CN114196521A - 一种荧光原位杂交芯片及荧光原位杂交方法 - Google Patents

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CN114196521A CN202111648945.0A CN202111648945A CN114196521A CN 114196521 A CN114196521 A CN 114196521A CN 202111648945 A CN202111648945 A CN 202111648945A CN 114196521 A CN114196521 A CN 114196521A
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Abstract

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及一种荧光原位杂交芯片及荧光原位杂交方法。包括：支撑衬底和功能结构层；功能结构层设置在支撑衬底上；功能结构层具有腔体结构；腔体结构包括分离区和捕获区；分离区中设置有确定性侧向位移阵列；捕获区与分离区通过连接通道连通；捕获区中设置有捕获阵列；功能结构层中还设置有反应试剂进样通道，反应试剂进样通道与捕获区连通。通过确定性侧向位移阵列将外周血中稀少的肿瘤细胞进行富集分离，并通过捕获阵列实现了对肿瘤细胞的捕获固定。肿瘤细胞可以在捕获区中进行荧光原位杂交，从而实现了直接在荧光原位杂交芯片上进行一体化的肿瘤细胞富集及荧光原位杂交检测，简化了检测过程，省时省力。

Description

一种荧光原位杂交芯片及荧光原位杂交方法
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及一种荧光原位杂交芯片及荧光原位杂交方法。
背景技术
恶性肿瘤是当前危害生命健康的重大疾病之一。检测转移是诊断肿瘤分期和预测生存的重要步骤。由于其大小，传统技术无法识别早期微转移或小肿瘤细胞簇。骨髓也已被用作播散性肿瘤细胞的来源。然而，与抽血不同，骨髓活检具有高度侵入性，不适合对患者的癌症进行常规和频繁的检查。液体活检等直接通过人外周血检测的方法备受关注，因为它们可以最大限度地减少检测的侵入性并能够实时观察患者。侵入性治疗提供的检测和诊断水平无法与液体活检相比。此外，循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)的分子分析有助于在实施治疗方案之前识别耐药性。
在过去的几十年里，人们开发了很多方法来实现CTCs的回收，但人们面临的主要困难是它们的丰度低。外周血中的CTCs数量极少，肿瘤转移患者每毫升全血中仅为1-10个，因此如何从几百万白细胞及几十亿红细胞中快速、特异性的、不遗漏的分选富集出CTCs成为制约CTCs成为临床肿瘤早期诊断的主要问题。
此外，检测外周血中的循环肿瘤细胞的上皮细胞粘附分子(Epithelial CellAdhesion Molecule，EpCAM)以及波形蛋白(Vimentin)的表达情况能够一定程度上反应细胞的转移潜能。因此，对于稀有的循环肿瘤细胞，若一次性能够获得蛋白表达量、RNA表达量等，则相对更丰富的结果能够对患者的治疗提供更为有效的依据。
发明内容
本发明提供一种荧光原位杂交芯片及荧光原位杂交方法，能够实现从血液样品中将肿瘤细胞富集捕获之后，并且可以在荧光原位杂交芯片中实现荧光原位杂交的检测。
为解决上述技术问题，第一方面，本申请实施例公开了一种荧光原位杂交芯片，包括：支撑衬底和功能结构层；
所述功能结构层设置在所述支撑衬底上；
所述功能结构层具有腔体结构；
所述腔体结构包括分离区和捕获区；
