CN107723207A - 一种分离捕获细胞的芯片及其在肿瘤细胞分选中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种一步分离和捕获细胞的集成芯片，该集成芯片包括细胞富集区和细胞分离区和细胞捕获区，细胞富集区的一端设有入口，另一端设置有废液出口和富集液出口；细胞分离区的一端有缓冲液入口和与富集液出口连通的富集液入口，另一端有出口；细胞捕获区一端有与细胞分离区出口连通的入口，另一端有分离液出口；待分离的细胞液进入细胞富集区，提高目标细胞在细胞液中的浓度；从富集区流出的富集液和缓冲液共同流入细胞分离区，细胞按尺寸大小分离开来；然后进入细胞捕获区捕获细胞。本发明与现有技术相比，能同时实现高效率、高纯度、高活性的从待处理细胞液中分离目标细胞，并同时实现将目标细胞原位捕获在芯片中。

Description

一种分离捕获细胞的芯片及其在肿瘤细胞分选中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是指一种细胞分选的方法，具体涉及一种一步分离和捕获细胞的集成芯片，及其在肿瘤细胞分选方面的应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)是从肿瘤原发灶或转移灶脱落，通过血管或淋巴系统进入血液的肿瘤细胞，来源于原发或转移灶的CTCs不仅能够间接体现肿瘤特征，也能够实时反映肿瘤的发展状况。和传统肿瘤筛查诊断手段(肿瘤影像学、血清肿瘤标志物、组织活检)相比，循环肿瘤细胞的检测有独特和重要的临床应用价值：
1、肿瘤影像学是一种常规的肿瘤筛查手段，但对于较小的肿瘤病灶(小于1厘米)，由于存在容积效应，易漏诊，但国内外的研究发现即使肿瘤组织比较小(如2-4毫米)，肿瘤细胞也可能脱落进入血液，因此CTCs的检测可作为肿瘤早期诊断的辅助手段。
2、血清肿瘤标志物的检查也是一种常规的临床筛查手段，但健康人血液中也存在一定水平的标志物，并且由于病人个体和生理状态的差异，易产生假阳性、假阴性，特异性不够高；与之对比，CTCs的检测具有高度的特异性，健康人血液中不存在CTCs。
3、组织活检是一种常规的诊断分析手段，但也是一种有创性检查，并且存在潜在的癌细胞转移的风险；与之对比，CTCs的检测被认为是一种非侵入性的、可重复的、低成本的新型液体活检技术。基于CTCs的液体活检技术不仅可以动态监测、判断预后(CTCs数量)，还可以用于指导治疗(CTCs生物学特性)。
由于CTCs在外周血中数量稀少，1亿个白细胞和红细胞中仅有数个肿瘤细胞，CTCs的分离捕获是后续分析(表型、基因型)的基础。目前，CTCs的分离方法按原理主要分为基于细胞生物学和物理学特征：
1、基于肿瘤细胞生物学特征的分离
CTCs是一种上皮细胞，会表达上皮细胞特有的抗原，如上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)，因此EpCAM的抗体可用于分离捕获CTCs。这类方法中最有代表性的是美国强生公司开发的Cellsearch系统，利用EpCAM与包含特异性抗体的磁珠结合，在外加磁场的作用下即可分离出肿瘤细胞，Cellsearch是唯一被美国食品药品管理局(FDA)准入临床使用的CTCs分离捕获平台。但有研究显示，癌细胞进入血液后上皮细胞特有的抗原EpCAM表达下调，这部分表达下调的肿瘤细胞无法被捕获。为了克服这一缺点，研究者开发了基于细胞物理学特征的分离方法。
2、基于肿瘤细胞物理学特征的分离
肿瘤细胞的物理学特征如尺寸、密度等，和白细胞、红细胞差别较大，如肿瘤细胞直径一般大于12微米，而白细胞直径大多小于15微米，利用此差异可将肿瘤细胞从血液中分离出来。常见的基于细胞尺寸的分离方法如过滤膜、惯性力、涡流(Vortex)和确定性侧向位移(Deterministic lateral displacement,DLD)等。
本发明采用的是基于确定性侧向位移(DLD)原理的CTCs分离，DLD的原理是首先设计按一定方向排布的微柱阵列，根据微柱阵列的尺寸和排布，每个微柱阵列有特定的物质临界分选尺寸(直径)，当大于临界直径的大物质与微柱阵列碰撞后发生侧向位移并向一侧汇聚，而小于临界直径的物质与微柱碰撞后不发生侧向位移，而是保持原来的流向，大物质和小物质因而产生空间分离。
肿瘤细胞的尺寸一般大于白细胞和红细胞，已有一些报道利用DLD微柱阵列分离外周血中的循环肿瘤细胞。现有技术中有人设计了对称的DLD三角形微柱芯片结构，血液通过芯片入口通入芯片，较大的细胞(临界尺寸6-8微米)包括肿瘤细胞和部分白细胞最终富集于流道中间被收集，但由于位于流道中间部分的红细胞和白细胞无法被分离，肿瘤细胞的分离纯度极低(低于0.01％)。
现有技术中还有人设计了类似的对称三角形微柱芯片结构，但在流道中间增加了一个缓冲液入口，红细胞被完全去除，肿瘤细胞和部分白细胞(临界尺寸6.5-8.5微米)富集于流道中间的缓冲液而被收集，但由于血液中仍有大量的大于临界尺寸的白细胞，因而分离液中肿瘤细胞纯度低，白细胞浓度高，需要做二次纯化，此外，现有技术中报道的DLD芯片宽度窄(3-5mm)，为提高分离通量需要用较高流速，但高流速会造成细胞损伤，影响后续肿瘤细胞染色和生物学分析。
