EA011753B1 - Диагностическая система для проведения амплификации и детекции последовательностей нуклеиновых кислот - Google Patents
Диагностическая система для проведения амплификации и детекции последовательностей нуклеиновых кислот Download PDFInfo
- Publication number
- EA011753B1 EA011753B1 EA200601377A EA200601377A EA011753B1 EA 011753 B1 EA011753 B1 EA 011753B1 EA 200601377 A EA200601377 A EA 200601377A EA 200601377 A EA200601377 A EA 200601377A EA 011753 B1 EA011753 B1 EA 011753B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- fluid
- unit
- nucleic acid
- lysis
- flow
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 94
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 39
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims description 27
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 137
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 83
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 67
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 66
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000004891 communication Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 68
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 67
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 45
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 37
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 28
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 28
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 28
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 24
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 22
- 239000012156 elution solvent Substances 0.000 claims description 19
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 16
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 8
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 5
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 claims description 4
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 4
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000004720 dielectrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 3
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000002032 lab-on-a-chip Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 39
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 25
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 24
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 23
- 239000000463 material Substances 0.000 description 20
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 15
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 15
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 14
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 14
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 13
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 13
- -1 for example Substances 0.000 description 12
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 10
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 238000004094 preconcentration Methods 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- JBRZTFJDHDCESZ-UHFFFAOYSA-N AsGa Chemical compound [As]#[Ga] JBRZTFJDHDCESZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001218 Gallium arsenide Inorganic materials 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 2
- 208000007727 Muscle Tissue Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101800000684 Ribonuclease H Proteins 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 208000021592 benign granular cell tumor Diseases 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 229910010293 ceramic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 2
- 238000000708 deep reactive-ion etching Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004070 electrodeposition Methods 0.000 description 2
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000005468 ion implantation Methods 0.000 description 2
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 2
- 238000003754 machining Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 238000004377 microelectronic Methods 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 201000004130 myoblastoma Diseases 0.000 description 2
- 125000002524 organometallic group Chemical group 0.000 description 2
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 2
- 229920001707 polybutylene terephthalate Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 2
- 238000001947 vapour-phase growth Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- PFNQVRZLDWYSCW-UHFFFAOYSA-N (fluoren-9-ylideneamino) n-naphthalen-1-ylcarbamate Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1=NOC(=O)NC1=CC=CC2=CC=CC=C12 PFNQVRZLDWYSCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- WUPHOULIZUERAE-UHFFFAOYSA-N 3-(oxolan-2-yl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC1CCCO1 WUPHOULIZUERAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 229910005540 GaP Inorganic materials 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 229910000673 Indium arsenide Inorganic materials 0.000 description 1
- GPXJNWSHGFTCBW-UHFFFAOYSA-N Indium phosphide Chemical compound [In]#P GPXJNWSHGFTCBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000005083 Zinc sulfide Substances 0.000 description 1
- LVQULNGDVIKLPK-UHFFFAOYSA-N aluminium antimonide Chemical compound [Sb]#[Al] LVQULNGDVIKLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDPILPRLPQYEEN-UHFFFAOYSA-N aluminium arsenide Chemical compound [As]#[Al] MDPILPRLPQYEEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910052980 cadmium sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+);selenium(2-) Chemical compound [Se-2].[Cd+2] UHYPYGJEEGLRJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- WVIIMZNLDWSIRH-UHFFFAOYSA-N cyclohexylcyclohexane Chemical group C1CCCCC1C1CCCCC1 WVIIMZNLDWSIRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003989 dielectric material Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005370 electroosmosis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- VTGARNNDLOTBET-UHFFFAOYSA-N gallium antimonide Chemical compound [Sb]#[Ga] VTGARNNDLOTBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZXMRANICFIONG-UHFFFAOYSA-N gallium phosphide Chemical compound [Ga]#P HZXMRANICFIONG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 229910052732 germanium Inorganic materials 0.000 description 1
- GNPVGFCGXDBREM-UHFFFAOYSA-N germanium atom Chemical compound [Ge] GNPVGFCGXDBREM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000017525 heat dissipation Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- RPQDHPTXJYYUPQ-UHFFFAOYSA-N indium arsenide Chemical compound [In]#[As] RPQDHPTXJYYUPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003475 lamination Methods 0.000 description 1
- 239000011133 lead Substances 0.000 description 1
- 229910052981 lead sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940056932 lead sulfide Drugs 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000007769 metal material Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000005459 micromachining Methods 0.000 description 1
- 238000001921 nucleic acid quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000001020 plasma etching Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- GGYFMLJDMAMTAB-UHFFFAOYSA-N selanylidenelead Chemical compound [Pb]=[Se] GGYFMLJDMAMTAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- OCGWQDWYSQAFTO-UHFFFAOYSA-N tellanylidenelead Chemical compound [Pb]=[Te] OCGWQDWYSQAFTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYUZTTNXJUJWQQ-UHFFFAOYSA-N tin telluride Chemical compound [Te]=[Sn] WYUZTTNXJUJWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052984 zinc sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- DRDVZXDWVBGGMH-UHFFFAOYSA-N zinc;sulfide Chemical compound [S-2].[Zn+2] DRDVZXDWVBGGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
- G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
- G01N27/44782—Apparatus specially adapted therefor of a plurality of samples
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/04—Closures and closing means
- B01L2300/046—Function or devices integrated in the closure
- B01L2300/048—Function or devices integrated in the closure enabling gas exchange, e.g. vents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/04—Closures and closing means
- B01L2300/046—Function or devices integrated in the closure
- B01L2300/049—Valves integrated in closure
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
- B01L2300/0645—Electrodes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/18—Means for temperature control
- B01L2300/1805—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks
- B01L2300/1822—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks using Peltier elements
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4005—Concentrating samples by transferring a selected component through a membrane
- G01N2001/4016—Concentrating samples by transferring a selected component through a membrane being a selective membrane, e.g. dialysis or osmosis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T156/00—Adhesive bonding and miscellaneous chemical manufacture
- Y10T156/10—Methods of surface bonding and/or assembly therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Ultrasonic Waves (AREA)
- Stabilization Of Oscillater, Synchronisation, Frequency Synthesizers (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Интегрированная диагностическая система "лаборатория-на-чипе" для осуществления процесса подготовки образца на образце текучей среды, содержащем клетки и/или частицы, которая включает:(a) входное отверстие для образца текучей среды;(b) блок лизиса для лизиса клеток и/или частиц, содержащихся в образце текучей среды;(c) блок экстракции нуклеиновой кислоты для экстракции нуклеиновых кислот из клеток и/или частиц, содержащихся в образце текучей среды;(d) резервуар, содержащий текучую среду для лизиса;(e) резервуар, содержащий растворитель для элюирования для перемещения нуклеиновых кислот, накапливающихся в блоке экстракции нуклеиновой кислоты;в которой входное отверстие для образца сообщается с блоком лизиса посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан;в которой блок лизиса сообщается с блоком экстракции нуклеиновой кислоты посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан;в которой резервуар, содержащий текучую среду для лизиса, сообщается с блоком лизиса посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан; ив которой резервуар, содержащий растворитель для элюирования, сообщается с блоком экстракции нуклеиновой кислоты посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан.
Description
Настоящее изобретение относится к экстракции нуклеиновой кислоты (НК), и в частности к интегрированной диагностической системе лаборатория-на-чипе для проведения комбинированной экстракции и концентрации НК. Система может применяться для проведения амплификации и детекции последовательности НК в жидком образце, содержащем клетки.
Существует значительный интерес к разработке упрощенных систем анализа для детекции биологических молекул, которые могли бы позволить неквалифицированному пользователю выполнять сложные процедуры анализа без излишних ошибок. Кроме того, существует большая заинтересованность в разработке систем закрытого анализа, для которых требуется минимальное количество жидких реагентов и которые могут быть автоматизированы для выполнения процедуры анализа при минимальном вмешательстве со стороны пользователя и, предпочтительно, уменьшены в размере для получения удобной системы для тестирования в удобном для пользователя месте. Это особенно важно в области здравоохранения, главным образом, в диагностике, где наблюдается возрастающая потребность в системах биологического анализа, которые можно эффективно и безопасно применять в кабинете врача-хирурга, клинике, ветеринарном хирургическом кабинете или даже на дому у пациента или на открытой местности.
Микроустройства лаборатория-на-чипе являются приемлемым вариантом для осуществления закрытых биологических реакций, для которых минимальное использование требуется пользователю реагента, а также которые позволяют использовать малые объемы образцов, что является значительным преимуществом для биологических реакций, для которых требуются дорогостоящие реагенты.
Для достижения как очистки, так и для предварительного концентрирования химики-аналитики, в основном, прибегали к любому способу экстракции. Эти способы включают удаление интересующих аналитов из матрицы образца или, в другом варианте, удаление всех других составляющих из матрицы образца, оставляя интересующие аналиты. Способы экстракции могут включать перенос образцов из одной жидкой фазы в другую или фиксацию образцов из жидкой фазы на твердую поверхность. В первом случае предварительное концентрирование образцов, в общем, не достигается, если растворитель активно удаляется из фазы, содержащей эти образцы. Однако в последнем случае может быть достигнуто предварительное концентрирование, если: (а) доступный участок связи является достаточно большим, чтобы связать количество молекул, большее, чем присутствует в растворе в контакте с поверхностью в любой момент времени, и (Ь) образцы могут быть эффективно удалены из твердой фазы с использованием лишь небольшого количества растворителя для элюирования. Так как предварительное концентрирование является важным аспектом процедуры предварительной обработки образца нуклеиновой кислоты, то было принято использовать экстракцию твердой фазы. Известный способ экстракции нуклеиновой кислоты включает связывание ДНК с частицами окиси кремния в присутствии хаотропного агента (см. Воот с1 а1., 1. Οΐίη. ΜίοτοΜοΙ. 1990, 28, 495-503). В настоящем изобретении предусмотрена интеграция способа твердофазной экстракции ДНК в микрогидравлические устройства.
В настоящем изобретении могут быть комбинированы экстракция и концентрация НК.
Применяемый здесь термин микроустройство или система означает любое устройство, произведенное с применением технологий, которые обычно, но не исключительно, применяются в серийном производстве полупроводниковых микроэлектронных устройств и в последние годы для продукции полупроводниковых микромеханических устройств. Подобные технологии микрообработки включают, например, эпитаксиальное выращивание (например, парофазное, жидкофазное, молекулярно-пучковое, металлоорганическое химическое парофазное осаждение), литографию (например, фото-, электроннолучевую, рентген-, ионно-лучевую), травление (например, химическое, газофазное, плазменное), электроосаждение, распыление, диффузионное легирование и ионную имплантацию. Несмотря на то, что могут применяться некристаллические материалы, такие как стекло, микроустройства обычно получают на кристаллических полупроводниковых субстратах, таких как оксид силикона или арсенид галлия, преимуществом которых является возможность электронных схем интеграции в систему обычными технологиями производства интегральных схем. Комбинации микрокомпонента с одним или несколькими другими элементами, такими как стеклянная пластинка или дополнительный микроэлемент, часто применяются и могут находиться в объеме применяемого здесь термина придание микроформы. Также в объем термина придание микроформы входят полимерные реплики, полученные, например, из кристаллического полупроводникового субстрата.
Выделение и очистка ДНК и/или РНК от бактериальных клеток и вирусных частиц является основной стадией во многих областях, например в диагностике, мониторинге окружающей среды, судебной медицине и исследованиях в области молекулярной биологии.
Придание микроформы является эффективным способом конструирования для производства устройств для осуществления биологических процессов, при которых требуются очень небольшие объемы образцов, таких как секвенирование и детекция ДНК.
Одно такое устройство для осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей стадией детекции раскрыто в патенте США № 5674742. Для переноса ДНК-праймеров, реагентов полимеразы и реагентов нуклеотидов из трех отдельных камер хранения в единую реакционную камеру, если требуется осуществление процесса ПЦР, при необходимости, с циклическим изменением температуры в реакционной камере, применяются генераторы волн Лэмба.
- 1 011753
Другое микроустройство для осуществления стадии химической реакции, сопровождаемой шагом электрофоретического разделения, раскрыто в Лиа1уйса1 СйешШту 1994, 66, 4127-4132. Травленные структуры в силиконовом субстрате, покрытом стеклянной пластинкой, обеспечивают реакционную камеру и связи с резервуарами для буфера, аналита, реагента и для отходов аналита, а также столбец электрофореза, связанный с резервуаром для отходов.
Амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (ΝΑ8ΒΑ), является праймерзависимой технологией, которая может применяться для непрерывной амплификации нуклеиновых кислот в отдельной смеси при неизменной температуре (способ изотермической амплификации нуклеиновой кислоты), и является одним из первых описанных способов амплификации РНК на основе транскрипции. Для амплификации нуклеиновой кислоты ΝΑ8ΒΑ обычно является простой и быстрой альтернативой ПЦР и способна осуществить амплификацию миллиарда участков РНК за 90 мин. По отношению к другим системам амплификации, таким как технология ПЦР, способность ΝΑ8ΒΑ однородно и изотермически амплифицировать РНК аналитов расширяет широту ее применения от диагностики вирусов до индикации биологической активности, например экспрессии гена и жизнеспособности клетки. Технология ΝΑ8ΒΑ описана, например, в журнале №1Шге № 350, стр. 91 и 92. Амплификация нуклеиновой кислоты в ΝΑ8ΒΑ достигается совместной ферментативной активностью обратной транскриптазы вируса миобластомы птиц, РНК-азы Н и РНК-полимеразы Т7, совместно с парой праймеров, что приводит к накоплению, главным образом, одноцепочечной РНК, которая может легко использоваться для детекции с помощью способов гибридизации. Применение внутреннего стандарта РНК в ΝΑ8ΒΑ приводит к способу количественной детекции нуклеиновой кислоты с динамическим диапазоном в четыре регистрации, но для которого требуется шесть реакций амплификации на квантификацию. Этот способ резко улучшается при применении множественных, различимых, внутренних стандартов РНК, добавляемых в различных количествах, и технологии детекции на основе электрохемилюминесценции (ЕСЬ). Эта однотрубочная количественная (О) ΝΑ8ΒΑ требует только одного шага процесса амплификации на квантификацию и дает возможность добавлять внутренние стандарты к клиническому образцу в буфере для лизиса до фактического выделения нуклеиновой кислоты. Преимущество этого подхода в том, что эффективность выделения нуклеиновой кислоты нисколько не влияет на результат количественного анализа, в отличие от способов, в которых внутренние стандарты смешиваются с нуклеиновой кислотой дикого типа после их выделения из клинического образца. Количественный способ ΝΑ8ΒΑ описан в журнале №.1с1ею Лс1б Векеатсй (1998) № 26, стр. 2150-2155. Однако детекция продуктов, получаемых в результате ΝΑ8ΒΑ, может все же быть трудоемкой процедурой, обычно включающей детекцию на основе гранул фермента и электрохемилюминесцентную (ЕСЬ) детекцию или флуоресцентную корреляционную спектрофотометрию. Однако, поскольку эти методы разнородны или требуют какой-либо обработки образцов или робототехнических устройств, которые в настоящее время являются экономически невыгодными, они относительно редко применяются при необходимости обработки большого количества материала. Однородная процедура, при которой детекция продукта производится одновременно с целевой амплификацией с помощью генерации направленного сигнала, будет облегчать крупномасштабный скрининг и полную автоматизацию. В последнее время была представлена новая технология детекции нуклеиновой кислоты, основанная на зондах (молекулярных маяках), которые флуоресцируют только при гибридизации с их мишенью.
Флюидика является наукой о течении жидкости, например, по трубам. В микроустройствах поток текучей среды через один или большее число наборов реакционных камер микро- или наноразмера обычно достигается с применением насоса, такого как пипетка, ротационный насос или находящийся вне устройства источник с предварительно созданным вакуумом или давлением. В другом варианте микронасос, или вакуумная камера, или элементы генерации волн Лэмба могут быть представлены непосредственно в виде части устройства. Для контроля потока текучих сред через реакционные камеры могут применяться другие комбинации элементов контроля потока, включая насосы, клапаны и камеры с предварительно созданным вакуумом и повышенным давлением. Другие механизмы для перемещения текучих сред в системе включают электроосмотический поток.
Международная заявка на патент № ^002/22265 относится к микросистеме реакционной камеры, которая может применяться в способе осуществления ΝΑ8ΒΑ. Международная заявка на патент Ρ0Τ/0Β02/005945 относится к микроизготовленной системе реакционной камеры и способу перемещения текучей среды. Система может также применяться в способе осуществления ΝΑ8ΒΑ. Международная заявка на патент ΡСΤ/СΒ03/004768 касается микрогидравлического устройства для фрагментации нуклеиновой кислоты. Устройство может применяться в микроизготовленной системе реакционной камеры или совместно с ней для осуществления ΝΑ8ΒΑ.
Настоящее изобретение относится к системе для осуществления процесса подготовки образца на образце текучей среды, содержащей клетки и/или частицы, система включает:
(a) входное отверстие для образца текучей среды;
(b) блок лизиса для лизиса клеток и/или частиц, содержащихся в образце текучей среды;
(c) блок экстракции нуклеиновой кислоты для экстракции нуклеиновых кислот из клеток и/или частиц, содержащихся в образце текучей среды;
(б) резервуар, содержащий текучую среду для лизиса;
- 2 011753 (е) резервуар, содержащий растворитель для элюирования для удаления нуклеиновых кислот, накапливающихся в блоке экстракции нуклеиновой кислоты;
в которой входное отверстие образца сообщается с блоком лизиса посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан;
в которой блок лизиса сообщается с блоком экстракции нуклеиновой кислоты посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан;
в которой резервуар, содержащий текучую среду для лизиса, сообщается с блоком лизиса посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан; и в которой резервуар, содержащий растворитель для элюирования, сообщается с блоком экстракции нуклеиновой кислоты посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан.
Для обычной диагностики система может применяться на образцах объемом в миллилитр. Система основана на предварительной загрузке некоторых реагентов.
В настоящем изобретении экстракция и концентрирование нуклеиновой кислоты могут сочетаться. Соответственно, настоящее изобретение относится к интегрированной системе диагностики лаборатория-на-чипе для осуществления процесса подготовки образца. Система может применяться для осуществления ΝΆ8ΒΆ в микроизготовленной системе реакционной камеры или совместно с ней.
По крайней мере, некоторым из компонентов системы предпочтительно придана микроформа. Предпочтительно блок лизиса, блок экстракции нуклеиновой кислоты, резервуар текучей среды для лизиса и резервуар растворителя для элюирования являются микроизготовленными и интегрированными, то есть сформированы на общем субстрате.
Резервуар, содержащий текучую среду для лизиса, предпочтительно сообщается с входным отверстием посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан.
Резервуар, содержащий растворитель для элюирования, предпочтительно сообщается с входным отверстием посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан.
Система по настоящему изобретению обычно, кроме того, включает: (д) блок взаимодействия нуклеиновой кислоты, в которой блок экстракции нуклеиновой кислоты сообщается с блоком взаимодействия нуклеиновой кислоты посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан. Предпочтительно блок взаимодействия нуклеиновой кислоты представлен в микроформе и предпочтительно интегрирован с другими компонентами. В блоке взаимодействия может быть осуществлена любая обычная реакция. Предпочтительно реакция позволяет осуществлять детекцию целевой специфической последовательности и/или количественный анализ. Блок взаимодействия нуклеиновой кислоты обычно включает блок амплификации и детекции последовательности нуклеиновых кислот, который запускает детекцию специфических последовательностей с помощью реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Примеры включают ПЦР и изотермические технологии амплификации, такие как ΝΆ8ΒΆ. Самой предпочтительной является ΝΆ8ΒΆ в реальном времени с применением молекулярных маяков.
Соответственно, в предпочтительном аспекте настоящее изобретение предоставляет интегрированную систему диагностики лаборатория-на-чипе для осуществления подготовки образца, процесса амплификации и детекции последовательности нуклеиновых кислот в образце текучей среды, содержащем клетки и/или частицы, более предпочтительно ΝΆ8ΒΆ в реальном времени. В международной заявке на патент № ^002/22265 описана микросистема реакционной камеры для осуществления ΝΆ8ΒΆ.
Система по настоящему изобретению предпочтительно включает концентрирование, например, инфицированных эпителиальных клеток, лизис и экстракцию мРНК и амплификацию и детекцию в реальном времени.
Система может применяться, например, для скрининга карциномы шейки матки.
Система по настоящему изобретению будет обычно, кроме того, включать: (11) блок для отходов, блок для отходов в системе сообщается с блоком лизиса посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан. Предпочтительно блок для отходов представлен в микроформе и предпочтительно интегрирован с другими компонентами.
Система будет обычно, кроме того, включать: (ί) резервуар, содержащий растворитель для промывки, этот резервуар сообщается с блоком экстракции нуклеиновой кислоты посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан. Предпочтительно резервуар, содержащий растворитель для промывки, представлен в микроформе и предпочтительно интегрирован с другими компонентами. Растворитель для промывки может быть выбран из любого подходящего растворителя, но предпочтительно выбирается тот, который может легко испаряться, например этанол.
Система обычно, кроме того, включает: (]) резервуар, содержащий растворитель для промывки, этот резервуар сообщается с блоком экстракции нуклеиновой кислоты посредством текучей среды, для контроля потока текучей среды между ними имеется дополнительный клапан. Предпочтительно резервуар, содержащий растворитель для промывки, является микроизготовленным и предпочтительно интегрирован
- 3 011753 с другими компонентами. Растворитель для промывки может быть выбран из любого подходящего растворителя, но предпочтительно выбирается тот, который может легко испаряться, например изопропанол.
Резервуар, содержащий растворитель для элюирования, преимущественно сообщается посредством текучей среды с резервуаром, содержащим первый растворитель для промывки (например, этанол), и/или с резервуаром, содержащим второй растворитель для промывки (например, изопропанол).
Более предпочтительно растворитель для элюирования, первый растворитель для промывки (например, этанол) и/или второй растворитель для промывки (например, изопропанол) содержатся в общем резервуаре. Это может быть достигнуто с помощью разделения друг от друга в общем резервуаре растворителя для элюирования, первого растворителя для промывки и/или второго растворителя для промывки при помощи текучей среды, такой как, например, воздух. Могут применяться другие разделяющие текучие среды (жидкости или газы), однако, при условии, что они не способны смешиваться или, по крайней мере, в основном, не способны смешиваться с растворителем для элюирования, первым растворителем для промывки и/или вторым растворителем для промывки.
В предпочтительном варианте осуществления растворитель для элюирования, этанол и/или изопропанол содержатся в трубке или канале, который сообщается с входным отверстием и блоком лизиса. Растворитель для элюирования, этанол и/или изопропанол разделяются с помощью промежутков текучей среды, таких как, например, воздушные промежутки.
Система обычно, кроме того, включает: (к) средства введения образца текучей среды и/или воздуха во входное отверстие. Указанное средство предпочтительно включает насос или пипетку. В другом варианте подобный способ может включать одну или несколько камер переменного объема, связанных с входным отверстием, в котором изменение объема камеры(камер) переменного объема ограничивает и/или воздействует на втекание во входное отверстие и/или вытекание из него образца текучей среды. Камера переменного объема обычно включает гибкую мембрану, покрывающую полое углубление на нижележащем субстрате. В международной заявке на патент РСТ/СВ02/005945 описана предпочтительная система перемещения текучей среды.
Система может преимущественно приводиться в действие с помощью единственной насосной системы.
Блок лизиса может иметь любую подходящую форму и конфигурацию, но обычно будет представлен в форме канала или камеры. Блок лизиса предпочтительно предназначен для лизиса эукариотических и прокариотических клеток и частиц, содержащихся в образце текучей среды.
По желанию, система может, кроме того, включать блок фильтрации, этот блок сообщается с блоком лизиса посредством текучей среды. Блок фильтрации может включать, например, фильтр перекрестного потока или пористый фильтр. В другом варианте блок лизиса может, кроме того, самостоятельно включать средства фильтрации образца текучей среды. Указанное средство может включать, например, фильтр перекрестного потока или пористый фильтр, который может быть интегрирован с блоком лизиса.
По желанию, система может, кроме того, включать блок фрагментации, этот блок сообщается с блоком лизиса посредством текучей среды. В другом варианте блок лизиса может, кроме того, самостоятельно включать средства фрагментации образца текучей среды. В качестве шага предварительной обработки образца часто бывает необходимой случайная фрагментация ДНК или РНК. Фрагментация может быть выполнена биохимически с применением рестрикционных энзимов или с помощью приложения физической силы для разрушения молекул (см., например, Р.Ы. Непдеп, Ттепбк ίη ВюсЬет. 8сь, νοί. 22, рр. 273-274, 1997 апб Р.Р. Όανίκοη, Ргое. №11. Асаб. 8с1. И8А, νοί. 45, рр.1560-1568, 1959). Фрагментация ДНК с помощью сдвига обычно включает пропускание образца через короткое сужение. В предпочтительном варианте осуществления ДНК и/или РНК разрушаются под воздействием механической силы при прокачивании через узкое отверстие в результате быстрого растяжения молекулы. Поток, приводимый в действие давлением, может привести к формированию силы сдвига, которая приводит к фрагментации нуклеиновых кислот. В международной заявке на патент РСТ/СВ03/004768 описано микрогидравлическое устройство для фрагментации нуклеиновой кислоты.
Блок лизиса может, кроме того, самостоятельно включать средства фильтрации образца текучей среды и средства фрагментации образца текучей среды.
Система может, кроме того, включать средства нагревания содержимого блока лизиса и/или блока экстракции нуклеиновой кислоты. Указанное средство может включать, например, один или большее число элементов РеШет, расположенных в блоке лизиса и/или блоке экстракции нуклеиновой кислоты или рядом с ними.
