CN110665557B - 多孔基底和嵌入生物测定中的微多孔基底 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于检测表面结合物质的多孔基底和嵌入生物测定中的微多孔基底，还提供了一种盒及用于移动盒内流体的方法，其简化了设计并消除了对任何内部阀或计量装置的需求。该设计适合于注射成型制造，降低了大批量生产的成本。该设计可适于执行样品制备以及对包括核酸和蛋白质的生物物质的检测。

Description

多孔基底和嵌入生物测定中的微多孔基底

技术领域

本公开涉及一次性盒及用于移动盒内流体和执行多个生物测定步骤的方法，该盒简化了设计并消除了对任何内部阀或计量装置的需求。该设计适于注射成型制造，降低了大批量生产的成本。

背景技术

用于生物测定的典型盒装置与包含注射器或其它类型的容积式泵的仪器接合，以精确地计量一次性盒内的反应区域中依次所需的液体容积。这通常还涉及在盒结构内集成机械阀以控制流体流动。此外，必须注意流体路径的设计，以消除可能明显干扰精确流体输送的气泡的形成。复杂的结构或气泡控制机构被引入到设计中以缓解这些问题。这导致了制造复杂性并增加了通常意图以一次性方式使用的盒的成本。

鉴于使用诊断测试的趋势，需要与一次性盒的批量生产一致地在成本有效的基础上将多个功能/测定步骤整合到单个盒中。因此，在使用诊断生物测定的自动化领域中，提供使多个功能与最少量的移动部（如主动泵和阀）整合的一次性盒是非常有益的。

发明内容

本发明涉及以下装置和方法，其仅使用施加的压力或真空、而无需任何内部阀将液体容积依次地输送到反应区域。流体输送通过毛细管压力而限制在盒内。反应区域之间的流动可通过用外部阀切换端口之间的压力或真空并因此选择性地超过盒连接反应区域的元件中的毛细管压力来实现。压力/真空源和阀位于仪器本身中，并与反应流体隔离。这些部件都不是一次性盒的一部分，从而显著降低了复杂性和成本。

在提供用于执行多重生物测定的一次性样品处理盒的实施方式中，该处理盒包括：

a）上部处理室，具有预选容积并具有安装在上部处理室的顶部上的气动端口；

b）下部处理室，位于上部处理室下方并具有安装在下部处理室的顶部上的气动端口；

c）多孔基底，多孔基底定位成将上部处理室与下部处理室相隔开，其中，多孔基底形成上部处理室的底部，多孔基底连接到上部处理室的主体，以使得当横跨多孔基底的所施加的压差超过临界压力时，流体能够仅经过多孔基底而经由上部处理室的底部排放到下部处理室中；

d）一个或多个试剂存储器，一个或多个试剂存储器通过配置成终止在上部处理室的顶部中的毛细管通道与上部处理室流体连通，以使得在执行测定时它们位于上部处理室中的液体水平上方，每个试剂存储器包括位于试剂存储器的顶部上的至少一个气动端口，上部处理室的容积被选择为大于流体容积，以提供位于上部处理室的上部中的头部空间，毛细管通道终止于头部空间中；

e）附加室，通过终止于附加室的顶部中的毛细管通道与下部处理室流体连通，附加室包括安装在附加室的顶部上的气动端口；以及

其中，通过施加具有用于克服所选的室之间的毛细管压力阻力所需的量级的气动压力，来控制所选的室之间的液体输送。

根据一个实施方式，多孔基底具有多个孔，单个孔的截面和尺寸配置成提供液体与气体界面处的流动阻力，以控制液体经过多孔基底的流动并阻断气泡经过多孔基底的流动。

多孔基底的孔隙率和多孔基底的厚度被选择为提供用于所选范围的压差所需的流速。

多孔基底为基本平面的多孔基底材料，多孔基底材料具有相对的表面和延伸经过多孔基底的厚度的孔，其中，孔在多孔基底的面向下部处理室的表面附近的宽度比孔在面向上部处理室的相对的表面上的宽度大，从而提高从孔内的发光成分发出的光的收集效率。

下部处理室沿着下部处理室的底壁包括光学窗以用于允许光进入和离开下部处理室，光学窗与多孔基底的底部平坦表面相隔开以在光学窗与多孔基底的底部平坦表面之间限定恒定间隙，底部平坦表面能够通过与光学窗相隔开的检测装置观察到，以用于检测来自多孔基底的光发射。

多孔基底通过结合物质功能化，结合物质结合在多孔基底的孔中并选择为与液体中的预选分析物物质相互作用。

多孔基底包括组织模式下的不同的分析物特异性结合剂，不同的分析物特异性结合剂结合在多孔基底的底部平坦表面的不同区域中。

不同的分析物特异性结合剂包含在加宽的孔的内表面内，并且不同的分析物特异性结合剂或与其特异性地结合的材料发出光，不同的分析物特异性结合剂的光学特性是不同的。

处理盒还包括一个或多个热隔离区域，一个或多个热隔离区域能够与盒的其余部分独立地加热或冷却。多孔基底为刚性多孔基底。刚性多孔基底为多孔二氧化硅基底。

终止于上部处理室的顶部处的和处于附加室的顶部处的毛细管通道中的至少一个具有锥形毛细管端部，以将试剂完整地输送至上部处理室，其中在测定工艺的后续步骤中试剂的最小量残留在上部处理室中。

终止于上部处理室的顶部处的和处于附加室的顶部处的毛细管通道具有与室的侧壁相隔开的端部。

处理盒还包括吸塑包装，吸塑包装包含预选试剂，吸塑包装配置成具有预选数量的独立包装，当与盒组装时，预选数量的独立包装与预先选择的室对齐并且部分地突出到预先选择的室中。

处理盒包括垫片，垫片具有配置成与吸塑包装和盒配合的形状，以使得当吸塑包装和盒被组装时，垫片形成盒中的室之间的液体和空气密封。

每个独立包装包括易碎密封件，易碎密封件的强度被选择使得根据经由与不同的室的气动端口联接的气动系统向不同的室施加压力，导致吸塑包装中的易碎密封件的破裂，从而使得试剂流入相应的室中。

气动端口与上部处理室相关联，下部处理室配置成在正气动压差与负气动压差之间切换，使得液体在上部处理室与下部处理室之间来回循环。

与下部处理室处于流体连通的附加室是废料容器，废料试剂和样本液体被引导到废料容器中。

与下部处理室处于流体连通的附加室是附加上部处理室，附加上部处理室位于附加下部处理室的上方并且被附加多孔基底相隔开，附加上部处理室和附加下部处理室各自具有气动端口，并且包括另外的室，另外的室通过终止于另外的室的顶部中的毛细管通道与附加下部处理室流体连通，另外的室包括安装在附加室的顶部上的气动端口。

处理盒包括多个成对的附加上部处理室和下部处理室，各自由相关联的多孔基底相隔开，成对的附加上部处理室和下部处理室中的每个具有关联的气动端口，并且每个附加上部处理室选择性地通过终止于附加上部处理室的顶部中的毛细管通道与一个或多个试剂室流体连通。

