CN115389766B - 用于诊断神经母细胞瘤是否发生骨髓浸润的标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于诊断神经母细胞瘤是否发生骨髓浸润的标志物及其应用，属于肿瘤诊断技术领域。本发明选择患儿外周血中的CTCClusters作为神经母细胞瘤的骨髓浸润诊断的新型标志物，通过对CTCClusters数量的检测来诊断患者肿瘤是否发生骨髓浸润，该方法相比于临床使用的骨髓穿刺方法，降低了患儿痛苦，同时也方便了取样检测，可支持短期内多次采样检测。基于CTCClusters这个标志物对NB肿瘤是否发生骨髓受累进行精准的区分。本发明检测系统所得评估结果与医院临床报告高度匹配，其对临床NB患儿的骨髓浸润判定或者监测具有一定的指导意义。

Description

用于诊断神经母细胞瘤是否发生骨髓浸润的标志物及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤诊断技术领域，尤其涉及用于诊断神经母细胞瘤是否发生骨髓浸润的标志物及其应用。
背景技术
神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)是一种多发于婴幼儿群体中的颅外实体瘤，该肿瘤由于其复杂多样性，原发病灶隐匿，初发病症不典型，早期诊断困难；发展过程会出现远端组织浸润，包括骨、肝、皮肤及骨髓(Bone marrow，BM)等组织，肿瘤浸润部位表现病症后开始诊断，因此NB的临床的治疗预后差，死亡率在儿童肿瘤中高于10％。临床一半以上NB患儿都会存在BM浸润的情况，临床上疑为NB的患儿术前都需进行骨髓穿刺活检。由此可见，骨髓内是否存在肿瘤组织浸润对于NB患儿的病情诊断、治疗方案确定具有现实意义。临床NB常规检测手段有：组织活检、尿检、影像学以及基因分子生物学诊断、涂片、骨髓穿刺等。
NB常规检测手段(骨髓穿刺外)或取样难或创面大或操作繁琐、精准度低，都不易实现对BM浸润的精准检测，组织活检甚至伴随瘤旁组织恶性浸润，导致病情恶化；多部位骨髓穿刺可以有效评估BM部位是否发生浸润，但这种多创高创且相对复杂的检测手段不仅增加了患儿的痛苦，同时也增加了检测难度与检测成本。
CTCs(Circulating tumor cells，CTCs)作为肿瘤转移中一个过程产物，与肿瘤转移息息相关，并且已经成为经批准的可以商业化用的肿瘤检测的一个特征标志物。但是目前基于CTC还难以实现对NB以及转移的精确诊断。环肿瘤细胞团(Circulating tumor cellclusters，CTC clusters)，主要是原始肿瘤部位、转移灶上脱落，形成的细胞团，不仅仅是外周血(Peripheralblood，PB)中单个CTC聚集、增殖而成，相比于单个CTCs，它不仅表征了原位实体瘤的特性，还表现出比CTCs更强的多样性、异质性，较CTCs具有更强的浸润性。因此我们认为CTC Clusters相比于CTCs判断肿瘤浸润以及浸润能力，可能是一个更佳的诊断标志物，目前并未有利用Clusters标志物诊断评估NB患者的BM浸润的研究被报道。
Clusters相比于CTCs，在PB中的数量数目更加稀少，对其有效分离和富集是其研究应用的第一步。目前，Clusters分离富集同CTCs，主要依据细胞团的物理特性(大小、密度、电荷等)及免疫学特性。基于物理学特性：根据全血中CTCs&Clusters与红细胞、白细胞、血小板的密度差，使用密度梯度离心分离收集；根据尺寸不同，使用过滤、惯性力、涡流及确定性侧向位移(Deterministic lateral displacement，DLD)分离收集。根据免疫学特性：肿瘤细胞特异性表达上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecules，EpCAM)，利用免疫磁珠或免疫芯片分离收集CTCs&Clusters。富集后的细胞需要进行肿瘤细胞的识别，主要包括免疫荧光染色(Immunofluorescence，IF)、荧光原位杂交(Fluorescence insitu hybridization，FISH)、流式细胞术(Flow cytometry，FCM)、逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)及酶联免疫斑点实验等。其中IF直接使用荧光染料标记的抗体分子特异性靶向肿瘤细胞，之后在荧光显微镜下观察。研究表明NB患者PB样本存在高水平的GD2、PHOX2B等分子，而在白细胞中不表达；CD45作为白细胞共同抗原分子，肿瘤细胞中不表达。