Блок экстракции нуклеиновой кислоты может иметь любую подходящую форму и конфигурацию, но обычно будет иметь форму канала или камеры. Блок экстракции нуклеиновой кислоты предпочтительно предназначен для экстракции эукариотических и прокариотических клеток и частиц, содержащихся в образце текучей среды.
Блок экстракции нуклеиновой кислоты может быть, по крайней мере, частично заполнен гранулами или частицами оксида кремния. Для накопления и/или предварительного концентрирования элюированных нуклеиновых кислот рядом с гранулами или частицами оксида кремния могут быть предоставлены один или большее число комплектов электродов. Один или большее число комплектов электродов могут включать, например, платиновые электроды. В связи с этим, могут быть предоставлены средства для
- 4 011753 создания разности потенциалов между электродами. Экстракционная камера предпочтительно сформирована из поли(диметилсилоксана) (ΡΌΜ8) или включает его. Блок обычно включает субстрат и прилежащее покрытие, экстракционный блок ограничивается углублением на поверхности субстрата и прилежащей поверхностью покрытия. Субстрат предпочтительно сформирован из силиконполи(диметилсилоксана) (ΡΌΜ8). В присутствии хаотропных агентов НК связывается с кремниевыми поверхностями.
Объединение электродов (например, платиновых электродов) может преимущественно применяться для обратимого накопления и предварительного концентрирования на одном чипе элюированной НК. Таким образом, настоящее изобретение позволяет осуществлять комбинированную экстракцию и обогащение нуклеиновой кислоты.
В предпочтительном варианте осуществления блок экстракции нуклеиновой кислоты включает канал из поли(диметилсилоксана) (ΡΌΜ8), наполненный гранулами кремния.
Система или, по крайней мере, вариант ее оригинала обычно сформированы из полупроводникового материала или включают его, несмотря на то, что могут также применяться диэлектрики (например, стекло, плавленый кремний, кварц, полимерные материалы и керамические материалы) и/или металлические материалы. Примеры полупроводниковых материалов включают один или большее число из элементов IV группы (то есть кремний и германий); соединений элементов Ш-У группы (например, арсенид галлия, фосфид галлия, антимонид галлия, фосфид индия, арсенид индия, арсенид алюминия и антимонид алюминия); соединений элементов 11-У1 группы (например, сульфид кадмия, селенид кадмия, сульфид цинка, селенид цинка) и соединений элементов 1У-У1 группы (например, сульфид свинца, селенид свинца, теллурид свинца, теллурид олова). Арсенид кремния и галлия являются предпочтительными полупроводниковыми материалами. Система может быть изготовлена с применением стандартных процессов, обычно связанных с серийным производством полупроводниковых микроэлектронных устройств и в последние годы с продукцией полупроводниковых микромеханических устройств.
Подобные технологии микрообработки включают, например, эпитаксиальное выращивание (например, парофазное, жидкофазное, молекулярно-пучковое, металлоорганическое химическое парофазное осаждение), литографию (например, фото-, электронно-лучевую, рентген-, ионно-лучевую), травление (например, химическое, газофазное, плазменное), электроосаждение, распыление, диффузионное легирование, ионную имплантацию и микрообработку. Могут также применяться некристаллические материалы, такие как стекло и полимерные материалы.
Примеры полимерных материалов включают ΡΜΜΑ (полиметилметакрилат), СОС (циклоолефиновый сополимер), полиэтилен, полипропилен, ΡΤ (полилактид), ΡΒΤ (полибутилентерефталат) и Ρδϋ (полисульфон), включая смеси двух или большего их числа. Предпочтительным полимером является ΡΌΜ8 или СОС.
Устройство/система будут обычно интегрально сформированы. Устройство/система могут быть в микроформе на общем материале подложки, например на полупроводниковом материале, как здесь было описано, несмотря на то, что может применяться диэлектрический материал подложки, такой как, например, стекло или керамический материал. Несмотря на это, обычный материал подложки предпочтительно является пластиком или полимерным материалом, и подходящие примеры приведены выше. Система может быть предпочтительно сформирована с помощью копирования, например, с кремниевого оригинала.
Преимущества применения пластмасс вместо кремниевого стекла для миниатюризированных структур велики, по крайней мере, для применения в области биологии. Одним из наибольших преимуществ является снижение стоимости массового производства при применении таких способов, как микроинъекционное формование, горячее тиснение и литье. Фактор 100 или больше весьма вероятен для сложных структур. Возможность копирования структур для многослойных закладных формовочных деталей дает большую гибкость в свободе выбора проектных решений. Взаимосвязь между микро- и макромиром во многих случаях более простая, так как везде предметом выбора является комбинирование обычно применяемых стандартных компонентов. Для технологий сборки могут применяться различные подходы, как, например, ϋδ-сварка с поддержкой микроструктур, лазерная сварка, склеивание и ламинирование. Другими свойствами, которые являются выгодными, являются изменения поверхности. Для миниатюризированных структур, направленных на биологические исследования, важно, чтобы поверхность была биологически совместимой. С помощью утилизации обработки плазмы и полимеризации плазмы гибкость и вариации ассортимента могут быть приспособлены под покрытие. Химическая устойчивость к воздействию кислот и оснований намного лучше у пластмасс, чем у силиконовых субстратов, которые легко подвергаются разъеданию. Большинство способов детекции в области биотехнологии включают оптические измерения. Поэтому главным свойством пластмассы является ее прозрачность по сравнению с кремнием, который является непрозрачным. Полимерная микрогидравлическая технология в настоящее время является признанной в еще развивающейся области рынка лабораторий-на-чипе.
Предполагается, что микроизготовленная система, как здесь было описано, также касается наноизготовленных устройств.
Для кремниевого или полупроводникового оригинала возможно формирование с помощью, например, травления или микрообработки одной или большего числа камер переменного объема, микрогидравлических каналов, реакционных камер и жидкостных соединений в силиконовом субстрате с точными
- 5 011753 измерениями микромасштаба. Затем по силиконовому оригиналу может быть изготовлена пластиковая копия. Таким образом, пластиковый субстрат с протравленной или механически обработанной микроструктурой может быть связан с покрытием любым подходящим способом (например, с применением адгезива или с помощью нагревания).
Дополнительные клапаны, применяемые в системе, могут принимать любую походящую форму. Например, клапаны могут легко регулировать поток в трубке или канале, соединяющем два блока. Может иметься поршневой элемент, который может подниматься или опускаться в отверстии трубки или канала под действием контактного устройства.
Применение системы включает следующие возможные стадии в качестве примера.
Вариант 1.
(ί) Сбор и лизис образца.
(ίί) Экстракция мРНК (ручная или автоматическая процедура).
(ΐϊϊ) Амплификация и детекция (предпочтительно мультиплексная) в реальном времени.
Вариант 2.
(ίν) Блок фрагментации может включать как лизис образца, так и подготовку образца.
(ν) Амплификация и детекция (предпочтительно мультиплексная) в реальном времени (ΝΑ8ΒΑ).
Настоящее изобретение также относится к способу производства интегрированной системы диагностики лаборатория-на-чипе, как здесь было описано, этот способ предусматривает:
Α. получение субстрата, имеющего на своей поверхности углубление для входного отверстия, углубление для блока лизиса, углубление для блока экстракции нуклеиновой кислоты, углубление для резервуара текучей среды для лизиса и углубление для резервуара растворителя для элюирования;
Β. получение покрытия и
С. связывание покрытия с субстратом, для создания: (а) входного отверстия, (Ь) блока лизиса, (с) блока экстракции нуклеиновой кислоты, (б) резервуара текучей среды для лизиса и (е) резервуара растворителя для элюирования, ограничивая каждый элемент соответствующим углублением в указанной поверхности субстрата и прилежащей поверхности покрытия.
Предполагается, что к применяемому здесь термину углубление также относится множество элементов, включая, например, прорези, щели, отверстия, бороздки и каналы, включая их части.
Способ может, кроме того, включать стадию введения текучей среды для лизиса в резервуар текучей среды для лизиса либо до, либо после связывания покрытия с субстратом.
Способ может, кроме того, предусматривать стадию введения растворителя для элюирования в резервуар растворителя для элюирования либо до, либо после связывания покрытия с субстратом.
Способ может, кроме того, предусматривать стадию введения этилового спирта в резервуар растворителя для элюирования либо до, либо после связывания покрытия с субстратом.
Способ может, кроме того, предусматривать стадию введения изопропанола в резервуар растворителя для элюирования либо до, либо после связывания покрытия с субстратом.
Растворитель для элюирования, и/или этиловый спирт, и/или изопропанол предпочтительно отделены друг от друга с помощью текучей среды, предпочтительно воздуха, несмотря на то, что может применяться любая не способная смешиваться текучая среда (жидкость или газ).
В предпочтительном варианте осуществления способ предусматривает введение растворителя для элюирования в резервуар растворителя для элюирования после связывания покрытия с субстратом; введение первого объема воздуха в резервуар растворителя для элюирования; введение этанола в резервуар растворителя для элюирования, в результате чего этанол отделяется от растворителя для элюирования с помощью указанного первого объема воздуха; введение второго объема воздуха в резервуар растворителя для элюирования; введение изопропанола в резервуар растворителя для элюирования, в результате чего изопропанол отделяется от этанола с помощью указанного второго объема воздуха.
Субстрат может быть сформирован, например, из оксида кремния, а вышележащее покрытие, например, из стекла. В этом случае стеклянное покрытие является предпочтительно анодно-соединенным с кремниевым субстратом произвольно через промежуточную пленку из оксида кремния, сформированную на поверхности субстрата.
Углубления в оксиде кремния могут быть сформированы с применением реактивного ионного травления. Для субстрата и/или покрытия могут также применяться другие материалы, например полимерные материалы. Подобные материалы могут быть изготовлены с применением, например, кремниевой копии.
В другом варианте устройство может быть изготовлено с помощью структурирования закладных формовочных деталей с помощью вальцевания и микрообработки электрическим разрядом (ΕΌΜ), с последующим инъекционным формованием частей чипа, с последующей механической обработкой полимерных частей, например, сверлением, вальцеванием, обдиркой. Впоследствии это может сопровождаться введением фильтра, связыванием растворителя и установкой жидкостных соединений.
Примеры полимерных материалов включают ΡΜΜΑ (полиметилметакрилат), СОС (циклоолефиновый сополимер), полиэтилен, полипропилен, РЬ (полилактид), ΡΒΤ (полибутилентерефталат) и Ρδϋ (полисульфон), включая смеси двух или большего числа этих соединений. Предпочтительным является СОС.
Предпочтительно, и особенно при необходимости оптических наблюдений содержимого клетки,
- 6 011753 вышележащее покрытие изготавливается из оптически прозрачной субстанции или материала, такого как стекло, Ругех или СОС.
Часто применяются комбинации микрокомпонента с одним или большим числом других элементов, таких как стеклянная пластинка или дополнительный микроизготовленный элемент, и предполагается, что они подпадают в объем применяемого здесь термина микроизготовленный.
Часть или вся основа субстрата может быть предоставлена с покрытием толщиной обычно до 1 мкм, предпочтительно менее 0,5 мкм. Покрытие предпочтительно сформировано из одного или большего числа соединений из группы, включающей полиэтиленгликоль (РЕС), альбумин бычьей сыворотки (В8Л), твин и декстраны. Предпочтительными декстранами являются те, которые имеют молекулярную массу от 9000 до 200000, особенно предпочтительны те, что имеют молекулярную массу от 20000 до 100000, в частности от 25000 до 75000, например от 35000 до 65000. Твин (полиоксиэтиленсорбитан) может быть любым подходящим от 81дта Λΐάποίι Сотрапу. Полиэтиленгликоли являются предпочтительными в качестве средств покрытия, как по отдельности, так и в комбинации. К полиэтиленгликолям относится чистый полиэтиленгликоль, то есть имеющий формулу НО-(СН2СН2О)п-Н, в которой п является целым числом, в зависимости от которого предоставляется полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу обычно от 200 до 10000, особенно полиэтиленгликоль с молекулярной массой от 1000 до 5000; или химически модифицированный полиэтиленгликоль, в котором один или большее число олигомеров этиленгликоля связаны посредством гомобифункциональных групп, таких как, например, фосфатные группы или ароматические спейсеры. Особенно предпочтительными являются полиэтиленгликоли, известные как ЕК108 (цепь полиэтиленгликоля, связанная с другой посредством фосфата); и полиэтиленгликоль, продаваемый 81дта Λΐάποίι Сотрапу как изделие Р2263. Вышеуказанные покрытия, нанесенные на поверхности клетки/камеры, входных отверстий, выходных отверстий и/или каналов, могут улучшать движение жидкости в системе. В частности, выявлено, что образец подвергается меньшей адгезии или прилипанию к подобным поверхностям. Предпочтительными являются покрытия из полиэтиленгликоля.