现有技术的缺陷，一是无法实现分离高纯度的CTCs，二是用DLD微柱芯片分离CTCs后需进行离心、重悬等操作，并收集于孔板、培养皿或芯片中进行染色、鉴定，多步操作会造成细胞损失和损伤，减少分离后的操作步骤或将这些操作集成于分离过程中是必要的，但目前还没有相关报道。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供一种一步分离和捕获细胞的集成芯片及其使用方法和应用，能够同时实现高效率、高纯度、高活性的分离细胞，并同时实现将细胞原位捕获在芯片中。
本发明的一个目的是提供一种一步分离和/或捕获细胞的集成芯片。
本发明所提供的一步分离和/或捕获细胞的集成芯片可为如下(A)或(B)或(C)或(D)：
(A)一种一步分离细胞的集成芯片，包括但不限于细胞分离区；所述细胞分离区一端设置有细胞液入口和缓冲液入口，另一端设置有出口。待分离的细胞液经所述细胞液入口，缓冲液经所述缓冲液入口共同流入所述细胞分离区，所述细胞分离区能够使流入的细胞按尺寸大小分离开来。
(B)一种一步分离和捕获细胞的集成芯片，该集成芯片包括但不限于细胞分离区和细胞捕获区；所述细胞分离区一端设置有细胞液入口和缓冲液入口，另一端设置有出口；所述细胞捕获区一端设置有与所述细胞分离区的出口相连通的入口，另一端设置有分离液出口。待分离的细胞液经所述细胞液入口，缓冲液经所述缓冲液入口共同流入所述细胞分离区，所述细胞分离区能够使流入的细胞按尺寸大小分离开来；按尺寸大小分离后的细胞进入所述细胞捕获区，所述细胞捕获区能够捕获目标细胞。
(C)一种一步分离细胞的集成芯片，该集成芯片包括但不限于细胞富集区和细胞分离区；所述细胞富集区的一端设置有一个或多个入口，另一端设置有废液出口和富集液出口；所述细胞分离区的一端设置缓冲液入口和与所述细胞富集区的富集液出口相连通的富集液入口，另一端设置有出口。待分离的细胞液从所述细胞富集区的入口通入，进入所述细胞富集区，所述细胞富集区能够提高目标细胞在细胞液中的浓度，以便后续进一步分离；废液从所述废液出口流出，从所述细胞富集区流出的富集液经所述富集液入口，缓冲液经所述缓冲液入口共同流入所述细胞分离区，所述细胞分离区能够使流入的细胞按尺寸大小分离开来。
(D)一种一步分离和捕获细胞的集成芯片，该集成芯片包括但不限于细胞富集区、细胞分离区和细胞捕获区；所述细胞富集区的一端设置有一个或多个入口，另一端设置有废液出口和富集液出口；所述细胞分离区的一端设置有缓冲液入口和与所述细胞富集区的富集液出口相连通的富集液入口，另一端设置有出口；所述细胞捕获区一端设置有与所述细胞分离区的出口相连通的入口，另一端设置有分离液出口。待分离的细胞液从所述细胞富集区的入口通入，进入所述细胞富集区，所述细胞富集区能够提高目标细胞在细胞液中的浓度，以便后续进一步分离；废液从所述废液出口流出，从所述细胞富集区流出的富集液经所述富集液入口，缓冲液经所述缓冲液入口共同流入所述细胞分离区，所述细胞分离区能够使流入的细胞按尺寸大小分离开来；按尺寸大小分离后的细胞进入所述细胞捕获区，所述细胞捕获区能够捕获目标细胞。
进一步地，所述细胞富集区的一端设置的多个入口包括但不限于细胞液入口和缓冲液入口。
进一步地，所述细胞富集区由一组、两组或两组以上(如三组)对称的DLD微柱阵列结构组成，大于所述对称的DLD微柱阵列结构的临界分选直径的细胞在流经所述细胞富集区时被富集于所述对称的DLD微柱阵列结构的中间，汇集后流入所述细胞分离区，废液从所述废液出口流出。
进一步地，当所述细胞富集区由两组和两组以上对称的DLD微柱阵列结构组成时，两组相邻的所述对称的DLD微柱阵列结构由柱子隔开。
进一步地，所述细胞富集区DLD微柱为三角形、圆形、长方形、“工”字形和异形状结构中的一种。
进一步地，在所述细胞富集区中，所述对称的DLD微柱阵列结构的临界分选直径在1-30微米之间。优选地，临界分选直径为3-15微米。更进一步优选地，临界分选直径为5-10微米。
在本发明的一个实施例中，所述对称的DLD微柱阵列结构的临界分选直径具体为6-8微米。
进一步地，在所述细胞富集区中，所述对称的DLD微柱阵列结构中DLD微柱按0.1-30度的倾斜角向对称轴收敛。优选地，倾斜角为1-20度。
在本发明的一个实施例中，所述对称的DLD微柱阵列结构中DLD微柱的倾斜角具体为1.2度。
进一步地，所述细胞富集区的DLD微柱为三角形结构，三角形的一个顶点指向其所在的所述对称的DLD微柱阵列结构的对称轴，三角形的边长为1-500微米，两个相邻三角形之间的间隔为1-500微米。优选地，边长为10-50微米，两个相邻三角形之间的间隔为10-50微米。更进一步优选地，边长为15-40微米，两个相邻三角形之间的间隔为15-50微米。其中，所述“两个相邻三角形之间的间隔”指的是纵向的行间距或横向的列间距。
在本发明的一个实施例中，所述细胞富集区的DLD微柱为三角形结构，三角形的边长具体为20微米，两个相邻三角形之间的间隔具体为25微米(行间距)和50微米(列间距)。
进一步地，所述细胞分离区由DLD微柱阵列结构组成；所述细胞分离区的DLD微柱为三角形、圆形、长方形、“工”字形和异形状结构中的一种；所述细胞分离区的DLD微柱阵列结构从所述细胞分离区的入口侧至出口侧具有渐变增大的临界分选直径或具有固定不变的临界分选直径。
