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Stand der Technik
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Um Proben von Menschen oder Tieren auf darin enthaltene Viren zu untersuchen, müssen diese Proben in ein Labor oder zu einem Gerät transportiert werden. Dazu werden die Proben in ein Transportmedium überführt. Unter einem Transportmedium kann dabei ein Behälter und/oder ein Fluid verstanden werden, in welchem die Probe aufgenommen wird. Das Transportmedium hat dabei den Zweck, die Probe möglichst unbeeinträchtigt vorübergehend zu konservieren. Manche Transportmedien wie beispielsweise eNAT™ des Unternehmens COPAN bewirken darüber hinaus eine Vorverarbeitung der Probe, insbesondere eine Lyse von biologischen Zellen in der Probe. Andere Transportmedien, wie z.B. UTM™ (UTM=Universal Transport Medium) des Herstellers COPAN sind nicht-lysierend und erhalten demgegenüber die Integrität der Probe, insbesondere die Integrität von biologischen Zellen in der Probe.
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Offenbarung der Erfindung
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Vorteile der Erfindung
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Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ein Transportmedium für eine Probe mit menschlichen oder tierischen Zellen, wobei das Transportmedium neutralisierende Körper zur Bindung an Oberflächenmerkmalen, insbesondere Proteinen von Virionen umfasst.
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Mit dem Ausdruck „Transportmedium“ ist allgemein ein Medium oder Mittel gemeint, das zum Transport von Proben geeignet ist. In besonderen Ausgestaltungen der Erfindung kann es sich bei dem Transportmedium um einen Behälter handeln, insbesondere einen Behälter aus Glas oder Kunststoff. Der Behälter ist vorzugsweise zum Transport von biologischen Proben geeignet, insbesondere von Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Blut, Sputum, Urin oder ein Abstrich. Beispielsweise handelt es sich bei dem Behälter um ein Mikroreaktionsgefäß, beispielsweise um ein sogenanntes Eppendorf Tube, kurz Eppi genannt. In weiteren vorteilhaften Ausgestaltungen der Erfindung kann es sich bei dem Transportmedium um ein Fluid handeln, insbesondere um eine Flüssigkeit. Beispielsweise kann das Transportmedium eine phosphatgepufferte Salzlösung (kurz PBS) oder UTM® des Unternehmens COPAN umfassen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Transportmedium um ein nicht-lysierendes Medium, also um ein Medium, welches insbesondere menschliche oder tierische Zellen nicht lysiert und vorzugsweise stabilisiert. Aus diesem Grund ist in UTM® unter anderen auch Gelatine enthalten, die durch einen Zusatz von Ammoniumcitrat ins Transportmedium oder nachfolgend im Lab-on-Chip-Prozess „unschädlich“ gemacht werden kann. Dies hat den Vorteil, dass die Zellen in der Probe bestehen bleiben und damit in den Zellen enthaltene Viren nicht durch die neutralisierenden Körper beeinträchtigt werden, während in der Probe frei schwimmende Virionen durch die neutralisierenden Körper vorzugsweise inaktiviert werden.
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Unter neutralisierenden Körper sind Entitäten, insbesondere Moleküle, zu verstehen, welche an Oberflächenmerkmale, insbesondere Proteine von Virionen binden können und damit vorzugsweise deren weitere Funktion beeinträchtigen oder unterbinden.
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Unter Oberflächenmerkmalen von Virionen sind Teile von Virionen gemeint, insbesondere Teile einer Hülle, beispielsweise dem Kapsid, oder einer Außenseite der Virionen, wie beispielsweise Proteine oder Kohlenhydrate, welche sich auf einer Oberfläche der Virionen befinden. Unter Proteinen von Virionen sind können dabei allgemein Proteine verstanden werden, welche Teil eines Viruspartikels sind. Im weiteren Sinne können darunter Proteine verstanden werden, welche durch genetische Information des Virus kodiert oder unter Mitwirkung des Virus produziert werden. Insbesondere sind damit Proteine gemeint, welche auf oder in einer Membran oder einem Kapsid des Virions angeordnet sind, im Weiteren kurz als Membranproteine bezeichnet.
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Das erfindungsgemäße Transportmedium hat somit den Vorteil, dass Bindungsstellen der Virionen durch die neutralisierenden Körper besetzt werden, was vorzugsweise eine weitere Interaktion dieser Bindungsstellen mit anderen Entitäten erschwert oder ganz verhindert. Mit anderen Worten werden die Oberflächenmerkmale durch die neutralisierenden Körper vorzugsweise abgesättigt. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn es sich bei den Oberflächenmerkmalen um Teile handelt, welche das Virus zur Infektion eines Menschen oder Tieres benötigt, beispielsweise zum Andocken und im Folgenden zum Eindringen in eine menschliche beziehungsweise tierische Zelle. Eine erfindungsmäße Zugabe der neutralisierenden Körper zum Transportmedium in insbesondere löslicher Form hat somit den Vorteil, dass eine Gefährlichkeit der in der Probe vorhandenen Viren für den Benutzer der Probe deutlich reduziert wird und damit der Umgang mit der Probe deutlich sicherer wird.
