KR101281107B1 - 칩 기반의 다중 면역반응 검사장치 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다중 면역반응 검사장치에 대한 것으로 하나의 조직샘플에 다수의 반응부를 마련하고 항체가 포함된 유체가 흐르면서 반응이 일어나도록 하여 여러 종류의 면역반응 검사를 한 번의 검사과정을 통해 용이하게 실시할 수 있는 다중 면역반응 검사장치에 대한 것이다.

본 발명에 따른 다중 면역반응 검사장치는 면역검사를 위한 항체가 주입되는 적어도 두개 이상의 항체 주입부; 상기 주입된 항체가 면역검사를 위해 마련된 샘플과 반응이 일어나는 적어도 두개 이상의 반응부; 상기 반응부와 연결되어 상기 항체를 포함하는 유체가 배출되는 적어도 두개 이상의 유체 배출구를 포함한다.

위와 같이 구성된 본 발명에 따른 다중 면역반응 검사장치는 값비싼 항체의 소모를 기존방식에 비해 수십배 이상 줄일 수 있어 비용 절감을 기대할 수 있고, 하나의 조직절편 시료로 다양한 표지자 검색을 통해 면역조직화학법이 가지는 절편제작의 낮은 수율 문제를 극복함과 동시에 암환자의 여러 조직상태 정보의 확보로, 정확한 진단을 통한 최적의 약물 및 분자요법을 시행할 수 있다. 또한, 여러 표지자 검색을 통해 환자의 예후를 미리 예측할 수 있다는 큰 장점이 있으므로 의료기술의 발전에 큰 도움이 될 수 있다. 뿐만 아니라, 신속한 진단결과의 제공으로 시간적 여유가 없는 암 환자들에게 빠른 임상적용을 가능하게 할 수 있으며, 비용적 절감으로 환자에게 부담을 줄일 수 있는 효과가 있다.

시약, 항체, 유체 배출구, 전열기판, 압착부, 조직샘플, 면역조직화학법, 채널, 면역 반응

Description

칩 기반의 다중 면역반응 검사장치 및 방법{Apparatus and method for multiple immunoassays on a chip}

본 발명은 세포와 조직을 포함한 바이오 샘플에 대해서 면역조직화학 (immunohistochemistry)과 형광접합보인법 (Fluorescence in situ hybridizatio)을 포함하는 여러 가지의 면역반응을 검사하는 장치에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 오랜 시간과 많은 노동력이 필요한 생물실험을 칩 위에서 편리하게 구현할 수 있는 랩온어칩(Lab-on-a-chip)기술을 접목하여 효소, 종양 표지자 및 예후 인자의 존재유무, 그리고 암종과 육종의 구별 및 양성종양과 악성종양의 검별 등에 효율적으로 이용될 수 있는 면역반응 검사장치에 대한 것이다.

질병의 정확한 진단과 적절한 치료 그리고 이에 대한 연구를 위해서는 환자의 병소에서 채취한 검체물의 형태학적 소견을 관찰하는 것이 중요하다. 그 중에서, 면역조직화학적 염색은 조직검사에서 민감성과 특이성이 매우 높은 검사방법으로서 진단 및 연구 분야에 광범위하게 이용되고 있다.

최근 20 년간 이 분야는 많은 발전을 이루어 결과의 판독을 신속히 할 수 있는 염색방법이 소개 되었으며, 파라핀 절편의 이용으로 후향적 연구가 가능하게 되었고, 항원의 검출을 위한 항체의 개발이 계속되어 수천가지 이상의 항체가 언제든지 실험에 이용할 수 있게 되었다.

이런 많은 장점을 가진 면역조직화학은 환자의 상태를 진단할 수 있는 기본적이고 좋은 방법이지만, 암 환자에게 있어서 정확한 진단을 통한 각 환자에게 적절한 약물 및 분자요법을 시행하기 위해서는 여러 표지자에 대한 검사를 수반해야 한다. 그러나, 한정된 환자의 조직 샘플과 조직샘플에서 절편제작 과정의 낮은 수율, 환자에게 부과되는 비용적, 시간적 문제 등으로 말미암아 여러 표지자에 대한 검사를 임상적으로 진행하지 못하고 있는 실정이다.

본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 다중 미세유체채널이 겸비된 장치를 조직절편 시료 위에 결합하고, 면역조직화학법(immunohistochemistry)에 필요한 유체의 주입, 반응 및 검사를 칩 상에서 채널을 통하여 구현하여 단일 조직절편의 시료만으로 다양한 표지자에 대한 검사를 실현할 수 있는 칩 기반의 다중 면역 반응 검사장치 및 검사방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 다중 면역반응 검사장치는 면역검사를 위한 항체가 주입되는 적어도 두개 이상의 항체 주입부; 상기 주입된 항체가 면역검사를 위해 마련된 샘플과 반응이 일어나는 적어도 두개 이상의 반응부; 상기 반응부와 연결되어 상기 항체를 포함하는 유체가 배출되는 적어도 두개 이상의 유체 배출구를 포함한다.

