CN115561468B - 一种评估患有肿瘤或特定肿瘤风险的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种评估患有肿瘤或特定肿瘤风险的方法，属于肿瘤标志物技术领域。本发明提供的用于非诊断目的的评估患有肿瘤风险的方法，包括如下步骤：以循环杂合细胞为标志物，检测外周血样本中是否含有所述标志物；所述标志物数目越多，则表明肿瘤恶性程度越高。本发明以个体的外周血作为单一检测样本，以CTCs为辅助诊断标志物，以循环杂合细胞CHCs为核心诊断标志物，检测个体外周血中的上述标志物，能够准确的对肿瘤的发展进程进行评估。进一步的，在个体外周血中检测到目的标志物CTCs与CHCs后，针对ES、RMS、NB三种肿瘤设计对应的抗体组合，利用免疫荧光技术实施一点多靶的检测，能够有效降低误诊率与漏诊率。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤标志物技术领域，尤其涉及一种评估患有肿瘤或特定肿瘤风险的方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circluating tumor cells,CTCs)是存在于外周血中的单个肿瘤细胞，是一种于原位肿瘤或转移灶上脱落，既可表征实体瘤的特性，又能够揭示肿瘤侵袭进程的细胞。循环杂合细胞(Circulating hybrid cancer cells，CHCs)，是外周血中免疫细胞与肿瘤细胞发生融合后既具备循环肿瘤细胞的特性，又表征肿瘤微环境免疫特性的一种杂合细胞，表现出比CTCs以及CTCs Cluster更强的组织侵袭能力。
尤文肉瘤(Ewing’s sarcoma，ES)、横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma，RMS)、神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)是儿童肿瘤中常见的恶性实体瘤，三者早期病症的隐匿性、复杂多样性及治疗后复发的不可预知性是肿瘤高致死率的主要原因。ES多见于青少年及儿童群体，局部病灶的患儿长期生存率可达70％，而转移性ES长期生存率仅10％～20％。RMS是起源于横向纹肌分化、发育的原始间叶组织的一组恶性肿瘤。病理是RMS的确诊手段，比如骨髓穿刺检测骨髓是否被肿瘤侵袭，结合影像学手段综合评估。NB是一种多发于婴幼儿群体中的颅外实体瘤，在儿童高发恶性肿瘤排名前三，死亡率高于10％。以上三种肿瘤由于其恶性程度高，易发不易查，治疗难度与预后不乐观。三者临床常规检测手段有：组织活检、液体活检、影像学以及基因分子生物学诊断等。但在临床层面的确诊多依赖组织病理，操作繁琐伴有高痛高创，并且组织切取过程多会加速肿瘤的恶化进程；传统的影像学手段又具有特异性或灵敏度不足的特点，往往需要联合组织和液体活检等手段综合评估，所以在早期诊断与治疗预后以及复发监测中应用受限。
近年来有研究利用CTCs评估ES，最常使用方法学为利用逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)，也有基于流式细胞术(Flow cytometry，FCM)检测CTCs用于ES的诊断。Lucia Tombolan等人基于免疫学特性收集RMS患者外周血和骨髓中的CTCs以及循环肿瘤细胞游离DNA，以desmin为标志物，实现对肿瘤以及是否发生侵袭的检测。Merugu等人应用成像流式细胞技术，以GD2+/CD45-作为标记物，对NB患儿的血浆及骨髓血样的CTCs检测。但是现有技术无论是样本选取、细胞富集、还是单一抗体检测结果，均同临床诊断结果存在较多病例误差，其操作简易性、结果精准度、应用广泛性都有待改善与提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种以个体的外周血作为单一检测样本，能够准确评估患有肿瘤或特定肿瘤风险的方法，能够有效降低误诊率与漏诊率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种评估患有肿瘤风险的方法，所述方法用于非诊断目的，包括如下步骤：以循环杂合细胞为标志物，检测外周血样本中是否含有所述标志物；所述标志物数目越多，则表明肿瘤恶性程度越高。