所述分离区中设置有确定性侧向位移阵列，所述确定性侧向位移阵列用于从待检测样品中分离出检测目标物；
所述捕获区与所述分离区通过连接通道连通；
所述捕获区中设置有捕获阵列，所述捕获阵列用于捕获所述检测目标物；
所述功能结构层中还设置有反应试剂进样通道，所述反应试剂进样通道与所述捕获区连通，所述反应试剂进样通道用于向所述捕获区内通入荧光原位杂交反应试剂。
进一步的，所述捕获阵列包括至少一列捕获微柱，相邻所述捕获微柱之间具有预设间距。
进一步的，所述捕获阵列包括第一列捕获微柱、第二列捕获微柱和第三列捕获微柱；
所述第一列捕获微柱中相邻所述捕获微柱之间具有第一预设间距，所述第一预设间距15μm-20μm；
所述第二列捕获微柱中相邻所述捕获微柱之间具有第二预设间距，所述第二预设间距10μm-15μm；
所述第三列捕获微柱中相邻所述捕获微柱之间具有第三预设间距，所述第三预设间距5μm-10μm。
进一步的，所述荧光原位杂交芯片还包括第一微控制阀和第二微控制阀；
所述第一微控制阀用于控制所述连接通道的开启与关闭；
所述第二微控制阀用于控制所述反应试剂进样通道的开启与关闭。
进一步的，所述第一微控制阀和所述第二微控制阀均为气动式微控制阀；
所述第一微控制阀包括第一气动薄膜，所述第一气动薄膜用于在气体压力下阻塞或释放所述连接通道；
所述第二微控制阀包括第二气动薄膜，所述第二气动薄膜用于在气体压力下阻塞或释放所述反应试剂进样通道。
进一步的，所述荧光原位杂交芯片还包括样品进入通道和压力平衡通道；
所述样品进入通道与所述分离区连通，所述样品进入通道用于使所述待检测样品进入所述分离区；
所述压力平衡通道用于平衡所述待检测样品进入所述分离区前的压力，以使所述待检测样品保持聚合状态。
进一步的，所述荧光原位杂交芯片还包括分离液出样通道和废液出样通道；
所述分离液出样通道与所述分离区连通，所述分离液出样通道用于排出分离出所述检测目标物后的所述待检测样品；
所述废液出样通道与所述捕获区连通，所述废液出样通道用于排出荧光原位杂交过程中产生的废液。
进一步的，所述功能结构层的材质为聚二甲基硅氧烷。
进一步的，所述腔体结构的尺寸为50μm-100μm。
第二方面，本申请实施例公开了一种荧光原位杂交方法，所述方法应用于如上所述的荧光原位杂交芯片；所述方法包括：
将待检测样品在分离区通过确定性侧向位移阵列进行分离得到含有检测目标物的分离样品；
将所述分离样品通过连接通道进入捕获区通过捕获阵列进行捕获；
打开反应试剂进样通道，通过所述反应试剂进样通道向所述捕获区中通入反应试剂；
对通入反应试剂后的所述荧光原位杂交芯片进行处理得到荧光原位杂交结果。
采用上述技术方案，本申请实施例所述的荧光原位杂交芯片及荧光原位杂交方法具有如下有益效果：
该荧光原位杂交芯片，通过确定性侧向位移阵列将外周血中稀少的肿瘤细胞进行富集分离，并通过捕获阵列实现了对肿瘤细胞的捕获固定。捕获固定后的肿瘤细胞可以在捕获区中进行荧光原位杂交，从而实现了直接在荧光原位杂交芯片上进行一体化的肿瘤细胞富集及荧光原位杂交检测，简化了检测过程，省时省力。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的一种荧光原位杂交芯片的结构示意图；
图2为本申请实施例提供的一种功能结构层的结构示意图；
图3为本申请实施例提供的一种确定性侧向位移阵列的结构示意图；
图4为本申请实施例提供的一种待检测样品在确定性侧向位移阵列中运动示意图；
图5为本申请实施例提供的一种捕获阵列阵列的结构示意图；
图6为本申请实施例提供的一种气动式微控制阀控制通道开启的结构示意图；
图7为本申请实施例提供的一种气动式微控制阀控制通道开启的结构示意图；
图8为本申请实施例提供的另一种荧光原位杂交芯片的结构示意图；