处理盒包括一个或多个孵化室，一个或多个孵化室与下部处理室和位于下部处理室下游的上部处理室流体连通。

处理盒包括一个或多个试剂室，一个或多个试剂室与样品室、上部处理室、下部处理室或废料室中的一个或多个流体连通，其中废料室包括选择为破坏或中和测定的有害产物或样品的清洁剂。

处理盒包括柔性隔膜，柔性隔膜串联地处于至少一个气动端口中，由气动压力导致的隔膜的变形允许有效地通过至少与盒内待输送的液体的容积一样大的流体容积，但不允许将物质实际输送进入或离开盒。

盒配置成使得能够施加大于多孔基底的孔的临界毛细管压力的压差以将液体从基底的孔完全去除。

盒中的室中的至少一个包含经干燥的试剂，并且经干燥的试剂通过将流体从盒中的另一个室输送到室而溶解。

盒中的室中的至少一个包含经干燥的试剂，并且经干燥的试剂通过由吸塑包装来输送被递送到室的流体而溶解。

盒配置成与配置用于向盒的所有气动端口提供压差的仪器、盒的温度控制器和用于检测从盒发射的光的装置接合。

盒包括孵化室，孵化室与上反应室和下反应室中的一个或两个处于毛细管流体连通，其中，温度以编程方式改变以实现聚合酶链反应的扩增。

试剂能够从试剂室输送到一组成对的上部处理室和下部处理室中的上部处理室，以使得分析物分子被修饰和/或复制，其中试剂能够在这些反应之后从一组成对的上部处理室和下部处理室中的下部处理室去除。

酶或催化剂固定在使位于下部处理室上方的上部处理室相隔开的多孔基底上，以修饰经由多孔基底输送的液体中的物质。

公共压力范围能够用于克服引起流过使位于下部处理室上方的上部处理室相隔开的多孔基底所需的临界压力，并且毛细管通道中的任一个连接盒中的室。

孔在基底的一个表面附近逐渐变宽。孔具有矩形截面。孔具有正方形截面。孔具有圆形截面。

在提供用于执行生物测定的方法的实施方式中，该方法包括：

提供一次性样品处理盒，一次性样品处理盒具有至少一组处理室，每组处理室包括由多孔基底相隔开的上部处理室和下部处理室，多孔基底由包含选择为向横跨整个表面的流动提供均匀阻力的孔的材料构成，以使得在横跨多孔基底的限定压差处，液体经过孔，但气体不经过孔，多孔基底具有结合在孔中的分析物特异性受体；

在一个或多个试剂室与包含分析物的样品室和上部处理室之间施加压差，以使得包含试剂的液体从一个或多个试剂室以及样品室经由毛细管通道移动到上部处理室；

在上部处理室与下部处理室之间施加压差，以使得液体从上部处理室经由多孔基底移动到下部处理室，其中，压差选择为推动液体通过多孔基底，但气体不通过多孔基底；

在下部处理室与废料室之间施加压差，以使得液体从下部处理室移动到废料室；

对结合到多孔基底上的分析物特异性受体的分析物进行检测；以及

在下部处理室与废料室之间施加压差，以使得液体从下部处理室移动到废料室。

在一个实施方式中，生物测定是核酸测定。生物测定是蛋白质测定。

本公开提供用于检测表面结合物质的多孔基底，其包括：

基本平坦的微多孔基底材料，微多孔基底材料具有相对的表面和延伸通过基底的厚度的孔，其中，孔在基底的一个表面附近比孔在相对的表面上的宽度更宽，从而提高从结合到更宽的孔的内表面的光学探针发出的光的收集效率。

孔可在基底的一个表面附近逐渐变宽。根据一个实施方式的多孔基底，孔具有矩形截面。根据一个实施方式的多孔基底，孔具有正方形截面。根据一个实施方式的多孔基底，孔具有圆形截面。根据一个实施方式的多孔基底，锥形是圆锥形的。根据一个实施方式的多孔基底，锥形是球锥形的。根据一个实施方式的多孔基底，锥形是抛物线锥形的。

在与加宽的孔的一侧相反的一侧上的孔尺寸基本上较小，从而提供结构稳定性。孔具有均匀的尺寸和形态。

根据一个实施方式的多孔基底还包括增强肋以提供结构稳定性。增强肋为基底的组成部分。增强肋与基底相隔开，并且以刚性支承网的形式制成。

根据一个实施方式的多孔基底，其中，基底附接到支承网，支承网放置在基底的与具有锥形孔的表面相反的表面上。

根据一个实施方式的多孔基底，其中，基底位于两个支承网之间，两个支承网位于基底的相对侧上。

根据一个实施方式的多孔基底，其中，多孔基底具有约0.15至约0.75mm之间的厚度。孔的锥形表面被反射涂层覆盖。

根据一个实施方式，多孔基底由硅制成。

根据一个实施方式，多孔基底通过硅的电化学蚀刻制成。

根据一个实施方式，多孔基底通过塑料材料的压塑或模制制成。

根据一个实施方式，其中，多孔基底材料是不透明的，以使得来自一个孔的光不能输送到微多孔基底内的相邻的孔。

提供了嵌入生物测定的微多孔基底，其包括：

微多孔基底，具有相对的表面和延伸通过基底的厚度的相隔开的孔，其中，孔的开口在基底的相对的表面中的一个上比孔在相对的表面上的开口更宽，分析物特异性受体位于微多孔基底的具有加宽的孔的一侧上的孔中，微多孔基底的特征在于，

当微多孔基底通过定位成面对具有较小开口的相对的表面的光源发光时，通过在基底的面对孔的较大开口的另一侧上隔开的检测器所检测到的光的强度比当在光源面对较大孔并且检测器在微多孔基底的另一侧上面对较小孔开口时检测到的光的强度更大。

根据一个实施方式，微多孔基底由硅制成。

根据一个实施方式，其中微多孔基底通过硅的电化学蚀刻制成。

根据一个实施方式，其中，孔朝着基底的一个表面逐渐变宽。

本文中所公开的装置、方法在医学诊断（人用和兽用）、食品安全测试、环境和生物危害的监测以及生物物种的一般测量方面尤其有用。该设计可适于执行用于蛋白质和核酸的最常见的测定形式，包括样品制备步骤。

可通过参照以下详细描述和附图来进一步理解本公开的功能和有利方面。

附图说明

现将参照附图仅以示例的方式对实施方式进行描述，在附图中：

图1是示出核心部件的气动驱动的测定盒的侧视图。

图2示出了图1的盒的更详细的侧视图，其中液体处于起始位置。

图3是图2的放大侧视图，示出了液体在气动控制下从试剂存储器移动到上部处理室（毛细管内的粗黑线）。

图4与图3相似，示出了液体在气动控制下从上部处理室经由多孔基底移动至下部处理室。

图5示出了盒中的液体在气动控制下移回上部处理室。

图6（a）示出了盒中的液体在完成加工步骤之后部分地移动到废料容器中。

图6（b）示出了包括一次性盒以及专用吸塑包装的试剂盒，其中，专用吸塑包装包含多个测定试剂和匹配垫片，匹配垫片与包含有与预选的试剂室对齐的测定试剂的包装匹配。

图7是经组装的盒的照片，示出了与中央上部处理室连接的五个（5）试剂/样品室以及散装试剂室。

图8示出了配置用于核酸样品制备和核酸扩增（等温或聚合酶链式反应（PCR））和产物的多重检测的盒的俯视图。

图9示出了夹置在上部气动块组件接口与下部热控制组件之间的一次性盒的局部分解图，其中下部热控制组件形成供盒插入的仪器的一部分。

图10是图9的夹置结构的局部剖视图，示出了定位成观察多孔基底的检测器。

图11的（a）至（c）示出了具有不同锥角的三（3）个锥形孔。（（b）与（a）相比较）更小的锥角导致更深的锥形。如（c）中所示，对于足够小的角度，锥形从基底的一个表面至另一个表面是连续的。

