DE102021203409A1

DE102021203409A1 - Verfahren zum Nachweis aktiver Viren

Info

Publication number: DE102021203409A1
Application number: DE102021203409.8A
Authority: DE
Inventors: Tanja Maucher; Christian Grumaz; Franz Laermer; Katrin Luckert; Eva Weimer
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2021-04-07
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2022-10-13
Also published as: WO2022214340A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren (500) zum Nachweis von aktiven Viren, insbesondere von aktiven Corona-Viren, mit einer insbesondere mikrofluidischen Vorrichtung (200). In einem ersten Schritt (501) wird eine biologische Probe (10) über einen Filter (221) der Vorrichtung (200) gespült, wobei der Filter (221) ausgebildet ist, humane oder tierische Zellen (11) zurückzuhalten. In einem zweiten Schritt (502) erfolgt ein Lysieren der auf dem Filter (221) zurückgehaltenen Zellen (11) zur Freisetzung von Nukleinsäuren von in den Zellen (11) befindlichen Viren. In einem dritten Schritt (503) werden zumindest Teilen der Nukleinsäuren der Viren vervielfältigt. In einem vierten Schritt (504) erfolgt ein Nachweis der Viren über Nachweis der vervielfältigten Teile.

Description

Stand der Technik
Methoden zum Nachweis von Krankheitserregern basierend auf einer Polymerase-Kettenreaktion (kurz PCR) weisen grundsätzlich eine sehr hohe Nachweisempfindlichkeit auf, beispielsweise zum Nachweis einer SARS-CoV-2-Infektion. Dies kann dazu führen, dass Testpersonen als infektiös eingestuft werden, auch wenn diese keine Viren mehr verbreiten, die noch in der Lage sind, eine Infektion hervorzurufen. Insbesondere können Virenbruchstücke oder inhibierte Viren in den Atemwegen ausreichen, um bei einem PCR-Test ein positives Signal zu generieren.
Um Proben von Menschen oder Tieren auf darin enthaltene Viren zu untersuchen, müssen diese Proben in ein Labor oder zu einem Gerät transportiert werden. Dazu werden die Proben in ein Transportmedium überführt. Unter einem Transportmedium kann dabei ein Behälter und/oder ein Fluid verstanden werden, in welchem die Probe aufgenommen wird. Das Transportmedium hat dabei den Zweck, die Probe möglichst unbeeinträchtigt vorübergehend zu konservieren. Manche Transportmedien wie beispielsweise eNAT™ des Unternehmens COPAN bewirken darüber hinaus eine Vorverarbeitung der Probe, insbesondere eine Lyse von biologischen Zellen in der Probe. Andere Transportmedien, wie z.B. UTM™ (UTM=Universal Transport Medium) des Herstellers COPAN sind nicht-lysierend und erhalten demgegenüber die Integrität der Probe, insbesondere die Integrität von biologischen Zellen in der Probe.
Offenbarung der Erfindung
Vorteile der Erfindung
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von aktiven Viren mit einer Vorrichtung. In einem ersten Schritt des Verfahrens wird eine biologische Probe über einen Filter der Vorrichtung gespült, wobei der Filter ausgebildet ist, humane oder tierische Zellen zurückzuhalten. In einem zweiten Schritt des Verfahrens werden die auf dem Filter zurückgehaltenen Zellen lysiert, um darin enthaltenes genetisches Material freizusetzen, insbesondere genetisches Material von in den Zellen befindlichen Viren. Gemäß einem dritten Schritt wird zumindest ein Teil der Nukleinsäuren der Viren vervielfältigt, bevor in einem vierten Schritt die Viren über einen Nachweis der vervielfältigen Teile nachgewiesen werden. Der dritte Schritt und der vierte Schritt können dabei auch parallel ausgeführt werden, insbesondere im Rahmen einer quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR).
Unter aktiven Viren sind insbesondere solche Viren zu verstehen, welche in der Lage sind, eine Infektion zu verursachen, also insbesondere in menschliche oder tierische Körperzellen (kurz Wirtszellen) eindringen können, und somit als infektiöse Viren bezeichnet werden können. Insbesondere kann es sich bei den Viren um Coronaviren handelt, beispielsweise um SARS-Coronaviren wie SARS-CoV-2.
Unter einer biologischen Probe kann insbesondere eine Probe umfassend eine Körperflüssigkeit wie beispielsweise Blut, Sputum, Urin oder ein Abstrich verstanden werden, welche menschliche oder tierische Zellen umfasst.