图9为本申请实施例提供的一种荧光原位杂交方法的流程示意图；
图10为本申请实施例提供的一种荧光原位杂交结果示意图。
以下对附图作补充说明：
1-支撑衬底；2-功能结构层；201-连接通道；202-反应试剂进样通道；203-样品进入通道；204-压力平衡通道；205-分离液出样通道；206-废液出样通道；210-分离区；211-确定性侧向位移阵列；220-捕获区；221-捕获阵列；230-第一微控制阀；231-第一气动薄膜；240-第二微控制阀；3-薄膜层。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本申请至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本申请的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含的包括一个或者更多个该特征。而且，术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)使整个细胞或组织切片中特定核酸序列的可视化成为可能。它基于荧光标记探针之间的分子识别，这些探针穿透固定但完整样品的细胞膜并与细胞内的靶核酸序列杂交以提供可测量的信号。FISH已用于例如基因定位、复杂遗传样品中染色体畸变的诊断和病原体鉴定以及细胞结构和功能的详细研究。这对于确定新的抗癌药物靶点具有重要意义。
目前大多FISH的研究都停留在使用微流控装置通过微腔和常闭阀门等微结构实现反应试剂的加载以及去除，能够统一化操作流程以及减少试剂用量，另一方面有望实现全自动化的反应以及检测程序。但是对于稀少的细胞样品如外周血中的循环肿瘤细胞，这些设备并不友好。一方面，大多数研究都是针对于组织切片进行荧光原位杂交的检测，其不兼容少量的细胞样品的检测。另一方面，循环肿瘤细胞数量非常稀少，需要结合其他的技术实现分离以实现下游的荧光原位检测。但是得到了稀少的目标细胞样品之后，后端的操作如细胞的导出以及细胞的固定是一个问题，极易产生细胞的丢失以及漏检。同时通过加热，烤片实现对这些细胞的固定没有相关文献的报道，证明该方法对于稀少细胞样品的检测是否有效，同时具体的损失率大概是多少，因此亟需一种方法能够自上而下实现对外周血中的循环肿瘤细胞的富集，固定以及荧光原位杂交的实际反应以及检测，同时该方法是集成的，能够实现细胞的原位检测，进一步的减少操作人员的操作步骤以及细胞的损失和试剂的消耗。
有鉴于此，本申请实施例提供了一种荧光原位杂交芯片，实现了直接在荧光原位杂交芯片上进行一体化的肿瘤细胞富集及荧光原位杂交检测。图1为本申请实施例提供的一种荧光原位杂交芯片的结构示意图，如图1所示，该荧光原位杂交芯片包括：支撑衬底1和功能结构层2。
本申请实施例中，支撑衬底1用于支撑功能结构层2。可选的，支撑衬底1的材质可以为无机材料，如玻璃片。支撑衬底1也可以为有机高分子材质制成薄片，如聚乙烯PE、聚丙烯PP、聚碳酸酯PC、聚对苯二甲酸乙二醇酯PET、聚苯乙烯PS、聚二甲基丙烯酸甲酯PMMA、丙烯腈-丁二烯-聚乙烯共聚合物ABS等。
本申请实施例中，功能结构层2设置在支撑衬底1上。图2为本申请实施例提供的一种功能结构层2的结构示意图，如图2所示，功能结构层2具有腔体结构。腔体结构在高度方向上的尺寸为50μm-100μm。腔体结构包括分离区210和捕获区220。分离区210中设置有确定性侧向位移(Deterministic lateral displacement，DLD)阵列，确定性侧向位移阵列211用于从待检测样品中分离出检测目标物。确定性侧向位移阵列211包括多组周期性分布的分离微柱。每组分离微柱可以包括一列至多列分离微柱。每列分离微柱包括多个分离微柱。