图12的（a）和（b）示出了根据本公开的具有锥形孔的硅基底的前表面和后表面的光学微观照片。这些光学微观照片示出了在具有较宽孔的一侧上的基底的高孔隙率（图12的（a）），以及相反侧上的基底的较低孔隙率（图12的（b））。

图13的（a）至（c）示出了具有不同截面的孔的基底的微观照片，其中，图13的（a）为圆形，图13的（b）为正方形，图13的（c）为多边形。

图14的（a）至（c）示出了具有不同锥角的锥形孔且因而具有孔的锥形部分的不同深度，其中光学微观照片示出了具有不同锥角的锥形孔的剖视图（图14的（a）、图14的（b））以及图14的（a）中所示的基底剖视图的俯视图（图14的（c））。

图15的（a）和（b）示出了多孔基底的透光性因孔的锥形而改进。图15的（a）和图15的（b）中示出了当由相同的漫射光源照射时的相同基底。在图15的（a）中，孔的加宽部分面向物镜，在图15的（b）中，孔的窄部分面向物镜。基底上的斑点是基底的孔已被孔中干燥的探针溶液阻挡的区域。

图16的（a）至（c）示出了有助于光收集改进的机构，其中图16的（a）示出了有效深度增加的效果，图16的（b）示出了收集角度增加的效果，图16的（c）示出了表面区域增加的效果。

图17示出了对于8μm（微米）直孔（曲线（a））和具有锥形壁的孔（曲线（b））的孔深度与光收集效率的函数的计算结果。

图18示出了通过具有直孔的基底和具有锥形孔的基底测量的信号强度的实验比较的结果。图18确认了根据本公开的光收集效率的预期40％的改进。

图19的（a）示出了具有以圆锥型锥形的圆柱形孔的流通式芯片基底的另一实施方式。

图19的（b）示出了图19的（a）的实施方式的单孔的截面。

图20的（a）示出了具有球型锥形的圆柱孔的流通式芯片基底的另一实施例。

图20的（b）示出了图20的（a）的实施方式的单孔的截面。

图21的（a）示出了具有抛物线型锥形的圆柱孔的流通式芯片基底的另一实施例。

图21的（b）示出了图21的（a）的实施方式的单孔的截面。

图22的（a）示出了多孔基底中的锥形圆柱孔的布置的第一实施方式。

图22的（b）示出了多孔基底中的锥形圆柱孔的布置的第二实施方式，其比图22的（a）的布置包装得更紧密且具有改进的光收集效率。

图23示出了流通式芯片基底的实施方式，其中，左手侧上的高效多孔基底由在图的右手侧上示出的用于结构稳定性的框架增强。

图24示出了用于改进光学检测灵敏度的流通式芯片基底的另一实施方式，其中，高效多孔基底由放置在基底相反侧上的用于结构稳定性的两个框架增强。

图25的（a）示出了使用图7中所示的经组装的盒执行的核酸生物测定的结果。

图25的（b）示出了在核酸生物测定结束时包含在图7中所示的经组装的盒内的多孔基底的化学发光图像。

图26示出了使用图7中所示的经组装的盒执行的蛋白质生物测定的结果。

图27的（a）示出了使用形成本发明的盒的一部分的多孔基底的样品制备的结果。

图27的（b）示出了用于检测由配置成用于样品制备的单独的多孔基底所处理的溶液中的残留蛋白质分析物的多孔基底的化学发光图像。

图27的（c）示出了用于检测由配置成用于样品制备的单独的多孔基底进行处理之前的溶液中的残留蛋白质分析物的多孔基底的化学发光图像。

具体实施方式

本公开的各实施方式和方面将参照下面讨论的细节来进行描述。以下描述和附图是对本公开的说明，而不应解释为限制本公开。许多具体细节被描述以提供对本公开的各种实施方式的透彻理解。然而，在某些情况下，公知的或常规细节未被描述以提供对本公开的实施方式的简要讨论。

如本文中使用的，术语“包括（comprises）”和“包括（comprising）”应解释为包容和开放性的，而不是排他性的。特别地，当在说明书和权利要求书中使用时，术语“包括”及其变型意指包括所指特征、步骤或部件。这些术语不应解释为排除其它特征、步骤或部件的存在。

如本文所使用的，术语“示例性”是指“用作示例、实施例或说明”，并且不应被解释为比本文公开的其它配置优选或有利。

如本文所使用的，术语“约”和“近似”是指涵盖可能存在于值范围的上限和下限中的变化，例如属性、参数和尺寸的变化。在一个非限制性示例中，术语“约”和“近似”是指加上或减去10％或更少。

除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

参照图1，示出了配置为在不需要任何内部阀或计量装置的情况下便于流体移动的盒100。该设计适合于注射成型制造，从而降低大批量生产的成本。盒100包括保持液体试剂或样品的第一试剂室10和保持第二液体试剂的第二试剂室12。

上部处理室14被设置为具有比第一试剂室10或第二试剂室12更大的容积。盒100包括下部处理室16，下部处理室16具有等于或超过上部处理室14的最大液体容量的容积，并被设计成使室16的底部内表面与位于室16内的多孔基底18的底表面之间的空间最小化。盒100包括出口室20，出口室20具有比经组合的所有试剂和样品的容积大的容积。

第一反应室10包括气动端口26，气动端口26配置成在外部系统控制下向室10提供负压差、正压差或通气。上部处理室14包括气动端口28，气动端口28配置成在外部系统控制下向上部处理室14提供负压差、正压差或通气。第二反应室12包括气动端口30，气动端口30配置成在外部系统控制下向室12提供负压差、正压差或通气。下部处理室16包括气动端口34，气动端口34配置成在外部系统控制下向下部处理室16提供负压差、正压差或通气。相似地，出口室20包括气动端口36，气动端口36配置成在外部系统控制下向出口室20提供负压差、正压差或通气。

气动端口26、28、30、34和36可包含位于它们各自的气动导管中的柔性隔膜，这些柔性隔膜可用于在允许气体通量经过受限于隔膜变形的导管的同时将特定的室与气动源隔离。在施加气动压力后，气体将流过导管，直到隔膜的背压等于所施加的气动压力。这种柔性隔膜在美国专利第7,470,546号中公开，该美国专利通过引用以其整体地并入本文。