Bei der Vorrichtung kann es sich insbesondere um eine mikrofluidische Vorrichtung handeln, insbesondere um eine Lab-on-a-Chip-Vorrichtung, insbesondere basierend auf einer mikrofluidischen Kartusche wie beispielsweise beschrieben in DE 10 2016 222 075 A1 oder DE 10 2016 222 072 A1 .
Der Filter ist ausgestaltet, vorzugsweise abhängig von der bestimmungsgemäßen Probe menschliche beziehungsweise tierische Körperzellen zurückzuhalten und bevorzugt Entitäten oder Partikel mit kleinerer Größe als die Größe der intakten Wirtszellen passieren zu lassen. Dabei kann es sich um einen Porenfilter handeln, welcher eine für die Zurückhaltung der gewünschten Wirtszellen abgestimmte Porengröße aufweist. Die Poren weisen zum Beispiel eine Größe zwischen 0,1 und 7 Mikrometer, bevorzugt zwischen 0,1 und 5 Mikrometer auf, um insbesondere Wirtszellen mit einer Größe von etwa 10 Mikrometer und mehr zurückzuhalten.
Unter genetischem Material sind insbesondere Nukleinsäuren zu verstehen, insbesondere Ribonukleinsäuren (kurz RNA) oder Desoxyribonukleinsäuren (kurz DNA). Unter einem Teil der Nukleinsäuren wird insbesondere ein Abschnitt, auch Sequenz genannt, einer Nukleinsäure verstanden, beispielsweise ein DNA- oder RNA-Abschnitt.
Die Erfindung stellt somit vorteilhafterweise eine Nachweismethode für Viren bereit, welche gezielt einen Nachweis von in menschlichen oder tierischen Zellen befindlichen Viren ermöglicht. Da Viren allgemein dann als infektiös gelten, wenn sie in der Lage sind, in Wirtszellen einzudringen, hat die Erfindung den besonderen Vorteil, dass mit deutlich erhöhter Zuverlässigkeit ein Nachweis von infektiösen Viren in einer Probe erbracht werden kann. Denn aufgrund des erfindungsgemäßen Filters werden intakte Wirtszellen mit potentiell darin enthaltenen Viren zurückgehalten, während in der Probe frei schwimmende Virionen und Bruchstücke von Virionen aus dem Nachweisverfahren vorteilhafterweise vorzeitig entfernt werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens wird der Filter mit den darauf zurückgehaltenen Zellen nachgespült, insbesondere mit einem nicht-lysierenden Spülmedium wie beispielsweise einer phosphatgepufferten Salzlösung (kurz PBS) oder UTM® des Unternehmens COPAN. Besonders vorteilhaft enthält dieses Spülmedium einen Anteil von 20-100g/l, vorzugsweise 50g/l des Stoffs Ammoniumcitrat (binäres Ammoniumcitrat oder besonders bevorzugt ternäres oder tri-basisches Ammoniumcitrat), da dieses ein Gelieren und Verkleben der im UTM® enthaltenen Gelatine verhindert.
Dieses Spülen hat den Vorteil, dass noch zuverlässiger weitere unerwünschte Bestandteile aus der Probe, insbesondere nicht zellgebundenes genetisches Material, vom Filter entfernt werden und eine noch höhere Reinheit an auf dem Filter verbleibenden Zellen erreicht wird.
Vorzugsweise können beim Lysieren der auf dem Filter zurückgehaltenen Zellen Proteasen wie beispielsweise Proteinase K oder Tenside/Detergenzen wie beispielsweise Tween®, Triton®-X, und/oder Natriumlaurylsulfat (SDS) ebenso wie weiteres Ammoniumcitrat (binäres oder bevorzugt ternäres NH4-citrat) um Gelatinereste aus dem UTM® am Gelieren zu hindern, zugegeben werden. Dies unterstützt eine Isolierung der Nukleinsäuren aus den aufgebrochenen Wirtszellen.