更进一步地，所述渐变增大的临界分选直径从所述细胞分离区的入口侧到出口侧的范围是1-50微米，优选为3-30微米，更进一步优选为5-25微米。
其中，所述渐变增大是线性递增、梯度递增或两者结合。
在本发明的一个实施例中，所述细胞分离区的DLD微柱阵列从所述细胞分离区的入口侧到出口侧渐变增大的临界分选直径设置如下：从入口侧的8微米等梯度(每4微米设置一个梯度)到出口侧的20微米。
更进一步地，所述固定不变的临界分选直径的范围是1-50微米，优选为3-30微米，更进一步优选为8-20微米。
在本发明的一个实施例中，所述固定不变的临界分选直径具体为15微米。
进一步地，所述细胞分离区DLD微柱阵列具有从所述细胞分离区的入口侧至出口侧渐变增大的倾斜角：从入口侧的0.1-15度，渐变增大到出口侧的0.2-30度，优选为从入口侧的1-5度，渐变增大到出口侧的10-25度。相比固定的DLD微柱阵列倾斜角，从入口侧至出口侧递增的倾斜角可以保证不同尺寸的细胞逐步分离，提高细胞分选的纯度和效率。更大的倾斜角度会产生更大的临界分离直径，从而使细胞在分离区出口按尺寸大小进行空间排布。
在本发明的一个实施例中，所述细胞分离区的DLD微柱阵列从所述细胞分离区的入口侧到出口侧渐变增大的倾斜角设置如下：从入口侧的1.2度等梯度(每3度设置一个梯度)增至出口侧的10.2度。
进一步地，所述细胞捕获区包括第一区和第二区；所述第一区由微柱捕获结构阵列组成，用于捕获目标细胞；所述微柱捕获结构为具有开口大，出口小的微柱；所述微柱捕获结构阵列中的微柱捕获结构成行错位排列；所述第二区由非微柱捕获结构阵列组成，非目标细胞经所述第二区流出；所述非微柱捕获结构为三角形微柱、圆形微柱、长方形微柱、“工”字形微柱或异形状结构微柱中的一种；所述非微柱捕获结构阵列中的非微柱捕获结构成行对齐排列。
进一步地，在所述细胞捕获区中，所述第一区和所述第二区均具有1个或多个。
进一步地，在所述第一区中，所述微柱捕获结构的开口直径为15-30微米，出口直径为3-8微米；优选开口直径为15-20微米，出口直径为3-6微米。在所述微柱捕获结构阵列中，每相邻的两个所述微柱捕获结构之间的垂直间距均为8-30微米，优选为22微米。在所述非微柱捕获结构阵列中，每相邻的两个所述非微柱捕获结构之间的垂直间距均为8-30微米，优选为22微米。在本发明的一个实施例中，所述第一区中所述微柱捕获结构的开口直径具体为16微米，出口直径具体为4微米。在所述微柱捕获结构阵列中，每相邻的两个所述微柱捕获结构之间的垂直间距均具体为22微米。在所述非微柱捕获结构阵列中，每相邻的两个所述非微柱捕获结构之间的垂直间距均具体为22微米。
进一步地，所述集成芯片由玻璃、硅和聚合物中的一种或多种制成；所述聚合物可为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、硅树脂(如聚(二甲基硅氧烷))、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯环烯烃聚合物(COP)和环烯烃共聚物(COC)中的一种或多种。
本发明还提供一种一步分离和/或捕获细胞的方法。
本发明所提供的一步分离和/或捕获细胞的方法，是利用本发明所提供的集成芯片对所述待分离的细胞液进行一步分离和/或捕获细胞，包括如下步骤：将待分离的细胞液流经所述集成芯片的所述细胞分离区。
进一步地，本发明所提供的一步分离和/或捕获细胞的方法，具体可包括以下步骤：将所述待分离的细胞液从所述集成芯片的所述细胞富集区的入口通入，进入所述细胞富集区，经所述对称的DLD微柱阵列结构的处理，大于临界分选直径的细胞富集于所述对称的DLD微柱阵列结构的的中间(使细胞在细胞液中的浓度得到提高)，汇集后流入所述细胞分离区，废液从所述废液出口流出；从所述细胞富集区流出的富集液经所述富集液入口，缓冲液经所述缓冲液入口共同流入所述细胞分离区，经所述细胞分离区的DLD微柱阵列结构的分选，富集液中的细胞按尺寸大小分离开来；按尺寸大小分离后的细胞进入所述细胞捕获区，所述细胞捕获区中的所述第一区将目标细胞捕获；非目标细胞通过所述第二区流出，分离液最终从所述分离液出口流出。所述细胞捕获区捕获的目标细胞直接进行染色分析和/或测序研究。
进一步地，流入所述细胞分离区的所述细胞液或所述富集液和所述缓冲液的体积比可在1:(1-50)之间，优选为1:(3-30)之间，进一步优选为1:(4-15)之间。
在本发明的一个实施例中，流入所述细胞分离区的所述富集液和所述缓冲液的体积比具体为1:10。
在本发明的一个实施例中，通入所述集成芯片的细胞液的通量具体为5-25mL/h。
进一步地，在所述富集区入口通入的可为如下任一：(a)所述待分离的细胞液的原液；(b)所述待分离的细胞液的稀释液；(c)所述待分离的细胞液的原液和缓冲液；(d)所述待分离的细胞液的稀释液和缓冲液。
本发明的再一个目的是提供所述一步分离和/或捕获细胞的集成芯片的应用。
所述应用为所述集成芯片在分离和/或捕获细胞中的应用。