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Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfassen die neutralisierenden Körper Peptide, insbesondere Polypeptide oder Proteine, insbesondere auch rekombinante Proteine, welche an Oberflächenmerkmale, insbesondere Proteine von Virionen binden. Beispielsweise umfasst das Transportmedium Angiotensin-konvertierendes Enzym 2 (kurz ACE2) um eine Bindung von Coronaviren, insbesondere SARS-CoV oder SARS-CoV2, an menschliche Zellen vorzutäuschen und den Spike-Protein-Rezeptor der Virionen zu blockieren.
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Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfassen die neutralisierenden Körper Antikörper. Bei den Antikörpern kann es sich insbesondere um Antikörper gegen Oberflächenmerkmale oder Oberflächenmoleküle von Virionen handeln, beispielsweise um Antikörper, welche an das Spike-Protein eines Corona-Virions binden, insbesondere an ein Spike-Protein von Sars-CoV2. Beispielsweise kann es sich dabei um Antikörper des Isotops G (IgG) handeln, zum Beispiel die monoklonalen Antikörper Casirivimab oder Imdevimab oder auch andere therapeutische Antikörper.
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In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung umfassen die neutralisierenden Körper Nanokörper. Unter Nanokörper, auch Nanobodies genannt, können dabei Fragmente von Antikörper verstanden werden, insbesondere Einzel-Domänen-Antikörper mit einer Größe zwischen 12 und 15 Kilo-Dalton, welche beispielsweise für den Einsatz gegen Sars-Cov2 vorteilhaft sind. , Beispielsweise handelt es sich um Antikörper-Fragmente wie beschrieben in Esparza, T.J., Martin, N.P., Anderson, G.P. et al. High affinity nanobodies block SARS-CoV-2 spike receptor binding domain interaction with human angiotensin converting enzyme. Sei Rep 10, 22370 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-79036-0. https://doi.org/10.1038/s41598-020-79036-0.
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Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfassen die neutralisierenden Körper organische oder anorganische Schwefelverbindungen, welche an Proteine der Virionen andocken können. Beispielsweise kann es sich bei den Schwefelverbindungen um Verbindungen handeln, welche in wässriger Lösung insbesondere nanoskaligen Schwefel freisetzen, beispielsweise Thiosulfate oder in nicht-wirtszelllysierender Konzentration Thiocyanate, insbesondere nanoskalige Schwefelcluster. Es kann sich auch um elementaren kolloidalen Schwefel handeln, welcher zum Beispiel aus dem Zerfall von Thiocyanaten oder Thiosulfaten in Form von Schwefelnanopartikeln entsteht. Ferner können die neutralisierenden Körper andere organische oder anorganische Verbindungen umfassen, welche an Proteine der Virionen andocken und diese vorzugsweise inaktivieren können.
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Wenn das Transportmedium ein Gefäß umfasst., können die neutralisierenden Körper vorzugsweise an einer Innenwand des Gefäßes angebracht sein, beispielsweise an einer Seitenwand und/oder am Boden des Gefäßes, beispielsweise in Form einer Beschichtung. Dies hat den Vorteil, dass in der Probe befindliche Virionen über eine Bindung an die Körper ebenfalls an der Innenwand fixiert und somit vom Rest der Probe abgesondert werden. Ferner ist von Vorteil, dass die neutralisierenden Körper bis zu einer Probeneingabe in dem Gefäß zuverlässig vorgelagert werden können.
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Die neutralisierenden Körper können dabei kovalent oder nicht-kovalent auf dem Gefäß immobilisiert sein. Beispielsweise kann das Gefäß eine carboxylierte Oberfläche aufweisen, wobei die neutralisierenden Körper, insbesondere die auf proteinischen Strukturen basierenden Körper, mittels Peptidbindung über proteinische Aminogruppen (NH2-Gruppen) gebunden werden. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung können weitere Proteine an dem Gefäß immobilisiert sein, beispielsweise in Form einer Beschichtung, wobei die weiteren Proteine eine Affinität zu den neutralisierenden Körpern aufweisen. Vorzugsweise ist die Affinität der weiteren Proteine derart ausgebildet, dass die darin anbindenden neutralisierenden Körper nach der Anbindung eine vorteilhafte Orientierung aufweisen, bei welcher eine Bindungsstelle für die Oberflächenmerkmale der Virionen zugänglich bleibt. Im Falle von Antikörpern als neutralisierende Körper können die weiteren Proteine basierend auf im Stand der Technik bekannte antikörperbindende Proteine (zum Beispiel Protein A, Protein G oder Protein L) beispielsweise eine Bindungsstelle für den Fc-Teil der Antikörper aufweisen, so dass die antigenbindenden Teile (Fab-Teile) der Antikörper zur Bindung der Oberflächenmerkmale der Virionen frei zugänglich sind. Eine nicht-kovalente Immobilisierung der neutralisierenden Körper, insbesondere der auf proteinischen Strukturen basierenden Körper, kann beispielsweise über Adsorption erfolgen.