Die Vervielfältigung von Teilen der Nukleinsäuren kann mithilfe einer Polymerase-Kettenreaktion, einer isothermalen Amplifikation oder einer Ligase-Kettenreaktion erfolgen. Der Nachweis der vervielfältigen Teile zum Nachweis der Viren kann insbesondere unter Zuhilfenahme von Fluoreszenzspektroskopie erfolgen, wobei Fluoreszenzsonden (Fluorophore) zum Andocken an die vervielfältigten Teile eingesetzt werden können. Wie oben bereits ausgeführt, können gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens können die Durchführung der Vervielfältigung und der Nachweis der Viren auch parallel durchgeführt werden, beispielsweise eine quantitative Echtzeit-PCR. Bevorzugt kann die Vervielfältigung beendet werden, wenn ein positives Nachweissignal eine vorgegebene Nachweisgrenze erreicht. Dies hat den Vorteil, dass das Verfahren zeitlich abgekürzt und Ressourcen eingespart werden können.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung umfasst der Nachweis der Viren einen Nachweis von zumindest einem viren-spezifische Nukleinsäureabschnitt und von zumindest einem menschlich- oder tierisch-spezifischen Nukleinsäureabschnitt. Dazu kann bevorzugt auch eine Vervielfältigung des Teils der menschlichen oder tierischen Nukleinsäuren vor dem Nachweis erfolgen, vorzugsweise parallel zur Vervielfältigung der viren-spezifischen Nukleinsäureteile. Der Nachweis von genetischem Material der Wirtszelle, beispielsweise der Nachweis eines „housekeeping gene“, hat die vorteilhafte Kontrollfunktion, dass tatsächliche Wirtszellen in der Probe enthalten und auf dem Filter zurückgehalten wurden.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung kann es sich bei dem menschlich-spezifischen beziehungsweise tierisch-spezifischem Nukleinsäureabschnitt um einen durch die Viren induzierten Nukleinsäureabschnitt handeln, also um einen Nukleinsäureabschnitt, welchen die infizierte Zelle aufgrund der Infektion durch den aktiven Virus produziert oder in größerem Ausmaß produziert. Beispielsweise handelt es sich bei dem induzierten Nukleinsäureabschnitt um ein oder mehrere Abschnitte ein oder mehrerer messanger-RNA (mRNA, deutsch auch Boten-RNS), die beispielsweise für Proteine, vorzugsweise der Familie der Interferone oder Chemokine kodieren können, welche von den infizierten Wirtszellen aufgrund der Infektion stärker exprimiert werden, wie beispielsweise in loannidis I, et al. Plasticity and virus specificity of the airway epithelial cell immune response during respiratory virus infection. J Virol. 2012 May;86(10):5422-36. doi: 10.1128/JVI.06757-11. Epub 2012 Mar 7. PMID: 22398282; PMCID: PMC3347264. für Atemwegsinfektionen beschrieben. Beispielsweise kann es sich bei den mRNA-Abschnitte um Abschnitte der Gene OASL2, RSAD2, CCL5, IFIT3 oder IFI44L handeln. Bei einer Infektion mit Viren kann dabei mit einer mindestens 10-fach stärkeren Expression relativ zu nicht infizierten Zellen gerechnet werden. Vorzugsweise kann somit ein Nachweissignal zu einem oder mehreren dieser induzierten Nukleinsäureabschnitte, welches mindestens 10-mal stärker als bei nicht-infizierten Zellen ist, als starkes Indiz für das Vorliegen von tatsächlich infizierten Wirtszellen dienen. Dies hat den Vorteil, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren neben dem direkten Nachweis der Viren ein unabhängiges Indiz für eine tatsächliche Infektion der Wirtszellen ermöglicht wird. Vorzugsweise kann das Verfahren somit drei Nachweise erbringen, nämlich einen ersten Nachweis eines viren-spezifischen Nukleinsäureabschnitts als Nachweis von Viren in der Probe, einen zweiten Nachweis eines ersten Wirtszellen-spezifischen Nukleinsäureabschnitts als Nachweis von Wirtszellen in der Probe und einen dritten Nachweis eines zweiten Wirtszellen-spezifischen Nukleinsäureabschnitts, wobei der zweite Wirtszellen-spezifische Nukleinsäureabschnitt, entsprechend dem oben beschriebenen virus-induzierten Nukleinsäureabschnitt, bei virus-infizierten Wirtszellen in größerer Menge als bei nicht virus-infizierten Wirtszellen vorliegt. Somit kann vorteilhafterweise über den dritten Nachweis, insbesondere über einen Vergleich einer Stärke des zweiten Nachweises mit der Stärke des dritten Nachweises ein belastbares Indiz für oder gegen das Vorliegen von tatsächlich infizierten Wirtszellen in der Probe erhalten werden. Die drei Nachweise können vorzugsweise parallel oder auch (teilweise) nacheinander erbracht werden, insbesondere unter Zuhilfenahme einer (Echtzeit-)Polymerase-Kettenreaktion mit passenden Primern zur Selektion der nachzuweisenden Nukleinsäureabschnitte.