进一步地，所述应用包括但不限于如下任一：(1)分离和/或捕获外周血样品中的循环肿瘤细胞；(2)分离和/或捕获胸腔积液、腹水积液、淋巴液、尿液或骨髓样品中的肿瘤细胞；(3)分离和/或捕获外周血或脐带血样品中的有核红细胞；(4)分离和/或捕获外周血样品中的循环内皮细胞；(5)分离和/或捕获外周血、脐带血、胸腔积液、腹水积液、尿液、脑脊液或骨髓样品中的白细胞、T细胞、B细胞、淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞或造血干细胞；(6)分离和/或捕获外周血、脐带血、胸腔积液、腹水积液、尿液或骨髓样品中的红细胞或血小板；(7)分离和/或捕获外周血、胸腔积液、腹水积液、尿液、唾液、血浆、血清、脑脊液、精液、前列腺液或阴道分泌物样品中的细菌或病毒；(8)分离和/或捕获精液样品中的精子。
在本发明的一个实施例中，所述目标细胞为肝癌细胞，具体为HepG2；所述非目标细胞为白细胞和红细胞。
本发明所提供的集成芯片能够将分离的目标细胞原位捕获，并直接进行流式细胞术、声聚焦、核酸或蛋白质分析、基因测序、核酸文库构建、细胞培养分析；或者使用显微镜术进行分析，包括免疫荧光染色和荧光原位杂交(FISH)染色。
本发明具有如下优点：本发明所提供的一步分离和捕获细胞的集成芯片与现有技术相比，能够同时实现高效率、高纯度、高活性的从待处理的细胞液中分离目标细胞，并同时实现将目标细胞原位捕获在芯片中。具体如下：
1、提高了分离通量
分离通量的提高是由细胞富集区实现的，如果只有一组微柱结构，流道窄，无法有效提高通量，本发明可用两组以上对称微组结构可将通量提高至2倍以上。
2、提高了分离纯度
分离纯度的提高是由细胞分离区实现的。现有技术设计的微柱阵列结构只有一个倾斜角度，因而无法使细胞按尺寸精确分离，只能富集大于某一个临床尺寸的细胞，无法提高分离的细胞纯度。本发明细胞分离区中的三角形微柱阵列的倾斜角度从分离区入口侧的0.1-15度，逐渐增加到出口侧的0.2-30度，更大的角度会产生更大的临界分离直径，从而使细胞在分离区出口按尺寸进行空间排布，较大尺寸细胞分离区的CTCs纯度会明显提高。
3、细胞的原位捕获
目前还没有报道用DLD芯片同时实现细胞的分离和捕获，本发明描述的是第一种利用DLD微柱结构同时实现分离和捕获。
4、分离细胞活性的提高
现有技术设计的芯片只能实现细胞富集，需二次或多次纯化才能分离得到高纯度的细胞，多步操作会造成细胞的损失和损伤；与之对比，本发明的一步集成操作减少了人为干预和操作，显著提高了细胞活性。
5、成本的降低
集成操作减少了人工劳动和耗材使用，显著降低了检测成本。
附图说明
图1为本发明实施例1的一步分离和捕获细胞的集成芯片的总体结构示意图。
图2为本发明实施例2的一步分离和捕获细胞的集成芯片的总体结构示意图。
图3为本发明实施例3的一步分离和捕获细胞的集成芯片的总体结构示意图。
图4为本发明实施例4的一步分离和捕获细胞的集成芯片的总体结构示意图。
图5为待分离细胞液入口的结构示意图。
图6为待分离细胞液入口侧的一组对称DLD微柱结构示意图。
图7为对称三角形微柱阵列示意图。
图8为两组对称微柱阵列交界示意图。
图9为三角形微柱阵列结构与尺寸示意图。
图10为富集区出口结构示意图。
图11为富集液收集结构示意图。
图12为富集区相邻出口组结构
图13为细胞分离区入口结构示意图。
图14为细胞分离区分离液入口结构示意图。
图15为细胞分离区三角形微柱阵列结构示意图。
图16为细胞捕获区结构示意图。
图17为实施例4细胞捕获区中第一区的结构示意图。
图18为实施例4细胞捕获区中第一区微柱阵列结构示意图。
图19为实施例4细胞捕获区中第一区微柱结构示意图。
图20为实施例4细胞捕获区中第二区结构示意图。
图21为实施例4细胞捕获区中第二区微柱阵列结构示意图。
图22为肝癌细胞HepG2捕获效率。
图23为肝癌细胞HepG2捕获纯度。
图24为肝癌细胞HepG2捕获活性。
图22、图23和图24中，模拟样品癌细胞浓度约每毫升100个癌细胞，细胞液通量约20mL/h。
其中，1-细胞富集区，2-细胞分离区，3-细胞捕获区，4-富集区入口，5-废液出口，6-捕获区出口。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
如图1所示，一种一步分离细胞的集成芯片，该集成芯片包括细胞分离区2；细胞分离区2一端设置有细胞液入口和缓冲液入口，另一端设置有出口。待分离的细胞液经细胞液入口，缓冲液经缓冲液入口共同流入细胞分离区2，细胞分离区2能够使流入的细胞按尺寸大小分离开来。
细胞分离区由DLD三角形微柱阵列结构组成，从入口侧至出口侧，细胞分离区具有渐变增大的临界分选直径或具有固定不变的临界分选直径。渐变增大的临界分选直径从入口侧的8微米等梯度(每4微米设置一个梯度)到出口侧的20微米(对应DLD微柱阵列从入口侧至出口侧渐变增大的倾斜角，从入口侧的1.2度等梯度增至出口侧的10.2度，每3度设置一个梯度)；固定不变的临界分选直径是15微米。
本实施例的集成芯片能够将分离的目标细胞原位捕获，并直接进行流式细胞术、声聚焦、核酸或蛋白质分析、基因测序、核酸文库构建、细胞培养分析；或者使用显微镜术进行分析，包括免疫荧光染色和荧光原位杂交染色。