优选的，所述标志物还包括循环肿瘤细胞。
优选的，对于初诊个体，标志物存在则表明肿瘤恶性风险高；对于治疗中个体，标志物存在则表明预后差；对于治疗后个体，标志物存在则表明个体肿瘤复发。
优选的，检测外周血样本中是否含有所述标志物的方法为使用CTC/CHC分选仪。
本发明还提供了一种评估患有特定肿瘤风险的方法，所述方法用于非诊断目的，包括如下步骤：按照上述方法检测外周血样本中是否含有所述标志物后，分别检测所述标志物中是否含有所述特定肿瘤的抗体，出现CTCs+、CHCs+、CTCs+&CHCs+三种结果中的任一种，对于初诊个体，则表明肿瘤恶性风险高；对于治疗中个体，则表明预后差；对于治疗后个体，则表明个体肿瘤复发。
优选的，所述特定肿瘤包括尤文肉瘤、横纹肌肉瘤和神经母细胞瘤。
优选的，所述尤文肉瘤的抗体包括CD45、CD99和NKX。
优选的，所述横纹肌肉瘤的抗体包括CD45、MyoD1和Myogenin。
优选的，所述神经母细胞瘤的抗体包括CD45、GD2和PHOX2B。
优选的，所述CTCs+为在CTC细胞中CD45阴性，其余检测抗体阳性；所述CHCs+为在CHC细胞中所有检测抗体阳性。
本发明的有益效果：
本发明以个体的外周血作为单一检测样本，以CTCs为辅助诊断标志物，以循环杂合细胞CHCs为核心诊断标志物，检测个体外周血中的上述标志物，能够准确的对肿瘤的发展进程进行评估。进一步的，在个体外周血中检测到目的标志物CTCs与CHCs后，针对ES、RMS、NB三种肿瘤设计对应的抗体组合，利用免疫荧光技术实施一点多靶的检测，能够有效降低误诊率与漏诊率。
本发明以外周血为检测样本，能够降低医生的取样难度，同时减少待测个体的痛苦与创口。本发明的检测样本以及目的检测物CTCs与CHCs都容易获取，方便进行后期的各项研究诊断，而且稳定可靠易获取的诊断标志物对于临床检验意义重大。本发明将CHCs与CTCs结合起来评估肿瘤恶性程度，指导性更加精准。
本发明根据不同肿瘤类型，选择两个及两个以上抗体组合来表征病理结果，使结果更为精准，既避免了抗体交叉反应带来的误诊，耽误治疗；同时也避免了因为个体化差异蛋白分子表达类型不同而导致的漏诊。本发明多抗体组诊断能够有效降低误诊率与漏诊率。
由于肿瘤的异质性以及患者的个体差异，同一肿瘤高表达的蛋白分子含量以及种类略有不同，不同肿瘤类型表达同一蛋白易导致抗体交叉反应，本发明采用一点多靶诊断技术，突破现有技术基于CTCs单一抗体的检测方法，选择多抗体组合的免疫荧光手段检测外周血中的CTCs与CHCs，弥补上述差异，弱化甚至消除交叉反应的可能，从根源上有效提高检出率。
本发明根据其数目细分的诊断评估报告指导临床医生对于早期患者制定个体化治疗方案、对于正在治疗中的患者进行疗效监测、对于康复中的患者实施复发诊断，从肿瘤的发生发展的各个阶段及时介入，阻断肿瘤的发展进程，综合提高患者的长期生存率。本发明方法可以实现对多种肿瘤不同发展阶段的类型的检测，临床意义重大。
附图说明
图1为本发明评估患有特定肿瘤风险方法的流程图；
图2为本发明方法对6例健康儿童和5例确诊ES患儿的外周血样本进行检测的结果图；
图3为本发明方法对5例健康儿童和4例确诊RMS患儿的外周血样本进行检测的结果图；
图4为本发明方法对7例健康儿童、7例确诊NB但未发生肿瘤侵袭的患者和18例确诊NB且发生了肿瘤远端侵袭的患者的外周血样本进行检测的结果图；
图5为本发明方法对7例经过治疗但复发的NB患者的外周血样本进行检测的结果图；
图6为本发明方法对31例疑NB的待测者外周血样进行检测，依据结果区分健康人与NB肿瘤恶性患者的AUC-ROC图。
具体实施方式
本发明提供了一种评估患有肿瘤风险的方法，所述方法用于非诊断目的，包括如下步骤：以循环杂合细胞为标志物，检测外周血样本中是否含有所述标志物；所述标志物数目越多，则表明肿瘤恶性程度越高。