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Abhängig von der Art und Stabilität der Immobilisierung kann bei Zugabe der Probe in das Gefäß eine teilweise oder vollständige Lösung der neutralisierenden Antikörper in die Probe erfolgen. Beispielsweise kann die Immobilisierung wasserlöslich ausgestaltet sein, insbesondere im Falle der nicht-kovalenten Bindung. Somit können frei schwimmende Virionen sowohl an den Wänden des Gefäßes als auch direkt in der Probe neutralisiert werden.
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Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung sind die neutralisierenden Körper an magnetischen Partikeln gebunden. Beispielsweise kann es sich bei den magnetischen Partikeln um Nanopartikel mit einem eisenhaltigen Kern und einer Kunststoffbeschichtung handeln, wie beispielsweise in DOI: 10.1039/C7AN01424D (Paper) Analyst, 2017, 142, 4247-4256 beschrieben, welche mit Fängermolekülen in Form von beispielsweise Antikörpern oder an Membranproteinen der Virionen bindenden Proteinen (ACE2 zum Beispiel im Fall von Coronaviren) funktionalisiert sind. Dies hat den Vorteil, dass die über die neutralisierenden Körper dann gebundenen Virionen mit Hilfe eines Magneten auf einfache Weise von der Probe getrennt werden können.
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Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum Transport einer Probe mit menschlichen oder tierischen Zellen mit einem Transportmedium, wobei das Transportmedium neutralisierende Körper zur Bindung und vorzugsweise Absättigung von Oberflächenmerkmalen, insbesondere Proteinen von Virionen umfasst. Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens und den folgenden vorteilhaften Weiterbildungen wird auf die oben angeführten Vorteile verwiesen.
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In einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens wird ein Magnet zur Trennung der an magnetischen Partikeln gebundenen neutralisierenden Körper von einem Rest der Probe verwendet.
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Figurenliste
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Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
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Es zeigen
- 1 ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Transportmediums und
- 2 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Ausführungsformen der Erfindung
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1 zeigt ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Transportmediums 100. Wie dargestellt, kann in einen Behälter 110 mit einer Flüssigkeit 120 die Probe 10 eingebracht werden. Ferner befinden sich in dem Gefäß neutralisierende Körper 130 zur Bindung an Proteinen von Virionen. Unter dem Transportmedium 100 kann, wie oben beschrieben, der Behälter 110 und/oder die Flüssigkeit 120 verstanden werden, welche beide die neutralisierenden Körper 130 umfassen. Beispielsweise handelt es sich bei dem Behälter 110 um einen Glasbehälter oder einen Kunststoffbehälter (Polypropylen) mit einem Fassungsvermögen zwischen 0,2 und 10 Milliliter (ml) wie zum Beispiel ein Eppendorf Tube. Bei der Flüssigkeit 120 kann es sich insbesondere um einen nicht-lysierenden Puffer handeln, beispielsweise um PBS oder UTM®.
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Die neutralisierenden Körper 130 können mit der Flüssigkeit vermischt und/oder wie oben beschrieben kovalent oder nicht-kovalent an einer Wand 111 des Behälters 110 gebunden sein, beispielsweise als wasserlösliche Beschichtung 131, welche durch Eintrocknung nach Eindispensierung als wässrige Lösung aufgebracht worden ist. Wie oben erläutert kann es sich bei den neutralisierenden Körpern 130 um Peptide, Proteine, Antikörper, Nanokörper oder Schwefelverbindungen handeln, welche an Oberflächenmerkmale der Virionen binden, insbesondere an Membranproteine, und damit die in der Probe schwimmenden Virionen vorzugsweise unschädlich machen. Die neutralisierenden Körper 130 können wie oben beschrieben auch an magnetische Partikel 140 gebunden sein, um sie mit Hilfe eines Magneten 40 aus der Probe 10 zu isolieren. Eine bevorzugte Anzahl beziehungsweise Konzentration an neutralisierenden Körpern hängt von einer typischen Virenkonzentration in der Probe und einer typischen Anzahl von zu bindenden Oberflächenmerkmalen der Virionen ab. Bei einer Größenordnung von 100 Oberflächenmerkmalen pro Virion, was einer typischen Anzahl von Spike-Proteinen auf einem SARS-CoV-2-Virion entspricht, können bei einer angenommenen Virenkonzentration zwischen 108 und 1010 pro Milliliter mindestens 1012 Körper pro Milliliter verwendet werden.
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2 zeigt ein Flussdiagramm 600 eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens 600, welches mit dem oben beschriebenen Ausführungsbeispiel des Transportmediums 100 durchgeführt werden kann. In einem ersten Schritt 601 des Verfahrens 600 wird das Transportmedium 100 bereitgestellt. In einem zweiten Schritt 602 wird die Probe 10 in das Transportmedium 100 eingebracht. In einem dritten Schritt 603 werden die neutralisierenden Körper 130 mit der Probe 10 vermischt, insbesondere durch Zugabe der Körper 130 in die Probe 10, durch Auslösung der Körper 130 aus der Beschichtung 131 in die Probe 10 oder durch Auflösung der in dem Transportmedium 100 vorgelagerten Körper 130 bei Zugabe der Probe 10.