本实施例的集成芯片由玻璃、硅和聚合物中的一种或多种制成；所述聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、硅树脂(如聚(二甲基硅氧烷))、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯环烯烃聚合物(COP)和环烯烃共聚物(COC)中的一种或多种。
实施例2
如图2所示，一种一步分离和捕获细胞的集成芯片，该集成芯片包括细胞分离区2和细胞捕获区3，细胞分离区2一端设置有细胞液入口和缓冲液入口，另一端设置有出口；细胞捕获区3一端设置有与细胞分离区2的出口相连通的入口，另一端设置有分离液出口6。待分离的细胞液经细胞液入口，缓冲液经缓冲液入口共同流入细胞分离区2，细胞分离区2能够使流入的细胞按尺寸大小分离开来；按尺寸大小分离后的细胞进入细胞捕获区3，细胞捕获区3能够捕获目标细胞。
细胞分离区由DLD三角形微柱阵列结构组成，从入口侧至出口侧，细胞分离区具有渐变增大的临界分选直径或者固定不变的临界分选直径。渐变增大的临界分选直径从入口侧的8微米等梯度(每4微米设置一个梯度)到出口侧的20微米(对应DLD微柱阵列从入口侧至出口侧渐变增大的倾斜角，从入口侧的1.2度等梯度增至出口侧的10.2度，每3度设置一个梯度)；固定不变的临界分选直径是15微米。
细胞捕获区包括2个第一区和1个第二区；第一区由微柱捕获结构阵列组成，用于捕获目标细胞；微柱捕获结构为具有开口大(直径16微米)，出口小(直径4微米)的微柱；微柱捕获结构阵列中的微柱捕获结构成行错位排列；第二区由非微柱捕获结构阵列组成，非目标细胞经所述第二区流出；非微柱捕获结构为三角形微柱、圆形微柱、长方形微柱、“工”字形微柱或异形状结构微柱中的一种；非微柱捕获结构阵列中的非微柱捕获结构成行对齐排列。
本实施例的集成芯片能够将分离的目标细胞原位捕获，并直接进行流式细胞术、声聚焦、核酸或蛋白质分析、基因测序、核酸文库构建、细胞培养分析；或者使用显微镜术进行分析，包括免疫荧光染色和荧光原位杂交染色。
本实施例的集成芯片为玻璃、硅和聚合物一种或多种制成；所述聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、硅树脂(如聚(二甲基硅氧烷))、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯环烯烃聚合物(COP)和环烯烃共聚物(COC)一种或多种。
实施例3
如图3所示，一种一步分离细胞的集成芯片，该集成芯片包括细胞富集区1和细胞分离区2，细胞富集区1的一端设置有一个或多个入口4，作为细胞液、缓冲液入口，细胞富集区1的另一端设置有废液出口5和富集液出口；细胞分离区2的一端设置有缓冲液入口和与细胞富集区1的富集液出口相连通的富集液入口，另一端设置有出口。待分离的细胞液从细胞富集区1的入口通入，进入细胞富集区1，细胞富集区1能够提高细胞在细胞液中的浓度，以便后续进一步分离；从细胞富集区1流出的富集液经富集液入口，缓冲液经缓冲液入口共同流入细胞分离区2，细胞分离区2能够使流入的细胞按尺寸大小分离开来。
细胞富集区由一组、两组或两组以上(三组)对称的DLD微柱阵列结构组成，细胞富集区的DLD微柱按1.2度的倾斜角向对称的DLD微柱阵列结构的对称轴收敛，每组DLD微柱阵列由柱子隔开，DLD微柱为三角形结构，三角形的顶点指向结构的中心，三角形的边长具体为20微米，两个相邻三角形之间的间隔具体为25微米(行间距)和50微米(列间距)。细胞富集区的临界分选直径为6-8微米。
细胞富集区有1个富集液收集通道，富集液中含目标细胞和非目标细胞，需进行进一步分离。
细胞分离区由DLD三角形微柱阵列结构组成，临界分选直径渐变增大，渐变增大的临界分选直径从入口侧的8微米等梯度(每4微米设置一个梯度)到出口侧的20微米(对应DLD微柱阵列从入口侧至出口侧渐变增大的倾斜角，从入口侧的1.2度等梯度增至出口侧的10.2度，每3度设置一个梯度)。
本实施例的集成芯片分离处理后的样品，可以直接使用流式细胞术、声聚焦、核酸或蛋白质分析、基因测序、核酸文库构建和细胞培养中的一种或多种分析。本实施例的集成芯片为玻璃、硅和聚合物一种或多种制成；所述聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、硅树脂(如聚(二甲基硅氧烷))、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯环烯烃聚合物(COP)和环烯烃共聚物(COC)一种或多种。
实施例4
如图4所示，一种一步分离和捕获细胞的集成芯片，该集成芯片包括细胞富集区1、细胞分离区2和细胞捕获区3。细胞富集区1的一端设置有多个入口4(如图5)，作为细胞液和缓冲液入口，另一端设置有废液出口5和富集液出口；细胞分离区2的一端设置有缓冲液入口和与细胞富集区1的富集液出口相连通的富集液入口，另一端设置有出口；细胞捕获区3一端设置有与细胞分离区2的出口相连通的入口，另一端设置有分离液出口6。待分离的细胞液从细胞富集区1的入口流入，进入细胞富集区1，细胞富集区1能够提高细胞在细胞液中的浓度，以便后续进一步分离；废液从废液出口流出，从细胞富集区1流出的富集液经所述富集液入口，缓冲液经所述缓冲液入口共同流入细胞分离区2，细胞分离区2能够使流入的细胞按尺寸大小分离开来；按尺寸大小分离后的细胞进入细胞捕获区3，细胞捕获区3能够捕获目标细胞。