또한, 상기 각 주입부, 반응부 및 유체 배출구는 채널을 통해 상호 연결된다.

또한, 상기 채널에 연결되고, 상기 채널 내에서 유체의 유속을 조절하기 위한 압력을 제공하는 압력 제공부를 더 포함한다.

또한, 상기 압력 제공부는 공압 및 유압기반 장치인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 유체의 흐름을 조절하는 유체 조절부를 더 포함하고, 상기 유체 조절부는 상기 각 주입부, 반응부 및 유체 배출구들이 연결되는 채널에 존재하여 유체 흐름을 조절한다.

또한, 상기 다중 면역반응 검사장치 하부에 위치하여 반응이 원활히 일어나도록 온도 조절을 할 수 있는 전열기판을 더 포함한다.

또한, 상기 반응부는 상기 항체 주입구의 개수만큼 마련된다.

또한, 상기 다중 면역반응 검사장치의 상부에 유체의 증발을 막기 우한 투명 재질의 덮개를 더 포함한다.

또한, 면역검사를 위한 시약이 주입되는 적어도 두개 이상의 시약 주입부를 더 포함한다.

또한, 상기 반응부를 압착하여 항체 및 시약과 샘플의 반응이 원활히 일어나도록 압착부를 더 포함한다.

또한, 상기 압착부는 볼트 너트의 조임 방식, 스프링 눌림 방식, 무게추 방식을 포함하는 압착장치로 상기 반응부를 압착하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 반응부는 상기 샘플 상에 지그재그의 형태로 마련되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 주입된 항체 및 시약은 상기 반응부상을 흐르면서 상기 샘플과 반응한다.

또한, 상기 다중 면역반응 검사장치에 마련된 샘플은 조직시료 및 세포인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 항체 주입부, 시약주입부, 반응부 및 유체배출구를 포함하는 다중 면역반응 검사장치는 칩상에 마련되는 랩온어칩의 형태로 이루어진다.

또한, 상기 반응부의 너비는 3cm 이하 인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기한 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 다중 면역반응 검사방법은 적어도 두개 이상의 항체를 항체 주입부에 주입하는 단계; 상기 항체가 포함된 유체가 반응부로 이동하도록 압력을 제공하는 단계; 상기 이동한 항체가 조직절편 시료를 포함하는 샘플과 다양한 표지자 검색이 가능하도록 상기 샘플에 다수의 항체들이 결합하여 반응하는 단계; 상기 반응부에 연결된 유체 배출구를 통해 상기 유체가 배출되는 단계를 포함한다.

또한, 상기 항체를 주입하는 단계에는 면역검사를 위한 시약을 시약 주입부에 주입하는 단계를 더 포함한다.

또한, 상기 항체가 반응부로 이동하도록 압력 제공한 후 상기 샘플에 상기 항체 및 시약이 포함된 유체의 흐름을 조절하는 단계를 더 포함한다.

또한, 상기 압력 제공 단계에서 압력은 공압 및 유압기반 장치를 이용하여 제공하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 반응 단계에서 반응이 원활히 일어나도록 상기 반응부를 압착하는 단계는 더 포함한다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 상기와 같이 구성되는 본 발명에 따른 다중 면역반응 검사장치 및 검사방법은 값비싼 항체의 소모를 기존방식에 비해 수 십배 이상 줄일 수 있어 비용적 절감을 기대할 수 있는 효과가 있다.

또한, 하나의 조직절편 시료로 다양한 표지자 검색을 통해 면역조직화학법이 가지는 절편제작의 낮은 수율 문제를 극복함과 동시에 암 환자의 여러 조직상태 정보의 확보로, 정확한 진단을 통한 최적의 약물 및 분자요법을 시행할 수 있는 효과가 있다.

또한, 환자의 예후를 더욱 정확히 예측할 수 있어 치료법 선정에 큰 도움을 줄 수 있으며, 엄청난 시간적 절약이 기대되어 시간적 여유가 없는 암 환자들에게 빠른 임상적용을 가능하게 할 수 있으며 비용적 절감으로 환자에게 부담을 줄 일 수 있는 효과가 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구체적인 내용 및 실시예를 설명하면 다음과 같다.

도 1a, 1b는 본 발명에 따른 제1 실시예에 따른 다중 면역반응 검사장치의 구조도 및 단면도를 나타내는 도면으로 본 발명에 따른 제1 실시예는 적어도 두개 이상의 항체 주입부, 적어도 두개 이상의 반응부, 적어도 두개 이상의 유체 배출구를 포함하여 이루어진다.

먼저, 다중 면역 반응 검사장치의 동작과 기능에 대해 첨부된 도면과 함께 설명한다.

본 발명으로 형광접합보인법(Fluorescence in situ hybridization) 등 다양한 생물학 실험을 구현 할 수 있지만, 대표적인 실시예로 면역조직화학법의 구현을 예로 들어 설명한다. 도 1에 도시한 바와 같이 면역조직화학에 필요한 제 1 항체 (primary antibody)를 포함하는 항체를 주입하는 항체 주입부가 제1항체 주입부(111)에서 제8항체 주입부(118)까지 있다. 먼저 면역조직화학 방법에서 제 1 항체를 반응시키기 전까지의 과정은 기존의 방식대로 수행해도 무관하다.