可选的，分离微柱的形状可以是圆柱形、棱柱形或其他不规则形状。优选的，分离微柱为三棱柱性微柱，即微柱的截面为三角形，能够实现对待检测样品的高效分离。可选的，每个分离微柱的尺寸相同，分离微柱的尺寸为10μm-100μm。当一组分离微柱中包括多列分离微柱时，分离微柱在该组内可以是正方形分布，即相邻分离微柱之间的行间距与列间距相等。确定性侧向位移阵列211能够从待检测样品中筛选出检测目标物。检测目标物可以是细胞、外泌体、大颗粒生物分子团等，例如，癌细胞等。确定性侧向位移阵列211所能够筛选的检测目标物尺寸根据每一列中相邻微柱之间的间距以及相邻组的分离微柱之间的错位角确定。图3为本申请实施例提供的一种确定性侧向位移阵列211的结构示意图，如图3所示，每组分离微柱包括一列分离微柱。在一列分离微柱中，相邻两个分离微柱的间距为G，前一组的一个分离微柱m与其相邻组中的两个相邻微柱之间具有排列方向角θ，相邻组中的这两个相邻微柱是与微柱m位置最接近的两个微柱，该角度θ决定了阵列的排列方向。通过合理的设计阵列的尺寸、间距G以及阵列排列方向能够实现对不同尺寸待检测样品的有效分选。其中的关键参数是关键尺寸Dc，确定性侧向位移阵列211能够将大于Dc以及小于Dc尺寸的颗粒成功的进行分离，其经验公式如下：
Dc＝1.4Gε0.48
其中，G为垂直于流体流动方向相邻两个分离微柱的间距，ε＝tanθ。图4为本申请实施例提供的一种待检测样品在确定性侧向位移阵列211中运动示意图，如图4所示，大于Dc的颗粒会沿着阵列不停的运动，以Displacement的运动轨迹进行运动，而小于Dc的颗粒则会在这列中不断的穿梭，以“之”字形的运动轨迹进行运动。最终实现对检测目标物的分离。
作为一种可选的实施方式，待检测样品为外周血细胞样品，检测目标物为癌细胞。根据癌细胞与白细胞的尺寸确定Dc，并设计排列方向角θ为2.86°，计算得到相邻两个分离微柱的间距为G为25μm。重复周期是20列，即每组分离微柱包括20列分离微柱，每列分离微柱包括20个分离微柱。组的重复周期为20组，因此，该确定性侧向位移阵列211包括20*20，即400列的分离微柱。大尺寸细胞在该确定性侧向位移阵列211中每运动20列会向下运动一行的距离。经过该确定性侧向位移阵列211对外周血细胞样品进行筛选，最终癌细胞会进入到癌细胞收集通道，而白细胞会进入到白细胞出样口。
本申请实施例中，如图2所示，捕获区220与分离区210通过连接通道201连通。经过分离区210分离出的检测目标物经过连接通道201进入捕获区220进行进一步的筛选富集。捕获区220中设置有捕获阵列221，捕获阵列221用于捕获检测目标物。捕获阵列221包括至少一列捕获微柱，相邻捕获微柱之间具有预设间距。图5为本申请实施例提供的一种捕获阵列221阵列的结构示意图，如图5所示，捕获阵列221中包括多列捕获微柱，不同列中的捕获微柱之间具有不同的间隙尺寸。总的来说，列中相邻捕获微柱之间的间隙尺寸由大逐渐变小。作为一种可选的实施方式，捕获阵列221包括第一列捕获微柱、第二列捕获微柱和第三列捕获微柱。第一列捕获微柱中相邻捕获微柱之间具有第一预设间距，第一预设间距L1为15μm-20μm。第二列捕获微柱中相邻捕获微柱之间具有第二预设间距，第二预设间距L2为10μm-15μm。第三列捕获微柱中相邻捕获微柱之间具有第三预设间距，第三预设间距L3为5μm-10μm。
在实际应用中，在荧光原位杂交芯片对外周血细胞样品中的癌细胞进行检测时，由于癌细胞之间存在异质性，其的尺寸也并不是唯一的，为了尽可能的减少癌细胞的损失以及实现单个细胞的捕获和排列，可以在捕获区220中设置三种不同间隙尺寸的捕获阵列221，可选的，不同列微柱之间的间隙尺寸依次为16微米，12微米以及8微米。从而能够尽可能的实现对血细胞的细筛以及捕获，方便下游的荧光原位杂交的检测。