更具体地，柔性隔膜可并入图1中的气动端口28和34中，以便当向端口28施加正气动压力时，气体流入上部处理室14，直到隔膜变形得足以产生等于所施加的压力的背压。进入上部处理室14的气体使得液体流过多孔基底18进入下部处理室16，并且空气流过端口34并使端口34中的隔膜变形，而端口34将向大气排放。虽然端口34向大气排放，但是在盒100的内部与环境之间不会存在材料的通道。该配置允许通过向端口28周期性地施加压力而使液体跨过多孔基底18进行前后输送，当没有施加压力时，端口28可向大气排放。

多孔基底18用作处理室14和16之间的界面，并且具有配置成防止在超出临界压力时流体经过处理室14和16之间而不经过多孔基底18的尺寸和形状。在下部处理室16中由于多孔基底18突出到下部处理室16中而产生头部空间22。尽管图1示出了两个（2）头部空间22，但是应理解，该盒可配置成仅具有一个。流动方向取决于室14和16之间的压差的符号。

下部处理室16包括光学窗40，光学窗40形成下部处理室16的下表面的一部分以允许多孔基底18从装置盒100的外部成像。在使用已用结合剂功能化且通过光学窗40进行成像的多孔基底18的那些实施方式中，多孔基底18是布置在与成像装置的图像平面平行的刚性平面中的刚性基底，使得其不发生将导致检测到质量差图像的移动或移位。下文中将讨论刚性多孔基底18的优选属性和结构。

上部处理室14包括固体支持区域44，固体支持区域44是紧邻于多孔基底18上方的空间，其可由尺寸比多孔基底18中的孔的尺寸大的固定支持材料占据，使得材料因为无法通过多孔基底18而被保留在区域44中。支持材料能够结合感兴趣分析物或用作结合材料与可溶性材料之间反应的支持。

毛细管流动通道48将试剂室10与上部处理室14连接，并且设计成具有这样的内径，即规定尺寸以防止任一方向上的流动、直到施加的压差超过预选临界水平从而允许室10和14之间的流动。毛细管流动通道50将试剂室12与上部处理室14连接，并且设计成具有规定尺寸以防止任一方向上的流动、直到施加的预选压差超过临界水平从而允许室12和14之间的流动的内径。毛细管流动通道52将下部处理室16与出口室20连接，并且设计成具有规定尺寸以防止任一方向上的流动、直到施加的预选压差超过临界水平以允许流动的内径。例如，毛细管内径可选自50至500微米的范围，以提供0.1至0.5psi的临界压力。

通过由安装在始发室上的气动端口向包含流体的始发室施加压力且同时由安装在目标室上的气动端口使连接有毛细管通道的目标室排放，流动从一个室进行到下一个室。可选地，在使始发室排放的同时，负压差可被施加到目标室。在这两种情况下，必须提供足够的压差以克服通道的阻力并允许发生流动。

在两个试剂室之间需要使流体循环（例如，混合）的情况下，这些室之间的压差可从正变为负并返回到正。这将改变流体流动的方向。

试剂室10和12可包含通过从另一个室转移溶液而溶解在装置中的液体试剂或干燥试剂。试剂室10和12中的一个或多个可设计成接受来自外部源的样品或其它材料的引入。应注意，尽管仅示出了两个（2）试剂室10和12连接到上部处理室14，但是根据目前的应用可包括更多个。每个试剂室10和12设置有用于室10的端口26和用于室12的端口30，端口26和30可与能够在外部控制下向给定的室提供正压或负压或排放中的一个或多个的外部气动系统接合。

上部处理室14设置有端口28，端口28还可与能够在外部控制下向室提供正压或负压或排放中的一个或多个的外部气动系统接合。

当施加了超过临界压力的压差时，每个毛细管通道48、50和52的内径被选择为仅允许从一个室流经通道到另一个室。通道的长度可与所选择的内径结合地设计为处于5至30mm的范围内，以控制在1至60秒内使用处于0.1至1.5psi范围内的施加压力在室之间转移全部试剂容积所需的时间。每个毛细管通道48、50和52的内径可沿着通道是恒定的。可选地，通道48、50和52的一部分可具有较小的直径（例如，50至500μm），并且通道的其余部分可具有较大的直径（例如，500μm至2mm）。这种类型的通道48、50和52允许独立地选择临界压力和流速。

上部处理室14被规定尺寸为超过可在任何时间被转移到上部处理室14的试剂或样品流体的总容积。如图1中所示，将试剂室10连接到上部处理室14的毛细管通道48和将试剂室12连接到上部处理室14的毛细管通道50被定位成使得它们终止于上部处理室14的上部中，由此使得它们均位于室中所达到的最大液体水平的上方。上部处理室14的底部包括以如下方式连接到室14的主体的多孔基底18，即，当压差超过临界压力时，流体只能通过穿过多孔基底18而离开室14的底部。

上部处理室14还可包含固体支持件44，固体支持件44表现为珠子、颗粒、凝胶或能够结合来自室内流体的感兴趣材料或用作结合材料的支持件的其它类似材料的形式，以与包含在流体中的材料相互作用。这些固体支持材料44具有足以使它们被多孔基底18保留且不限制流过基底18的流动的尺寸。

多孔基底18还可包括用作固体支持件的材料或修饰为用作固体支持件，该固体支持件能够结合来自经过上部处理室14和下部处理室16之间的流体的感兴趣材料或用作结合材料的支持件，以与包含在流体中的材料相互作用。

多孔基底18由包含选择为向横跨其整个表面的流动提供均匀阻力的孔的材料构成，以便在横跨基底18的限定压差下，流体将经过孔，而气体（例如，空气）将不经过孔。孔的属性被选择使得对于流动的阻力将不被上部处理室14中的液体的重量克服，或允许毛细管作用以将流体从基底18中的孔完全抽出。多孔基底18的属性可选择性地被选择为要求压差以引发处于与引发流过毛细管48、50和52的流动所需的范围相同的范围中的流动，从而简化外部气动系统的设计。通过向包含流体的上部处理室14施加压力且同时使由多孔基底18分隔开的下部处理室16进行排放，来实现在上部处理室14与下部处理室16之间的流动。

可选地，负压可施加到下部室16，且同时使上部室14排放。在两种情况下，压差必须设置为处于以下范围内，即足以克服基底18中孔的阻力且允许发生液体流动，但低于克服对通过孔的空气流动的阻力所需的压差。该过程可反转以在相反方向上实现流动，从而允许与基底18和包含在上部室14中的任何固体支持件44重复接触并允许提供有效的混合。

下部处理室16设置有两个或更多个端口34（图1中仅示出一个），两个或更多个端口34可与能够在外部控制下向室16提供一个或多个正压或负压或排放的外部气动系统接合。下部处理室16具有等于或大于可在任何时间从室16转移的试剂或样品流体的最大容积的容积。

下部处理室16的基座定位成紧邻多孔基底18的下表面，而额外的容积可通过将室16的一部分在上部处理室14的外壁上方延伸以形成头部空间22来提供。

下部处理室16的下表面包括光学透明窗40，光学透明窗40允许使用例如电荷耦合器件（CCD）相机或其它合适的光学传感器对多孔基底18的下表面进行成像。

在超出待包含在出口室20中液体的最大水平的点处，下部处理室16通过从下部处理室16的最低点延伸并终止于出口室20上部中的一个或多个毛细管通道52与一个或多个出口室20连接。这些毛细管通道52中的至少一个定位在室16的最低水平处，以允许室16中基本上所有的液体通过通道52被移除。