채널을 통해 반응부와 연결되어 있는 항체 주입부는 반응부의 채널 개수만큼 존재하게 된다. 각각의 항체 주입부에는 항체의 흐름을 조절하기 위해 유체 조절부 를 더 포함할 수 있는데 개폐도의 조절을 통해 유체의 흐름을 조절하는 유체 조절부를 예로 들 수 있다. 유체 조절부와 항체 주입부는 필요에 따라 원하는 만큼 증가 및 감소 될 수 있는데 본 실시예에서는 8개의 항체 주입부가 마련되어 있다. 상기 항체 주입부에 주입되는 유체는 면역조직화학법에서 사용되는 항체인 것을 특징으로 하는데 본 실시예 1에서는 8가지의 반응부 채널이 있기 때문에 항체 주입부 또한 제1항체 주입부(111)에서 제8항체 주입부(118)까지 존재한다.

또한, 상기 채널에 연결되어, 상기 채널 내에서 유체의 유속을 조절하기 위해 압력을 제공하는 압력 제공부를 더 포함할 수 있다. 여기서 압력을 제공하는 수단으로서 주사기 펌프(syringe pump)를 포함하는 공압 및 유압기반 장치 등을 예로 들 수 있다. 상기와 같이 압력 제공부에 의해 채널 내에서 유체의 유속을 더욱 효율적으로 조절함으로써, 항체들이 조직 샘플과 반응이 원활히 일어날 수 있게 할 수 있게 된다. 유체 흐름의 동력은 유체 배출구(151)와 연결된 펌프를 통하여 항체들이 흐르게 되거나, 항체 주입부에 직접 압력을 가하여 유체 동력을 유발하여 면역반응 검사를 수행할 수 있다. 혹은 압력 제공부의 필요 없이, 제 1항체 주입부에 항체만을 주입하여 하부에 존재하게 되는 샘플과 반응을 일으키게 할 수도 있다.

위와 같이 본 발명에 따른 다중 면역반응 검사장치는 항체 주입부(111~118)에 항체를 주입하고 압력 제공부 및 유체 조절부를 통해 유체의 흐름을 조절하여 항체가 포함된 유체가 반응부(131~138)에서 하부에 마련된 조직시료, 세포 등으로 이루어진 샘플(141)과 다중 면역반응이 일어나도록 한 후 유체 배출구(151)을 통해 외부로 배출된다. 반응부(131~138)의 너비는 3cm 이하로 하는 것이 바람직한데 이 는 조직시료의 너비가 일반적으로 3cm를 넘지 않고 본 발명은 다중 면역검사를 위해 다수의 반응부가 마련되기 때문이다. 또한, 본 발명에 따른 다중 면역반응 검사장치는 하나의 칩에 구현되는 랩온어칩(lab on a chip)의 형태로 제작될 수 있는데 이를 통해 간단하고 효율적으로 면역반응검사를 수행할 수 있는 효과가 있다.

이하의 본 발명의 다중 면역반응 검사장치 동작을 위한 구성 및 조립에 대해 좀 더 자세히 서술하면, 샘플을 도 1b의 하부 조립판(200) 위에 올려놓고 도 1a의 장치를 압착판(400)과 상부 조립판(500)과 결합 후, 샘플(141)위에 적절히 올려놓는다. 이 때, 샘플위에 장치를 올려놓을 때, blocking solution과 같은 유체를 샘플위에 올려놓은 상태에서 장치를 결합시키는 것이 바람직하며, 제대로 결합이 되었으면 제1 항체 내지 제8 항체를 항체 주입부(111-118)를 통해 주입시킨다. 본 예에서는 8개의 항체 주입부가 존재하지만, 연구의 설계에 따라서 다른 개수로도 조절이 가능함을 밝힌다. 항체 주입부와 채널을 통해 연결되어 있는 반응부(131-138)에서는 항체가 채널을 통하여 이동한 후, 조직샘플과 상호 반응한다. 항체가 반응부에 전달되기 위해, 상기 반응부를 압착하여 항체와 샘플의 반응이 원활히 일어나도록 압착부(600)를 포함한다. 압착부(600)를 통해 상기 다중 면역반응 검사장치를 압착함으로써, 항체를 반응부에 전달한다. 여기서 압착부(600)는 볼트 너트의 조임 방식 뿐만 아니라, 무게추 방식, 스프링 압착방식 등을 포함하는 압착장치를 통해 반응부를 압착할 수 있다.

또한, 상기 항체 주입부, 반응부와 연결되어, 상기 채널 내에서 유체의 유속을 조절하기 위해 압력을 제공하는 압력 제공부를 더 포함할 수 있다. 유체 배출구(151)에는 압력을 제공하는 수단의 예로서 주사기 펌프(syringe pump)와 연결하여 음압을 통해 항체들이 반응부로 흐르도록 하여 하부의 샘플과 반응하게 된다. 반응이 끝나게 되면, 압착부를 풀어서 압착판 및 상부 조립판을 샘플로부터 분리하고, 분리된 샘플은 기존의 방식대로 제1 항체 반응 이후의 과정을 진행할 수 있다.