本申请实施例中，如图2所示，功能结构层2中还设置有反应试剂进样通道202，反应试剂进样通道202与捕获区220连通，反应试剂进样通道202用于向捕获区220内通入荧光原位杂交反应试剂。
本申请实施例中，如图2所示，荧光原位杂交芯片还包括第一微控制阀230和第二微控制阀240。第一微控制阀230用于控制连接通道201的开启与关闭。第二微控制阀240用于控制反应试剂进样通道202的开启与关闭。作为一种可选的实施方式，第一微控制阀230和第二微控制阀240均为气动式微控制阀。第一微控制阀230包括第一气动薄膜231，第一气动薄膜231用于在气体压力下阻塞或释放连接通道201。第二微控制阀240包括第二气动薄膜，第二气动薄膜用于在气体压力下阻塞或释放反应试剂进样通道202。图6为本申请实施例提供的一种气动式微控制阀控制通道开启的结构示意图，如图6所示，气动式微控制阀包括气动薄膜和气动薄膜下方的空气腔。气动薄膜设置在通道的下方，且与通道具有干涉重叠区域。正常状态下，在不施加气动压力时，气动薄膜处于自然状态，通道未被阻塞，处于畅通状态，检测目标物或试剂可以通过通道。图7为本申请实施例提供的一种气动式微控制阀控制通道开启的结构示意图，如图7所示，在通道需要关闭时，通过向空气腔中施加气体压力，将气动薄膜压入通道内，通道被气动薄膜贴附，处于阻塞状态。
在一些可选的实施例中，图8为本申请实施例提供的另一种荧光原位杂交芯片的结构示意图，如图8所示，该应该原位检测荧光原位杂交芯片可以是三层结构，下方为支撑衬底1，支撑衬底1的上方设置有一层薄膜层3，可选的，该薄膜层3的厚度为10-100μm，优选为50μm。薄膜层3的上方为具有容腔且底部敞口的功能结构层2。功能结构层2的容腔与薄膜层3连接在一起形成密封的腔体结构。在连接通道201和反应试剂进样通道202处，薄膜层3的下方设置有空气腔结构，在连接通道201或反应试剂进样通道202需要关闭时，通过向空气腔中施加气体压力，如通过进样泵施加压力，那么会将两个通道交叉处的薄膜层3顶起，然后堵住上层的通道，使通道处于阻塞状态，从而实现连接通道201或反应试剂进样通道202开启与关闭。在一些实施例中，功能结构层2的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。通过在设计好的模具上浇筑聚二甲基硅氧烷，经过倒模得到功能结构层2。在另一些实施例中，薄膜层3的材质也为聚二甲基硅氧烷，同样经过倒模得到。然后将薄膜通过粘接、键合等方式连接到支撑衬底1上，然后将功能结构层2与薄膜层3通过等离子体键合的方式连接在一起。
在一些可选的实施例中，如图2所示，荧光原位杂交芯片还包括样品进入通道203和压力平衡通道204。样品进入通道203与分离区210连通，样品进入通道203用于使待检测样品进入分离区210。压力平衡通道204用于平衡待检测样品进入分离区210前的压力，以使待检测样品保持聚合状态。
在一些可选的实施例中，如图2所示，荧光原位杂交芯片还包括分离液出样通道205和废液出样通道206。分离液出样通道205与分离区210连通，分离液出样通道205用于排出分离出检测目标物后的待检测样品。废液出样通道206与捕获区220连通，废液出样通道206用于排出荧光原位杂交过程中产生的废液。
本申请实施例所述的荧光原位杂交芯片，通过确定性侧向位移阵列211将外周血中稀少的肿瘤细胞进行富集分离，并通过捕获阵列221实现了对肿瘤细胞的捕获固定。捕获固定后的肿瘤细胞可以在捕获区220中进行荧光原位杂交，从而实现了直接在荧光原位杂交芯片上进行一体化的肿瘤细胞富集及荧光原位杂交检测，简化了检测过程，省时省力。