Для кремниевого или полупроводникового оригинала возможно формирование, с помощью, например, травления или механической микрообработки одной или большего числа камер переменного объема, микрогидравлических каналов, реакционных камер и жидкостных соединений в кремниевом субстрате с точными измерениями микромасштаба (глубокое реактивное ионное травление (ΌΚ1Ε) является предпочтительной технологией). Затем по кремниевому оригиналу может быть изготовлена пластиковая копия. Таким образом, пластиковый субстрат с протравленной или механически обработанной микроструктурой может быть связан с покрытием любым подходящим способом (например, с применением адгезива или с помощью нагревания), формируя при этом камеру(ы) закрытой фрагментации, входное(ые) отверстие(я), выходное(ые) отверстие(я) и соединяющий(е) канал(ы).
Устройство включает субстрат с желательной микроструктурой, сформированной на его верхней поверхности. Субстрат может быть, например, кремниевым или пластиковым субстратом, сформированным с помощью копирования с кремниевого оригинала. Субстрат связан его верхней поверхностью с покрытием, формируя, таким образом, ряд блоков/камер, входных отверстий, выходных отверстий и/или каналов. Покрытие может быть сформировано, например, из пластика или стекла. Покрытие предпочтительно является прозрачным, что позволяет наблюдать за текучей средой. В общем, устройство является предпочтительно изготовленным с помощью глубокого реактивного ионного травления (ΌΚ1Ε) кремния для сжатий с высоким аспектным отношением, сопровождаемых анодным соединением стеклянного покрытия. В другом варианте устройство может быть изготовлено с помощью структурирования закладных формовочных деталей, с помощью вальцевания и микрообработки электрическим разрядом (ΕΌΜ), с последующим инъекционным формованием частей чипа, с последующей механической обработкой полимерных частей, например, сверлением, вальцеванием, обдиркой. Впоследствии это может сопровождаться введением фильтра, связыванием растворителя и установкой жидкостных соединений.
Образец нуклеиновой кислоты может быть, например, биологической текучей средой, молочным продуктом, текучими средами окружающей среды и/или питьевой водой или может быть получен из них. Примеры включают кровь, сыворотку, слюну, мочу, молоко, питьевую воду, морскую воду и воду из бассейна. Следует понимать, что выделение и очистка ДНК и/или РНК от бактериальных клеток и вирусных частиц во многих сложных биологических образцах, таких как, например, кровь и молоко, становится возможной только после отделения вирусных частиц и бактериальных клеток от других частиц в образце. Также следует понимать, что с целью концентрирования бактериальных клеток и вирусных частиц, то есть для уменьшения объема исходного материала, может оказаться необходимым выполнение дополнительных шагов подготовки образца до перехода к разрушению клеточной стенки бактерий или протеиновой оболочки вирусов и выделения нуклеиновых кислот. Это важно, когда исходный материал состоит из большого объема, например, водного раствора, содержащего относительно небольшое количество бактериальных клеток или вирусных частиц. Этот тип исходного материала обычно встречается в методах тестирования окружающей среды, например при регулярном мониторинге бактериальной контаминации питьевой воды.
Система предпочтительно сконструирована для обработки образца объемом 10-100 мл.
Настоящее изобретение также относится к прибору для анализа биологических образцов и/или об
- 7 011753 разцов из окружающей среды, прибор включает описанную здесь систему. Прибор может быть одноразовым прибором.
Настоящее изобретение также относится к набору реактивов для анализа биологических образцов и/или образцов из окружающей среды, набор включает описанную здесь систему и средства для контактирования образца с системой. Набор реактивов может быть одноразовым набором.
Примеры
Ниже будет описано настоящее изобретение в качестве примера со ссылкой на прилагаемые чертежи, из которых фиг. 1 является схематической иллюстрацией многослойного расположения, используемого для интеграции плоской мембраны в устройство с одноразовым полимерным чипом, для применения в настоящем изобретении;
фиг. 2 является схематической иллюстрацией конструкции клапана для применения с системой настоящего изобретения;
фиг. 3а-б являются схематическими иллюстрациями конструкции клапана для применения с системой настоящего изобретения;
фиг. 4 является схематической иллюстрацией возможного расположения камеры для гранул настоящего изобретения;
фиг. 5 является схематической иллюстрацией конструкции системы настоящего изобретения, показывающей заполнение буфером для лизиса (фиг. 5а) и экстракционными текучими средами (фиг. 5Ь);
фиг. 6 является схематической иллюстрацией расположения чипа в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения;
фиг. 7 является схематической иллюстрацией конструкции системы другого предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения;
фиг. 8 относится к примерам;
фиг. 9 относится к примерам.
Конструкция пластикового чипа настоящего изобретения предпочтительно включает подающие каналы, реакционные камеры и системы микрогидравлического привода и предпочтительно обработана с помощью инъекционного формования сополимера циклоолефина (СОС). Закладная формовочная деталь для, например, 12-канального чипа может быть произведена с применением высокопрецизионного вальцевания. Объем детекции обычно составляет приблизительно 80 нЛ (400x2000x100 рт). До покрытия 5% раствором полиэтиленгликоля (РЕО) (81дта Сйет1са1 Со., 81. Ьош8, МО), пластиковый чип предпочтительно первоначально активируется кислородной плазмой. После покрытия чип может быть запаян мембраной СОС толщиной приблизительно 75 мкм посредством сварки растворителем с применением, например, бициклогексила. Для предотвращения фоновой флюоресценции от тепловой подушки на вершине элемента РеШег на нижнюю сторону чипа предпочтительно напыляется тонкая пленка золота (приблизительно 25 нм).
В случае необходимости, элементы РеШег могут быть интегрированы в держатель образца, обеспечивающий контроль температуры пластиковых чипов. На вершину элементов РеШег могут быть помещены алюминиевые блоки для защиты чипов от равномерного рассеивания тепла. Тепловая подушка предпочтительно устанавливается на алюминиевых блоках для создания термического контакта между чипами и источником теплоты. На держатель образца обычно помещается термопара, измеряющая температуру воздуха и имеющая контур обратной связи с элементами РеШег. Регулирование температуры может контролироваться извне на портативном компьютере.
Как предварительно описано, ΝΑ8ΒΑ является способом изотермической (приблизительно при 41°С) амплификации, специфически предназначенным для амплификации любой одноцепочечной последовательности РНК.
Реакция ΝΑ8ΒΑ может применяться в большом числе методов, например для детекции наличия специфических вирусных РНК, РНК других инфекционных или патогенных агентов или некоторых клеточных РНК. Одновременная активность трех ферментов обратной транскриптазы вируса миобластомы птиц, РНК-азы Н и РНК-полимеразы Т7 создает основную технологию реакции амплификации. Два олигонуклеотидных праймера определяют специфичность реакции и флуоресцентных молекулярных зондов-маяков, которые являются специфичными к РНК мишени. Приблизительно за 90 мин интересующая последовательность нуклеиновой кислоты может быть амплифицирована до >109 копий. Блок оптической детекции предпочтительно сконструирован для возбуждения флуорофоров в реакционных камерах с длиной волны приблизительно 494 нм и детекции образуемого флуоресцентного излучения с длиной волны приблизительно 525 нм. Излучение возбужденных флурофоров может быть отфильтровано с применением полосового фильтра (465-500 нм) до коллимации излучения с помощью линзы. Для фокусирования освещения и концентрирования флуоресцентного излучения может применяться аналогичная линза Френели. Другая линза может применяться для фокусирования флуоресцентного излучения на поверхность детектора (например, фотоэлектронного умножителя). Сбор данных и подготовка детектированного сигнала могут быть осуществлены на портативном компьютере с применением МАТЬАВ 6.0.
- 8 011753
088 Рс1са5с 12 (ТНе МаШХМогкз 1пс., №Юск. МА).
Эффективная предварительная обработка образца является важным фактором в контексте систем микротехнологического анализа. В частности. устройства концентрации необходимы для возможности детекции малых чисел специфических частиц. как. например. клеток. бактерий или вирусов. находящихся в биологических образцах. В области техники известно многообразие способов концентрации. включая. например. технологии фильтрации. такие как тупиковая фильтрация и фильтрация в перекрестном потоке. с применением различных видов средств фильтрации (микроструктурированные каналы. пористые полые волокна или мембраны). гравитационных осадителей. центрифуг. акустических клеточных фильтров. оптических ловушек. способов. основанных на диэлектрофорезе (ΌΕΡ). электрофорезе. проточной цитометрии и адсорбции.
Предпочтительный способ концентрации включает тупиковую фильтрацию. Это относительно простой и дешевый способ. который может легко быть интегрирован в одноразовый полимерный чип. Кроме того. применение плоских мембран гарантирует высокую гибкость в области применения. так как доступно множество мембран. а обработка поверхности. такая как. например. покрытие полиэтиленгликолем или Твин 20. может быть легко осуществлена.
Интеграция плоской мембраны в полимерный одноразовый чип может быть достигнута при применении многослойного устройства. как схематически показано на фиг. 1. Чип включает покрывающую мембрану 40. канал для текучей среды 41 и фильтрующую мембрану 44. Верхняя и нижняя границы чипа показаны под номерами 42 и 43. соответственно.
Предпочтительно один или большее число клапанов интегрированы в устройство для возможности контроля потока на чипе. Конструкции подходящих клапанов показаны на фиг. 2 и 3. В отношении фиг. 2. могут применяться мембраны с предварительно приданной формой или плоские мембраны. Чип 45 включает канал для текучей среды 46 и мембрану с предварительно приданной формой 47. Вертикальная стрелка показывает открытое положение.
На фиг. 3а-6 показан чип. имеющий корпус. который включает верхнюю часть корпуса 50. основную часть корпуса 52 и помещенную между ними мембрану 51.
Рядом с мембраной 51 имеется микрогидравлический канал 57. В соответствующих углублениях основной части корпуса 52 имеются поршень 54 и клапан 55. Текучая среда/жидкость находится в емкости 53 над поршнем 54 (см. фиг. 3а). Клапан 55 установлен в верхнее положение с натяжением (см. фиг. 3а). В этом положении он герметично закрывает микрогидравлический канал 57 таким образом. чтобы через него не могла пройти никакая текучая среда. Для опускания клапана 55 в открытое положение может применяться конический контактный штырь 56Ь (см. фиг. 3Ь. 3с и 36). В частности. когда контактный штырь 56Ь проталкивается вверх. он попадает с помощью фрикционной установки в соответствующее углубление в клапане 55. Так же при проталкивании вверх конического контактного штыря 56а поршень 54 попадает с помощью фрикционной установки в соответствующее углубление в поршне 54. Для перемещения жидкости из емкости 53 контактные штыри 56а и 56Ь проталкиваются в соответствующие углубления в поршне 54 и клапане 55. соответственно. и жидкость выталкивается из емкости 53 (см. фиг. 3с и 36). После применения чипа конические контактные штыри 56а и 56Ь извлекаются. соответственно. из поршня 54 и клапана 55.
Изобретатели установили. что гранулы кремния хорошо подходят для экстракции и очистки РНК. Обычно для экстракции могут применяться 0.3-0.4 мг гранул с диаметром от 15 до 35 мкм. но также возможно применение больших гранул кремния (до приблизительно 200 мкм в диаметре). Возможное расположение камеры для гранул показано на фиг. 4. Камера для гранул 60 загружена предварительно увлажненными гранулами кремния 61 до связи чипов. После связи контейнер с гранулами удерживается с помощью сужений размером 100 мкм. Форма камеры для гранул и расположение жидкостных соединений 62 (входное отверстие) и 63 (выходное отверстие) гарантируют. что применяемая жидкость проходит через гранулы кремния 61. даже если камера для гранул 60 не заполнена полностью. Объем камеры для гранул 60 составляет приблизительно 6.5 мкл. и она подходит для экстракции из образца. имеющего объем обычно 10-50 мкл.
В течение всего процесса предварительной обработки предпочтительно применяются четыре жидкости: буфер для лизиса (обычно приблизительно 100 мкл). изопропанол (обычно приблизительно 40 мкл). этиловый спирт (обычно приблизительно 40 мкл) и буфер для элюирования (обычно приблизительно 5-20 мкл). Последние три необходимы для экстракции. Изобретатели установили. что эффективным является хранение буфера для лизиса в канале (обычно в извитом канале) на верхнем чипе 70а (см. фиг. 5а) и хранение экстракционных жидкостей в двух ^-образных и ϋ-образных резервуарах на нижней части 70Ь (см. фиг. 5Ь).
Все резервуары для хранения могут быть легко заполнены через небольшие (0.5 ммх0.5 мм) боковые каналы. обозначенные на фиг. 5 с помощью положения игл представленных пипеток 75а-6. После наполнения боковые каналы могут быть герметично закрыты с применением любых подходящих средств. например жидкого клея или ленты.
Преимущественно. для получения относительно простой системы обработки предпочтительно применять единый насос (пипетку) для приведения в движение всех жидкостей.
