CN111060694B - 一种用于血管炎性高血压联合诊断试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于血管炎性高血压联合诊断试剂盒及其应用，以MCP‑1、CD146、HMGB‑1、PTX‑3及抗PTX‑3抗体为特异性生物标记物，创造性的提供一种用于诊断血管炎性高血压的诊断试剂盒，与现有技术相比，该诊断试剂盒能够有效的诊断血管炎性高血压，并且成本低、便于操作，本试剂、检测试剂盒和检测技术成熟，与传统方法相比，检测更加精准，周期短、特异性好，这对于血管炎性高血压的早期诊断，早期治疗，改善预后具有广泛的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及中诊断试剂盒技术领域。具体地，本发明涉及是一种通过血浆检测来联合诊断血管炎性高血压的技术领域。
背景技术
系统性血管炎（Systemicvasculitis,SV）是一组以累及不同类型血管及伴多个器官系统受损为主要特征的自身免疫疾病，它们在病初的表现或伴随全身表现往往很相似，常易累及肾脏、呼吸系统、心血管系统、消化系统等重要脏器，但是不同的血管炎性高血压疾病在病理学上也有各自的特征性，因此，系统性血管炎有时也易误诊为感染性疾病、脏器肿瘤，若不及时治疗，致残率、致死率很高。当前的系统性诊断在无病原学证据且抗感染无效的情况下，主要结合体检和病理检查。体检包括鼻窦观察，皮疹特征、分布部位、肺部体征，综合分析病史，临床典型表现，肺部病变的特征；病理检查支持，可选择肾活检、支气管镜下肺活检，或皮肤活检。
由于血管炎性高血压的临床表现较为多样化且缺乏特异性生物标记物，临床的诊断及评估具有极大的挑战性。临床急需寻找血管炎性高血压的血清学指标用于诊断及病情活动评估，以早期诊断，早期治疗，改善预后。根据目前报道，应用于系统性血管炎诊断的方法中披露了CD146及IL-6R单独应进行诊断的方法或产品，但检测过程复杂，检测成本相对较高。对于联合多种因子诊断效果好、成本低、便于操作的血管炎性高血压诊断的方法目前未见报道。
发明内容
针对现有技术中血管炎性高血压诊断困难且现有的诊断方式成本高的技术现状，现有技术也未见有关专门针对MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体为特异性生物标记物多种因子联合用于诊断血管炎性高血压的报道。本发明旨在于提供一种用于诊断血管炎性高血压的诊断试剂盒，以MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体为特异性生物标记物，创造性的提供一种用于诊断血管炎性高血压的诊断试剂盒，与现有技术相比，该诊断试剂盒能够有效的诊断血管炎性高血压，并且成本低、便于操作，这对于血管炎性高血压的早期诊断，早期治疗，改善预后具有广泛的实用性。
本发明的第一方面，提供一组能够诊断早期血管炎性高血压的标志物，包括单核细胞趋化蛋白1(Mon℃ytechemotactic protein1，MCP-1)、CD146、血清高迁移率族蛋白-1（High mobility group box1，HMGB-1）、五聚蛋白-3（Pentraxin3，PTX-3）和抗PTX-3抗体。
本发明的第二方面，提供MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体在制备诊断早期血管炎性高血压的检测试剂或试剂盒中的应用。
所述的检测试剂或试剂盒通过检测血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体的含量诊断早期血管炎性高血压。
所述的检测试剂为检测血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体的含量的试剂的组合。
所述的检测试剂盒包含检测血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体的含量的试剂。
本发明的第三方面，提供一种诊断早期血管炎性高血压的MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体联合检测试剂盒。
所述的试剂盒通过检测血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体含量来联合诊断早期血管炎性高血压。
所述的试剂盒包含检测血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体含量的试剂。
所述的试剂盒是以ELISA方法检测生物样品血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体表达的试剂盒。
同时，本发明提供一种制备诊断早期血管炎性高血压的检测试剂盒，检测试剂盒具体组成如下：
(1)MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体检测抗体；
(2)实验标准品；
(3)血清或血浆基质，以及检测溶液A和检测溶液B；
(4)实验对应的96孔板。
本发明的第四方面，提供一种利用上述诊断早期血管炎性高血压的MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体联合检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
（1）抽取待测者的外周血2mL到促凝管，离心获取血清，直接进行检测或冻存在-80℃备检；
（2）加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔，设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品，空白孔加100μL标准品稀释液，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时；
（3）弃去液体，甩干，不用洗涤；