本申请实施例还提供了一种荧光原位杂交方法，该方法应用于如上所述的荧光原位杂交芯片。该荧光原位杂交芯片的上层为PDMS功能结构层2，功能结构层2中的微腔高度为60微米，功能结构层2的下端键合有包含气动结构的PDMS薄膜，以实现功能结构层2中通道的开合与关闭。待检测样品经过功能结构层2中的分离区210的分离以及捕获区220捕获后，检测目标物固定在捕获阵列221上。在固定完毕之后，可以关闭连接通道201，使捕获区220与分离区210断开，打开反应试剂进样通道202，此时捕获区220构成了荧光原位检测的反应测试腔，通过陆续通入荧光原位杂交反应试剂进行相应的荧光原位杂交检测程序。
图9为本申请实施例提供的一种荧光原位杂交方法的流程示意图，如图9所示，方法包括：
S901：将待检测样品在分离区210通过确定性侧向位移阵列211进行分离得到含有检测目标物的分离样品。
本申请实施例中，将待检测样品加入样品进入通道203。同时，为了保证待检测样品中不同尺寸的分离物在进入分离区210时处于同一水平线上，即保证待检测样品在进入分离区210前不分散，可以同时在压力平衡通道204中加入压力平衡液，通过调整待检测样品的加入压力以及压力平衡液的加入压力，使待检测样品在进入分离区210前不分散。本申请实施例中，将检测外周血中的癌细胞为例，对本申请的荧光原位杂交方法进行详细阐述，其他类型的待检测样品的具体检测过程请参考检测外周血中的癌细胞的方法，文中不再赘述。
本申请实施例中，将外周血细胞样品加载到样品进样口，样品进样口为样品进入通道203与外界的连通口。同时将带有红色色素的PBS缓冲液加载到平衡液进样口，平衡液进样口为压力平衡通道204与外界的连通口。在两个进样口加上正压，通过调整压力比例，使得外周血细胞样品和PBS缓冲液处于平衡状态且外周血细胞样品在分离区210前不分散。样品进样口将外周血细胞样品输送到分离区210中进行细胞分离。然而由于这种方式是通过不同的运动轨迹将不同尺寸的颗粒进行分离的，较大尺寸的颗粒偏离的位移较大。在外周血细胞样品进入样品通道时，不同细胞的纵向的位移是不一样的，但是假如样品不是水平加样到荧光原位杂交芯片内部并进行运动的话，在纵向上会有一定的流体偏移分量，因此会导致细胞分离的偏差。因此需要设定一个相同的“起跑线”，让外周血细胞样品中所有的细胞在同一个位置开始运动。所以可以在平衡液进样口中加入平衡液，去挤压样品流体，不让它产生纵向的偏移，从而将这些细胞全都从同一个横向位置通入到分离区210中的确定性侧向位移阵列211中去。在此过程中，需要将这外周血细胞样品和PBS缓冲液的压力调到一定的比例，从而实现两种液体是相互平行的，外周血细胞样品的流体不会在纵向上产生流动的分量。
本申请实施例中，对进样口的加压方式可以是通过微流体进样泵进行的，该设备的优势是可以即时开始以及停止，因此可以得到较为稳定的压力值。对于任意宽度的样品进入通道203和压力平衡通道204，在检测前可以通过通入墨水试验来确定对两个通道所施加压力的比值。此外，也可以根据流体阻力公式1以及阻力压力和流体通量的关系式2来计算通道的流体阻力以及压力。
Figure BDA0003445998730000121
P＝R*Q 公式(2)
本申请实施例中，根据腔体结构的高度、两个通道的宽度以及长度，可以得到两者的压力比值。
本申请实施例中，外周血细胞样品进入分离区210后，经过确定性侧向位移阵列211后，可以将外周血细胞样品中的白细胞和癌细胞分离开。
S903：将分离样品通过连接通道201进入捕获区220通过捕获阵列221进行捕获。