发明内容
本发明的目的之一在于提供用于检测外周血中CTC clusters数量的试剂在制备用于诊断或监测神经母细胞瘤是否发生骨髓浸润的试剂或试剂盒中的用途。
优选地，所述试剂盒包括CTC clusters分离富集的CTC/CHC分选仪、不同荧光标记的抗体分子CD45/PHOX2B/GD2。
更优选地，所述试剂盒还包括PB样本稀释液、细胞铺板使用的黏附液、清洗培养板的PBS溶液和细胞固定试剂4％多聚甲醛固定液。
更优选地，所述试剂盒的使用方法如下：
(1)使用CTC/CHC分选仪分离收集神经母细胞瘤患者稀释后外周血中的细胞；
(2)固定细胞并利用抗体分子CD45/PHOX2B/GD2进行免疫染色；
(3)成像鉴定。
更优选地，还包括步骤(4)评估：CTC clusters检出即可判定患者肿瘤发生骨髓浸润。
本发明的目的之二在于提供一种用于诊断或监测神经母细胞瘤是否发生骨髓浸润的试剂盒，所述试剂盒包括CTC clusters分离富集的CTC/CHC分选仪、不同荧光标记的抗体分子CD45/PHOX2B/GD2。
更优选地，所述试剂盒还包括PB样本稀释液、细胞铺板使用的黏附液、清洗培养板的PBS溶液和细胞固定试剂4％多聚甲醛固定液。
本发明的目的之三在于提供上述试剂盒在制备用于诊断或监测神经母细胞瘤是否发生骨髓浸润的工具中的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)目前并未有利用Clusters标志物诊断评估NB患者的BM浸润的研究被报道。我们选择患儿外周血中的Clusters作为NB的骨髓浸润诊断的新型标志物，相比于临床用骨髓穿刺方法，我们仅需常规PB，降低了患儿痛苦也方便医生取样检测，可支持短期内多次采样检测，并且相比于CTCs这个标志物，Clusters对于NB肿瘤浸润以及骨髓是否受累的区分度更精准；获得PB后，使用我们自主研发的循环肿瘤细胞/杂合肿瘤细胞(Circulatinghybrid cells，CHC)分选仪分离富集目的标志物Clusters。上述分选仪是基于级联式微流控确定侧向位移分离原理，根据细胞尺寸、细胞弹性形变特性、流体力学原理等综合因素，分离富集CTCs、Clusters。所需上样量少，上机时间仅需30min，整个分离过程不使用抗体，无标记分离富集，最终肿瘤细胞捕获效率大于95％，分离得到活细胞悬液活性高达100％，可直接应用于IF、FISH、PCR/数字PCR、高通量单细胞转录组测序和细胞培养、药敏筛选。
(2)分离富集所得目的细胞，经铺板固定，搭配CD45/PHOX2B/GD2等抗体组合，对细胞免疫荧光染色，之后在荧光显微镜下观察统计样本中Clusters的数目，根据Clusters评估患者是否存在骨髓浸润的可能性。这种有优势的抗体组合，突破以往研究应用中单一抗体靶向检测NB的弊端，检测结果更加精准，并且我们搭配的抗体组合还可以避免单一抗体检测存在的交叉反应，提高了检测特异性与灵敏度，为NB外周血及骨髓浸润检测提供了有效途径。
(3)基于PB中Clusters这个标志物，利用我们搭配的抗体组合，可以对临床NB患儿是否发生BM进行准确评估，最后评估报告给予临床医生个体化治疗按方案的制定。本发明检测系统所得评估结果与医院临床报告高度匹配。本发明对临床NB患儿的骨髓浸润具有精准切实的指导意义。
附图说明
图1为实施例1中CTC/CHC分选仪的检测流程图。
图2为实施例1中对患者外周血中收集到的CTCs、Clusters铺板染色后的荧光成图。
图3为试验例1中45例NB患者外周血中CTCs与Clusters的检测结果图。
图4为试验例1中45例NB患者外周血中Clusters数目/3mL的统计结果图。
图5为试验例1中AUC-ROC曲线图。
具体实施方式
实施例1
(1)临床样本获取：抽取NB患者外周血3～5mL，室温保存。
(2)分离富集
①样本预处理：PBS稀释外周血；
②上样：稀释的外周血，按照CTC/CHC分选仪(CTC/CHC分选仪的检测流程图参见图1)使用流程上样，进行CTCs、Clusters的分离收集，等待30min，收样；
③收集所得细胞，1200rpm，离心10min。
(3)IF染色与成像