Расположение чипа согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения
- 9 011753 показано на фиг. 6.
Четыре жидких резервуара (с буфером для лизиса, изопропанолом, этанолом и буфером для элюирования) последовательно заполнены с применением обычных пипеток (диаметр иглы 0,4 мм), и заполненные каналы герметично закрыты.
Сначала суспензия клеток наносится на блок фильтрации с помощью насоса пипетки. Помимо суспензии пипетка наполняется воздухом в объеме приблизительно от 200 до 300 мкл, который применяется для приведения в действие жидкостей на чипе (ясно, что в зависимости от применения могут применяться другие несмешиваемые жидкости).
Вторым этапом воздух закачивается в резервуар буфера для лизиса и вытесненный буфер воздействует на клетки, находящиеся на фильтре. Клеточный лизат проталкивается через фильтр и направляется к камере для гранул. В результате дополнительного этапа фильтрования вероятность засорения в камере для гранул понижается.
Третьим этапом насос, приводящий в действие (пипетка), связывается с резервуаром экстракции жидкости при закрытых сообщениях с фильтровальной камерой и резервуаром буфера для лизиса.
Экстракционные жидкости хранятся в едином резервуаре, разделенные воздушными пробками. Под воздействием давления на одну сторону резервуара жидкости параллельно вытесняются и последовательно перемещаются через камеру для гранул.
Протокол операции, включая действия клапанов, суммированы ниже, также со ссылкой на фиг. 6. Не перечисленные клапаны находятся в закрытом состоянии, тогда как перечисленные клапаны открыты для соответствующего действия.
Фильтрация.
Клапаны 5, 7: введение клеточной суспензии, фильтрата левое выходное отверстие.
Лизис.
Клапаны 2, 3, 7: введение воздуха, вытесненная текучая средам левое выходное отверстие.
Клапаны 2, 3, 6: введение воздуха, лизат^контейнер с гранулами, правое выходное отверстие.
Очистка.
Клапаны 1, 4, 6: введение воздуха, изопропанол^контейнер с гранулами;
введение воздуха, этанол^контейнер с гранулами;
введение воздуха, буфер для элюирования^контейнер с гранулами.
Обратимся теперь к фиг. 7, на которой показан другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения. Вышеприведенное описание также применимо к этому варианту осуществления. Система 1 имеет входное отверстие 5 для образца текучей среды, блок лизиса/фильтрации 10, блок экстракции нуклеиновой кислоты 15, канал 20, содержащий текучую среду для лизиса, канал 25, содержащий растворители для элюирования, этанол и изопропанол, блок амплификации и детекции последовательности нуклеиновой кислоты 30 и блок для отходов 35.
Канал 11 соединяет входное отверстие для образца 5 с блоком лизиса/фильтрации 10. Для контроля потока жидкости между ними имеется клапан 12.
Канал 16 соединяет блок лизиса/фильтрации 10 с блоком экстракции нуклеиновой кислоты 15. Для контроля потока жидкости между ними имеется клапан 17.
Канал 20, содержащий текучую среду для лизиса, связан с блоком лизиса/фильтрации 10 и входным отверстием для образца 5. Для контроля потока жидкости имеются клапаны 22 и 23.
Канал 25, содержащий растворитель для элюирования, этанол и изопропанол, связан с блоком экстракции нуклеиновой кислоты 15 и входным отверстием для образца 5. Для контроля потока жидкости имеются клапаны 27 и 28.
Канал 31 соединяет блок экстракции нуклеиновой кислоты 15 с блоком амплификации и детекции последовательности нуклеиновой кислоты 30. Для контроля потока жидкости между ними имеется клапан 32.
Канал 36 соединяет блок лизиса/фильтрации 10 с блоком для отходов 35. Для контроля потока жидкости между ними имеется клапан 37.
Канал 25 содержит растворитель для элюирования и растворители для промывки, такие как этанол и изопропанол. Растворитель для элюирования и растворители для промывки загружены в канал предварительно с применением воздушного промежутка для отделения жидкостей друг от друга.
Примером подходящей текучей среды буфера для лизиса является 100 мМ Тп&НС1, 8М Си8СЫ (рН 6,4).
Примером подходящего раствора для элюирования является 10 мМ Тгщ/НС1, 1 мМ ΕΌΤΆ Να2 (рН 8)+1 мМ ΥΟΥΟ-1.
Квантификация нуклеиновой кислоты может быть осуществлена с применением флуоресцентного микроскопа и программы анализа интенсивности пикселя (Τίδρίχ).
Блок экстракции нуклеиновой кислоты содержит гранулы кремния, например 0,3 мг гранул кремния, величиной 15-30 мкм. Непосредственно под уплотненным слоем также предоставлены платиновые электроды (не показаны) для электрокинетического накопления отрицательно заряженных, элюированных нуклеиновых кислот.
Протокол операции суммирован ниже.
- 10 011753
Фильтрация.
Все клапаны закрываются, за исключением клапанов 12 и 37. Пипетка, содержащая образец текучей среды (который содержит анализируемые клетки), связывается с входным отверстием для образца 5, и образец вводится под давлением в блок фильтрации/лизиса 10. Таким образом, клетки удерживаются в блоке 10, а оставшаяся часть текучей среды затем поступает в блок для отходов 35.
Лизис.
Все клапаны закрываются, за исключением клапанов 22, 23 и 37. В первом шаге (дополнительном) воздух, содержащийся в пипетке, вводится во входное отверстие для образца 5. Это вызывает перемещение текучей среды для лизиса, содержащейся в канале 20, по направлению к блоку фильтрации/лизиса
10. Однако до поступления текучей среды для лизиса в блок фильтрации/лизиса 10 воздух перед текучей средой для лизиса, то есть воздух в области канала 20 между клапаном 23 и блоком 10, вытесняет и вызывает перетекание любой оставшейся текучей среды в блоке 10 в блок для отходов 35. Затем, вторым шагом, клапан 37 закрывается, а клапан 17 открывается. Поскольку воздух, содержащийся в пипетке, продолжает вводиться во входное отверстие для образца 5, текучая среда для лизиса, содержащаяся в канале 20, перетекает под давлением в блок фильтрации/лизиса 10. Как следствие, удерживаемые там клетки лизируются и лизат перетекает в блок экстракции нуклеиновой кислоты 15.
Очистка/экстракция.
Все клапаны закрываются, за исключением клапанов 27, 28 и 32. Первым этапом воздух, содержащийся в пипетке, вводится во входное отверстие для образца 5. Это вызывает перемещение текучих сред (изопропанол, воздушный промежуток, этанол, воздушный промежуток, буфер для элюирования), содержащихся в канале 25, в виде столбца текучей среды по направлению к блоку экстракции нуклеиновой кислоты 15. После поступления всего изопропанола (то есть первой части столбца текучей среды) в блок экстракции нуклеиновой кислоты 15 этот процесс останавливается. После короткого промежутка времени (вместе с дополнительным нагреванием содержимого блока 15) процесс продолжается и воздушный промежуток между изопропанолом и этанолом вытесняет изопропанол. Изопропанол испаряется и/или перемещается в блок для отходов. Затем этанол перетекает под давлением в блок экстракции нуклеиновой кислоты 15.
После поступления всего этанола в блок 15 процесс останавливается еще раз. После короткого промежутка времени (вместе с дополнительным нагреванием содержимого блока 15) процесс продолжается и воздушный промежуток между этанолом и буфером для элюирования вытесняет этанол. Этанол испаряется и/или перемещается в блок для отходов. Затем буфер для элюирования перетекает под давлением в блок экстракции нуклеиновой кислоты 15 и элюирует нуклеиновые кислоты, высвобождаемые с поверхности гранул кремния. Затем элюированные нуклеиновые кислоты поступают в блок амплификации и детекции последовательности нуклеиновой кислоты 30.
Настоящее изобретение предоставляет прибор и способ для экстракции и анализа нуклеиновой кислоты (НК). Успешной была экстракция из биологических образцов, таких как лизаты человеческих клеток, с накоплением НК в первых 15 мл элюата.
Производилась оценка амплификации в реальном времени, основанной на последовательности нуклеиновых кислот (ΝΆ8ΒΆ) в пластиковых микрочипах из сополимера циклоолефина (СОС) со встроенными подающими каналами и параллельными реакционными камерами. Была осуществлена успешная детекция последовательности модели папилломавируса человека 16 (НРУ) в линии клеток 81На со встроенным НРУ 16 и образцах от пациента, положительных на наличие НРУ 16. Образцы материалов, наносимых на чип, были разделены на одиннадцать параллельных реакционных камер, где осуществлялась их одновременная детекция в объеме 80 нл.
Кроме того, теперь настоящее изобретение будет описано со ссылкой на следующие не ограничивающие примеры.
Примеры
Материал образца.
Линии клеток карциномы шейки матки 81На (плоскоклеточная карцинома) были получены из Атепсаи Туре СиНиге Со11есбои (И8А). Линия клеток 81На поддерживалась в модифицированной питательной среде ЭЫЬессо'з Еад1ек (ΌΜΕΜ), подкрепленной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (ΡΒ8), 2 мМ Ь-глутамином и 25 мкг/мл гентамицином. Клетки культивировались при температуре 37°С в атмосфере с 5% СО2. Клетки были обработаны трипсином, подсчитаны в камере Вигкегк и лизированы в буфере для лизиса ΝΑ8ΒΑ (ЬюМепеих, Нидерланды, содержащем 5М гуанидинтиоцианата). Нуклеиновые кислоты были изолированы и экстрагированы с применением способа Воот (Воот, К., 8о1, 1.А., 8а11таи5, М.М.М., 1аи§еи, С.Ь., ХУеПйеппуапбШеп Р.М.Е., Уаибетоогбаа, 1.1. оГ С11шса1 МсгоЬюк, 1990, 28, (3), 495-503) на экстракторе ШсКЗепзе. Клетки 81На содержат 1-2 копии интегрированной ДНК НРУ 16 на клетку (8уг)аиеи, 8., Райаиеи, Р., Маи!у)агу1, К. и 8уг)аиеи, К. 1. У1го1. МеШобк, 1988, 19, 225-238). Проводилось тестирование десятикратных серийных разведений экстракта линии клеток 81На. Кроме того, последовательности модели НРУ типа 16 из набора НРУ РгооГег (№гС’1ир А8, №г\гау) применялись в качестве мишени. Серии разведения были протестированы для определения предела чувствительности системы.
- 11 011753
ΝΑ8ΒΑ.
Реагенты в наборе РгеТесК НРУ-РгооГег были смешаны в соответствии с инструкцией изготовителей (ΝοΓΟΙιίρ Л8, Норвегия). В наборе имелись в наличии все праймеры и зонды. Кроме того, в качестве динамического покрытия к смеси был добавлен Β8Α до конечной концентрации 0,05%. Раствор реагента (26 мкл) из набора и 13 мкл материала образца (образцы линии клеток 81На и образцы последовательности НРУ типа 16 из набора) были смешаны и нагревались до температуры 65°С в течение 2 мин.
Затем смесь охлаждалась в течение 2 мин до температуры 41 °С, после чего были добавлены энзимы (13 мкл). Одна камера приведения в действие при каждом реакционном канале была рассечена, перед тем как в полимерный микрочип была добавлена смесь. Каждый реакционный канал в чипе был заполнен смесью посредством капиллярных сил. Оставшаяся смесь была заключена в камеру для отходов в конце питающего канала. Затем держатель чипа был перемещен под оптическую систему, где были измерены каналы один за другим. Измерения проводились каждые 30 с. Только участок величиной 2x2 мм2 освещался с помощью светодиода, этот участок соответствовал участку детекции 80 нл.
Также для сравнения с детекцией на микрокрочипе с помощью обычного оборудования были протестированы десятикратные серийные разведения как последовательностей НРУ 16, так и линий клеток 8гНа. Все эксперименты продолжались в течение 2,5 ч.
Расчет.
Все результаты были рассчитаны с применением РгсТсс! Эа1а Лпа1ухсг (ΡΌΛ) (ΝοτΟΗίρ А8). Микрочип был сконструирован с 12 реакционными камерами, но 2 реакционных канала на каждой стороне в расчетах не учитывались, вследствие систематической погрешности в измерениях. Расчеты были основаны на алгоритмах полиномиальной регрессии. Коэффициент определялся как разность уровня флуоресценции в конце реакции и уровня флуоресценции в начале реакции. Все образцы с коэффициентом 1,7 или больше были определены как положительные. Время до положительности или исходная точка были установлены в том месте, где кривая начинала нарастать по экспоненте. Среднее значение углового коэффициента было вычислено с применением величины 10% повышения уровня флуоресценции и величины 80% повышения уровня флуоресценции от исходной точки. Предел чувствительности для полимерных микрочипов был установлен по последней протестированной концентрации, где все 10 реакционных каналов были положительными.
Результаты.