在本发明中，所述标志物优选的还包括循环肿瘤细胞。本发明以循环杂合细胞为核心标志物，以循环肿瘤细胞为辅助标志物，两者协同实现对患有肿瘤的风险进行，进一步提高了结果的准确性。在本发明所述方法中，对于初诊个体，标志物存在则表明肿瘤恶性风险高；对于治疗中个体，标志物存在则表明预后差；对于治疗后个体，标志物存在则表明个体肿瘤复发。在本发明中，两个标志物的数目与肿瘤的发展进程呈正相关：对于初诊患者，标志物存在即肿瘤恶性，数目越多恶性程度越高；对于治疗中的患者，预后于数目呈负相关；对于治疗后的患者，若存在标志物，则判定个体的肿瘤复发，此时需要临床干预，及时阻断肿瘤的进程。在本发明所述方法中，检测外周血样本中是否含有所述标志物的方法优选为使用CTC/CHC分选仪。
本发明还提供了一种评估患有特定肿瘤风险的方法，所述方法用于非诊断目的，包括如下步骤：按照上述方法检测外周血样本中是否含有所述标志物后，分别检测所述标志物中是否含有所述特定肿瘤的抗体，出现CTCs+、CHCs+、CTCs+&CHCs+三种结果中的任一种，对于初诊个体，则表明肿瘤恶性风险高；对于治疗中个体，则表明预后差；对于治疗后个体，则表明个体肿瘤复发。
在本发明中，所述特定肿瘤优选的包括尤文肉瘤、横纹肌肉瘤和神经母细胞瘤。所述尤文肉瘤的抗体优选的包括CD45、CD99和NKX，所述横纹肌肉瘤的抗体优选的包括CD45、MyoD1和Myogenin，所述神经母细胞瘤的抗体优选的包括CD45、GD2和PHOX2B。本发明评估患有特定肿瘤风险方法的流程图如图1所示。
在本发明所述方法中，所述CTCs+优选的为在CTC细胞中CD45阴性，其余检测抗体阳性，比如对于尤文肉瘤而言，若在CTC细胞中CD45阴性，CD99和NKX阳性，则表明CTCs+；所述CHCs+优选的为在CHC细胞中所有检测抗体阳性，比如对于尤文肉瘤而言，若在CHC细胞中，CD45、CD99和NKX均为阳性，则表明CHCs+。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
(1)采样：使用临床常规外周血采集方法，获取约3mL的外周血样本。
(2)标志物提取：
使用PBS溶液稀释新鲜的外周血样本，稀释倍比为2；将稀释后的样本，使用ZigZag的CTC/CHC分选仪及配套分离辅基芯片，收集目的细胞CTCs与CHCs；收集所得细胞，4℃低温，1200rpm离心5min，弃上清；细胞平铺于96孔细胞培养板皿底，室温等待细胞贴壁后使用4％组织固定液固定细胞；针对特定肿瘤类型，加入荧光素标记的抗体CD45/Ab1/Ab2，4℃避光过夜孵育；DAPI染核8min；
(3)标志物检测：荧光显微镜下观察，CTCs+(CD45阴性/检测Ab1/Ab2抗体阳性)、CHCs+(CD45以及检测抗体Ab1/Ab2皆为阳性)、CTCs+&CHCs+(两情况都存在)，并且统计两标记物的数目，根据铺板量计算患者定量外周血中的CTCs与CHCs的浓度。
(4)报告评估：
镜下观察，根据标志物是否存在以及数目评估待测者病情。存在CTCs+、CHCs+、CTCs+&CHCs+三种情况任一，1.对于初诊患者，标志物存在即待测者肿瘤恶性；2.对于治疗中的患者，标志物存在即预后差；3.对于治疗后的患者，若存在标志物，则判定个体患者的肿瘤复发。
根据统计所得CTCs与CHCs的数目，计算患者定量外周血中的CTCs与CHCs的数目。1.对于初诊患者，数目越多待测者肿瘤恶性程度越高，需要及时介入治疗；2.对于治疗中的患者，数目越多则预后结果越差，需要针对病情及时调整治疗方案；3.对于治疗后的患者，数目越多则判定个体患者的肿瘤复发情况越严重。
实施例2
采用实施例1的方法对6例健康儿童和5例确诊ES患儿的外周血样本进行检测，其中荧光素标记的抗体为CD45、CD99和NKX，其余步骤均同实施例1，结果如图2所示。6例健康儿童中未检出标志物CTCs与CHCs；4例确诊ES患儿外周血中检出大量的标志物CTCs与CHCs，其中CHCs存在比CTCs更具普遍性。
实施例3
采用实施例1的方法对5例健康儿童和4例确诊RMS患儿的外周血样本进行检测，其中荧光素标记的抗体为CD45、MyoD1和Myogenin，其余步骤均同实施例1，结果如图3所示。5例健康儿童的外周血样本中未检出标志物CTCs与CHCs；4例确诊RMS患儿外周血中检出大量的标志物。
实施例4
