CN112180103A - 一种用于临床检测新冠肺炎患者血浆中活性尿激酶受体的试剂盒 - Google Patents

一种用于临床检测新冠肺炎患者血浆中活性尿激酶受体的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术应用领域，涉及一种新的人严重急性呼吸系统综合征2型冠状病毒（SARS‑CoV‑2）感染的预测技术，具体涉及一种通过酶联免疫吸附测定人体内活性尿激酶受体的含量作为COVID‑19患者的预后生物标志物。本发明通过检测 COVID‑19患者、无症状感染者或健康人体内活性尿激酶受体的水平，发现 COVID‑19患者、无症状感染者体内活性suPAR的水平远高于健康人的，无症状感染者体内的活性suPAR水平也略高于 COVID‑19患者。本发明所得结果说明检测COVID‑19患者体内suPAR的水平可以作为患者的预后生物标志物，为 COVID‑19患者的早期分诊提供一定价值。

Description

一种用于临床检测新冠肺炎患者血浆中活性尿激酶受体的试 剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测领域，具体是涉及一种人严重急性呼吸系统综合征2型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染及新冠肺炎病征严重程度的ELISA检测试剂盒。
背景技术
自2020年初被发现以来，新型冠状病毒肺炎在世界范围内迅速传播，是目前全球共同面临的一大挑战。至2020年8月31日，由SARS-CoV-2引起的全球大流行病已经在全球180多个国家和地区感染了2520多万人，并导致了84万人死亡。目前虽然有许多可用的方法来检测病毒并在目前的大流行中防治这种疾病，但这些可用的诊断或预测方法都有其局限性。因此，开发新的检测方法或生物标志物将有助于对临床疑似感染指数较高的个体进行推定诊断或预后。
尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）是一种包括DI、DII和DIII的多结构域细胞表面受体，也是一种高度糖基化的表面膜蛋白，广泛表达于激活的单核细胞、嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞，以及大多数恶性肿瘤细胞的表面，但在正常细胞表面表达量很低。uPAR与其天然配体尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）相互作用，从而介导细胞表面的多种生物活性。当uPAR被蛋白酶从细胞表面裂解时，一种可溶性的uPAR（suPAR）被释放。在血液中有三种不同的suPAR形式（suPAR DI-III、suPAR DI和suPAR DII-III），其中suPAR DI-III与uPA的结合常数等特征均与全长uPA接近被定义为活性suPAR。据报道，suPAR的预后能力等同于或优于其他评分系统，因此，将其加入传统的分类算法可以改善风险分层。此外，suPAR水平升高与癌症和急性肾损伤患者的预后不良密切相关，数据表明，病人入院时suPAR水平较高是严重疾病的标志，与再入院风险、发病率和死亡率增加也有关，对患者suPAR水平的评估有助于区分病人的病情严重程度。因此，对COVID-19患者的suPAR水平的评估也有助于确定是否需要更深入的临床评估和护理。近期丹麦的ViroGates公司已经确定COVID-19患者在SARS-COV-2感染期的suPAR水平显著高于健康人，但此试剂盒所测的suPAR含量为三种形式的suPAR（suPAR DI-III、suPAR DI和suPAR DII-III），因此评估不同分型COVID-19的患者和无症状感染者血浆样本中活性suPAR水平仍可为疫情控制和早期入院和治疗的指导提供重要信息。
本发明制备了一种检测活性suPAR的ELISA试剂盒，通过测定 COVID-19患者、无症状感染者和健康人血浆中活性suPAR的含量，发现 COVID-19患者、无症状感染者人体内活性suPAR的水平显著高于高于健康人中suPAR的水平，其中无症状感染者体内的活性suPAR水平也略高于COVID-19患者中suPAR的水平。本发明所得结果可以作为COVID-19患者的预后生物标志物，为 COVID-19患者的早期分诊和无症状感染者体的确诊提供一定指征信息。
发明内容
本发明的目的是利用酶联免疫吸附反应（ELISA）测定 COVID-19患者、无症状感染者和健康人血浆中活性suPAR的含量作为COVID-19的预后生物标志物，为 COVID-19患者的早期分诊和无症状感染者体的确诊提供指导信息。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于临床检测新冠肺炎患者血浆中活性尿激酶受体的试剂盒，包含预包被可结合活性suPAR的融合蛋白的ELISA高结合力酶标板、兔源抗活性suPAR多克隆抗体、碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG、标准品稀释液、洗涤液、底物显色液组成。
所述ELISA高结合力酶标板预先包被40-140 μg/ml的可结合活性suPAR的融合蛋白；所述包被具体包括如下步骤：
向酶标板中加入经过包被液稀释的ATF或ATF-HSA蛋白溶液，用密封胶带将96孔板密封好以防止液体蒸发，并与4℃过夜；揭开密封胶带，甩干酶标仪板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔3次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留；向所有孔中加入封闭液，并用密封胶带将96孔板密封好以防止液体蒸发，置于37℃孵育1h。揭开密封胶带，甩干酶标仪板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔3次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留；随后将板至于4℃存放；
所述封闭液配方为：由TBST，pH 7.4的缓冲溶液配制而成，其中含有4%的蔗糖和3%的BSA。
所述可结合活性suPAR的融合蛋白为ATF或ATF-HSA，ATF的的氨基酸序列为：SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGKKPSSPPEE。
所述包被液为pH 9.6的50 mM的碳酸氢盐缓冲液。
所述洗涤液和样品稀释液的配方为：含0.05% Tween 20的TBS缓冲液，其中TBS的配方为20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，2.7 mM KCl。
所述底物显色液为0.1 M Tris-HCl，0.1 M NaCl，5 mM MgCl和1 mg/ml PNPP。
所述uPAR标准品制备方法为：在果蝇胚胎细胞S2中表达重组的suPAR，经离子柱纯化得到。
本发明试剂盒所得活性 suPAR浓度结果可以作为COVID-19患者的预后生物标志物，也为 COVID-19患者的早期分诊提供一定价值。
附图说明
图1为活性suPAR的ELISA检测方法原理图
图2 为COVID-19患者、无症状感染者或健康人体内活性尿激酶受体（suPAR）的水平
图3 为COVID-19患者（普通型、重型和危重型）血浆中活性suPAR水平。
具体实施方案
以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
实施例一 制备预包被可结合活性suPAR的融合蛋白的ELISA检测试剂盒
（1）配制洗涤液/样品稀释液