In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens wird die Probe vor dem Einbringen in die mikrofluidische Vorrichtung oder vor dem Spülen über den Filter in ein nicht-lysierendes Transportmedium überführt oder mit einem nicht-lysierenden Transportmedium vermischt. Insbesondere handelt es sich bei dem Transportmedium um eine Flüssigkeit wie phosphatgepufferte Salzlösung (kurz PBS) oder UTM®. Dies hat den Vorteil, dass die in der Probe enthaltenen Wirtszellen nicht vorzeitig zerstört, sondern vorübergehend konserviert werden. Dem Transportmedium UTM kann Ammoniumcitrat (binäres oder vorzugsweise ternäres oder „tri-basisches“ Ammoniumcitrat) zugesetzt werden, um die darin enthaltene Gelatine im späteren Prozess am gelieren zu hindern.
Gemäß einer besonders bevorzugten Weiterbildung umfasst das nicht-lysierende Transportmedium neutralisierende Körper. Alternativ werden dem nicht-lysierenden Transportmedium neutralisierende Körper zugegeben. Unter neutralisierenden Körper sind Entitäten, insbesondere Moleküle, zu verstehen, welche an Oberflächenmerkmale, insbesondere Proteine von Virionen binden können und damit vorzugsweise deren weitere Funktion beeinträchtigen oder unterbinden. Unter Oberflächenmerkmalen von Virionen sind Teile von Virionen gemeint, insbesondere Teile einer Hülle, beispielsweise dem Kapsid, oder einer Außenseite der Virionen, wie beispielsweise Proteine oder Kohlenhydrate, welche sich auf einer Oberfläche der Virionen befinden. Unter Proteinen von Virionen sind allgemein Proteine zu verstehen, welche Teil eines Viruspartikels sind. Im weiteren Sinne können darunter Proteine verstanden werden, welche durch genetische Information des Virus kodiert oder unter Mitwirkung des Virus produziert werden. Insbesondere sind damit Proteine gemeint, welche auf oder in einer Membran oder einem Kapsid des Virions angeordnet sind, im Weiteren kurz als Membranproteine bezeichnet. Dies hat den Vorteil, dass Bindungsstellen der Virionen durch die neutralisierenden Körper besetzt werden, was vorzugsweise eine weitere Interaktion dieser Bindungsstellen mit anderen Entitäten erschwert oder ganz verhindert. Mit anderen Worten werden die Oberflächenmerkmale durch die neutralisierenden Körper vorzugsweise abgesättigt. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn es sich bei den Oberflächenmerkmalen um Teile handelt, welche das Virus zur Infektion eines Menschen oder Tieres benötigt, beispielsweise zum Andocken und im Folgenden zum Eindringen in eine menschliche beziehungsweise tierische Zelle. Eine erfindungsmäße Zugabe der neutralisierenden Körper zum Transportmedium in insbesondere löslicher Form hat somit den Vorteil, dass eine Gefährlichkeit der in der Probe vorhandenen Viren für den Benutzer der Probe deutlich reduziert und damit der Umgang mit der Probe deutlich sicherer wird.
Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Transportmedium für eine Probe mit menschlichen oder tierischen Zellen, wobei das Transportmedium solche neutralisierenden Körper zur Bindung an Oberflächenmerkmalen, insbesondere Proteinen von Virionen umfasst.
Mit dem Ausdruck „Transportmedium“ ist allgemein ein Medium oder Mittel gemeint, das zum Transport von Proben geeignet ist. In besonderen Ausgestaltungen der Erfindung kann es sich bei dem Transportmedium um einen Behälter handeln, insbesondere einen Behälter aus Glas oder Kunststoff. Der Behälter ist vorzugsweise zum Transport von biologischen Proben geeignet, insbesondere von Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Blut, Sputum, Urin oder ein Abstrich. Beispielsweise handelt es sich bei dem Behälter um ein Mikroreaktionsgefäß, beispielsweise um ein sogenanntes Eppendorf Tube, kurz Eppi genannt. In weiteren vorteilhaften Ausgestaltungen der Erfindung kann es sich bei dem Transportmedium um ein Fluid handeln, insbesondere um eine Flüssigkeit. Beispielsweise kann das Transportmedium eine phosphatgepufferte Salzlösung (kurz PBS) oder UTM® des Unternehmens COPAN umfassen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Transportmedium um ein nicht-lysierendes Medium, also um ein Medium, welches insbesondere menschliche oder tierische Zellen nicht lysiert und vorzugsweise stabilisiert. Aus diesem Grund ist in UTM® unter anderen auch Gelatine enthalten, die durch einen Zusatz von Ammoniumcitrat ins Transportmedium oder nachfolgend im Lab-on-Chip-Prozess „unschädlich“ gemacht werden kann. Dies hat den Vorteil, dass die Zellen in der Probe bestehen bleiben und damit in den Zellen enthaltene Viren nicht durch die neutralisierenden Körper beeinträchtigt werden, während in der Probe frei schwimmende Virionen durch die neutralisierenden Körper vorzugsweise inaktiviert werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung umfassen die neutralisierenden Körper Peptide, insbesondere Polypeptide oder Proteine, insbesondere auch rekombinante Proteine, welche an Oberflächenmerkmale, insbesondere Proteine von Virionen binden. Beispielsweise umfasst das Transportmedium Angiotensinkonvertierendes Enzym 2 (kurz ACE2) um eine Bindung von Coronaviren, insbesondere SARS-CoV oder SARS-CoV2, an menschliche Zellen vorzutäuschen und den Spike-Protein-Rezeptor der Virionen zu blockieren.