（4）临用前配制，每孔加检测溶液A工作液100μL，酶标板覆膜，37℃温育1小时；
（5）弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体，重复洗板3次，最后一次洗涤后，吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干；
（6）临用前配制，每孔加检测溶液B工作液100μL，酶标板覆膜，37℃温育30分钟；
（7）弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4；
（8）每孔加TMB底物溶液90μL，酶标板覆膜，37℃避光显色10-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时终止；
（9）每孔按照底物溶液加入相同顺序加入终止液50μL；
（10）在酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值（OD值）。
本发明，所述的检测溶液A为检测抗体。
本发明，所述的检测溶液B为IgG-HRP酶标抗体。
本发明，所述的检测溶液A和检测溶液B临用前配制，使用前短暂离心处理，以使粘附在管壁及瓶盖的液体沉积在平底。
本发明，所述的检测溶液A工作液由检测溶液A稀释200倍，充分混匀获得。
本发明，所述的检测溶液B工作液由检测溶液B稀释200倍，充分混匀获得。
优选的，所述步骤（1）血清标本的配制：准备不稀释的血清，或将血清从中吸取10uL至新管，加入PBS 490uL，配成50倍稀释的血清标本。
优选的，所述步骤（2）标准品稀释液的处理：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL-0.5mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时轻轻摇动，每个EP管中加入500μL的标准品稀释液。
优选的，MCP-1标准孔中的标准浓度分别为：1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6pg/mL。
优选的，CD146标准孔中的标准浓度分别为：20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL。
优选的，HMGB-1标准孔中的标准浓度分别为：4000pg/mL，2000pg/mL，1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL
优选的，PTX-3及抗PTX-3抗体标准孔中的标准浓度分别为：20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL。
优选的，MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体的标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。
通过实施本发明具体的发明内容可以达到以下有益效果：
本发明涉及一种通过检测血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体含量来联合诊断血管炎性高血压的试剂盒，可以通过定量检测血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体的含量，能够用于血管炎性高血压的早期诊断，治疗过程中的疗效评估及其治疗后的转移复发监控，检测结果早于临床症状。试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点，本试剂和检测技术成熟，与传统方法相比，检测更加精准，周期短、特异性好，这对于血管炎性高血压的早期诊断，早期治疗，改善预后具有广泛的实用性。
附图说明
图1所示为血清MCP-1诊断血管炎性高血压的ROC曲线。
图2所示为血清HMGB1诊断血管炎性高血压的ROC曲线。
图3所示为血清CD146诊断血管炎性高血压的ROC曲线。
图4所示为血清PTX-3诊断血管炎性高血压的ROC曲线。
图5所示为血清抗PTX-3抗体诊断血管炎性高血压的ROC曲线。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中涉及的设备和材料：
MCP-1抗体标准液、CD146抗体标准液、HMGB-1抗体标准液、LAMP-2抗体标准液、LAMP-2抗体抗体标准液、PTX-3抗体标准液、抗PTX-3抗体标准液、恒温水浴箱、-80℃冰箱、-10℃冰箱、1000mL量筒、电动连续分液器Eppendorf、微量移液枪、离心机、微量振荡器、枪头、电动连续分液器Eppendorf枪头、10mL样品管、EP管、蒸馏水或去离子水、吸水纸、ELX-800型酶标仪、ELX-50型洗板机、全自动血液分析仪Sysmex XN 9000、Model Minitor-100（意大利）、AU-2700（日本）。
本发明中选用的所有试剂、仪器、原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：血管炎性高血压诊断试剂盒
本发明的第一方面，提供一组能够诊断早期血管炎性高血压的标志物，包括单核细胞趋化蛋白1(Mon℃ytechemotactic protein1，MCP-1)、CD146、血清高迁移率族蛋白-1（High mobility group box1，HMGB-1）、五聚蛋白-3（Pentraxin3，PTX-3）和抗PTX-3抗体。
本发明的第二方面，提供MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体在制备诊断早期血管炎性高血压的检测试剂或试剂盒中的应用。
所述的检测试剂或试剂盒通过检测血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体的含量诊断早期血管炎性高血压。