상기 유체 배출구(151)는 샘플과 결합되지 않은 항체들을 포함하여 다수의 유체들이 배출된다. 상기 유체 배출구에 튜브를 꽂음으로써, 음압을 가할 수 있는 장치, 예를 들어 주사기 펌프(syringe pump)를 통해 음압을 가하여 유체의 배출이 원활히 이루어질 수 있도록 할 수 있음은 앞서 설명한 바와 같다.

다중 면역 반응 검사 장치 하부면에 위치하여 반응이 원활히 일어나도록 온도 조절을 할 수 있는 전열기판을 더 구비할 수 있다. 상기 전열기판을 다중 면역 반응 검사 장치 하부면에 위치시킴으로써, 최적의 반응이 일어날 수 있도록 온도를 조절할 수 있고, 형광접합보인법 (Fluorescence in situ hybridizatio)에 이용할 때에도 전열기판을 통하여 실험에 맞게 온도를 맞추어 줄 수 있다. 또한, 반응부 채널의 구조에 맞게끔 세포를 배양하고 이와 다중 면역 반응 장치를 결합하여 실험자의 원하는 분자 생물학 및 세포 생물학적 실험을 구현 할 수 있다. 또한, 도면에 도시되지는 않았지만 하부 조립판(200)은 샘플 지지부 주위에 홈이 파여 있어서 물과 같은 액체를 담을 수 있어서 다중 면역 반응 장치에 주입된 시약 및 항체의 증발을 막도록 하였다. 이를 통해, 값비싼 항체의 소모를 줄이기 위한 본원발명의 목적에도 부합하게 된다.

(제2 실시예)

도 2는 본 발명의 제2 실시예에 따른 다중 면역반응 검사장치를 나타낸 것이다. 도시한 바와 같이 제2 실시예의 칩 기반의 다중 면역반응 검사장치에는 면역조직화학에 필요한 시약을 주입하는 시약 주입부가 더 포함되는데 본 실시예에서는 제1시약 주입부(101)에서 제6시약 주입부(106)까지 마련된다. 실제의 면역조직화학법의 시약을 예로 든다면, 제1시약 주입부(101)에 TBS Tween washing buffer, 제2시약 주입부(102)에 biotinylated secondary antibody, 제3시약 주입부(103)에 streptavidin-HRP, 제4시약 주입부(104)에 distilled water, 제5시약 주입부(105)에 DAB, 제6시약 주입부(106)에 Mayer's hematoxylin 시약이 주입된다. 이 때, 요구되는 시약의 개수에 따라서 시약 주입부의 수는 원하는 만큼 증가 및 감소될 수 있다.

따라서, 본 발명을 통하여 생물학 실험에서 소요되는 다양한 시약을 원하는 대로 손쉽게 주입할 수 있다. 상기 시약 주입부에 주입되는 유체는 앞서와 같이 다양한 종류의 시약을 주입할 수 있는데 면역조직화학법에서 사용되는 시약을 일예로 들 수 있다. 또한, 각각의 시약 주입부에는 시약의 흐름을 조절하기 위한 유체 조절부(121-126)를 구비하고 있다.

또한, 채널을 통해 반응부 및 시약 주입부와 상호 연결되어 있는 항체 주입부는 반응부의 채널 개수만큼 존재하게 되는데 각각의 항체 주입부에도 역시 항체의 흐름을 조절하기 위한 유체 조절부(128)가 구비되어 있다. 항체 주입부 역시 요 구에 따라 원하는 만큼 증가 및 감소 될 수 있다. 앞서 제1실시예와 유사하게 시약 주입부 및 항체 주입부, 그리고 유체채널의 유동조절은 유체 조절부(121-129)를 통해서 조절된다. 상기 유체 조절부는 상기 시약 주입부, 상기 항체 주입부, 상기 반응부 및 유체 배출부에 위치하여 여러 시료의 흐름을 조절할 수 있게 한다.

또한, 앞서 제1 실시예와 유사하게 상기 채널에 연결되어, 상기 채널 내에서 유체의 유속을 조절하기 위해 압력을 제공하는 압력 제공부도 물론 구비한다. 여기서 압력을 제공하는 수단으로서 공압 또는 유압기반의 장치를 포함하는데 주사기 펌프(syringe pump) 일예로 들 수 있다. 상기와 같이 압력 제공부에 의해 채널 내에서 유체의 유속을 조절함으로써, 시약 및 항체들이 조직 샘플과 반응이 원활히 일어날 수 있도록 조절할 수 있게 된다. 유체 흐름의 동력은 유체 배출구(151)와 연결된 압력 제공부를 통하여 시약 및 항체들이 흐르게 되거나, 시약 및 항체 주입부에 직접 압력을 가하여 유체 동력을 유발하여 면역반응 검사를 수행할 수 있다. 여기서 밸브를 통한 유체채널의 유체 조절부 개수 또한 시약 주입부와 항체 주입부의 개수에 따라서 증가 및 감소 될 수 있다.