本申请实施例中，外周血细胞样品中的白细胞和癌细胞分离开后，白细胞进入分离液出样通道205，进而排出荧光原位杂交芯片。分离出白细胞后的外周血细胞样品经过连接通道201进入捕获区220进行进一步的富集筛选。可选的，在分离出白细胞后的外周血细胞样品即分离样品进入捕获区220后，通过微控制阀将连接通道201关闭，将分离区210与捕获区220断开连接，以方便后续的检测。分离样品在捕获区220经过捕获阵列221的富集捕获，进一步去除分离样品中的其他杂质细胞或分子颗粒。
本申请实施例中，癌细胞被捕获阵列221所捕获，其他物质进入废液出样通道206。
S905：打开反应试剂进样通道202，通过反应试剂进样通道202向捕获区220中通入反应试剂。
本申请实施例中，在癌细胞被捕获阵列221固定之后，通过控制微控制阀保持反应试剂进样通道202开启，然后通过反应试剂进样通道202向捕获区220中通入反应试剂。
本申请实施例中，通过反应试剂进样通道202向捕获区220中通入胃蛋白酶溶液，在37℃温度下消化细胞约3分钟。然后再通过反应试剂进样通道202向捕获区220中通入PBS溶液冲洗5分钟，将多余的胃蛋白酶溶液洗去。
S907：对通入反应试剂后的荧光原位杂交芯片进行处理得到荧光原位杂交结果。
本申请实施例中，对通入反应试剂后的荧光原位杂交芯片进行处理，进而得到荧光原位杂交结果。具体的，首先，通过反应试剂进样通道202向捕获区220中分别加入0.5μlanti-CK、1μl anti-CD45，在37±1℃对癌细胞染色约30分钟。标记有荧光的anti-CK抗体能够特异性的与癌细胞内膜相结合从而进行标记。而标记有荧光的anti-CD45可以与正常白细胞的外膜向结合从而实现标记。从而能够进一步区分细胞种类，方便后续荧光原位杂交结果的统计。然后通过反应试剂进样通道202向捕获区220中加入PBS缓冲液对标记后的癌细胞清洗10分钟，以洗去多余的未结合的抗体。在荧光原位杂交检测中，细胞中的水分会影响与探针的结合，因此，可以通过反应试剂进样通道202向捕获区220中加入乙醇对癌细胞进行洗脱。具体的分别用70％、85％、100％乙醇对癌细胞轻轻脱水3分钟。由于荧光原位杂交芯片中酒精挥发的速度会比敞开的状态下慢，真空条件下能够帮助乙醇的挥发。因此，在对癌细胞进行洗脱之后，将荧光原位杂交芯片在真空干燥机中干燥荧光原位杂交芯片十分钟左右，以加快在荧光原位杂交芯片中乙醇的挥发和去除。之后通过真空干燥机产生的负压将含有荧光原位杂交探针的杂交液吸入荧光原位杂交芯片，直到荧光原位杂交芯片中的捕获区220充满试剂。然后，将荧光原位杂交芯片放入湿盒中，放入分子杂交仪中过夜杂交。湿盒在较高温度杂交的情况下能够提供一定的湿度，防止荧光原位杂交芯片中杂交液的蒸干情况的发生。当杂交完成后，将荧光原位杂交芯片置于73℃的热板上，洗去未与目的基因杂交的多余探针。此过程中，使用洗脱液将杂交过程中多余的、没有杂交上的或者非特异结合的探针洗去。然后，通过反应试剂进样通道202向捕获区220中通入去离子水以冲洗腔体，然后将荧光原位杂交芯片放入真空干燥器中十分钟，然后通过DAPI进行复染。最后在100X荧光显微镜下观察荧光原位杂交结果。图10为本申请实施例提供的一种荧光原位杂交结果示意图，如图10所示，固定在捕获阵列221上的HBE细胞的荧光原位杂交结果，CEP7以及EGFR的数目基本都维持在两个，与常规检测结果相一致。
本申请实施例所述的荧光原位杂交方法，基于荧光原位杂交芯片，可以实现对外周血中癌细胞的富集、固定及检测，同时简化了荧光原位杂交操作流程。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光原位杂交芯片，其特征在于，包括：支撑衬底(1)和功能结构层(2)；
所述功能结构层(2)设置在所述支撑衬底(1)上；
所述功能结构层(2)具有腔体结构；
所述腔体结构包括分离区(210)和捕获区(220)；
所述分离区(210)中设置有确定性侧向位移阵列(211)，所述确定性侧向位移阵列(211)用于从待检测样品中分离出检测目标物；