Идентификация НРУ 16 вирусов с помощью ΝΑ8ΒΑ в реальном времени была успешно выполнена в полимерных микрочипах при объеме детекции 80 нл. На фиг. 8 и 9 показан результат одного эксперимента, выполненного, соответственно, на линиях клеток 81На и олигонкулеотидных последовательностях НРУ 16. На фигурах показаны графики, которые очевидно являются положительными и имеют такую же кривизну, как и образцы, определение которых выполнялось с применением постоянных объемов 20 мкл и обычных считывающих устройств (не показаны). В табл. 1 показаны результаты серий разведения последовательностей модели НРУ16 и линий клеток 81На, полученные с применением полимерных микрочипов. Для характеристики реакций амплификации производилось определение нескольких различных параметров: коэффициент флуоресценции, время до положительности, среднее значение углового коэффициента линейной части кривой, число положительных амплификации и число тестируемых полимерных микрочипов. В таблице показаны средние значения и среднеквадратичное отклонение протестированных положительных образцов. Как для последовательностей НРУ 16, так и для линий клеток 81На, протестированных на микрочипах, коэффициент был более или менее постоянным. Из сравнения с обычным тестированием (табл. 2) материала того же образца видно, что коэффициент уменьшается при снижении концентрации. С другой стороны, другие параметры для микрочипов и для обычных способов значительно соответствуют. При снижении концентрации возрастает время до положительности, тогда как среднее значение коэффициента регрессии при снижении концентрации уменьшается. Десятикратные серийные разведения от 100 аМ до 100 нМ были протестированы на последовательности модели НРУ 16, тогда как линия клеток 81На была протестирована в разведениях от 0,02 до 2000 клеток/мкл. Изготовленная на заказ система оптической детекции имела предел чувствительности 1 пМ и 20 клеток/мкл для последовательностей модели НРУ 16 и материала линии клеток 81На, соответственно. Для обычных считывающих устройств Вю1ек пределы чувствительности были сходными. На обеих системах была возможна детекция более низких концентраций, но отмечались противоречивые результаты. Результаты также иллюстрируют, что при снижении концентрации образца заданной мишени наблюдалось увеличение среднеквадратичного отклонения. Сравнение результатов ΝΑ8ΒΑ для олигонуклеотидных последовательностей НРУ 16 и для линии клеток 81На показало, что все параметры имели сходные тенденции как для микросистем, так и для обычных способов, за исключением соотношения между уровнями флюоресценции в начале и в конце реакции амплификации. Фоновые помехи более различимы в малых реакционных камерах, чем при применении макроскопических флуоресцентных способов. Части фоновой флюоресценции удалялись из анализа с применением тонкой золотой пленки на нижней стороне полимерных микрочипов. СОС сам по себе является флуоресцентентным и всегда производит некоторую фоновую флюоресценцию. Другой составляющей в детекции шума является рассеяние света вслед
- 12 011753 ствие недостаточно идеальных полимерных поверхностей. Время до положительности уменьшается при снижении концентрации, как ожидается вследствие того, что для обнаружения субстратов и взаимодействия с ними субстраты применяются в течение более длительного времени. В экспериментах для максимальных концентраций, в частности для модели НРУ 16, время до положительности увеличивается. Очень высокие концентрации образца могут также замедлять реакцию и поэтому могут применяться в течение более длительного времени, в отличие от идеальной реакционной смеси. Подобным образом уменьшается среднее значение углового коэффициента. Чем меньшее количество мишени изначально будет находиться в реакционной смеси, тем меньше ампликонов будет произведено и угловой коэффициент будет меньше, чем для более высоких концентраций. Предел чувствительности реакции ΝΆ8ΒΆ зависит от интересующей мишени, конструкции праймеров и зонда. В этих экспериментах в обеих системах детекции мы могли осуществить детекцию концентраций до 1 пМ и 20 клеток/мкл. Соответственно, этот пример показывает, что детекция последовательностей модели НРУ 16 в концентрации до 1 пМ в полимерных микрочипах с применением ΝΆ8ΒΆ в реальном времени является возможной. Для образцов линий клеток предел чувствительности составлял 20 клеток/мкл. Эти пределы чувствительности были сходными с полученными в экспериментах, проводимых на обычном считывающем устройстве Вю1ек.
Таблица 1 ΝΆ8ΒΆ, выполненная на микрочипах, с детекцией олигонуклеотидных последовательностей НРУ 16 и серий разведения линии клеток §1На
| Концентрация | Отношение | Исходная точка | Среднее значение углового коэффициента линейной части кривой | Число положительных амплификаций/ число реакций | Число тестируемых чипов |
| Олигонуклеотидная последовательность НРУ 16[мкМ] | |||||
| 0,1 | 2,9010,33 | 12,31+5,36 | 45,09+9,89 | 50/50 | 5 |
| 0,01 | 3,06+0,37 | 14,73+4,03 | 43,4819,48 | 40/40 | 4 |
| 0,001 | 2,6510,42 | 9,0012,05 | 45,99117,66 | 30/30 | 3 |
| 0,0001 | 2,7510,32 | 22,19+4,45 | 35,08117,94 | 30/30 | 3 |
| 0,00001 | 2,56+0,38 | 22,5517,36 | 29,87113,74 | 30/30 | 3 |
| 0,000001 | 2,5410,46 | 25,3013,60 | 19.6219^21 | 30/30 | 3 |
| 0,0000001 | 2,1010,32 | 37,09+12,74 | 17,27111,78 | 33/70 | 7 |
| 0,00000001 | 1.85Ю.28 | 43,7517,13 | 9,9413,55 | 6/60 | 6 |
| 0,000000001 | 2,2710,86 | 81,00138,18 | 15,0216,26 | 2/60 | 6 |
| 0,0000000001 | 3,93 | 4,50 | 21,83 | 1/60 | 6 |
| Клеточная линия 51На [клетки/мкл] | |||||
| 2000 | 2,8610,30 | 16,9112,67 | 42,5716,24 | 40/40 | 4 |
| 200 | 2,80+0,43 | 18,8913,39 | 40,56114,50 | 40/40 | 4 |
| 20 | 2,88+0,27 | 30,65+9,28 | 37,49+11,09 | 39/40 | 4 |
| 2 | 2,7510,50 | 38,02126,12 | 35,09115,47 | 60/70 | 7 |
| 0,2 | 2,7310,54 | 70,13139,12 | 39,29114,97 | 4/50 | 5 |
| 0,02 | 0 | 0 | 0 | 0/30 | 3 |
Результаты всех значений, полученных в экспериментах, приведены в средних значениях и со среднеквадратичным отклонением.
- 13 011753
Таблица 2 й на ΗΡΥ 16
Стандартный ΝΑ8ΒΑ анализ, онуклеотидных последовательностях и клеточных линиях Б1На
Результаты всех значений, полученных в экспериментах, приведены в средних значениях и со среднеквадратичным отклонением.
Claims (25)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Интегрированная диагностическая система лаборатория-на-чипе для подготовки к анализу образца текучей среды, содержащего клетки и/или частицы, включающая следующие компоненты, расположенные на общей подложке:(a) входное отверстие для образца текучей среды;(b) блок лизиса для лизиса клеток и/или частиц, содержащихся в образце текучей среды;(c) блок экстракции нуклеиновой кислоты для экстракции нуклеиновых кислот из клеток и/или частиц, содержащихся в образце текучей среды;(й) резервуар, содержащий текучую среду для лизиса;(е) резервуар, содержащий растворитель для элюирования для перемещения нуклеиновых кислот, накапливающихся в блоке экстракции нуклеиновой кислоты;в которой входное отверстие для образца сообщается с блоком лизиса посредством текучей среды, а для контроля потока текучей среды между ними имеется необязательный клапан;- 14 011753 в которой блок лизиса сообщается с блоком экстракции нуклеиновой кислоты посредством текучей среды, а для контроля потока текучей среды между ними имеется необязательный клапан;в которой резервуар, содержащий текучую среду для лизиса, сообщается с блоком лизиса посредством текучей среды, а для контроля потока текучей среды между ними имеется клапан;в которой резервуар, содержащий растворитель для элюирования, сообщается с блоком экстракции нуклеиновой кислоты посредством текучей среды, а для контроля потока текучей среды между ними имеется клапан; и в которой, кроме того, имеется единый насос или шприц для приведения в действие всех жидкостей.
- 2. Система по п.1, где резервуар, содержащий текучую среду для лизиса, сообщается с входным отверстием посредством текучей среды, а для контроля потока текучей среды между ними имеется необязательный клапан.
- 3. Система по п.1 или 2, где резервуар, содержащий элюент, сообщается с входным отверстием посредством текучей среды, а для контроля потока текучей среды между ними имеется необязательный клапан.
- 4. Система по любому из пп.1-3, кроме того, включающая: (д) блок взаимодействия нуклеиновой кислоты, предпочтительно блок амплификации и детекции последовательности нуклеиновой кислоты, в которой блок экстракции нуклеиновой кислоты сообщается с блоком взаимодействия нуклеиновой кислоты посредством текучей среды, а для контроля потока текучей среды между ними имеется необязательный клапан.
- 5. Система по любому из пп.1-4, кроме того, включающая: (11) блок для отходов, в которой блок для отходов сообщается с блоком лизиса посредством текучей среды, а для контроля потока текучей среды между ними имеется необязательный клапан.
- 6. Система по любому из пп.1-5, кроме того, включающая: (ί) резервуар, содержащий растворитель для промывки, предпочтительно этанол, этот резервуар сообщается с блоком экстракции нуклеиновой кислоты посредством текучей среды, а для контроля потока текучей среды между ними имеется необязательный клапан.
- 7. Система по любому из пп.1-6, кроме того, включающая: (|) резервуар, содержащий дополнительный растворитель для промывки, предпочтительно изопропанол, этот резервуар сообщается с блоком экстракции нуклеиновой кислоты посредством текучей среды, а для контроля потока текучей среды между ними имеется необязательный клапан.
- 8. Система по п.6 или 7, в которой резервуар, содержащий растворитель для элюирования, сообщается посредством текучей среды с резервуаром, содержащим первый растворитель для промывки, и/или с резервуаром, содержащим второй растворитель для промывки.
- 9. Система по п.8, в которой растворитель для элюирования, первый растворитель для промывки и/или второй растворитель для промывки содержатся в общем резервуаре.
- 10. Система по п.9, в которой растворитель для элюирования, первый растворитель для промывки и/или второй растворитель для промывки отделены друг от друга в общем резервуаре при помощи текучей среды, предпочтительно воздуха.
- 11. Система по п.9 или 10, в которой общий резервуар включает трубку, сообщающуюся с входным отверстием и блоком лизиса посредством текучей среды.
- 12. Система по любому из пп.1-11, кроме того, включающая: (к) средство для введения жидкого образца и/или воздуха во входное отверстие, где указанное средство предпочтительно включает насос или шприц.
- 13. Система по любому из пп.1-11, кроме того, включающая блок фильтрации, причем этот блок сообщается с блоком лизиса посредством текучей среды.
- 14. Система по п.13, в которой блок фильтрации включает один или несколько фильтров тупиковой фильтрации, фильтров перекрестного потока, например микроструктурированных каналов, пористых полых волокон или мембран, гравитационных осадителей, центрифуг, акустических клеточных фильтров, оптических ловушек, способов, основанных на диэлектрофорезе (БЕР), электрофорезе, проточной цитометрии и адсорбции.
- 15. Система по любому из пп.1-11, в которой блок лизиса, кроме того, включает средства фильтрации образца текучей среды.
- 16. Система по п.15, в которой указанные средства включают один или несколько фильтров тупиковой фильтрации, фильтров перекрестного потока, например микроструктурированных каналов, пористых полых волокон или мембран, гравитационных осадителей, центрифуг, акустических клеточных фильтров, оптических ловушек, способов, основанных на диэлектрофорезе (БЕР), электрофорезе, проточной цитометрии и адсорбции.
- 17. Система по любому из предыдущих пунктов, причем система, кроме того, включает средства для нагревания содержимого блока лизиса и/или блока экстракции нуклеиновой кислоты.
- 18. Система по п.17, в которой указанное средство включает один или несколько элементов РеШег, расположенных в блоке лизиса, и/или блоке экстракции нуклеиновой кислоты, или рядом с ними.
- 19. Система по любому из предыдущих пунктов, в которой блок экстракции нуклеиновой кислоты,- 15 011753 по крайней мере, частично заполнен гранулами или частицами кремния.
- 20. Система по п.19, в которой блок экстракции нуклеиновой кислоты, кроме того, включает один или несколько наборов электродов рядом с гранулами или частицами кремния для накопления и/или предварительного концентрирования элюированных нуклеиновых кислот.
- 21. Система по п.20, в которой указанный один или несколько комплектов электродов включают платиновые электроды.
- 22. Система по любому из предыдущих пунктов для экстракции нуклеиновых кислот, присутствующих в биологической текучей среде, молочном продукте, текучей среде окружающей среды или питьевой воде.
- 23. Прибор для анализа биологических образцов и/или образцов окружающей среды, причем прибор включает систему, определенную в любом из предыдущих пунктов.
