV疾病活动性诊断价值还优于其他传统标志物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，尤其涉及抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎疾病(AAV)活动期/缓解期的诊断鉴定领域。
背景技术：
抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibodyassociated vasculitis，AAV)是一种表现为循环中存在抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)以及中小血管的坏死性炎症的自身免疫性疾病。AAV可累及全身多系统，其中以肺部和肾脏受累最常见。AAV的临床类型包括肉芽肿性多血管炎(GPA)、显微型多血管炎(MPA)和嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)。
AAV是一组病情活动和缓解交替的多系统疾病，在临床上明显缓解的阶段，往往会出现一种潜伏的进展。如何选择性诊断活动和缓解阶段，有助于更好地了解和治疗病情。然而，现有的常规的鉴定方法，难于高选择性地鉴别AAV的活性期或者缓解期。例如，ANCA是支持GPA、MPA和EGPA分类和诊断的独特标志物。间接免疫荧光试验通常是ANCA的初始筛选试验，但也需要高质量的免疫定量测定。ANCA虽然对明确诊断重要价值，但其对疾病活动/缓解等方面作用仍然未知。传统标志物C反应蛋白和红细胞沉降率由于缺乏特异性，在评估疾病活动性方面的应用有限。其他新的疾病活性生物标志物有尿CD163等，但他们在临床应用的还有待验证。此外，肾活检在AAV的诊断和治疗过程中是必要的，但因其有创且极少重复，因此不能成为监测疾病活动的首选方法。中性粒细胞胞外捕网(NETs)是反映中性粒细胞活动的指标，但需要特定的实验技术和步骤分离中性粒细胞，使其在临床常规应用中并不容易实施。尽管miR-126等microRNA在AAV的病理生理过程研究中提供了新的见解，但由于检测需要高度敏感的技术增加了其在临床应用中的难度。
因此，临床上需要简便、高选择性地鉴定AAV活动或病情缓解的手段。
发明内容
针对现有AAV病情的活动和缓解鉴定选择性不理想的问题，本发明目的在于，提供一种胞外SYK作为选择性诊断AAV活动或病情缓解的诊断标志物的应用，旨在基于胞外SYK的鉴定用于选择性判断AAV活动和病情缓解阶段。
本发明的第二个目的在于，提供检测胞外可溶性SYK水平的试剂在制备选择性诊断AAV活动、病情缓解的诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的在于，提供一种特异性强、灵敏度高的选择性诊断AAV活动和病情缓解的诊断试剂盒。
一种胞外SYK作为选择性诊断AAV活动期、缓解期的诊断标志物的应用。
本发明提供了一种胞外SYK作为选择性诊断活性期AAV(指病情处在AAV活动期)以及缓解期AAV(指病情处在AAV缓解期)的诊断标记物的应用。本发明研究表明，胞外的SYK和AAV的活性以及缓解病情存在密切关联，创新地对胞外的SYK进行鉴定，能够意外地高选择性、高灵敏度地鉴定AAV的活动以及缓解病程。
本发明中，所述的胞外SYK指细胞外(指血细胞外，主要是白细胞和血小板外))的SYK，具体可指血清、血浆和/或尿液中的SYK。
本发明还提供了检测胞外SYK含量的试剂在制备选择性诊断AAV活动期、缓解期的诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。
本发明研究表明，可以将能够鉴定胞外SYK含量的试剂用于检测胞外SYK的含量，进而选择性诊断AAV的活动期以及缓解期病情。
本发明所述的应用，所述诊断试剂为检测尿液、血浆和/或血清中的SYK的试剂。
本发明中，所述的诊断试剂包含兔抗人SYK抗体、鼠抗人SYK抗体和辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG抗体中的至少一种。
本发明中，所述诊断试剂盒包含了所述的诊断试剂。
本发明还提供了一种选择性诊断AAV活动期/缓解期病情的诊断试剂盒，包含了能够鉴定胞外SYK含量的所述的诊断试剂。
有益效果
针对AAV的诊断，现有手段主要的思路在于胞内标记物的诊断鉴定，然而，目前的手段难于高选择性、高灵敏度地鉴定AAV的疾病活动性。本发明跳脱出现有的检测思路，基于创新地胞外SYK和活性以及缓解期病情的密切关联规律，创新地提出通过胞外SYK的鉴定用于选择性地鉴别诊断AAV的活动性和病情缓解。研究表明，本发明所述的鉴定方案，具有优异的选择性、灵敏度和准确性。研究表明，敏感性和特异性分别为83.3％和85.7％，而且其诊断价值还优于其他如ANCA、CRP、BCA-1、TIMP-1、GM-CSF、KIM-1等标志物。
附图说明
图1采用SYK试剂盒检测活动期AAV和缓解期AAV患者SYK中水平
图2检测活动期AAV患者在血浆置换治疗前后血清中SYK水平
图3受试者工作曲线评价SYK和其他指标预测AAV疾病活动的诊断价值。
具体实施方式
以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体
实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。
实施例1.构建SYK检测试剂盒用于活动性AAV患者与缓解期AAV患者血清中SYK水平检测
1)、试剂盒构成及操作步骤
(1)、SYK检测试剂盒组成
■标准96孔透明酶标板；
■SYK标准品
■捕获抗体(兔抗人SYK抗体，免疫原22206-1-AP)0.325mg；
■检测抗体(鼠抗人SYK抗体，免疫原Ag17654)1.1mg；
■辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG抗体0.6mg；
■TMB显色液；
■显色终止液；
■磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)；
■牛血清白蛋白(BSA)；
■包被缓冲液；
■Tween-20；
■封板膜。
(2)、样本处理前试剂盒准备工作
■A液配制：捕获抗体以溶于1ml PBS中(终浓度0.325mg/ml)，-20℃保存；
■B液配制：检测抗体溶于1ml PBS(终浓度1.1mg/ml)，-20℃保存；
■C液配制：辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG抗体溶于1ml PBS(终浓度0.5mg/ml)，-20℃保存；
■SYK标准品：配置6个浓度为800、400、200、100、50、25pg/mL标准品
■PBST配制：将Tween-20加入PBS中，配成PBST(终浓度为0.05％Tween-20)，室
温保存；
■BSA溶液配制：将BSA加入PBS中，构成1％BSA溶液，4℃保存；
■使用包被缓冲液将A液稀释200倍，每孔100ul加入96孔透明酶标板中。贴上封板膜，4℃静置过夜。
(3)、样本处理
■血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜。
■1000×g离心20分钟，吸取上清。
(4)、样本检测
■弃去孔内液体，每孔加入200μl PBST，5分钟后弃去，在吸水纸上拍干残留液
体，重复3次；
■每孔加入100ul 1％BSA溶液，贴上封板膜，37℃封闭1小时；
■重复第1步洗板操作；
■依从加入100ul标准品和样本，贴上封板膜，37℃孵育2小时；
■重复第1步洗板操作；
■使用1％BSA将B液稀释1000倍，每孔加入100ul，贴上封板膜，37℃孵育1小时；
■重复第1步洗板操作；
■使用1％BSA将C液稀释2000倍，每孔加入100ul，贴上封板膜，37℃孵育1小时；
■弃去孔内液体，每孔加入200μl PBST，5分钟后弃，在吸水纸上拍干残留液体，重复5次；
■每孔加入100ul TMB显色液，室温避光孵育15分钟；
■不弃TMB显色液，每孔加入终止液100ul，酶标仪检测450nm处吸光度值；
实施例2.活动性AAV患者与缓解期AAV患者血清中SYK水平检测
1)、样品收集
收集10名活动期AAV患者及其治疗6个月后处于缓解期的血样，使用促凝管收集2ml外周血。所有患者均签署知情同意书，该实验方案取得本单位伦理委员会同意。
2)、样品处理
新鲜收集的外周血于室温下1000×g离心10分钟，吸取上层血清，-80℃冰箱中保存。
3)、血清SYK水平检测
具体步骤同实施例1。
4)、统计学分析
统计学分析应用软件SPSS20.0(SPSS Inc)，组间比较采用曼-惠特尼U检验；p<0.05表示差异具有统计学意义。
5)、结果
如图1所示，活动期AAV患者血清中SYK水平升高，与活动期AAV患者相比，缓解期AAV患者血清中SYK水平下降，差异有统计学意义(p<0.05)。
实施例3.检测活动期AAV患者在血浆置换治疗前后血清中SYK水平
1)、样品收集
收集4名接受血浆置换和接受蛋白A免疫吸附的AAV患者，使用促凝管收集血浆置换和蛋白A免疫吸附前后的2ml外周血。所有患者均签署知情同意书，该实验方案取得本单位伦理委员会同意。
2)、样品处理
具体步骤同实施例2.
3)、血清SYK水平检测
具体步骤同实施例1。
4)、统计学分析
具体步骤同同实施例2
5)、结果
如图2所示，活动期AAV在接受血浆置换后SYK明显下降(p<0.05)。
实施例4受试者工作曲线评价胞外SYK和其他指标预测AAV疾病活动的诊断价值
我们使用受试者工作特征曲线(ROC)评价血清SYK作为AAV活动诊断指标的有效性。结果如图3，AUC＝0.84，具有较好的诊断价值。根据ROC曲线，我们在约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)最大处认为诊断效果最佳，依此原理确定的诊断界值为SYK＝194.26pg/ml。敏感性和特异性分别为83.3％和85.7％，而且其对AAV疾病活动性诊断价值还优于其他传统标志物。
Claims (7)
1.胞外SYK作为选择性诊断AAV活动期、缓解期的诊断标志物的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的胞外SYK指血清、血浆和/或尿液中的SYK。
3.检测胞外SYK含量的试剂在制备选择性诊断AAV活动期、缓解期的诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂为检测尿液、血浆和/或血清中的SYK的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂盒包含了所述的诊断试剂。
6.根据权利要求3～5任一项所述的应用，其特征在于，所述的诊断试剂包含兔抗人SYK抗体、鼠抗人SYK抗体和辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG抗体中的至少一种。
7.一种选择性诊断AAV活动期、缓解期病情的诊断试剂盒，其特征在于，包含了权利要求3～6任一项所述应用中所述的诊断试剂。
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| PB01 | Publication | ||
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