如图5所示，细胞富集区由三组对称的DLD微柱阵列结构组成(如图6)，细胞富集区DLD微柱按1.2度的倾斜角向对称的DLD微柱阵列结构的对称轴收敛(如图7)，每组DLD微柱阵列由柱子隔开(如图8)，DLD微柱为三角形结构，三角形的顶点指向结构的中心，三角形的边长具体为20微米，两个相邻三角形之间的间隔具体为25微米(行间距)和50微米(列间距)(如图9)。
细胞富集区的临界分选直径为6-8微米。大于临界分选直径的细胞富集于对称的DLD微柱阵列结构的中间，汇集后流入细胞分离区，废液从废液出口流出。
细胞富集区有3个富集液收集通道(如图10、图11和图12)，富集液中含有目标细胞和非目标细胞，需进行进一步分离。
细胞分离区由DLD三角形微柱阵列结构组成，临界分选直径渐变增大，从入口侧到出口侧临界分选直径范围是8-20微米。
所述细胞分离区的DLD微柱阵列从所述细胞分离区的入口侧到出口侧渐变增大的临界分选直径设置如下：从入口侧的8微米等梯度(每4微米设置一个梯度)到出口侧的20微米(对应DLD微柱阵列从入口侧至出口侧渐变增大的倾斜角，从入口侧的1.2度等梯度增至出口侧的10.2度，每3度设置一个梯度)。
富集液进入细胞分离区后(如图13和图14)，继续流经由DLD微柱阵列结构(如图15)，细胞分离区DLD微柱阵列具有从入口侧至出口侧渐变增大的倾斜角，从入口侧的1.2度，渐变增大到出口侧的10.2度。更大的角度会产生更大的临界分离直径，从而使细胞在分离区出口按尺寸进行空间排布。
按尺寸大小进行空间分布的细胞流入细胞捕获区(如图16)，细胞捕获区包括7个，由微柱捕获结构组成的第一区31(如图17)有4个，用于捕获目标细胞，微柱捕获结构为具有开口大(16微米)，出口小(4微米)的微柱，每相邻的两个所述微柱捕获结构之间的垂直间距均为22微米(如图18和图19)；非目标细胞经由长方形非微柱捕获结构(长方形的两个边长分别为20和22微米，每相邻的两个所述非微柱捕获结构之间的垂直间距均具体为22微米，如图20)组成的第二区32(该捕获区为3个)，经出口流出。
非微柱捕获结构也可以是三角形微柱、圆形微柱、工字形微柱或异形状结构微柱中的一种。
本实施例的集成芯片能够将分离的目标细胞原位捕获，并直接进行流式细胞术、声聚焦、核酸或蛋白质分析、基因测序、核酸文库构建、细胞培养分析；或者使用显微镜术进行分析，包括免疫荧光染色和荧光原位杂交染色。
本实施例的集成芯片为玻璃、硅和聚合物一种或多种制成；所述聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、硅树脂(如聚(二甲基硅氧烷))、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯环烯烃聚合物(COP)和环烯烃共聚物(COC)一种或多种。
实施例5
一种一步分离和捕获细胞的集成芯片的使用方法，包括以下步骤：
待分离的细胞液从本发明所提供的集成芯片的细胞富集区入口通入，进入细胞富集区，经细胞富集区对称的DLD微柱阵列结构处理，大于临界分选直径的细胞富集于DLD微柱阵列结构的中间，提高细胞在细胞液中的浓度，汇集后流入细胞分离区，废液从废液出口流出；从细胞富集区流出的富集液和缓冲液(富集液和缓冲液的体积比在1:(1-50)之间)共同流入细胞分离区，经具有渐变增大的临界分选直径或固定不变的细胞分离区的DLD微柱阵列结构分选，富集液中的细胞按尺寸大小分离开来；按尺寸大小分离后的细胞进入细胞捕获区，细胞捕获区中具有进口大、出口小的微柱捕获结构的第一区将目标细胞捕获；非目标细胞通过第二区流出，分离液最终从分离液出口流出；对所述捕获区捕获的细胞直接进行染色分析和/或测序研究。
实施例1-4的一步分离和捕获细胞的集成芯片用于包括但不限于分离和捕获如下任一：外周血样品中循环肿瘤细胞；胸腔积液、腹水积液、淋巴液、尿液或骨髓样品中的肿瘤细胞；外周血和脐带血样品中有核红细胞；外周血样品中循环内皮细胞；外周血、脐带血、胸腔积液、腹水积液、尿液、脑脊液和骨髓样品中白细胞、T细胞、B细胞、淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞或造血干细胞；外周血、脐带血、胸腔积液、腹水积液、尿液或骨髓样品中的红细胞或血小板；外周血、胸腔积液、腹水积液、尿液、唾液、血浆、血清、脑脊液、精液、前列腺液和阴道分泌物样品中细菌或病毒；以及精液样品中精子分选中的应用；
富集区入口通入的待分离样品可为待分离的细胞液的原液、稀释液或缓冲液。
试验例
采用实施例4的集成芯片和实施例5的方法(流入所述细胞分离区的所述富集液和所述缓冲液的体积比具体为1:10)对肝癌细胞HepG2进行分选。
试验例1，共进行5组，每组3次的实验，每次实验模拟样品约10毫升血液(即非目标细胞主要为血液中的白细胞和红细胞)，作为目标细胞的肝癌细胞HepG2直接加入到血液中，癌细胞浓度约每毫升100个癌细胞，5组实验通量分别为5mL/h、10mL/h、15mL/h、20mL/h和25mL/h，经实施例4的芯片分选，观察并计算细胞捕获区捕获的细胞量，进而分析捕获效率，每组取3次结果平均后，捕获效率见图22。