所述的检测试剂为检测血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体的含量的试剂的组合。
所述的检测试剂盒包含检测血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体的含量的试剂。
本发明的第三方面，提供一种诊断早期血管炎性高血压的MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体联合检测试剂盒。
所述的试剂盒通过检测血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体含量来联合诊断早期血管炎性高血压。
所述的试剂盒包含检测血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体含量的试剂。
所述的试剂盒是以ELISA方法检测生物样品血浆中MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体表达的试剂盒。
实施例二：诊断试剂盒的检测方法
本发明提供一种利用上述实施例一诊断早期血管炎性高血压的MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体联合检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
（1）抽取待测者的外周血2mL到促凝管，离心获取血清，直接进行检测或冻存在-80℃备检；
（2）加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔，设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品，空白孔加100μL标准品稀释液，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时；
（3）弃去液体，甩干，不用洗涤；
（4）临用前配制，每孔加检测溶液A工作液100μL，酶标板覆膜，37℃温育1小时；
（5）弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，在吸水纸上轻拍酶标板来移除孔内所有液体，重复洗板3次，最后一次洗涤后，吸取或倒出剩余的洗涤缓冲液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干；
（6）临用前配制，每孔加检测溶液B工作液100μL，酶标板覆膜，37℃温育30分钟；
（7）弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4；
（8）每孔加TMB底物溶液90μL，酶标板覆膜，37℃避光显色10-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时终止；
（9）每孔按照底物溶液加入相同顺序加入终止液50μL；
（10）在酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值（OD值）。
所述的，步骤（1）血清标本的配制：准备不稀释的血清，或将血清从中吸取10uL至新管，加入PBS 490uL，配成50倍稀释的血清标本。
所述的，步骤（2）标准品稀释液的处理：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL-0.5mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时轻轻摇动，每个EP管中加入500μL的标准品稀释液。
所述的，MCP-1标准孔中的标准浓度分别为：1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6pg/mL。
所述的，CD146标准孔中的标准浓度分别为：20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL。
所述的，HMGB-1标准孔中的标准浓度分别为：4000pg/mL，2000pg/mL，1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL。
所述的，PTX-3及抗PTX-3抗体标准孔中的标准浓度分别为：20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL。
所述的，MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体的标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。
实施例三：检测试剂盒有效性检测
基于实施例一及实施例二，对单个标记物有效性进行检测。
血管炎性高血压组：本研究连续纳入2013年1月至2018年12月在新疆维吾尔自治区人民医院高血压中心住院并确诊为血管炎性高血压患者43例。所有这些患者均符合1990ACR 血管炎性高血压诊断标准或2012年国际C健康对照组C修订的血管炎性高血压命名及定义。排除标准：1.继发性血管炎（系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征等引起的血管炎）；2.恶性肿瘤；3.急慢性感染；4.怀孕或妊娠需求的。根据伯明翰血管炎活动期评分（Birmingham vasculitis activity score，BVAS）量表对血管炎性高血压的疾病活动程度进行评估。
原发性高血压组：同期收集在高血压中心住院明确诊断为原发性高血压患者46例。排除1.继发性高血压（肾上腺皮质腺瘤，嗜铬细胞瘤，中重度睡眠呼吸暂停综合征，库欣综合征，肾性高血压等）2.恶性肿瘤；3 急慢性感染；4.怀孕或妊娠需求的。
健康对照组组：同期收集新疆维吾尔自治区人民医院体检中心进行健康体检的正常人群。临床检查排除有急性、慢性感染及高血压、糖尿病、肾病等血管损伤的体检者，最终纳入与病例组年龄和性别相匹配的健康对照组43例。