所述捕获区(220)与所述分离区(210)通过连接通道(201)连通；
所述捕获区(220)中设置有捕获阵列(221)，所述捕获阵列(221)用于捕获所述检测目标物；
所述功能结构层(2)中还设置有反应试剂进样通道(202)，所述反应试剂进样通道(202)与所述捕获区(220)连通，所述反应试剂进样通道(202)用于向所述捕获区(220)内通入荧光原位杂交反应试剂。
2.根据权利要求1所述的荧光原位杂交芯片，其特征在于，所述捕获阵列(221)包括至少一列捕获微柱，相邻所述捕获微柱之间具有预设间距。
3.根据权利要求2所述的荧光原位杂交芯片，其特征在于，所述捕获阵列(221)包括第一列捕获微柱、第二列捕获微柱和第三列捕获微柱；
所述第一列捕获微柱中相邻所述捕获微柱之间具有第一预设间距，所述第一预设间距15μm-20μm；
所述第二列捕获微柱中相邻所述捕获微柱之间具有第二预设间距，所述第二预设间距10μm-15μm；
所述第三列捕获微柱中相邻所述捕获微柱之间具有第三预设间距，所述第三预设间距5μm-10μm。
4.根据权利要求1所述的荧光原位杂交芯片，其特征在于，所述荧光原位杂交芯片还包括第一微控制阀(230)和第二微控制阀(240)；
所述第一微控制阀(230)用于控制所述连接通道(201)的开启与关闭；
所述第二微控制阀(240)用于控制所述反应试剂进样通道(202)的开启与关闭。
5.根据权利要求4所述的荧光原位杂交芯片，其特征在于，所述第一微控制阀(230)和所述第二微控制阀(240)均为气动式微控制阀；
所述第一微控制阀(230)包括第一气动薄膜(231)，所述第一气动薄膜(231)用于在气体压力下阻塞或释放所述连接通道(201)；
所述第二微控制阀(240)包括第二气动薄膜，所述第二气动薄膜用于在气体压力下阻塞或释放所述反应试剂进样通道(202)。
6.根据权利要求1所述的荧光原位杂交芯片，其特征在于，所述荧光原位杂交芯片还包括样品进入通道(203)和压力平衡通道(204)；
所述样品进入通道(203)与所述分离区(210)连通，所述样品进入通道(203)用于使所述待检测样品进入所述分离区(210)；
所述压力平衡通道(204)用于平衡所述待检测样品进入所述分离区(210)前的压力，以使所述待检测样品保持聚合状态。
7.根据权利要求1-6任一项所述的荧光原位杂交芯片，其特征在于，所述荧光原位杂交芯片还包括分离液出样通道(205)和废液出样通道(206)；
所述分离液出样通道(205)与所述分离区(210)连通，所述分离液出样通道(205)用于排出分离出所述检测目标物后的所述待检测样品；
所述废液出样通道(206)与所述捕获区(220)连通，所述废液出样通道(206)用于排出荧光原位杂交过程中产生的废液。
8.根据权利要求7所述的荧光原位杂交芯片，其特征在于，所述功能结构层(2)的材质为聚二甲基硅氧烷。
9.根据权利要求8所述的荧光原位杂交芯片，其特征在于，所述腔体结构的尺寸为50μm-100μm。
10.一种荧光原位杂交方法，其特征在于，所述方法应用于如权利要求1-9中任一项所述的荧光原位杂交芯片；所述方法包括：
将待检测样品在分离区(210)通过确定性侧向位移阵列(211)进行分离得到含有检测目标物的分离样品；
将所述分离样品通过连接通道(201)进入捕获区(220)通过捕获阵列(221)进行捕获；
打开反应试剂进样通道(202)，通过所述反应试剂进样通道(202)向所述捕获区(220)中通入反应试剂；
对通入反应试剂后的所述荧光原位杂交芯片进行处理得到荧光原位杂交结果。
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