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfassen die neutralisierenden Körper Antikörper. Bei den Antikörpern kann es sich insbesondere um Antikörper gegen Oberflächenmerkmale oder Oberflächenmoleküle von Virionen handeln, beispielsweise um Antikörper, welche an das Spike-Protein eines Corona-Virions binden, insbesondere an ein Spike-Protein von Sars-CoV2. Beispielsweise kann es sich dabei um Antikörper des Isotops G (IgG) handeln, zum Beispiel die monoklonalen Antikörper Casirivimab oder Imdevimab oder auch andere therapeutische Antikörper.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung umfassen die neutralisierenden Körper Nanokörper. Unter Nanokörper, auch Nanobodies genannt, können dabei Fragmente von Antikörper verstanden werden, insbesondere Einzel-Domänen-Antikörper mit einer Größe zwischen 12 und 15 Kilo-Dalton, welche beispielsweise für den Einsatz gegen Sars-Cov2 vorteilhaft sind. , Beispielsweise handelt es sich um Antikörper-Fragmente wie beschrieben in Esparza, T.J., Martin, N.P., Anderson, G.P. et al. High affinity nanobodies block SARS-CoV-2 spike receptor binding domain interaction with human angiotensin converting enzyme. Sei Rep 10, 22370 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-79036-0.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfassen die neutralisierenden Körper organische oder anorganische Schwefelverbindungen, welche an Proteine der Virionen andocken können. Beispielsweise kann es sich bei den Schwefelverbindungen um Verbindungen handeln, welche in wässriger Lösung insbesondere nanoskaligen Schwefel freisetzen, beispielsweise Thiosulfate oder in nicht-wirtszelllysierender Konzentration Thiocyanate, insbesondere nanoskalige Schwefelcluster. Es kann sich auch um elementaren kolloidalen Schwefel handeln, welcher zum Beispiel aus dem Zerfall von Thiocyanaten oder Thiosulfaten in Form von Schwefelnanopartikeln entsteht. Ferner können die neutralisierenden Körper andere organische oder anorganische Verbindungen umfassen, welche an Proteine der Virionen andocken und diese vorzugsweise inaktivieren können.
Wenn das Transportmedium ein Gefäß umfasst., können die neutralisierenden Körper vorzugsweise an einer Innenwand des Gefäßes angebracht sein, beispielsweise an einer Seitenwand und/oder am Boden des Gefäßes, beispielsweise in Form einer Beschichtung. Dies hat den Vorteil, dass in der Probe befindliche Virionen über eine Bindung an die Körper ebenfalls an der Innenwand fixiert und somit vom Rest der Probe abgesondert werden. Ferner ist von Vorteil, dass die neutralisierenden Körper bis zu einer Probeneingabe in dem Gefäß zuverlässig vorgelagert werden können.
Die neutralisierenden Körper können dabei kovalent oder nicht-kovalent auf dem Gefäß immobilisiert sein. Beispielsweise kann das Gefäß eine carboxylierte Oberfläche aufweisen, wobei die neutralisierenden Körper, insbesondere die auf proteinischen Strukturen basierenden Körper, mittels Peptidbindung über proteinische Aminogruppen (NH2-Gruppen) gebunden werden. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung können weitere Proteine an dem Gefäß immobilisiert sein, beispielsweise in Form einer Beschichtung, wobei die weiteren Proteine eine Affinität zu den neutralisierenden Körpern aufweisen. Vorzugsweise ist die Affinität der weiteren Proteine derart ausgebildet, dass die darin anbindenden neutralisierenden Körper nach der Anbindung eine vorteilhafte Orientierung aufweisen, bei welcher eine Bindungsstelle für die Oberflächenmerkmale der Virionen zugänglich bleibt. Im Falle von Antikörpern als neutralisierende Körper können die weiteren Proteine basierend auf im Stand der Technik bekannte antikörperbindende Proteine (zum Beispiel Protein A, Protein G oder Protein L) beispielsweise eine Bindungsstelle für den Fc-Teil der Antikörper aufweisen, so dass die antigenbindenden Teile (Fab-Teile) der Antikörper zur Bindung der Oberflächenmerkmale der Virionen frei zugänglich sind. Eine nicht-kovalente Immobilisierung der neutralisierenden Körper, insbesondere der auf proteinischen Strukturen basierenden Körper, kann beispielsweise über Adsorption erfolgen.