所有入选者均了解并签署知情同意书，本研究经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会同意。
（1）MCP-1对血管炎性高血压患者检测的有效应验证
血管炎性高血压、原发性高血压、健康对照组的MCP-1水平分别为134.65pg/mL，59.1pg/mL, 68.43pg/mL，血管炎性高血压患者血清MCP-1水平明显高于健康对照组及原发性高血压组(P = 0.008)，而健康对照组与原发性高血压组并无明显的统计学差异(P =0.197)。
以血清MCP-1诊断血管炎性高血压的误诊率为横坐标，灵敏度为纵坐标，绘制受试者工作曲线（receiver operator characteristic curve，ROC曲线），参见附图1。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在 0.5～0.7时诊断价值较低，AUC在0.7～0.9时诊断价值中等，AUC>0.9时诊断价值较高。AUC=0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。MCP-1的变化较好地将血管炎性高血压与健康对照组区分开来，ROC曲线下面积为0.772。
（2）HMGB1对血管炎性高血压患者检测的有效应验证
测定了血管炎性高血压、原发性高血压、健康对照组间血清HMGB1水平分别为8.03±14.33ng/mL、16.27±8.18ng/mL、13.95±7.55）ng/mL，血管炎性高血压患者中血清HMGB1水平显著高于原发性高血压组和健康对照组。原发性高血压组和健康对照组之间血清HMGB1水平没有显著差异。
绘制ROC曲线，如附图2所示，利用约登指数找到最佳切点值。对于血管炎性高血压的诊断，敏感性和特异性分别为66.7%和82.8%。
（3）CD146对血管炎性高血压患者检测的有效应验证
测定了血管炎性高血压、原发性高血压、健康对照组间血清CD146水平分别为68.67±45.37ng/mL、36.83±17.35 ng/mL、36.83±17.35 ng/mL，血管炎性高血压患者中血清CD146水平显著高于原发性高血压组和健康对照组。原发性高血压组和健康对照组之间血清CD146水平没有显著差异。
绘制ROC曲线，如附图3所示，通过计算ROC曲线估计血清CD146水平的最佳截止值。通过分析血管炎性高血压组和健康对照组之间的血清CD146水平，对血管炎性高血压组的诊断计算灵敏度和特异性为64.2%和77.4%。
（4）PTX-3对血管炎性高血压患者检测的有效应验证
测定了血管炎性高血压、原发性高血压、健康对照组间血清PTX-3水平分别为4.42±0.95ng/mL、2.92±0.6ng/mL、2.67±0.92ng/mL，血管炎性高血压患者中血清PTX-3水平显著高于原发性高血压组和健康对照组。原发性高血压组和健康对照组之间血清PTX-3水平没有显著差异。
绘制ROC曲线，如附图4所示，通过计算ROC曲线估计血清PTX-3水平的最佳截止值。通过分析血管炎性高血压组和健康对照组的血清PTX-3水平，对血管炎性高血压组的诊断计算灵敏度和特异性为84.3%和93.5%。
（5）抗PTX-3抗体对血管炎性高血压患者检测的有效应验证
测定了血管炎性高血压、原发性高血压、健康对照组间血清抗PTX-3抗体水平分别为16.18±9.58μg/mL、8.29±6.04μg/mL、7.12±8.93μg/mL，血管炎性高血压患者中血清PTX-3水平显著高于原发性高血压组和健康对照组。原发性高血压组和健康对照组之间血清抗PTX-3抗体水平没有显著差异。
绘制ROC曲线，如附图5所示，通过计算ROC曲线估计血清抗PTX-3抗体水平的最佳截止值。通过分析血管炎性高血压组和健康对照组的血清抗PTX-3抗体水平，对血管炎性高血压组的诊断计算灵敏度和特异性为88.2%和67.4%。
使用本发明所提供的联合诊断试剂盒，上述43例无一例误诊或者漏诊，诊断准确性达到了100%。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (1)
1.一种诊断早期血管炎性高血压的检测试剂盒，其特征在于，
用于检测诊断早期血管炎性高血压标志物，标志物为MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3和抗PTX-3抗体；所述MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体从血清中检测；所述的试剂盒中含有检测MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体的含量的试剂；
所述的试剂盒中含有：
(1)MCP-1、CD146、HMGB-1、PTX-3及抗PTX-3抗体检测标准液；
(2)实验标准品；
(3)血清或血浆基质，以及检测溶液A和检测溶液B；
(4)实验对应的96孔板；
所述的检测溶液A为检测抗体；
所述的检测溶液B为IgG-HRP酶标抗体；
检测溶液A工作液由检测溶液A稀释200倍，充分混匀获得；
检测溶液B工作液由检测溶液B稀释200倍，充分混匀获得；
MCP-1标准孔中的标准浓度分别为：1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6pg/mL；
CD146标准孔中的标准浓度分别为：20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL；
HMGB-1标准孔中的标准浓度分别为：4000pg/mL，2000pg/mL，1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL；
PTX-3及抗PTX-3抗体标准孔中的标准浓度分别为：20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL。
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