一个出口室20可用于废料容纳，在这种情况下，其尺寸大于需要从下部处理室16输送的所有流体总和的容积。取决于要执行的测试，另一个出口室（未示出）可用于将流体输送到附加的下游室以用于进一步处理。

除了控制流体的流动之外，单独或与固体支持件44组合的多孔基底18可用于结合流体中的成分，并且经结合的成分可与本体流体分离、洗涤、修饰或复制、用作附加成分的结合剂，通过从装置上的室中顺序输送至少一种流体而回收以进一步使用或这些步骤的任何组合。

除了控制流体的流动之外，多孔基底18可设计成结合基底18的不同区域处的流体中的不同物质，随后检测和/或量化在基底18的不同区域处结合的物质。

单个装置100可包含一个或多个处理区域（示出了两个处理室14和16，但是可以包括更多个），一个或多个处理区域使用其整体多孔基底18来完成不同的功能，包括分析物捕获（核酸、蛋白质、小分子的其它生物或化学实体）、捕获的分析物的修饰（复制、延伸、扩增、标记、切割、水解）、通过固定化酶或催化剂修饰可溶性分析物、保留用于更高容量捕获的固体基质（珠子、颗粒、凝胶）、通过光学成像（比色、荧光、化学发光、生物发光）检测和/或定量一种或多种被捕获的分析物。在所有情况下，多孔基底18还用作执行这些功能所必需的流体控制装置。

图2至图6的侧视图示出了使用塑料制造的实际盒的侧视图，其中中心塑料盒试剂板82夹在上盒板80与下盒板84之间。图7示出了经组装的盒的照片，并且图2至图6可被视为从图7获得的剖视图。

图2和图3示出了将液体试剂或样品分配到上部处理室14中。在通过试剂/样品进入端口64进行测定之前，将液体试剂或样品60装载到试剂室10中，然后关闭端口64。经由端口26将约1psi的压力施加到包含液体60的室10，且同时使与上部处理室14连接的端口28排放，产生允许试剂经过试剂毛细管通道48流入上部处理室14的压差。液体60落到上部处理室14的底部并覆盖整体多孔基底18。任何多余的空气被允许经由端口28排放。分配流体的方法对于在测定中使用的所有其它试剂室是相似的，除了大量洗涤缓冲液（未示出）之外，该洗涤缓冲液存储在较大存储器中并通过毛细管通道定时地计量，以在分配期间可提供精确容积。

参照图4，为了拉动流体经过多孔基底18，通过端口28施加压力且通过端口28向大气排放而产生压差。所有其它端口在循环期间关闭。流体60从上部处理室14进入下部处理室16和头部空间22中。通过施加高于液体流过多孔基底18的临界压力、而不超过空气流过多孔基底18所需的临界压力的压差，流动继续直到所有液体60从上部处理室14中抽出，然后停止。这种设计确保了没有空气被吸入，从而消除了可能干扰盒的处理或操作的任何气泡。

参照图5，为了提供与固体支持件44单独或组合的多孔基底18重复接触并且为了确保有效的混合，流体60可通过反转处理而返回到上部处理室14中。通过向端口34施加压力且同时通过端口28向大气排放而产生压差。通过施加高于液体流过多孔基底18的临界压力、而不超过空气流过多孔基底18所需的临界压力的压差，流动继续直到所有液体60从下部处理室16抽回到上室14，然后停止。这个原理消除了对流体流动的任何精确容积控制的需求并大大简化了控制。通过基底18来回循环的处理可根据需要重复多次。

参照图6（a），在通过端口34向大气排放的同时通过室20上的端口36施加负压来实现流体从下部处理室16的排出。这允许空气通过下部处理室16进入头部空间22，并允许液体60从下部室16的一侧行进经过远端废料毛细管通道66并且穿过近端废料毛细管70，其中，下室16的所述一侧与倒入室20中的废料进口76联接，并且近端废料毛细管70与从室16的另一侧离开的近端废料出口72联接，室16的所述另一侧与将液体60倾倒入室20中的废料出口78联接。

图6（b）示出了包括一次性盒100以及专用吸塑包装130的试剂盒，其中专用吸塑包装130包含多个包装134和匹配垫片132，包装134包含所选液体测定试剂，匹配垫片132与包含有与塑料盒试剂板82中的预选试剂室对齐的测定试剂的包装134匹配。具有上盒板80的经组装的盒100包括部分地突出到其相应试剂室中的包装134。当插入到仪器中以实施生物测定时，通过与各个室的板80（未示出）上的气动端口联接的气动系统施加压力导致吸塑包装中的易碎密封件破裂，由此导致试剂流入她们各自的室中。垫片132提供室之间的液体和气体密封件。在盒100的组装之前，附加的固体试剂可沉积到塑料盒试剂板82内的预选试剂室中，从而为用于期望生物测定的试剂选择的定制提供灵活性，并且简化了存储和输送要求。

应注意，图7是经组装的盒的照片，其中示出了与中央上部处理室14连接的五（5）个试剂/样品室10。该照片示出了没有与盒的气动连接的盒。核酸生物测定（图25）和蛋白质生物测定（图26）使用图7所示的经组装的盒来执行。

核酸的分析通常需要分离核酸以及得到它们的标记副本以用于随后检测的处理步骤。许多应用需要分析许多不同的靶序列，并且通常需要高分析灵敏度。此外，将需要自动化的、具有成本效益的系统，以使相对不熟练的人能够可靠地对常规临床测试执行测试。

多核酸靶标的纯化和扩增可通过捕获固体支持件上的核酸并在支持件上进行一系列孵育和洗涤步骤来执行，以产生核酸的衍生物，该核酸的衍生物可通过排列在多孔基底上的核酸探针上的杂交来进行分析。

图8及其包括的图例示出了生物测定盒200的配置的俯视图，其中生物测定盒200并入盒100的设计，但配置成用于核酸样品制备和核酸扩增（等温或聚合酶链式反应（PCR））和产物的多重检测。盒200配置成用于在处理室A 209中使用一个多孔支持件18的样品制备，以及在处理室B 224中使用第二多孔基底18的反应产物检测，其中，处理室A 209和处理室B 224各自包括通过多孔基底18相隔开的上部处理室14和下部处理室16。

盒200提供有样品入口208、用于将样品与裂解缓冲液或预处理缓冲液混合的装置210、含有多孔基底18的处理室209，在该多孔基底18中对来自样品的核酸的捕获和修饰可使用室205、207、201、202、203、204或206提供的经干燥或液体试剂来执行。来自处理室A209的流体可以输送到废料室A 226，或者在含有衍生物核酸的流体的情况下，输送到热处理室A 211或中间室A 212。

室212可用于将流体与室213中经干燥的试剂或液体试剂混合。随后，流体可通过一个或多个温度处理室214、216来处理，其中，在一个或多个温度处理室214、216中可能发生等温或热循环扩增。这些热处理室211、214、216通过绝热区域215与盒的大部分隔离，并且通过外部热控制组件108（图9）的热量施加或冷却来控制。包含扩增的衍生物核酸的经处理液体然后被输送到中间室B 218中、与用于杂交至多孔基底18的适当的结合缓冲液219混合、定位在样品处理室B 224中，其中在样品处理室B 224中，在多孔基底18上的特定位置中的结合核酸探针上检测衍生核酸。

如前所述的一系列步骤使用来自相邻的室217、220、222、223、225的试剂来执行，其中废液流体被引导至废料室B 227。在所有情况下，通过位于每个室上的端口施加的气动压力用于控制流体运动。作为最终步骤，利用具有位于光学窗40（图1）下方的整体透镜120（图10）的CCD相机捕获多孔基底18的图像。针对横跨多孔基底测量的且与已知含有固定化探针的特定区域相关的光的强度，对该图像进行分析。该信息用于计算原始样品中的特定核酸的存在性或不存在性或数量。

一般来说，使用上述公开的设计原理，盒可配置成具有多个试剂/样品室/存储器、上部处理室14和下部处理室16以及废料室20。例如，废料室20实际上可为接收来自包括第一上部处理室14和第二下部处理室16的第一处理站的反应产物的中间室，其中室20形成用于第二系列上部处理室14和下部处理室16的样品室。

应当理解，盒200可配置有附加特征，以允许在第一组和第二组上部处理室14和下部处理室16之间执行许多中间处理步骤。这些中间处理步骤的非限制性示例可包括混合、稀释、孵育、包括但不限于热循环的热处理，以给出若干示例。选择性地，盒200可包括试剂室228，试剂室228包含清洁剂，清洁剂被选择为用于破坏或中和测定或样品的有害产物。

利用本文中公开的一次性盒的图8的系统非常适合于进行上述核酸测定，例如在美国专利公开第15/561,083号中公开的核酸测定法，该美国专利公开的全部内容通过引用并入本文，其为于2016年3月29日提交的PCT/2016/050367的国家阶段专利申请。因此，本公开提供了一种盒，该盒在一个实施方式中包括两个不同的多孔基底，每个多孔基底具有上部和处理室，其中一个是用于纯化多个靶核酸并处理靶核酸以产生衍生核酸的固体支持件，另一个是在结合的核酸探针上检测衍生核酸的多孔基底。本盒与设计成用于操作其的仪器一起，在插入样品之后接收样品并提供临床相关信息，而无需用户干预。

通过免疫结合反应分析生物样品（例如，人血清）中的蛋白质通常需要在免疫结合反应之前稀释样品。本公开提供了包括两个不同的多孔基底18的一次性盒的实施方式，两个不同的多孔基底18中的每个具有相关联的上部处理室14和下部处理室16，联接的室14和16中的一个可用于将样品与稀释剂混合，联接的室14和16中的第二个包括流通式多孔基底18，在流通式多孔基底18上通过免疫结合反应来检测蛋白质。

特定容积的样品和稀释剂被输送到位于第一多孔支持件18上方的上部处理室14，并通过使溶液通过多孔基底18进入下部处理室18来混合，并且在经稀释的样品从第一下部处理室16输送到位于第二多孔基底18上方的第二缓冲处理室14以用于在第二多孔基底18上进行检测之前，特定容积的样品和稀释剂在室14和16之间气动地来回循环或驱动至少一次。第一多孔基底18可包含固定的结合剂，固定的结合剂将结合样品中的特定成分。例如，在第二多孔基底18上执行免疫结合步骤之前，可能通过结合到第一多孔基底18来移除干扰物质。

在另一情况下，低丰度物质可通过结合到第一多孔基底18而从较大容积中浓缩，然后在第二多孔基底18上执行免疫结合步骤之前以较高浓度释放较小的容积，以提高检测的灵敏度。

图9示出了夹置在上气动块组件接口106与形成有供盒104插入的仪器的一部分的下热控制组件108之间的一次性盒14的局部分解图。气动接口106包括需要联接到盒104的气动端口的所有必需的气动联接部件、管等。所有这些部件容纳在接口106中，并且不形成一次性盒104的一部分。

相似地，热控制组件108包含所有必需特征，诸如加热器、温度传感器和相关联的控制器、微处理器等，以控制盒104的选定区域中的温度。热控制组件108包括中心孔110，当与盒104组装时，中心孔110与光学窗40对准以允许多孔基底18的成像。图10是图9的夹置结构的局部剖视图，其中示出了定位成观察组装系统中的多孔基底18的检测器。包括适当物镜的检测器120被配置成对多孔基底18的底侧进行成像，以检测比色的、荧光的、化学发光的或生物发光的信号的存在性。

生产多孔基底18的优选材料是刚性且对化学发光发射是不透明的硅。该不透明度防止基底的不同孔之间的串扰，并因此防止具有不同结合剂的基底上紧密间隔的区域之间的串扰。因为可紧密布置不同的结合剂，所以这允许在小型装置中分析许多分析物。作为示例，基底可包含尺寸处于1至15微米范围内的孔，其中，孔之间的壁厚度处于1至5微米的范围内。

参照图11的（a）至图14的（c），在多孔基底18的实施方式中，两个相对的侧具有不同的孔径。从图11的（a）至图14的（c）可看出，收集光的基底18的、能够进行检测和分析的一侧具有基本上更宽的孔，并且该侧是面向下部反应室16并且面对使检测器120（图10）与之相隔开的光学窗40的一侧。从图11的（a）至（c）可领会，该表面上的孔的壁是锥形的，而不是垂直于表面。这种几何形状对检测光学元件呈现更大的表面积，并且对孔内光的透射的限制较少。尽管前表面上具有大孔和大的孔隙率，但是由于相对侧上具有小的孔径并且在孔之间存在着大量材料，所以基底18对于流通应用具有足够的强度和结构稳定性。

图15的（a）和（b）中示出了基底的显著不对称的光学属性。具体地，图15的（a）和图15的（b）示出了多孔基底的透光性因孔的锥形而改进。图15的（a）和图15的（b）中示出了当由相同的漫射光源照射时的相同基底。在图15的（a）中，孔的加宽部分面向物镜，并且在图15的（b）中，孔的窄部分面向物镜。基底上的斑点是其中基底的孔已被孔中干燥的探针溶液阻挡的区域。

由于可收集光的深度的增加、孔的上部的发射表面积的增加以及收集角度的增加，孔壁的锥形提供了对光收集的改进。图16的（a）至图16的（c）中示出了光收集效率的这些机构，图16的（a）示出了有效深度增加的效果，图16的（b）示出了收集角度增加的效果，并且图16的（c）示出了表面积增加的效果。

图17中示出了对于本申请中描述的方法的具体实现方案的这些效果的评估结果，其中示出了光收集效率与8μm的直孔的孔深度的函数的计算结果（曲线（a））和光收集效率与具有锥形壁的孔的函数的计算结果（曲线（b））。用于评估的参数为：1）孔的非锥形部分的宽度为8μm；2）孔之间的壁厚度为4μm；3）基底厚度为350μm；4）锥角度为2度；5）物镜的直径为25.4mm；以及6）物镜的工作距离为50mm。

在图17中，曲线的平坦部分的上升由收集表面积的增加引起，曲线的位移由孔深度的增加引起，由此光收集被光学组件的参数而非孔壁限制，曲线的斜率中的变化与收集角度的变化相关联。其结果是，光收集效率预期改进了1.4至1.5倍。

使用硅的基底18已被用于制造流通式芯片，在流通式芯片上不同的探针已固定在离散区域或点上。相同的流通式芯片已制造有具有高度多孔的硅基底且具有与表面垂直的孔壁。当这些流通式芯片与相同的靶分子杂交并用相同的方法进行处理以检测附接到由探针结合的靶分子的化学发光标记时，信号强度比本发明所述的基底（图18）大约大40％。这个实验结果证实了由于孔的锥形来提高效率的理论评估。增强的光学检测灵敏度提高了对芯片执行的测定的灵敏度和/或提高了测定系统的产量。

只要孔壁的内平面不限制光收集，所建议的方法就对锥角度的特定选择不是很敏感。对于上述所列参数，锥角度可在0.3度至（孔壁沿全部孔深度呈锥形）至约14度之间的范围内选择。这个范围之外的角度的锥形仍然会增加收集的光量，但是改进将不太明显。应注意，特定锥角度和锥形深度的选择可额外地受到基底制造工艺、所选孔径和膜厚度的影响。

孔的几何形状不需要是正方形。如果制造工艺需要，它们可具有不同的截面，例如圆形。在这种情况下，孔是圆柱形的（参见图19的（a）、图19的（b）至图21的（a）、包括图21的（b））。在这种情况下，如图19的（a）和图19的（b）中所示，锥形的最简单形式是圆锥形的。光收集效率可通过将锥形形状从圆锥形改变到球形（参见图20（a）和图20（b））或改变到抛物线形（图21的（a）和图21的（b））而附加地增加。

不同截面（圆形、正方形、多边形）的孔被导出以供实践：图13的（a）至图13的（c）中示出了这些硅基底的微观照片。与图22的（a）的包装结构的收集效率相比，具有圆柱形孔的基底的光收集效率可通过如图22的（b）所示的更密集布置的孔而附加地提高。

基底材料的结构稳定性取决于材料的类型（例如，硅或塑料）及其厚度。如果基底是薄的或/和材料是柔性的或柔软的，则增强框架可用于加强基底（参见图23和图24）。基底可附接到单个框架（参见图23），或者优选地夹置在两个框架之间（参见图24），以允许双向施加如上所述用于驱动流体穿过多孔基底所需的压力，而不损坏基底。

总之，本公开提供了用于执行多重生物测定的一次性样品处理盒，其中盒被设计和配置为提供复杂的流体处理，而不需要主动泵送和安装阀。盒通过使用标准模制技术容易地生产，不需要纳米结构，也不需要精确的容差。样品和试剂流体的移动仅通过应用压差来确定，压差主要与样品基底18的属性相关，即，基底18中孔径和分布以及毛细管通道（例如，48）的内径。与通常包含主动泵、主动阀等现有系统相比，本文所公开的盒有利地不包含移动部件并且通常由少量的部件制成。

本文公开的盒可用于，但不限于用于对蛋白质抗原分析的夹心免疫测定或竞争性免疫测定；与对于过敏、自身免疫、感染性疾病的固定化抗原结合的血清学；DNA、RNA、mRNA、微RNA（miRNA）等的核酸测定，以鉴别其存在或表达与疾病的存在或进展相关的具体序列、能够用于鉴别样品中细菌、真菌、病毒的种类的序列、指示病原体中特异性抗性基因的存在的序列、与病毒风险相关的拷贝数变异（CNV）或特异性基因变体或缺失的测量、用于为取证或鉴定目的键入样品的基因标记。此外，其可用于包括药物和环境污染物的小分子测量。其还可用于多个样品基质，包括人和动物流体和组织、食品和农业样品、环境样品、细胞和细胞裂解物以及生物处理流体。

现在将使用核酸测定法和蛋白质测定法提供本文所公开的一次性盒的非限制性示例性用途。

实施例

图25的（a）示出了核酸生物测定的结果，其中使用图7中所示的盒来处理样品，该样品包含表示来自细菌样品的特定基因序列的副本的生物素标记的PCR产物。在组装盒之前，将多孔基底18功能化为不连续的区域以形成分析点，每个分析点的直径为约200μm，其中寡核苷酸探针包含与已发生在扩增的细菌基因中的序列互补的序列（+ve探针1、2、3、4），不知发生在扩增的细菌基因中的序列（-ve探针1、2）或与添加到样品中的人造寡核苷酸互补的序列（基准）。另外，固定有寡核苷酸探针的一个空白位点被用作控制件以测定背景信号。使用了5个单独的试剂孔10和散装室87。

试剂室分别独立地装载有封闭缓冲液、杂交缓冲液、样品、链霉亲和素-HRP和化学发光基底。散装存储器87装载有洗涤缓冲液。试剂按照图3中所示的各个步骤输送到上部处理室。然后将每个液体输送到如图4中所示的下部处理室中，然后返回如图5中所示的上部处理室。

如图6所示，在按照每个步骤所需次数多次重复该循环往复通过多孔基底18之后，将试剂移除到废料室。在每个步骤之间，相似地处理来自散装室87的洗涤缓冲液的等分试样。顺次步骤完成了多孔基底的阻断以防止非特异性结合、样品中PCR产物与固定在多孔基底18上离散区域中的互补序列的探针的杂交、将链霉亲和素-HRP与捕获的PCR产物上的生物素标记进行结合、以及引入可通过捕获到的HRP酶进行处理以在该特定区域产生化学发光发射的化学发光基底。

在最终步骤期间，利用位于光学窗40下方的CCD相机120拍摄多孔基底18的图像。对图像图25的（b）进行分析，以测量横跨多孔基底并与已知含有固定化探针的特定区域相关的光的强度。图25的（a）示出了相同样品的三次重复生物测定的发光强度。将注意到，在通过将包含互补序列的探针固定到样品中预期基因序列（+ve探针1、2、3、4）而形成的分析点上观察到显著的信号，在通过将包含互补序列的探针固定到样本中未预期的基因序列（-ve探针1、2）而形成的分析点上观察到最小信号。如预期的，在空白分析点上没有观察到信号，并且在包含与分析前添加到样品中的人造寡核苷酸的互补序列分析点上观察到实质信号。

图26示出了对人血清或控制缓冲液的蛋白质生物测定的结果，以确定使用图7中所示的盒进行的抗体对于麻疹病毒的存在。在组装盒之前，将多孔基底18功能化在离散区域中以形成分析点，每个分析点的直径为约200μm，具有去活化的麻疹病毒制剂。四个试剂室分别独立地装载有封闭缓冲液、样品、HRP标记的抗人免疫球蛋白G和化学发光基底。散装存储器87装载有洗涤缓冲液。

试剂按照图3中所示的各个步骤输送到上部处理室。然后将每个液体输送到如图4中所示的下部处理室中，然后返回如图5中所示的上部处理室。如图6所示，在按照每个步骤所需的次数重复多次该循环往复通过多孔基底18之后，将试剂移除至废料室。在每个步骤之间，相似地处理来自散装室87的洗涤缓冲液的等分试样。顺次步骤完成了多孔基底的阻断以防止非特异性结合、来自包含固定在多孔基质18上的离散区域中麻疹病毒的组分特异性区域的任何免疫球蛋白样品的结合、将与HRP酶接合的抗人免疫球蛋白G抗体结合至任何保留的抗麻疹免疫球蛋白、以及引入可由经结合的HRP酶进行处理以在该特定区域中产生化学发光的化学发光基底。

在最终步骤期间，利用位于光学窗40下方的CCD相机120拍摄多孔基底18的图像。对该图像进行分析，以测量跨过多孔基底并与已知含有固定病毒的特定区域相关的光的强度。图26中的图表示出了三种样品记录的发光强度。应注意，从已知对麻疹病毒（阳性血清）免疫的患者抽取的血清样品中观察到与麻疹特异性抗体的存在对应的显著信号。从已知对麻疹病毒（阴性血清）降低免疫力的患者的血清中观察到明显较低的信号。从不包含任何麻疹特异性抗体的控制缓冲液样品观察到最小信号。

图27的（a）示出了利用两个不同的多孔基底进行处理的结果，两个不同的多孔基底中的每个具有上部和处理室，其中一个是用于捕获蛋白质分析物的固体支持件，其中另一个是在其上对经接合的蛋白特异性受体检测蛋白质分析物的多孔基底。在该实施例中，将包含生物素化小鼠IgG分析物的相同样品循环通过用已知具有对小鼠IgG具有高结合亲和力的兔抗小鼠抗体功能化的多孔基底18（经处理的样品）、或者循环通过未被功能化的多孔基底18（未经处理的样品）。

然后，所产生的流体通过已功能化在离散区域中的多孔基底进行处理以形成分析点，每个分析点的直径为约200μm，其中，具有对小鼠IgG的高结合亲和力的已知兔抗小鼠抗体或者生物素化牛血清白蛋白用作基准点。依次执行洗涤、链霉抗生物素蛋白-HRP与任何经捕获的生物素-小鼠IgG和固定生物素-BSA的结合、以及引入可由经结合的HRP酶进行处理以产生该特定区域中的化学发光发射的化学发光基底。在最终步骤期间，利用位于光学窗40下方的CCD相机120拍摄多孔基底18的图像。用兔抗小鼠IgG功能化的每个点的强度与溶液中存在的生物素化小鼠IgG分析物的量相关。

图27的（a）示出了当在用于检测的第二多孔基底18上处理时，由第一功能化多孔基底18（经处理的）处理的样品几乎完全耗尽了小鼠IgG分析物。还可观察到，当在用于检测的第二多孔基底18上处理时，由第一非功能化多孔基底18（未处理的）处理的样品表现出高水平的小鼠IgG分析物。

图27的（b）示出了对于经处理的样品由CCD相机120从第二多孔基底18捕获到的信号。仅在基准生物素化BSA分析点上观察到显著信号。图27的（c）示出了对于未经处理的样品由CCD相机120从第二多孔基底18捕获到的信号。可从基准生物素化BSA和生物素化小鼠IgG这两者的分析点观察到显著信号。这说明在对第二多孔基质18检测和定量之前，使用通过分析物特异性试剂功能化来耗尽那些分析物的第一多孔基底18的高效率。作为示例，这可用于移除或消耗可能干扰对第二多孔基底18的分析的物质。

Claims (22)

1.一种用于检测表面结合目标分析物分子的微多孔基底，包括：

平坦的微多孔基底材料，所述微多孔基底材料具有相对的表面和微孔，所述微孔具有结合在其中的与所述目标分析物分子互补的分析物特异性受体，所述微孔具有延伸通过所述微多孔基底的厚度的锥形壁，其中，所述微孔在所述微多孔基底的一个表面附近比所述微孔在所述相对的表面上的宽度更宽，以与当所述微孔是直孔而不是锥形孔时从当所述目标分析物分子由所述分析物特异性受体捕获时结合到所述目标分析物分子的光学探针发出的光的收集效率相比，增大从所述光学探针发出的光的收集效率，所述光的收集效率由与所述微多孔基底的面向较大的微孔开口的一侧间隔开的光检测器检测。

2.根据权利要求1所述的微多孔基底，其中，所述微孔具有均匀的尺寸和形态。

3.根据权利要求1所述的微多孔基底，还包括增强肋以提供结构稳定性。

4.根据权利要求3所述的微多孔基底，其中，所述增强肋为所述微多孔基底的组成部分。

5.根据权利要求3所述的微多孔基底，其中，所述增强肋与所述微多孔基底相隔开，并且以刚性支承网的形式制成。

6.根据权利要求5所述的微多孔基底，其中，所述微多孔基底附接到支承网，所述支承网放置在所述微多孔基底的与具有锥形孔的表面相对的表面上。

7.根据权利要求6所述的微多孔基底，其中，所述微多孔基底位于放置在所述微多孔基底的相对侧上的两个支承网之间。

8.根据权利要求1所述的微多孔基底，其中，所述微多孔基底具有在0.15至0.75mm之间的厚度。

9.根据权利要求1所述的微多孔基底，其中，所述微孔的锥形表面被反射涂层覆盖。

10.根据权利要求1所述的微多孔基底，其中所述微多孔基底由硅制成。

11.根据权利要求1所述的微多孔基底，其中所述微多孔基底通过硅的电化学蚀刻制成。

12.根据权利要求1所述的微多孔基底，其中所述微多孔基底通过塑料材料的压塑或模制制成。

13.根据权利要求1所述的微多孔基底，其中，所述微多孔基底材料是不透明的，以使得来自一个微孔的光不能输送到所述微多孔基底内的相邻的微孔。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的微多孔基底，其中，所述微孔具有矩形截面。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的微多孔基底，其中，所述微孔具有正方形截面。

16.根据权利要求1至13中任一项所述的微多孔基底，其中，所述微孔具有圆形截面。

17.根据权利要求16所述的微多孔基底，其中，所述锥形是圆锥形的。

18.根据权利要求16所述的微多孔基底，其中，所述锥形是球状锥形的。

19.根据权利要求16所述的微多孔基底，其中，所述锥形是抛物线状锥形的。

20.嵌入生物测定中的用于检测表面结合目标分析物分子的微多孔基底，包括：

微多孔基底，具有相对的表面和延伸通过所述微多孔基底的厚度的相隔开的锥形微孔，其中，所述微孔的开口在所述微多孔基底的所述相对的表面中的一个上比所述微孔在所述相对的表面上的开口更宽，与所述目标分析物分子互补的分析物特异性受体位于所述微多孔基底的具有加宽的微孔的一侧上的微孔中，所述微多孔基底的特征在于，

与当所述微孔是直孔而不是锥形孔时从当所述目标分析物分子由所述分析物特异性受体捕获时结合到所述目标分析物分子的光学探针发出的光的收集效率相比，从所述光学探针发出的光的收集效率增大，所述光的收集效率由与所述微多孔基底的面向较大孔开口的一侧间隔开的光检测器检测。

21.根据权利要求20所述的微多孔基底，其中所述微多孔基底由硅制成。

22.根据权利要求21所述的微多孔基底，其中所述微多孔基底通过硅的电化学蚀刻制成。

Images