Abhängig von der Art und Stabilität der Immobilisierung kann bei Zugabe der Probe in das Gefäß eine teilweise oder vollständige Lösung der neutralisierenden Antikörper in die Probe erfolgen. Beispielsweise kann die Immobilisierung wasserlöslich ausgestaltet sein, insbesondere im Falle der nicht-kovalenten Bindung. Somit können frei schwimmende Virionen sowohl an den Wänden des Gefäßes als auch direkt in der Probe neutralisiert werden.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung sind die neutralisierenden Körper an magnetischen Partikeln gebunden. Beispielsweise kann es sich bei den magnetischen Partikeln um Nanopartikel mit einem eisenhaltigen Kern und einer Kunststoffbeschichtung handeln, wie beispielsweise in DOI: 10.1039/C7AN01424D (Paper) Analyst, 2017, 142, 4247-4256 beschrieben, welche mit Fängermolekülen in Form von beispielsweise Antikörpern oder an Membranproteinen der Virionen bindenden Proteinen (ACE2 zum Beispiel im Fall von Coronaviren) funktionalisiert sind. Dies hat den Vorteil, dass die über die neutralisierenden Körper dann gebundenen Virionen mit Hilfe eines Magneten auf einfache Weise von der Probe getrennt werden können.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum Transport einer Probe mit menschlichen oder tierischen Zellen mit einem Transportmedium, wobei das Transportmedium neutralisierende Körper zur Bindung und vorzugsweise Absättigung von Oberflächenmerkmalen, insbesondere Proteinen von Virionen umfasst. Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens und den folgenden vorteilhaften Weiterbildungen wird auf die oben angeführten Vorteile verwiesen.
In einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens wird ein Magnet zur Trennung der an magnetischen Partikeln gebundenen neutralisierenden Körper von einem Rest der Probe verwendet.
Figurenliste
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
Es zeigen

1 ein Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung für die Durchführung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens,
2 ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Transportmediums und
3 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens,
4 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Transportverfahrens.

Ausführungsformen der Erfindung
1 zeigt ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung 200 und 3 ein Flussdiagramm zu einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens 500, welches diese Vorrichtung 200 zur Durchführung nutzen kann.
Die Vorrichtung 500 kann insbesondere auf einer mikrofluidischen Kartusche basieren, beispielsweise auf einer Kartusche wie beschrieben in DE 10 2016 222 075 A1 oder DE 10 2016 222 072 A1 . Die Vorrichtung 500 weist eine Eingabekammer 210 zur Eingabe einer Probe 10 auf. Bei der Probe 10 kann es sich wie oben beschrieben um eine Körperflüssigkeit mit menschlichen oder tierischen Zellen handeln. Beispielsweise handelt es sich um einen Abstrich aus dem Nasen- oder Rachenbereich, um eine Infektion mit einem Virus nachzuweisen, insbesondere eine Infektion mit einem Coronavirus wie SARS-CoV-2. Die Probe 10 kann ein nicht-lysierendes Transportmedium wie beispielsweise UTM® oder PBS aufweisen, um darin enthaltene Zellen zu konservieren.