采用实施例1的方法对7例健康儿童、7例确诊NB但未发生肿瘤侵袭的患者和18例确诊NB且发生了肿瘤远端侵袭的患者的外周血样本进行检测，其中荧光素标记的抗体为CD45、GD2和PHOX2B，其余步骤均同实施例1，结果如图4所示。其中7例健康儿童的外周血样本中未检出CTCs与CHCs，假阳性率为0％。7例确诊NB但未发生肿瘤侵袭的患者，依据CTCs的阳性检出率为28.57％，依据本发明新型标志物CHCs的阳性检出率为85.71％。18例确诊NB且发生了肿瘤远端侵袭的患者，依据CTCs的阳性检出率为88.89％，依据本发明新型标志物CHCs的检出率为100％。
另外，由图4可以看出，发生肿瘤侵袭的NB患者外周血中检出的CTCs与CHCs数目远高于未发生侵袭的NB患者外周血中检出的CTCs与CHCs数目，明确了两个标志物的数目与肿瘤发展进程呈正相关，这对于实际的临床诊断以及NB的早期诊断都有切实意义，早期发现，及时介入，能够阻断肿瘤恶化的趋势。
实施例5
采用实施例1的方法对7例经过治疗但复发的NB患者的外周血样本进行检测，其中荧光素标记的抗体为CD45、GD2和PHOX2B，其余步骤均同实施例1，结果如图5所示。在明确患者发生复发的外周血中检出了高浓度的CTCs与CHCs，且3mL定量样本中CHCs的数目较CTCs更多，作为诊断标志物，指导意义更加明确，有助于提高检测结果的灵敏度。
实施例6
采用实施例1的方法对31例疑NB的待测者的外周血样本进行检测，依据CTCs与CHCs检测结果区分健康人与NB肿瘤恶性患者，其中荧光素标记的抗体为CD45、GD2和PHOX2B，其余步骤均同实施例1，结果如图6所示。AUC高达0.98，表明基于本发明标志物CTCs与CHCs的检测结果对NB患者与健康人的区分度极高，诊断结果精准，指导意义明确。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种利用免疫荧光技术进行一点多靶检测的肿瘤风险评估产品，其特征在于，
所述肿瘤包括尤文肉瘤、横纹肌肉瘤和神经母细胞瘤；
所述产品以循环杂合细胞CHCs和循环肿瘤细胞CTCs为标志物；
所述产品包括以下模块：
采样模块；所述采样模块用于获取外周血样本；
标志物提取模块；所述标志物提取模块包括PBS溶液、CTC/CHC分选仪及配套分离辅基芯片、96孔细胞培养板皿、4％组织固定液和荧光素标记的抗体；所述PBS溶液用于稀释外周血样本；所述CTC/CHC分选仪及配套分离辅基芯片用于从稀释后的外周血样本收集目的细胞CTCs与CHCs；所述96孔细胞培养板皿用于细胞平铺和细胞贴壁；所述4％组织固定液用于固定细胞；所述荧光素标记的抗体用于在细胞固定后对其进行孵育，所述抗体包括CD45、CD99、NKX、MyoD1、Myogenin、GD2和PHOX2B，其中，CD45、CD99和NKX作为尤文肉瘤的抗体，CD45、MyoD1和Myogenin作为横纹肌肉瘤的抗体，CD45、GD2和PHOX2B作为神经母细胞瘤的抗体；
标志物检测模块；所述标志物检测模块包括荧光显微镜子模块、标志物判定子模块、CTCs与CHCs数目统计子模块以及CTCs与CHCs浓度定量子模块；所述荧光显微镜子模块用于观察CTCs与CHCs；所述标志物判定子模块用于根据以下特征判定标志物：尤文肉瘤CTCs+为在循环肿瘤细胞CTCs中CD45阴性，CD99和NKX阳性；尤文肉瘤CHCs+为在循环杂合细胞CHCs中CD45、CD99和NKX均为阳性；横纹肌肉瘤CTCs+为在循环肿瘤细胞CTCs中CD45阴性，MyoD1和Myogenin阳性；横纹肌肉瘤CHCs+为在循环杂合细胞CHCs中CD45、MyoD1和Myogenin均为阳性；神经母细胞瘤CTCs+为在循环肿瘤细胞CTCs中CD45阴性，GD2和PHOX2B阳性；神经母细胞瘤CHCs+为在循环杂合细胞CHCs中CD45、GD2和PHOX2B均为阳性；所述CTCs与CHCs数目统计子模块用于统计CTCs与CHCs的数目；所述CTCs与CHCs浓度定量子模块用于根据铺板量计算患者外周血中的CTCs与CHCs的浓度；
报告评估模块；所述报告评估模块以循环杂合细胞CHCs为核心诊断标志物，以CTCs为辅助诊断标志物，出现CHCs+，或出现CHCs+和CTCs+两者，对于初诊个体，则表明肿瘤恶性风险高；对于治疗中个体，则表明预后差；对于治疗后个体，则表明个体肿瘤复发。
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