시약 주입부 및 항체 주입부와 채널을 통해 연결되어 있는 반응부에서는 시약 및 항체가 채널을 통하여 이동한 후, 조직샘플과 상호 반응한다. 시약 및 항체가 반응부에 전달되기 위해, 상기 반응부를 압착하여 시약 및 항체와 샘플의 반응이 원활히 일어나도록 압착부(600)를 구비한다. 압착부를 통해 상기 다중 면역반응 검사장치를 압착함으로써, 시약 및 항체를 반응부에 전달한다. 여기서 압착부는 볼트 너트의 조임 방식뿐만 아니라, 스프링 압착방식, 무게추 방식 등으로 압착하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 항체와 반응하는 조직샘플은 조직과 세포를 포함한 바이오 시료가 사용되는 것을 특징으로 한다. 여기서, 항체와 조직샘플과의 편리한 결합을 위해서 조립기도 포함될 수 있다. 상기 반응부에서는 각 채널마다 다른 조건의 시약을 주입함으로써 다용도의 실험에 사용될 수 있다.

상기 유체 배출구는 시약 및 결합되지 않은 항체들을 포함하여 다수의 유체들이 배출된다. 상기 유체 배출구에 튜브를 꽂음으로써, 음압을 가할 수 있는 장치에 연결한다. 여기서, 유체 배출구에 튜브를 꽂는 순서는 위의 기술한 과정의 어디에서든지 할 수 있다. 앞에서도 살핀 것처럼, 음압을 가할 수 있는 대표적인 장치로는 주사기 펌프(syringe pump)를 예로 들 수 있다.

도 4a는 본 발명의 제2 실시예에 덮개를 추가한 형태로서 투명재질의 덮개를 추가하여 상부에 흐르는 유체의 증발을 막으면서도 면역반응과정을 손쉽게 관찰할 수 있는 효과가 있다. 또한, 다중 면역 반응 덮개(900) 이외에도 샘플 지지부(300), 압착판(400) 및 상부 조립판은 현미경 관찰의 편이성을 위해 투명한 재질로 하는 것이 바람직하며, 상부 조립판은 다중 면역 반응 검사장치의 채널이 있는 부분은 뚫려 있도록 제작하는데 다중 면역 반응 장치의 시약 주입부, 유체 조절부, 항체 주입부, 그리고 유체 배출구와 같은 위치에 구멍을 뚫는다. 이하 다른 구성은 제2 실시예와 동일하므로 설명을 생략한다.

(제3 실시예)

도 4b는 본 발명의 제3 실시예에 따른 다중 면역반응 검사장치의 단면도를 나타내는 것으로 앞서 설명한 바와 같이 면역 반응 검사장치의 시약 주입부, 유체 조절부, 항체 주입부, 그리고 유체 배출구의 구멍과 같은 위치에 구멍이 뚫린 압착판 일체형 상부 조립판(450)을 하부의 면역 반응 검사장치의 구멍과 배열하여 올려놓는다. 제3 실시예에서는 상부 조립판과 압착판을 일체형으로 하여 구성을 간단하게 하고 조립 등 준비과정을 간소화하였다.

(제4 실시예)

도 5는 본 발명에 따른 제4실시예를 나타내는 것으로 도 1 또는 2의 장치에서 반응부의 모양이 일자 모양이 아닌, 지그재그 (zigzag) 형태의 반응부를 가지는 것을 그 특징으로 한다. 이를 통해 반응부의 샘플과 항체사이의 반응하는 면적을 더 넓게 확보하여 보다 신뢰성 있는 면역반응검사가 가능한 효과가 있다. 또한, 도 5에서는 중앙을 기준으로 지그재그의 형태로 반응부가 마련되었지만 전체 반응부가 샘플 전체에 지그재그의 형태로 배치될 수도 있고 상기와 같은 의도에서 여러 가지 형태가 가능하다. 도 7의 장치 또한 도 1 또는 2와 작동 방식 및 순서가 동일하다.

(제5 실시예)

도 6은 본 발명에서 제시하는 다중 면역반응 시스템을 Tissue microarray(541)에 적용한 제5 실시예를 도시한 것이다. 도 6에서처럼, 슬라이드글 라스(543) 위에 조직샘플이 어레이 형태로 존재를 하고, 그 위에 다중 면역반응 시스템을 위치시키면 여러 조직샘플에 대하여 여러 가지의 항체에 대한 반응을 한 번에 검색할 수 있다. 본 도시에서는 어레이화된 조직샘플이 다중면역 반응검사 장치의 반응부 채널 사이즈보다 작다는 개념에서 표현이 되었지만, 조직샘플을 다중면역 반응검사 장치의 반응부 전체 너비보다 더 크게 만들게 되면, 여러 가지 조직샘플에 대해서 각 조직샘플마다 다양한 항체에 대한 반응을 검사할 수 있게 된다. 이를 구현하기 위해서는, 본 발명의 다중면역 반응검사 반응부 채널이 슬라이드글라스 위에 놓인 조직샘플들에 맞게 어레이 형태로 제작되어야 하며, 위의 구성 또한 본 발명의 사상에 포함됨을 밝힌다.