试验例2，共进行3次实验，每次实验模拟样品约10毫升血液(即非目标细胞主要为血液中的白细胞和红细胞)，作为目标细胞的肝癌细胞HepG2直接加入到血液中，癌细胞浓度约每毫升100个癌细胞，实验通量为20mL/h，经实施例4的芯片分选，观察并区分捕获到的癌细胞和血细胞，计算捕获纯度，每组取3次结果平均后，捕获纯度见图23。
实验例3，共进行5组，每组3次的实验，每次实验模拟样品约10毫升血液(即非目标细胞主要为血液中的白细胞和红细胞)，作为目标细胞的肝癌细胞HepG2直接加入到血液中，癌细胞浓度约每毫升100个癌细胞，5组实验通量分别为5mL/h、10mL/h、15mL/h、20mL/h和25mL/h，经实施例4的芯片分选，并进行活性染色分析，得到捕获细胞活性的结果，每组取3次结果平均后，捕获细胞活性见图24。
从图22可以看出，本发明的集成芯片的捕获效率随着细胞液通量的增大而减小，当细胞液通量为5mL/h时，捕获率高达98％以上，当细胞液通量为20mL/h时，捕获效率仍高达90％以上。
从图23可以看出，细胞捕获区中，细胞尺寸越大的捕获区癌细胞纯度越高。
从图24可以看出，本发明的集成芯片肝癌细胞HepG2的捕获细胞活性高，在细胞液通量为5mL/h时，分离的肝癌细胞HepG2的活性高达98％。在细胞液通量为5-20mL/h时，分离的肝癌细胞HepG2的活性较为稳定，在细胞液通量为25mL/h时，分离的肝癌细胞HepG2的活性仍高达83％。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (20)

1.一种一步分离细胞的集成芯片，其特征在于：所述集成芯片包括细胞分离区；
所述细胞分离区一端设置有细胞液入口和缓冲液入口，另一端设置有出口；
待分离的细胞液经所述细胞液入口，缓冲液经所述缓冲液入口共同流入所述细胞分离区，所述细胞分离区能够使流入的细胞按尺寸大小分离开来。
2.一种一步分离和捕获细胞的集成芯片，其特征在于：所述集成芯片包括细胞分离区和细胞捕获区；
所述细胞分离区一端设置有细胞液入口和缓冲液入口，另一端设置有出口；
所述细胞捕获区一端设置有与所述细胞分离区的出口相连通的入口，另一端设置有分离液出口；
待分离的细胞液经所述细胞液入口，缓冲液经所述缓冲液入口共同流入所述细胞分离区，所述细胞分离区能够使流入的细胞按尺寸大小分离开来；按尺寸大小分离后的细胞进入所述细胞捕获区，所述细胞捕获区能够捕获目标细胞。
3.一种一步分离细胞的集成芯片，其特征在于：所述集成芯片包括细胞富集区和细胞分离区；
所述细胞富集区的一端设置有一个或多个入口，另一端设置有废液出口和富集液出口；
所述细胞分离区的一端设置有缓冲液入口和与所述细胞富集区的富集液出口相连通的富集液入口，另一端设置有出口；
待分离的细胞液从所述细胞富集区的入口流入，进入所述细胞富集区，所述细胞富集区能够提高目标细胞在细胞液中的浓度；从所述细胞富集区流出的富集液经所述富集液入口，缓冲液经所述缓冲液入口共同流入所述细胞分离区，所述细胞分离区能够使流入的细胞按尺寸大小分离开来。
4.一种一步分离和捕获细胞的集成芯片，其特征在于：所述集成芯片包括细胞富集区、细胞分离区和细胞捕获区；
所述细胞富集区的一端设置有一个或多个入口，另一端设置有废液出口和富集液出口；
所述细胞分离区的一端设置有缓冲液入口和与所述细胞富集区的富集液出口相连通的富集液入口，另一端设置有出口；
所述细胞捕获区一端设置有与所述细胞分离区的出口相连通的入口，另一端设置有分离液出口；
待分离的细胞液从所述细胞富集区的入口流入，进入所述细胞富集区，所述细胞富集区能够提高目标细胞在细胞液中的浓度；从所述细胞富集区流出的富集液经所述富集液入口，缓冲液经所述缓冲液入口共同流入所述细胞分离区，所述细胞分离区能够使流入的细胞按尺寸大小分离开来；按尺寸大小分离后的细胞进入所述细胞捕获区，所述细胞捕获区能够捕获目标细胞。
5.根据权利要求3或4所述的集成芯片，其特征在于：所述细胞富集区的一端设置的多个入口包括细胞液入口和/或缓冲液入口。
6.根据权利要求3-5中任一所述的集成芯片，其特征在于：所述细胞富集区由一组、两组或两组以上对称的DLD微柱阵列结构组成，大于所述对称的DLD微柱阵列结构的临界分选直径的细胞在流经所述细胞富集区时被富集于所述对称的DLD微柱阵列结构的中间，汇集后流入所述细胞分离区，废液从所述废液出口流出；
当所述细胞富集区由两组和两组以上对称的DLD微柱阵列结构组成时，两组相邻的所述对称的DLD微柱阵列结构由柱子隔开；
所述细胞富集区的DLD微柱为三角形、圆形、长方形、“工”字形和异形状结构中的一种。
7.根据权利要求6所述的集成芯片，其特征在于：在所述细胞富集区中，所述对称的DLD微柱阵列结构的临界分选直径在1-30微米之间。
8.根据权利要求6或7所述的集成芯片，其特征在于：在所述细胞富集区中，所述对称的DLD微柱阵列结构中的DLD微柱按0.1-30度的倾斜角向对称轴收敛；
所述细胞富集区的DLD微柱为三角形结构，三角形的一个顶点指向其所在的所述对称的DLD微柱阵列结构的对称轴，三角形的边长为1-500微米，两个相邻三角形之间的间隔为1-500微米。