①细胞铺板：培养板提前使用细胞黏附液处理皿底，之后将离心收集的细胞平铺于96孔细胞培养板中，设置三个复孔及一个对照孔，室温下等待细胞沉降，镜下观察细胞在皿底贴附舒展即可，PBS清洗2遍；
②细胞固定:4％多聚甲醛固定液室温固定，PBS清洗3遍；
③封闭：4％BSA孵育2h，PBS清洗3遍；
④免疫染色：CD45、GD2、PHOX2B抗体使用PBS分别以20、100、100的倍比稀释到工作浓度，加入固定好的细胞中，4℃避光孵育12-16h，PBS清洗3遍；DPAI染色，PBS清洗3遍。
⑤成像鉴定：将各孔细胞置于荧光显微镜下观察并记录各孔中CTCs(CD45-/PHOX2B+/GD2+的细胞)、Clusters(CD45-/PHOX2B+/GD2+的细胞簇)的数目，观察结果参见图2。
(4)BM评估
根据荧光镜下观察的Clusters数目，评估患者的NB肿瘤浸润、骨髓受累状态。镜下观察，存在Clusters即可判定NB患者肿瘤发生组织浸润，骨髓已经受累；Clusters数目与骨髓受累程度呈正相关，Clusters越多，骨髓受累越严重。
本实施例使用的分选仪为中国专利CN 107723207 A中的分选仪。
试验例1
实验病例：选择45例临床NB患者，其中17例未发生肿瘤转移；8例肿瘤转移，但骨髓未受累；20例发生肿瘤转移且骨髓受累；使用我们的检测系统对45例患者的外周血样本中CTCs、Clusters的数目进行检测统计，具体结果参见图3。
实验结果：17例未发生肿瘤转移的患者外周血样本，6例检出CTCs，11例未检出CTCs，Clusters17例都未检出；8例肿瘤转移但骨髓未受累患者外周血样本，8例检出CTCs，Clusters8例都未检出；20例肿瘤转移且骨髓受累患者外周血样本，19例检出CTCs与Clusters，1例未检出Clusters，仅检出CTCs。45例NB患者外周血中Clusters数目/3mL的统计结果参见图4。
实验结论：根据Clusters评估BM，假阴性检出率0％，阳性检出率高达95％。检测系统根据45例患者外周血中检测的Clusters评估BM状态数据与临床患者实际BM状态数据统计AUC-ROC曲线图(参见图5)，ROC是概率曲线，AUC表示可分离的程度或测度，AUC越高对于患者的病情区分能力越好；AUC高达0.975，本发明区分患者的BM与non-BM效果很好，具备优秀的临床指导意义。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.用于检测外周血中CTC clusters数量的试剂在制备用于诊断或监测神经母细胞瘤是否发生骨髓浸润的试剂盒中的用途；所述试剂中含有不同荧光标记的CD45抗体分子、PHOX2B抗体分子、GD2抗体分子。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包括CTC clusters分离富集的CTC/CHC分选仪、不同荧光标记的CD45抗体分子、 PHOX2B抗体分子、GD2抗体分子。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括PB样本稀释液、细胞铺板使用的黏附液、清洗培养板的PBS溶液和细胞固定试剂4%多聚甲醛固定液。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下：
（1）使用CTC/CHC分选仪分离收集神经母细胞瘤患者稀释后外周血中的细胞；
（2）固定细胞并利用抗体分子CD45/ PHOX2B/GD2进行免疫染色；
（3）成像鉴定。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，还包括步骤（4）评估：CTC clusters检出即可判定患者肿瘤发生骨髓浸润。
6.一种用于诊断或监测神经母细胞瘤是否发生骨髓浸润的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括CTC clusters分离富集的CTC/CHC分选仪、不同荧光标记的CD45抗体分子、PHOX2B抗体分子、GD2抗体分子。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PB样本稀释液、细胞铺板使用的黏附液、清洗培养板的PBS溶液和细胞固定试剂4%多聚甲醛固定液。
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