洗涤液和样品稀释液含0.05% Tween 20的TBS缓冲液，其中TBS的配方为20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，2.7 mM KCl。
（2）配置包被液
包被液为50 mM的碳酸氢盐缓冲液（pH 9.6），具体为1L 缓冲溶液中含有1.59 gNaCO3,，2.93 g NaHCO3。
（3）配制封闭液
封闭液是由TBST，pH 7.4的缓冲溶液配制而成，其中含有4%的蔗糖和3%的BSA。
（4）配制底物显色液
底物显色液为0.1 M Tris-HCl，0.1 M NaCl，5 mM MgCl和1 mg/ml PNPP。
（5）重组表达和纯化suPAR标准品
在果蝇胚胎细胞S2中表达重组的suPAR，经离子柱纯化得到。具体重组表达和纯化步骤如下：
将人源suPAR的片段克隆到pMTBiP/blast/V5-His A载体上，用去内毒素质粒抽提试剂盒抽提质粒，A260/280>1.7，取20 μg质粒加入到100 μl的S2细胞培养基中，然后加入10 μl的转染试剂FuGENE HD，静置15分钟后加入到铺好板的S2空载细胞中。培养24小时候后，更换新鲜的培养基并加入终浓度为20 μg/ml 的杀稻瘟菌素（blasticidin)，每三天更换一次培养基并加入抗性，直到空白对照的细胞全部死亡。
筛选出稳定细胞系后开始扩大培养，将筛选成功的细胞系置于细胞培养瓶里面培养后，待细胞生长状况良好取4 ml细胞于10 ml的小三角瓶，待细胞系长到4×106个/ml后用培养基稀释两倍后继续培养到4×106个/ml再稀释两倍。如此，直到体积扩大到2L，待细胞长到4×106个/ml后加入硫酸铜溶液（终浓度为700 μM）诱导表达8天。用收菌瓶收集细胞液，7800转/分钟离心20分钟。弃去细胞取上清再在同样的条件下离心20分钟。取上清用0.45 μm的滤膜抽滤，上清在4℃的冷室里流过阴离子柱。待上清全部过完离子柱后用梯度洗脱的方法得到目的蛋白。
（6）制备预包被酶标板
向酶标板中加入100 μl经过包被液稀释的ATF-HSA蛋白溶液40-140 μg/ml，用密封胶带将96孔板密封好以防止液体蒸发，100 μl/孔，4℃孵育过夜。揭开密封胶带，甩干酶标仪板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔3次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留。向所有孔中加入封闭液，并用密封胶带将96孔板密封好以防止液体蒸发，置于37℃孵育1h。揭开密封胶带，甩干酶标仪板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔3次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留。随后将板至于4℃存放。
（7）检测方法：
向一些酶标板孔中加入不同浓度的活性suPAR标准品，所述不同浓度为10 ng/ml、5ng/ml、2.5 ng/ml、1.25 ng/ml、0.625 ng/ml、0.3125 ng/ml、0.156ng/ml，向另一些孔中加入标准品稀释液作为空白对照，血浆样本用TBST稀释5倍后加入酶标板孔中。37℃孵育2h后洗板5次，每孔加入100 μl 1:200-1:800稀释的兔源抗活性suPAR多克隆抗体（1-5 mg/ml）37℃孵育1h，洗板5次；每孔加入100 μl 1:500-1:1200稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG37℃孵育1h，洗板5次；每孔加入100 μl显色液显色1h，随后用酶标仪测定405 nm出吸光度，原理图如图1所示。
实施例二使用ELISA检测试剂盒来检测 COVID-19患者、无症状感染者或健康人体内活性的可溶性尿激酶受体（suPAR）的水平
1、分别向酶标板加入不同浓度的标准品100 μl，然后向酶标板内其他孔加入待检测病人的稀释血浆样品（用样品稀释液稀释5倍），每个血浆样本2个重复，并用密封胶带将96孔板密封好以防止液体蒸发，置于37℃孵育2h。揭开密封胶带，甩干酶标仪板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔5次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留。
2、分别向酶标板加入经样品稀释液稀释200-800倍的兔源抗活性suPAR多克隆抗体，并用密封胶带将96孔板密封好以防止液体蒸发，置于37℃孵育1h。揭开密封胶带，甩干酶标仪板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔5次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留。
3、分别向酶标板加入经样品稀释液稀释500-1200倍的碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG，并用密封胶带将96孔板密封好以防止液体蒸发，置于37℃孵育1h。揭开密封胶带，甩干酶标仪板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔5次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留。
4、随后用排枪向每孔快速加入100 μl底物显色液，并用密封胶带将96孔板密封好以防止液体蒸发，置于37℃孵育1h。揭开密封胶带，将酶标板置于酶标仪上于405 nm读取吸光度。
5、制作标准曲线，计算病人血液中活性suPAR的浓度。所得结果见图2。
实施例三 COVID-19患者（普通型、重型和危重型）血浆中活性suPAR水平
对实例二中的 COVID-19患者进行更详细的分类，分为普通型、重型和危重型，随后对这三类人群活性suPAR的水平进行分析，发现病情患者越重的患者血液中suPAR的水平越高，所得结果见图3。普通型、重型和危重型患者血浆中的平均浓度分别为4.57 ng/ml，5.97ng/ml和6.68 ng/ml。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
福州国重生物科技有限公司
<120> 一种用于临床检测新冠肺炎患者血浆中活性尿激酶受体的试剂盒
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly
1 5 10 15
Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys Asn
20 25 30
Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys
35 40 45
Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr
50 55 60
Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Val Leu
65 70 75 80
Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gln Leu Gly Leu
85 90 95
Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp
100 105 110
Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln Glu Cys Met Val
115 120 125
His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu
130 135 140