다음으로, 다중 면역반응 검사장치를 통한 검사방법에 대해서 개략적으로 설명하면 먼저, 슬라이드글라스 위에 검사하고자 하는 조직절편을 놓고 그 위에 도 1 또는 도 2의 다중 면역반응 검사장치를 올려놓는데, 조직절편 중 검사하고자 하는 위치(141)에 다중면역 반응 검사장치의 반응부가 위치하도록 배열한다. 하부의 샘플과 면역반응 검사장치의 반응부가 위치하도록 배열하는 것이 가장 중요하다. 검사장치가 배열되면, 시약 주입부 또는 항체 주입부에 각각의 시약 및 항체를 주입하고 유체 배출구에는 펌프와 연결을 시켜 적당한 유속으로 유체를 흡입한다. 적당한 유속의 예로 50 ㎕/h 속도를 들 수 있다.

본 다중면역 반응 검사장치를 면역조직화학법에 이용하면 하나의 조직샘플에 여러 항체에 대한 정보를 얻을 수 있다는 것이 장점이다. 유체 조절부(128)만을 열 고 나머지의 밸브들(121-127, 129)은 닫도록 하여 4개의 반응부 채널(131-134)에 각각 다른 항체들(111-114)이 흐르게 되고 반응부에 존재하는 샘플과 항체가 반응하게 된다. 항체와의 반응을 유지하기 위해서 천천히 항체를 흘려 줄 수도 있고, 혹은 유체 조절부(129)를 닫아서 반응부 내에 항체를 가두어 놓을 수도 있다.

반응이 끝나고 면역조직화학법 순서에 따른 유체를 흘려 반응부로 흘려주면 되는데, 그 예로 제1시약 주입부에 있는 TBS Tween washing buffer를 흘려주려면 (121),(127),(129)번 밸브를 열고 (122),(123),(124),(125),(126),(128)번 밸브를 닫으면 4개의 반응부 채널에 TBS Tween washing buffer가 흐르게 된다. 이와 같은 방식으로 다른 시약들도 반응부에 흘려줄 수 있다. 반응이 완료되면, 그 상태에서 바로 각 채널에 대해 현미경으로 시료에 대해 검사를 할 수 있고, 이미지 획득 후, 이미지 분석을 통해 후속 진단을 하는 것도 가능하다. 또한, 반응 완료 후, 샘플 지지부와 다중 면역 반응 장치를 분리하고 샘플 지지부를 현미경으로 관측함으로써 후속 진단이 가능하며, 또한 샘플 지지부는 따로 보관이 가능하다. 이상의 면역 반응 검사의 기본장치 설정과정 및 검사과정을 도 7과 도 8에 순서도로써 표현하였다.

도 7는 다중 면역반응 검사장치의 기본설정을 위한 순서도를 나타낸다.

먼저, 샘플 지지부를 지지하기 위한 하부 조립판을 준비한다. 준비한 하부 조립판 위에 샘플 지지부를 위치시킨다.(S401) 샘플 지지부 위에 위치한 본 발명인 다중 면역반응 검사 장치에 플라즈마 처리하고(S402), 하부 조립판 및 샘플 지지부 위에 증류수를 떨어뜨려(S403) 샘플 지지부와 상기 다중 면역반응 검사 장치를 배열한다.(S404) 그 후, 샘플 지지부와 장치 사이에 버블이 생겼는지를 판단한다.(S405) 이 때, 샘플 지지부와 장치 사이에 버블이 생겼을 경우 샘플 지지부와 장치를 다시 해체한 후(S406), 버블이 생기지 않도록 샘플 지지부와 상기 다중 면역반응 검사 장치를 다시 배열한다.(S404) 이 경우, 또 다시 버블이 생겼을 경우 버블이 생기지 않을 때까지 샘플 지지부와 상기 다중 면역반응 검사 장치를 배열하는 과정을 계속 반복한다.

상기에서 샘플 지지부와 상기 다중 면역반응 검사장치를 배열한 뒤에 버블이 생기지 않았을 경우, 다중 면역반응 검사장치 상측에 위치한 상부 조립판을 덮고, 상기 다중 면역반응 검사장치 양쪽에 위치하여 다중 면역반응 검사 장치를 압착하기 위한 압착부로 하부 조립판과 고정을 시킨다.(S407) 상기 다중 면역반응 검사 장치와 조직샘플을 압착하는 단계가 끝나면, 시약 주입부에 시약을 넣고 항체 주입부에 항체를 넣는다.(S408) 주입한 시약 및 항체가 반응부에 잘 흐르도록, 상기 각 주입부 및 우체 배출구에 존재하여 유체 흐름을 조절하는 유체 조절부와 유체 조절 컨트롤러를 연결한다.(S409) 그 후, 채널을 통해 상기 반응부에 연결되어 유체가 배출되는 유체 배출구와 상기 유체 배출구에 연결되는 튜브에 연결되고 원하는 유체를 반응부에 흘려주도록 음압을 주기 위한 펌프를 연결한다.(S410)