Die Eingabekammer 210 ist mit einer Aufbereitungskammer 220 fluidisch verbunden, wobei die Aufbereitungskammer 220 einen Filter 221 aufweist, über welchen die Probe 10 in einem ersten Schritt 501 des Verfahrens 500 gespült werden kann. Der Filter 221 ist ausgestaltet, menschliche oder tierische Zellen 11 (wie oben kurz als Wirtszellen bezeichnet) wie in 1 dargestellt zurückzuhalten, während ein Rest der Probe 10 durch den Filter 221 treten und in einer Abfallkammer (nicht dargestellt) entsorgt werden kann. Dazu weist der Filter 221 beispielsweise Poren 222 mit einer Porengröße zwischen 0,1 und 5 Mikrometer auf, da Wirtszellen eine Größe von etwa 10 bis ca. 20 Mikrometer besitzen. Beispielsweise handelt es sich bei dem Filter 221 um einen in der Mikrofluidik üblicherweise verwendeten Silikafilter mit einer beispielhaften Porengröße von 1 Mikrometer. Die Aufbereitungskammer 220 kann mit einer Pufferkammer 230 verbunden sein, wobei in der Pufferkammer 230 beispielsweise Waschpuffer vorgelagert sind. Insbesondere kann die Pufferkammer 230 ein die Wirtszellen 11 nicht lysierendes Spülmedium wie UTM® oder PBS umfassen, um einerseits die zurückgehaltenen Wirtszellen 11 intakt zu lassen und andererseits alle anderen Bestandteile der Probe 10 vom Filter 221 im Zuge einer Nachspülung zu entfernen. Falls das Medium UTM® zugegen ist, sollte dem Waschpuffer noch zusätzlich Ammoniumcitrat (binäres oder besonders bevorzugt ternäres NH-citrat) zugesetzt werden zur Neutralisation der im UTM enthaltenen Gelatine.
In einem zweiten Schritt 502 des Verfahrens 500 werden die zurückgehaltenen Wirtszellen 11 lysiert, beispielsweise chemisch unter Einsatz eines üblichen Lysepuffers mit zugesetzten Tensiden, und dabei die Nukleinsäuren der in den Wirtszellen befindlichen der Viren freigesetzt. Wie oben ausgeführt, können dabei auch Proteasen wie beispielsweise Proteinase K zum Einsatz kommen.
In einem dritten Schritt 503 des Verfahrens 500 werden Teile, insbesondere Abschnitte, von Nukleinsäuren der Viren vervielfältigt, insbesondere über eine (quantitative Echtzeit-)Polymerase-Kettenreaktion oder eine isothermale Amplifikation. Die Vervielfältigung kann dabei in einer mit der Aufbereitungskammer 220 verbundenen Vervielfältigungskammer 240 der Vorrichtung 200 stattfinden, in welcher für die Reaktion erforderliche Substanzen vorgelagert sein können, insbesondere ein PCR-Bead samt Primern für die gezielte Vervielfältigung genetischen Materials der gesuchten Viren. Gleichzeitig (insbesondere im Falle einer Echtzeit-PCR) oder anschließend können in einem vierten Schritt 504 des Verfahrens 500 die gesuchten Teile nachgewiesen werden, insbesondere unter Zuhilfenahme von Fluoreszenztechniken, sofern die Wirtszellen 11 tatsächlich mit den gesuchten Viren infiziert waren. Bei gleichzeitiger Vervielfältigung und Nachweis kann wie oben beschrieben die Vervielfältigung vorzeitig beendet werden, wenn ein ausreichend starkes Nachweissignal erreicht wird.
Die Probe 10 kann vor einer Spülung über den Filter in ein nicht-lysierendes Transportmedium überführt werden, beispielsweise vor oder während des Transports der Probe 10 zur Vorrichtung 200. 2 zeigt dazu ein ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Transportmediums 100. Wie dargestellt, kann in einen Behälter 110 mit einer Flüssigkeit 120 die Probe 10 eingebracht werden. Ferner befinden sich in dem Gefäß neutralisierende Körper 130 zur Bindung an Proteinen von Virionen. Unter dem Transportmedium 100 kann, wie oben beschrieben, der Behälter 110 und/oder die Flüssigkeit 120 verstanden werden, welche beide die neutralisierenden Körper 130 umfassen. Beispielsweise handelt es sich bei dem Behälter 110 um einen Glasbehälter oder einen Kunststoffbehälter (Polypropylen) mit einem Fassungsvermögen zwischen 0,2 und 10 Milliliter (ml) wie zum Beispiel ein Eppendorf Tube. Bei der Flüssigkeit 120 kann es sich insbesondere um einen nicht-lysierenden Puffer handeln, beispielsweise um PBS oder UTM®.