Claims (8)

1.一种用于临床检测新冠肺炎患者血浆中活性尿激酶受体的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：uPAR标准品、酶联免疫吸附反应高结合力酶标板、兔源抗活性suPAR多克隆抗体、碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG、洗涤液、样品稀释液、底物显色液。
2.根据权利要求1所述的用于临床检测新冠肺炎患者血浆中活性尿激酶受体的试剂盒，其特征在于，所述酶联免疫吸附反应高结合力酶标板预先包被40-140 μg/ml的可结合活性suPAR的融合蛋白；所述包被具体包括如下步骤：
向酶标板中加入经过包被液稀释的ATF或ATF-HSA蛋白溶液，用密封胶带将96孔板密封好以防止液体蒸发，并与4℃过夜；揭开密封胶带，甩干酶标仪板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔3次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留；向所有孔中加入封闭液，并用密封胶带将96孔板密封好以防止液体蒸发，置于37℃孵育1h。
3.揭开密封胶带，甩干酶标仪板孔内的液体，并用排枪吸取洗涤液，洗涤每孔3次，在最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻轻拍干并保证孔内没有气泡存留；随后将板至于4℃存放；
所述封闭液配方为：由TBST，pH 7.4的缓冲溶液配制而成，其中含有4%的蔗糖和3%的BSA。
4.根据权利要求2所述的用于临床检测新冠肺炎患者血浆中活性尿激酶受体的试剂盒，其特征在于，所述ATF或ATF-HSA中ATF的的氨基酸序列为：
SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYEGNGHFYRGKASTDTMGRPCLPWNSATVLQQTYHAHRSDALQLGLGKHNYCRNPDNRRRPWCYVQVGLKPLVQECMVHDCADGKKPSSPPEE。
5.根据权利要求2所述的用于临床检测新冠肺炎患者血浆中活性尿激酶受体的试剂盒，其特征在于，所述包被液为pH 9.6的50 mM的碳酸氢盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的用于临床检测新冠肺炎患者血浆中活性尿激酶受体的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液和样品稀释液的配方为：含0.05% Tween 20的TBS缓冲液，其中TBS的配方为20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，2.7 mM KCl。
7.根据权利要求1所述的用于临床检测新冠肺炎患者血浆中活性尿激酶受体的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液为0.1 M Tris-HCl，0.1 M NaCl，5 mM MgCl和1 mg/mlPNPP。
8.根据权利要求1所述的用于临床检测新冠肺炎患者血浆中活性尿激酶受体的试剂盒，其特征在于，所述uPAR标准品制备方法为：在果蝇胚胎细胞S2中表达重组的suPAR，经离子柱纯化得到。
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