9.根据权利要求1-8中任一所述的集成芯片，其特征在于：所述细胞分离区由DLD微柱阵列结构组成；
所述细胞分离区的DLD微柱为三角形、圆形、长方形、“工”字形和异形状结构中的一种；
所述细胞分离区的DLD微柱阵列结构从所述细胞分离区的入口侧至出口侧具有渐变增大的临界分选直径或具有固定不变的临界分选直径；
所述渐变增大的临界分选直径从所述细胞分离区的入口侧到出口侧的范围是1-50微米；所述固定不变的临界分选直径为1-50微米。
10.根据权利要求9所述的集成芯片，其特征在于：所述细胞分离区的DLD微柱阵列结构具有从所述细胞分离区的入口侧至出口侧渐变增大的倾斜角：从入口侧的0.1-15度，渐变增大到出口侧的0.2-30度。
11.根据权利要求2和4-10中任一所述的集成芯片，其特征在于：所述细胞捕获区包括第一区和第二区；
所述第一区由微柱捕获结构阵列组成，用于捕获目标细胞；所述微柱捕获结构为具有开口大，出口小的微柱；所述微柱捕获结构阵列中的微柱捕获结构成行错位排列；
所述第二区由非微柱捕获结构阵列组成，非目标细胞经所述第二区流出；所述非微柱捕获结构为三角形微柱、圆形微柱、长方形微柱、“工”字形微柱或异形状结构微柱中的一种；所述非微柱捕获结构阵列中的非微柱捕获结构成行对齐排列。
12.根据权利要求11所述的集成芯片，其特征在于：所述细胞捕获区中具有1个或多个所述第一区；所述细胞捕获区中具有1个或多个所述第二区。
13.根据权利要求11或12所述的集成芯片，其特征在于：在所述第一区中，所述微柱捕获结构的开口直径为15-30微米，出口直径为3-8微米；
在所述微柱捕获结构阵列中，每相邻的两个所述微柱捕获结构之间的垂直间距均为3-30微米；
在所述非微柱捕获结构阵列中，每相邻的两个所述非微柱捕获结构之间的垂直间距均为3-30微米。
14.根据权利要求1-13中任一所述的集成芯片，其特征在于：所述集成芯片由玻璃、硅和聚合物中的一种或多种制成；所述聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、硅树脂、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯环烯烃聚合物和环烯烃共聚物中的一种或多种。
15.一种一步分离和/或捕获细胞的方法，是利用权利要求1-14中任一所述的集成芯片对所述待分离的细胞液进行一步分离和/或捕获细胞，包括如下步骤：将待分离的细胞液流经所述集成芯片的所述细胞分离区。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述方法是利用权利要求4-14中任一所述的集成芯片对所述待分离的细胞液进行一步分离和/或捕获细胞，包括如下步骤：所述待分离的细胞液从所述集成芯片的所述细胞富集区的入口流入，进入所述细胞富集区，经所述对称的DLD微柱阵列结构的处理，大于临界分选直径的细胞富集于所述对称的DLD微柱阵列结构的中间，汇集后流入所述细胞分离区，废液从所述废液出口流出；从所述细胞富集区流出的富集液经所述富集液入口，缓冲液经所述缓冲液入口共同流入所述细胞分离区，经所述细胞分离区的DLD微柱阵列结构的分选，富集液中的细胞按尺寸大小实现分离；按尺寸大小分离后的细胞进入所述细胞捕获区，所述细胞捕获区中的所述第一区将目标细胞捕获；非目标细胞通过所述第二区流出，分离液从所述分离液出口流出。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于：流入所述细胞分离区的所述细胞液或所述富集液和所述缓冲液的体积比在1:(1-50)之间。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于：在所述富集区入口通入的是如下任一：
(a)所述待分离的细胞液的原液；
(b)所述待分离的细胞液的稀释液；
(c)所述待分离的细胞液的原液和缓冲液；
(d)所述待分离的细胞液的稀释液和缓冲液。
19.权利要求1-14中任一所述集成芯片在分离和/或捕获细胞中的应用。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述应用包括如下任一：
(1)分离和/或捕获外周血样品中的循环肿瘤细胞；
(2)分离和/或捕获胸腔积液、腹水积液、淋巴液、尿液或骨髓样品中的肿瘤细胞；
(3)分离和/或捕获外周血或脐带血样品中的有核红细胞；
(4)分离和/或捕获外周血样品中的循环内皮细胞；
(5)分离和/或捕获外周血、脐带血、胸腔积液、腹水积液、尿液、脑脊液或骨髓样品中的白细胞、T细胞、B细胞、淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞或造血干细胞；
(6)分离和/或捕获外周血、脐带血、胸腔积液、腹水积液、尿液或骨髓样品中的红细胞或血小板；
(7)分离和/或捕获外周血、胸腔积液、腹水积液、尿液、唾液、血浆、血清、脑脊液、精液、前列腺液或阴道分泌物样品中的细菌或病毒；
(8)分离和/或捕获精液样品中的精子。
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