Die neutralisierenden Körper 130 können mit der Flüssigkeit vermischt und/oder wie oben beschrieben kovalent oder nicht-kovalent an einer Wand 111 des Behälters 110 gebunden sein, beispielsweise als wasserlösliche Beschichtung 131, welche durch Eintrocknung nach Eindispensierung als wässrige Lösung aufgebracht worden ist. Wie oben erläutert kann es sich bei den neutralisierenden Körpern 130 um Peptide, Proteine, Antikörper, Nanokörper oder Schwefelverbindungen handeln, welche an Oberflächenmerkmale der Virionen binden, insbesondere an Membranproteine, und damit die in der Probe schwimmenden Virionen vorzugsweise unschädlich machen. Die neutralisierenden Körper 130 können wie oben beschrieben auch an magnetische Partikel 140 gebunden sein, um sie mit Hilfe eines Magneten 40 aus der Probe 10 zu isolieren. Eine bevorzugte Anzahl beziehungsweise Konzentration an neutralisierenden Körpern hängt von einer typischen Virenkonzentration in der Probe und einer typischen Anzahl von zu bindenden Oberflächenmerkmalen der Virionen ab. Bei einer Größenordnung von 100 Oberflächenmerkmalen pro Virion, was einer typischen Anzahl von Spike-Proteinen auf einem SARS-CoV-2-Virion entspricht, können bei einer angenommenen Virenkonzentration zwischen 10⁸ und 10¹⁰ pro Milliliter mindestens 10¹² Körper pro Milliliter verwendet werden.
4 zeigt ein Flussdiagramm 600 eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens 600, welches mit dem oben beschriebenen Ausführungsbeispiel des Transportmediums 100 durchgeführt werden kann. In einem ersten Schritt 601 des Verfahrens 600 wird das Transportmedium 100 bereitgestellt. In einem zweiten Schritt 602 wird die Probe 10 in das Transportmedium 100 eingebracht. In einem dritten Schritt 603 werden die neutralisierenden Körper 130 mit der Probe 10 vermischt, insbesondere durch Zugabe der Körper 130 in die Probe 10, durch Auslösung der Körper 130 aus der Beschichtung 131 in die Probe 10 oder durch Auflösung der in dem Transportmedium 100 vorgelagerten Körper 130 bei Zugabe der Probe 10.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 102016222075 A1 [0006, 0033]
DE 102016222072 A1 [0006, 0033]

Claims

Verfahren (500) zum Nachweis von aktiven Viren, insbesondere von aktiven Corona-Viren, mit einer insbesondere mikrofluidischen Vorrichtung (200), umfassend die Schritte: • Spülen (501) einer biologischen Probe (10) über einen Filter (221) der Vorrichtung (200), wobei der Filter (221) ausgebildet ist, humane oder tierische Zellen (11) zurückzuhalten • Lysieren (502) der auf dem Filter (221) zurückgehaltenen Zellen (11) zur Freisetzung von Nukleinsäuren von in den Zellen (11) befindlichen Viren • Durchführen (503) einer Vervielfältigung zumindest von Teilen der Nukleinsäuren der Viren • Nachweis (504) der Viren über Nachweis der vervielfältigten Teile.
Verfahren (500) nach Anspruch 1, wobei das Verfahren (500) nach dem Spülen (501) der Probe (10) über den Filter (221) einen Schritt des Nachspülens mit einem nicht-lysierenden Spülmedium über den Filter (221) umfasst.
Verfahren (500) nach Anspruch 1 oder 2, wobei vor dem Spülen (501) der Probe über den Filter (221) ein Überführen der Probe (10) in ein nicht-lysierendes Transportmedium (100) erfolgt.
Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das nicht-lysierende Transportmedium (100) neutralisierende Körper (130) aufweist oder wobei dem nicht-lysierenden Transportmedium (100) neutralisierende Körper (130) zugegeben werden, wobei die neutralisierenden Körper (130) an Oberflächenmerkmale, insbesondere Proteine von Virionen in der Probe binden.
Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Nachweis (504) der Viren einen Nachweis von zumindest einem viren-spezifischen Nukleinsäureabschnitt und von zumindest einem menschlich- oder tierisch-spezifischen Nukleinsäureabschnitt umfasst.
Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Durchführung (503) einer Vervielfältigung auch eine Vervielfältigung eines Teils von menschlichen oder tierischen Nukleinsäuren umfasst.
Verfahren (500) nach Anspruch 5 oder 6, wobei der menschlich- oder tierischspezifische Nukleinsäureabschnitt einen durch die Viren induzierten Nukleinsäureabschnitt umfasst.
Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Durchführung (503) einer Vervielfältigung eine Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion, einer isothermalen Amplifikation oder einer Ligase-Kettenreaktion umfasst.
Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Durchführung (503) der Vervielfältigung und der Nachweis (504) der Viren parallel durchgeführt werden und wobei bei Erreichen einer Nachweisgrenze die Vervielfältigung beendet wird.
Transportmedium (100) für eine Probe (10) mit menschlichen oder tierischen Zellen insbesondere für ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Transportmedium (100) neutralisierende Körper (130) zur Bindung an Oberflächenmerkmalen von Virionen umfasst.