- 24. Набор для анализа биологических образцов и/или образцов окружающей среды, причем набор включает систему, определенную в одном из пп.1-22, и средства для приведения в контакт образца и системы.
- 25. Прибор по п.23 или набор для анализа по п.24, который является одноразовым.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0401868A GB2416030B (en) | 2004-01-28 | 2004-01-28 | A diagnostic system for carrying out a nucleic acid sequence amplification and detection process |
| PCT/GB2005/000308 WO2005073691A1 (en) | 2004-01-28 | 2005-01-28 | A diagnostic system for carrying out a nucleic acid sequence amplification and detection process |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200601377A1 EA200601377A1 (ru) | 2007-02-27 |
| EA011753B1 true EA011753B1 (ru) | 2009-06-30 |
Family
ID=31971613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200601377A EA011753B1 (ru) | 2004-01-28 | 2005-01-28 | Диагностическая система для проведения амплификации и детекции последовательностей нуклеиновых кислот |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20080227185A1 (ru) |
| EP (1) | EP1714134B1 (ru) |
| JP (1) | JP4921177B2 (ru) |
| KR (1) | KR20070027507A (ru) |
| CN (1) | CN1973197B (ru) |
| AT (1) | ATE465401T1 (ru) |
| AU (1) | AU2005208085B8 (ru) |
| BR (1) | BRPI0507200A (ru) |
| CA (1) | CA2554452A1 (ru) |
| DE (1) | DE602005020742D1 (ru) |
| EA (1) | EA011753B1 (ru) |
| GB (1) | GB2416030B (ru) |
| IL (1) | IL177122A (ru) |
| MX (1) | MXPA06008469A (ru) |
| NO (1) | NO20063782L (ru) |
| NZ (1) | NZ548801A (ru) |
| WO (1) | WO2005073691A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200606197B (ru) |
Families Citing this family (81)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102006002258B4 (de) * | 2006-01-17 | 2008-08-21 | Siemens Ag | Modul zur Aufbereitung einer biologischen Probe, Biochip-Satz und Verwendung des Moduls |
| KR100785010B1 (ko) * | 2006-04-06 | 2007-12-11 | 삼성전자주식회사 | 수소 결합을 이용하여 고체 지지체의 친수성 표면 상에서핵산 정제 방법 및 장치 |
| JP4685691B2 (ja) * | 2006-04-13 | 2011-05-18 | 株式会社日立ソリューションズ | 検査チップ及び検査チップシステム |
| CA2646309C (en) | 2006-04-21 | 2016-07-26 | Nanobiosym, Inc. | Single-molecule platform for drug discovery: methods and apparatuses for drug discovery, including discovery of anticancer and antiviral agents |
| JP4759451B2 (ja) * | 2006-06-16 | 2011-08-31 | 株式会社日立ソリューションズ | 生体物質の前処理チップ及び前処理チップシステム |
| EP2041318A2 (en) | 2006-06-26 | 2009-04-01 | Blood Cell Storage, Inc. | Device and method for extraction and analysis of nucleic acids from biological samples |
| JP2008051803A (ja) * | 2006-07-28 | 2008-03-06 | Sharp Corp | 分析用マイクロ流路デバイス |
| WO2008133640A2 (en) * | 2006-10-11 | 2008-11-06 | Arcxis Biotechnologies, Inc. | Disposable micropurification cards, methods, and systems thereof |
| EP1970121A1 (en) * | 2006-12-15 | 2008-09-17 | Universiteit Leiden | A microfluidic chip design comprising capillaries |
| EP1942058A1 (en) | 2007-01-08 | 2008-07-09 | Nutricia N.V. | Package for flowable goods, in particular comestibles, and use of such package during transportation, presentation and consumption |
| EP3677905A1 (en) | 2007-04-04 | 2020-07-08 | ANDE Corporation | Integrated nucleic acid analysis |
| GB0710957D0 (en) | 2007-06-07 | 2007-07-18 | Norchip As | A device for carrying out cell lysis and nucleic acid extraction |
| WO2009117167A1 (en) | 2008-01-02 | 2009-09-24 | Blood Cell Storage, Inc. | Devices and processes for nucleic acid extraction |
| US8961902B2 (en) * | 2008-04-23 | 2015-02-24 | Bioscale, Inc. | Method and apparatus for analyte processing |
| DE102008050092A1 (de) * | 2008-10-06 | 2010-04-08 | Hach Lange Gmbh | Mobile Wasser-Analyseanordnung |
| GB0820720D0 (en) * | 2008-11-12 | 2008-12-17 | Norchip As | Method for worldwide screening of pre-cancer epithelial disease of the cervix |
| US10196700B2 (en) | 2009-03-24 | 2019-02-05 | University Of Chicago | Multivolume devices, kits and related methods for quantification and detection of nucleic acids and other analytes |
| US9447461B2 (en) | 2009-03-24 | 2016-09-20 | California Institute Of Technology | Analysis devices, kits, and related methods for digital quantification of nucleic acids and other analytes |
| US9464319B2 (en) | 2009-03-24 | 2016-10-11 | California Institute Of Technology | Multivolume devices, kits and related methods for quantification of nucleic acids and other analytes |
| AU2010229490B2 (en) | 2009-03-24 | 2015-02-12 | University Of Chicago | Slip chip device and methods |
| EP2443254A2 (en) | 2009-06-15 | 2012-04-25 | NetBio, Inc. | Improved methods for forensic dna quantitation |
| GB0912509D0 (en) | 2009-07-17 | 2009-08-26 | Norchip As | A microfabricated device for metering an analyte |
| KR101626846B1 (ko) * | 2009-12-22 | 2016-06-02 | 삼성전자주식회사 | 핵산 분리 방법 및 장치 |
| US20110091873A1 (en) * | 2009-10-21 | 2011-04-21 | Microfluidic Systems, Inc. | Integrated sample preparation and amplification for nucleic acid detection from biological samples |
| US20110111386A1 (en) * | 2009-11-11 | 2011-05-12 | Norchip As | Cervical cell collection method |
| US9144799B2 (en) * | 2009-11-24 | 2015-09-29 | Lawrence Livermore National Security, Llc | Modular microfluidic system for biological sample preparation |
| WO2012122564A2 (en) | 2011-03-10 | 2012-09-13 | Xagenic, Inc. | Diagnostic and sample preparation devices and methods |
| AU2012253271A1 (en) | 2011-05-12 | 2014-01-09 | Netbio, Inc. | Methods and compositions for rapid multiplex amplification of STR loci |
| US8629264B2 (en) | 2011-05-19 | 2014-01-14 | Blood Cell Storage, Inc. | Gravity flow fluidic device for nucleic acid extraction |
| ITMI20112080A1 (it) * | 2011-11-16 | 2013-05-17 | Eugenio Iannone | Sistema di diagnosi preliminare. |
| KR20130065279A (ko) * | 2011-12-09 | 2013-06-19 | 한국전자통신연구원 | 바이오칩 및 이를 이용한 검체 정량 주입 방법 |
| KR101406347B1 (ko) * | 2011-12-12 | 2014-06-12 | 나노바이오시스 주식회사 | 핵산 추출용 미세유동 칩, 이를 포함하는 핵산 추출 장치, 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법 |
| KR101915675B1 (ko) * | 2012-02-07 | 2018-11-06 | 주식회사 미코바이오메드 | 초고속 핵산 추출 장치, 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법 |
| KR102041217B1 (ko) * | 2012-05-30 | 2019-11-07 | 주식회사 미코바이오메드 | 다-채널 하향 액체 주입 장치, 이를 포함하는 핵산 추출 장치, 및 이를 이용한 핵산 추출 방법 |
| US9399986B2 (en) * | 2012-07-31 | 2016-07-26 | General Electric Company | Devices and systems for isolating biomolecules and associated methods thereof |
| US20150259671A1 (en) * | 2012-07-31 | 2015-09-17 | General Electric Company | Devices and systems for isolating biomolecules and associated methods thereof |
| US20140322706A1 (en) | 2012-10-24 | 2014-10-30 | Jon Faiz Kayyem | Integrated multipelx target analysis |
| CA2889415C (en) | 2012-10-24 | 2020-06-02 | Genmark Diagnostics, Inc. | Integrated multiplex target analysis |
| US9994839B2 (en) * | 2013-01-16 | 2018-06-12 | The Regents Of The University Of California | Microfluidic devices to extract, concentrate and isolate molecules |
| WO2014112671A1 (ko) * | 2013-01-21 | 2014-07-24 | 나노바이오시스(주) | 핵산 추출용 미세유동 칩, 이를 포함하는 핵산 추출 장치, 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법 |
| EP2969217A2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-20 | Genmark Diagnostics Inc. | Systems, methods, and apparatus for manipulating deformable fluid vessels |
| US10933417B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-03-02 | Nanobiosym, Inc. | Systems and methods for mobile device analysis of nucleic acids and proteins |
| WO2014144548A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Nanobiosym, Inc. | Systems and methods for mobile device analysis of nucleic acids and proteins |
| US9506934B2 (en) * | 2013-04-29 | 2016-11-29 | Honeywell International Inc. | Polymer test cartridge mixer for cell lysis |
| GB2516669B (en) * | 2013-07-29 | 2015-09-09 | Atlas Genetics Ltd | A method for processing a liquid sample in a fluidic cartridge |
| USD881409S1 (en) | 2013-10-24 | 2020-04-14 | Genmark Diagnostics, Inc. | Biochip cartridge |
| US9498778B2 (en) | 2014-11-11 | 2016-11-22 | Genmark Diagnostics, Inc. | Instrument for processing cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system |
| CN103602583A (zh) * | 2013-11-07 | 2014-02-26 | 苏州汶颢芯片科技有限公司 | 一种集成式多功能微流控芯片 |
| CN103592209B (zh) * | 2013-11-27 | 2016-05-04 | 武汉武大绿洲生物技术有限公司 | 一种黑胸大蠊浓核病毒定性定量的检测方法及应用 |
| CN103743607A (zh) * | 2014-01-20 | 2014-04-23 | 厦门大学 | 一种用于食品样品检测前处理的芯片卡盒 |
| CN105277725B (zh) * | 2014-07-01 | 2017-03-29 | 清华大学 | 一种用于核酸分析检测的集成化微流控系统 |
| CN104312913B (zh) * | 2014-10-17 | 2016-05-11 | 复旦大学附属华山医院 | 整合全血核酸提取、扩增即可视化检测肿瘤基因突变的微流控芯片及其应用 |
| US9598722B2 (en) | 2014-11-11 | 2017-03-21 | Genmark Diagnostics, Inc. | Cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system |
| US10005080B2 (en) | 2014-11-11 | 2018-06-26 | Genmark Diagnostics, Inc. | Instrument and cartridge for performing assays in a closed sample preparation and reaction system employing electrowetting fluid manipulation |
| CN104560636A (zh) * | 2014-12-30 | 2015-04-29 | 北京理工大学 | 一种细胞预处理装置和方法 |
| US11207681B2 (en) | 2015-07-17 | 2021-12-28 | Delta Electronics, Inc. | Method for extracting nucleic acid and extraction cassette thereof |
| US11491482B2 (en) | 2015-07-17 | 2022-11-08 | Delta Electronics, Inc. | Method for extracting nucleic acid and extraction cassette thereof |
| TWI591182B (zh) | 2015-07-17 | 2017-07-11 | 台達電子工業股份有限公司 | 核酸萃取裝置 |
| CN109966776B (zh) * | 2017-12-26 | 2021-07-13 | 台达电子工业股份有限公司 | 核酸萃取方法及其萃取卡匣 |
| CN105349401B (zh) * | 2015-10-14 | 2018-03-27 | 安徽易康达光电科技有限公司 | 一种多功能的集成化微流控核酸分析芯片及制备和分析方法 |
| US10376885B2 (en) | 2015-11-04 | 2019-08-13 | Lehigh University | Microfluidic concentrator for label-free, continuous nanoparticle processing |
| CN105296349A (zh) * | 2015-11-20 | 2016-02-03 | 青岛意诚融智生物仪器有限公司 | 一种用于dna快速检测的微流控芯片、检测系统和装置 |
| CN116083530A (zh) | 2016-01-29 | 2023-05-09 | 普瑞珍生物系统公司 | 用于核酸纯化的等速电泳 |
| DE102016222032A1 (de) | 2016-11-10 | 2018-05-17 | Robert Bosch Gmbh | Mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren |
| EP3611508B1 (en) * | 2017-05-16 | 2022-08-03 | SK Telecom Co., Ltd. | Nucleic acid analysis apparatus using catridge |
| AU2018312570B2 (en) | 2017-08-02 | 2024-01-11 | Purigen Biosystems, Inc. | Systems, devices, and methods for isotachophoresis |
| FR3088340B1 (fr) * | 2018-11-12 | 2021-01-22 | Commissariat Energie Atomique | Systeme automatise de preparation, de detection et d'analyse d'un echantillon fluidique |
| CN109355283B (zh) * | 2018-11-27 | 2023-05-05 | 中国科学院上海技术物理研究所 | 一种适用于空间的核酸自动提取装置 |