그 다음, 유체가 채널을 통해 잘 흐르는지를 판단한다.(S411) 만약에 상기의 과정에 의해 유체가 흐르지 않거나 유체 조절부가 제대로 작동하지 않는다면, 상기에서 다중 면역반응 검사장치와 조직샘플을 압착하기 위해 설치한 압착부의 힘을 조절하여 유체가 잘 흐르도록, 유체 조절부가 잘 작동하도록 조절한다.(S412) 따라서, 이러한 조절을 통해 유체가 잘 흐르고 유체 조절부가 잘 작동한다면 다중 면역반응 검사를 위한 장치의 기본 설정은 끝나게 된다.

도 8는 다중 면역반응 검사의 과정을 나타내는 예시적 순서도를 나타낸다.

먼저, 다중 면역 반응 검사를 하기 위해 적어도 두개 이상의 시약 및 항체를 각각 시약 주입부 및 항체 주입부에 주입을 한다.(S501) 시약 및 항체를 주입한 후, 조직 샘플과의 반응이 시작되기 전에 하기와 같은 조치를 취하여 최적의 환경에서 반응이 일어날 수 있도록 한다.

탈파라핀 용액이 들어 있는 밸브와 유체 조절부인 (127),(129)밸브를 연 후, 순차적으로 100% 에탄올 밸브, 95% 에탄올 밸브, 80% 에탄올 밸브, 70% 에탄올 밸브, 증류수 밸브를 열어 조직의 함수화(hydration) 과정을 수행한다.(S502) 상기 다중 면역반응 검사장치를 지지하고 있는 샘플 지지부 하부 면에 위치하는 전열기판의 온도를 90℃로 유지하고 Citrate buffer 혹은 TRIS-EDTA buffer가 들어 있는 밸브를 연다. 상기 전열기판을 꺼서 반응부의 온도를 상온 상태로 유지한다. 이렇게 함으로써 항체들과 조직샘플이 반응하기에 최적의 온도가 형성된다.(S503)

반응이 일어나기 좋은 상태가 유지되었으면, 각각의 채널 내부에 버블이 존재하는지를 확인한다.(S504) 왜냐 하면, 채널 내부에 버블이 존재하게 되면 반응이 잘 일어나지 않게 되기 때문이다. 만약에 각각의 채널에 버블이 생겼다면, 상기에서 열어놓은 모든 밸브를 닫고 상기 유체 배출구에 연결되어 있는 튜프에 연결된 펌프를 통해 양압을 인가하여 채널 내부의 버블을 없앤다. (S505)상기 펌프는 대표적인 것으로 주사기 펌프를 예로 들 수 있다. 상기 과정은 채널 내부의 버블이 생기지 않을 때까지 반복된다.

이런 과정을 거쳐 채널 내부에 버블이 생기지 않았으면, 순차적으로 Hydrogen peroxide 밸브, TBS tween buffer 밸브, Blocking solution 밸브를 연 후에 항체 밸브를 열고, 유체 조절부인 (127)밸브를 닫는다.

상기와 같이 세척 및 온도 조절이 끝난 후에는 시약 및 항체가 반응부로 이동하도록 압력을 제공한다.(S506) 이에 의해, 항체가 반응부에 채워지는데, 항체가 반응부에 완전히 채워지지 않았다면 펌프를 통해 음압을 인가하여 항체가 반응부에 완전히 채워지도록 한다.

상기 이동한 항체가 하나의 조직절편 시료와 다양한 표지자 검색이 가능하도록 상기 조직샘플에 다수의 항체들이 결합하여 반응하는 과정이 일어난다.(S507) 상기 반응 단계에서 반응이 원활히 일어나도록 상기 반응부를 압착하는 과정도 포함된다.(S508) 반응이 일어난 후에는 TBS tween buffer 밸브, Streptavidin HRP 밸브, 증류수 밸브를 순차적으로 열고 그 후에, DAB 밸브, 증류수 밸브, Mayer's Hematoxylin 밸브를 열고 증류수 밸브, 에탄올 밸브, Xyline 밸브를 열고 그 상태에서 현미경을 통해 이미지 분석을 한다. 여기서 시약 및 항체 등 유체들은 반응부에 연결되어 있는 유체 배출구를 통해 배출된다.(S509) 이러한 과정에 의해, 다중 면역반응 검사과정은 끝나게 된다.

도 9은 본 발명에 따른 다중면역 반응검사 장치를 통하여 실제로 하나의 셀블럭 (cellblock) 샘플 위에서 여러 항체에 대한 검사를 구현한 결과이다. 도 9A는 샘플 (Breast cancer cell line: AU-565) 위에 다중면역 반응검사 장치를 올려놓은 그림이고, 도 9B는 estrogen receptor, HER2, progesteron receptor, Ki67 항체에 대한 면역조직화학법을 구현한 것이다. 도 9C를 보면 알 수 있듯이, 하나의 샘플에 대해서 여러 항체에 대한 반응감사를 구현할 수 있으며, 그 결과의 차이가 극명하게 나타남을 알 수 있다.

이상과 같이 본 발명에 의한 다중 면역반응 검사장치의 동작과 검사방법을 예시된 도면을 참조로 설명하였으나, 본 명세서에 개시된 실시예와 도면에 의해 본 발명은 한정되지 않고, 기술사상이 보호되는 범위 이내에서 응용될 수 있다.

도 1a, 1b는 본 발명의 제1실시 예에 따른 다중 면역반응 검사장치 구조도와 단면도이고,

도 2는 본 발명의 제2실시 예에 따른 다중 면역반응 검사장치 구조도이고,

도 3은 본 발명의 도 2의 다중 면역반응 검사장치의 여러 단면의 단면도이고,

도 4a는 본 발명의 제2실시 예의 덮개형 다중 면역반응 검사장치의 단면도이고,

도 4b는 본 발명의 제3실시 예에 따른 다중 면역반응 검사장치의 단면도이고,

도 5는 본 발명의 제4실시 예에 따른 다중 면역반응 검사장치의 구조도이고,

도 6은 본 발명의 제5실시 예에 따른 다중 면역반응 검사장치의 구조도이고,

도 7은 면역 반응 검사를 위한 장치 기본설정을 위한 순서도이고,

도 8은 다중 면역반응 검사방법을 나타내는 순서도이고,

도 9는 본 발명의 다중 면역반응 검사장치를 통한 다중 면역반응 검사결과를 나타내는 그림이다.

<도면의 주요 부분에 관한 부호의 설명>

100 : 다중 면역반응 검사장치

101~106 : 제1 내지 제6 시약주입부

111~118 : 제1 내지 제8 항체 주입부

121~129 : 유체 조절부 130 : 유체 채널판

131~138 : 반응부 141 : 샘플

151 : 유체 배출구 152 : 튜브

200 : 하부 조립판 300 : 샘플 지지부

400 : 압착판 450 : 압착판 일체형 상부 조립판

500 : 상부 조립판 600 : 압착부

800 : 전열기판

Claims (21)

1. 면역검사를 위한 항체가 주입되는 적어도 두개 이상의 항체 주입부;

   상기 주입된 항체가 면역검사를 위해 마련된 샘플과 반응이 일어나는 적어도 두개 이상의 반응부;

   상기 반응부와 연결되어 상기 항체를 포함하는 유체가 배출되는 적어도 두개 이상의 유체 배출구,

   채널에 연결되고, 상기 채널 내에서 유체의 유속을 조절하기 위한 압력을 제공하는 압력 제공부; 및

   면역검사를 위한 시약이 주입되는 적어도 두개 이상의 시약 주입부를 포함하며,

   상기 샘플은 조직시료 및 세포인 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
2. 청구항 1에 있어서,

   상기 각 주입부, 반응부 및 유체 배출구는 채널을 통해 상호 연결되는 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서,

   상기 압력 제공부는 공압 및 유압기반 장치인 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
5. 청구항 1에 있어서,

   상기 유체의 흐름을 조절하는 유체 조절부를 더 포함하고,

   상기 유체 조절부는 상기 각 주입부, 반응부 및 유체 배출구들이 연결되는 채널에 존재하여 유체 흐름을 조절하는 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
6. 청구항 1에 있어서,

   상기 다중 면역반응 검사장치 하부에 위치하여 반응이 원활히 일어나도록 온도 조절을 할 수 있는 전열기판을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
7. 청구항 1에 있어서,

   상기 반응부는 상기 항체 주입구의 개수만큼 마련되는 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
8. 청구항 1에 있어서,

   상기 다중 면역반응 검사장치의 상부에 유체의 증발을 막기 위한 투명 재질의 덮개를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
9. 삭제
10. 청구항 1에 있어서,

    상기 반응부를 압착하여 항체 및 시약과 샘플의 반응이 원활히 일어나도록 압착부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
11. 청구항 10에 있어서,

    상기 압착부는 볼트 너트의 조임 방식, 스프링 눌림 방식, 무게추 방식을 포 함하는 압착장치로 상기 반응부를 압착하는 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
12. 청구항 1에 있어서,

    상기 반응부는 상기 샘플 상에 지그재그의 형태로 마련되는 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
13. 청구항 1에 있어서,

    상기 주입된 항체 및 시약은 상기 반응부상을 흐르면서 상기 샘플과 반응하는 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
14. 청구항 1에 있어서,

    상기 조직시료는 티슈 마이크로어레이(tissue microarray)를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
15. 청구항 1에 있어서,

    상기 항체 주입부, 시약주입부, 반응부 및 유체배출구를 포함하는 다중 면역반응 검사장치는 칩상에 마련되는 랩 온 어칩의 형태로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
16. 청구항 1에 있어서,

    상기 반응부의 너비는 3cm 이하 인 것을 특징으로 하는 다중 면역반응 검사장치.
17. 삭제
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