| WO2021000750A1 (zh) * | 2019-07-01 | 2021-01-07 | 申翌生物科技(杭州)有限公司 | 利用pcr综合反应系统进行pcr反应的新方法 |
| CN110257245A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-09-20 | 东莞博识生物科技有限公司 | 核酸检测试剂卡 |
| US20220325272A1 (en) * | 2019-09-20 | 2022-10-13 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Sample preparation apparatus and multi-well plate with pcr chip |
| JP7164505B2 (ja) * | 2019-10-02 | 2022-11-01 | 積水化学工業株式会社 | マイクロ流路チップ |
| JP2021065112A (ja) * | 2019-10-18 | 2021-04-30 | 国立大学法人東海国立大学機構 | 植物物質検出用流路チップおよび植物物質検出装置 |
| AU2021202504A1 (en) * | 2020-04-29 | 2021-11-18 | Teleflex Medical Incorporated | System for identifying severe acute respiratory syndrome corona virus 2 (sars-cov-2) ribonucleic acid (rna) |
| CN111944682A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-11-17 | 上海前瞻创新研究院有限公司 | 一种核酸检测芯片、制备方法及核酸检测方法 |
| WO2022061521A1 (zh) * | 2020-09-22 | 2022-03-31 | 京东方科技集团股份有限公司 | 核酸提取微流控芯片、核酸提取装置及提取方法 |
| TWD218529S (zh) * | 2020-09-30 | 2022-05-01 | 富佳生技股份有限公司 | 核酸檢測儀之圖形化使用者介面 |
| DE102021203409A1 (de) | 2021-04-07 | 2022-10-13 | Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung | Verfahren zum Nachweis aktiver Viren |
| GB2605956A (en) | 2021-04-14 | 2022-10-26 | Univ Of South Eastern Norway | Systems, apparatus and methods for extracting and analysing cellular material |
| KR20230014169A (ko) * | 2021-07-21 | 2023-01-30 | 주식회사 위즈바이오솔루션 | 시료 전처리 카트리지 장치 및 이를 이용한 시료 전처리 방법 |
| WO2023181813A1 (ja) * | 2022-03-22 | 2023-09-28 | 京セラ株式会社 | 核酸増幅方法、核酸増幅システム、ウイルス検出方法、及びウイルス検出システム |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5229297A (en) * | 1989-02-03 | 1993-07-20 | Eastman Kodak Company | Containment cuvette for PCR and method of use |
| DE19700364A1 (de) * | 1997-01-08 | 1998-07-09 | Bayer Ag | Elektrokinetische Probenvorbereitung |
| EP0987327A1 (en) * | 1998-09-14 | 2000-03-22 | QIAGEN GmbH | Novel method for purifying covalently closed circular DNA |
| WO2000062931A1 (en) * | 1999-04-21 | 2000-10-26 | Clinical Micro Sensors, Inc. | The use of microfluidic systems in the electrochemical detection of target analytes |
| US20020045246A1 (en) * | 1999-06-25 | 2002-04-18 | Cepheid | Device for lysing cells, spores, or microorganisms |
| US6544734B1 (en) * | 1998-10-09 | 2003-04-08 | Cynthia G. Briscoe | Multilayered microfluidic DNA analysis system and method |
| US20030138941A1 (en) * | 2001-10-26 | 2003-07-24 | Haiqing Gong | Sample preparation integrated chip |
| WO2004096443A1 (en) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin | Device and method for the preparation of analyte comprising liquids |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1338505C (en) * | 1989-02-03 | 1996-08-06 | John Bruce Findlay | Containment cuvette for pcr and method of use |
| US6403367B1 (en) * | 1994-07-07 | 2002-06-11 | Nanogen, Inc. | Integrated portable biological detection system |
| JP3834357B2 (ja) * | 1996-07-10 | 2006-10-18 | オリンパス株式会社 | 小型分析装置及びその駆動方法 |
| US6074827A (en) * | 1996-07-30 | 2000-06-13 | Aclara Biosciences, Inc. | Microfluidic method for nucleic acid purification and processing |
| JP4209589B2 (ja) * | 1997-12-24 | 2009-01-14 | シーフィード | 一体型流体操作カートリッジ |
| JP4495866B2 (ja) * | 1999-05-28 | 2010-07-07 | セフィード | 化学反応を制御するためのカートリッジ |
| CA2393690A1 (en) * | 1999-12-09 | 2001-06-14 | Huinan Yu | Multilayered microfluidic devices for analyte reactions |
| FR2813207B1 (fr) * | 2000-08-28 | 2002-10-11 | Bio Merieux | Carte reactionnelle et utilisation d'une telle carte |
| JP2002236131A (ja) * | 2000-12-08 | 2002-08-23 | Minolta Co Ltd | マイクロチップ |
| WO2003011768A2 (en) * | 2001-08-01 | 2003-02-13 | Datascope Investment Corp. | Microfluidic device for molecular analysis |
| EP1546412B1 (en) * | 2002-10-02 | 2014-05-21 | California Institute Of Technology | Microfluidic nucleic acid analysis |
| US20040086872A1 (en) * | 2002-10-31 | 2004-05-06 | Childers Winthrop D. | Microfluidic system for analysis of nucleic acids |
| CN101098956B (zh) * | 2002-12-26 | 2012-05-23 | 梅索磅秤技术有限公司 | 检定盒及其使用方法 |
| JP4455014B2 (ja) * | 2003-11-07 | 2010-04-21 | セイコーインスツル株式会社 | 検査用マイクロチップおよび検査装置と検査方法 |
-
2004
- 2004-01-28 GB GB0401868A patent/GB2416030B/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-01-28 US US10/597,541 patent/US20080227185A1/en not_active Abandoned
- 2005-01-28 CA CA002554452A patent/CA2554452A1/en not_active Abandoned
- 2005-01-28 JP JP2006550304A patent/JP4921177B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-01-28 CN CN200580006519.XA patent/CN1973197B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-01-28 WO PCT/GB2005/000308 patent/WO2005073691A1/en active Search and Examination
- 2005-01-28 NZ NZ548801A patent/NZ548801A/en unknown
- 2005-01-28 MX MXPA06008469A patent/MXPA06008469A/es not_active Application Discontinuation
- 2005-01-28 BR BRPI0507200-0A patent/BRPI0507200A/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-01-28 KR KR1020067017188A patent/KR20070027507A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-01-28 AU AU2005208085A patent/AU2005208085B8/en not_active Ceased
- 2005-01-28 EA EA200601377A patent/EA011753B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-01-28 AT AT05702057T patent/ATE465401T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-01-28 DE DE602005020742T patent/DE602005020742D1/de active Active
- 2005-01-28 EP EP05702057A patent/EP1714134B1/en not_active Not-in-force
-
2006
- 2006-07-26 ZA ZA200606197A patent/ZA200606197B/en unknown
- 2006-07-27 IL IL177122A patent/IL177122A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-08-24 NO NO20063782A patent/NO20063782L/no not_active Application Discontinuation
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5229297A (en) * | 1989-02-03 | 1993-07-20 | Eastman Kodak Company | Containment cuvette for PCR and method of use |
| DE19700364A1 (de) * | 1997-01-08 | 1998-07-09 | Bayer Ag | Elektrokinetische Probenvorbereitung |
| EP0987327A1 (en) * | 1998-09-14 | 2000-03-22 | QIAGEN GmbH | Novel method for purifying covalently closed circular DNA |
| US6544734B1 (en) * | 1998-10-09 | 2003-04-08 | Cynthia G. Briscoe | Multilayered microfluidic DNA analysis system and method |
| WO2000062931A1 (en) * | 1999-04-21 | 2000-10-26 | Clinical Micro Sensors, Inc. | The use of microfluidic systems in the electrochemical detection of target analytes |
| US20020045246A1 (en) * | 1999-06-25 | 2002-04-18 | Cepheid | Device for lysing cells, spores, or microorganisms |
| US20030138941A1 (en) * | 2001-10-26 | 2003-07-24 | Haiqing Gong | Sample preparation integrated chip |
| WO2004096443A1 (en) * | 2003-04-25 | 2004-11-11 | november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin | Device and method for the preparation of analyte comprising liquids |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| JOON-HO KIM ET AL.: "A disposable DNA sample preparation microfluidic chip for nucleic add probe assay", PROCEEDINGS OF THE IEEE 15TH. ANNUAL INTERNATIONAL CONFERENCE ON MICROELECTRO MECHANICAL SYSTEMS. MEMS 2002. LAS VEGAS, NV, JAN. 20-24, 2002, IEEE INTERNATIONAL MICRO ELECTRO MECHANICAL SYSTEMS CONFERENCE, NEW YORK, NY: IEEE, US, vol. CONF. 15, 2002, pages 133-136, XP010577613, ISBN: 0-7803-7185-2, the whole document * |
| PRINZ ET AL.: "Bacterial Chromosome extraction and isolation", LAB CHIP, vol. 2, 2002, pages 207-212, XP009047795, the whole document * |
| SCHILLING E.A. ET AL.: "CELL LYSIS AND PROTEIN EXTRACTION IN A MICROFLUIDIC DEVICE WITH DETECTION BY A FLUOROGENIC ENZYME ASSAY", ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. COLUMBUS, US, vol. 74, no. 8, 15 April 2002 (2002-04-15), pages 1798-1804, XP001115858, ISSN: 0003-2700, the whole document * |
| WATERS L.C. ET AL.: "MICROCHIP DEVICE FOR CELL LYSIS, MULTIPLEX PCR AMPLIFICATION, AND ELECTROPHORETIC SIZING", ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. COLUMBUS, US, vol. 70, no. 1, January 1998 (1998-01), pages 158-162, XP000733220, ISSN: 0003-2700, the whole document * |
| ZHANG N. ET AL.: "AUTOMATED AND INTEGRATED SYSTEM FOR HIGH-THROUGHPUT DNA GENOTYPING DIRECTLY FROM BLOOD", ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. COLUMBUS, US, vol. 71, no. 6, 15 March 1999 (1999-03-15), pages 1138-1145, XP000831550, ISSN: 0003-2700, the whole document * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL177122A0 (en) | 2006-12-10 |
| MXPA06008469A (es) | 2009-03-11 |
| CA2554452A1 (en) | 2005-08-11 |
| IL177122A (en) | 2011-07-31 |
| ATE465401T1 (de) | 2010-05-15 |
| DE602005020742D1 (de) | 2010-06-02 |
| WO2005073691A1 (en) | 2005-08-11 |
| EP1714134B1 (en) | 2010-04-21 |
| JP4921177B2 (ja) | 2012-04-25 |
| CN1973197B (zh) | 2010-12-15 |
| NO20063782L (no) | 2006-10-19 |
| NZ548801A (en) | 2010-12-24 |
| JP2007519917A (ja) | 2007-07-19 |
| EP1714134A1 (en) | 2006-10-25 |
| ZA200606197B (en) | 2008-02-27 |
| AU2005208085B2 (en) | 2010-12-16 |
| EA200601377A1 (ru) | 2007-02-27 |
| CN1973197A (zh) | 2007-05-30 |
| US20080227185A1 (en) | 2008-09-18 |
| AU2005208085B8 (en) | 2011-02-24 |
| GB2416030B (en) | 2008-07-23 |
| KR20070027507A (ko) | 2007-03-09 |
| BRPI0507200A (pt) | 2007-06-12 |
| GB2416030A (en) | 2006-01-11 |
| GB0401868D0 (en) | 2004-03-03 |
| AU2005208085A1 (en) | 2005-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA011753B1 (ru) | Диагностическая система для проведения амплификации и детекции последовательностей нуклеиновых кислот | |
| AU2020273294B2 (en) | System and Method for Isolating and Analyzing Cells | |
| AU2022201238B2 (en) | Flow cells utilizing surface-attached structures, and related systems and methods | |
| JP5063616B2 (ja) | マイクロ流体デバイス | |
| KR101214780B1 (ko) | 미세유동 장치 | |
| US8404440B2 (en) | Device for carrying out cell lysis and nucleic acid extraction | |
| US20050221281A1 (en) | Self-contained microfluidic biochip and apparatus | |
| US20050196779A1 (en) | Self-contained microfluidic biochip and apparatus | |
| KR20120051709A (ko) | 미세유체 장치 및 이의 용도 | |
| US20160186167A1 (en) | Method and Device for Processing a Sample of Biological Material Containing Target Cells and Companion Cells in Order to Extract Nucleic Acids of the Target Cells | |
| CN107615064B (zh) | 一次性生物测定盒及盒内执行多个测定步骤和流体输送的方法 | |
| WO2004039977A1 (en) | A microfabricated fluidic device for fragmentation | |
| RU2784821C2 (ru) | Автоматизированный прибор для выделения, очистки и анализа нуклеиновых кислот методом пцр-рв | |
| Siegrist et al. | Microfluidics for biological ana lysis: triumphs and hurdles of CD platforms |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |