WO2023089078A1 - Verfahren zur kaskadierbaren aufkonzentrierung mindestens einer zielsubstanz in einer probenflüssigkeit - Google Patents

Verfahren zur kaskadierbaren aufkonzentrierung mindestens einer zielsubstanz in einer probenflüssigkeit Download PDF

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WO2023089078A1
WO2023089078A1 PCT/EP2022/082367 EP2022082367W WO2023089078A1 WO 2023089078 A1 WO2023089078 A1 WO 2023089078A1 EP 2022082367 W EP2022082367 W EP 2022082367W WO 2023089078 A1 WO2023089078 A1 WO 2023089078A1
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sample
liquid
target substance
volume
concentration
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Application number
PCT/EP2022/082367
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French (fr)
Inventor
Timo Hillebrand
Elmara Graser
Wiebke JACOBI
Original Assignee
Ist Innuscreen Gmbh
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • the invention relates to a method for the cascadable concentration of at least one target substance in a sample liquid.
  • Target substances to be detected or monitored can be biomolecules such as eukaryotic cells, prokaryotic cells, subcellular vesicles, bacteriophages, viruses, toxins, antibodies or also nucleic acids or proteins.
  • Analysis methods are used for the qualitative or quantitative determination of target substances in samples taken from a liquid to be examined.
  • laboratory methods that can be carried out manually or automatically or at least partially automatically, or analytical devices that work completely automatically are available.
  • the automated analyzers also include online analyzers that continuously or discontinuously take samples from the liquid to be monitored and carry out a qualitative or quantitative determination of the target substance.
  • the problem arises of providing a sufficient amount of the target substance for the subsequent analysis when taking the sample.
  • the target substance is present in an untreated fluid sample at a concentration too low for subsequent processing or analysis. This results in the need for a concentration of the target substance in the sample.
  • An example of this is the detection of biomolecules in water or wastewater, e.g. the detection of SARS-CoV-2 in water using molecular genetic techniques such as PCR or real-time PCR.
  • the concentration of the virus particles to be detected or of viral fragments in the waste water is often too low to be able to be detected using the methods known to those skilled in the art. While a volume of 200 pl is sufficient when examining blood samples for the presence of a virus infection, the sample volume required when examining water/wastewater is significantly larger. Starting quantities of up to several liters are described in the literature.
  • the concentration of target molecules in a liquid volume not only plays an important role in the preparation of samples for molecular genetic analysis techniques, but also for all immunological technologies and spectroscopic technologies such as molecular spectroscopy or mass spectroscopy.
  • a sample collection device for flow-through sampling in bodies of water is known from US 2015/0224502 A1.
  • the way to concentrate low concentrations of target substances in water is to retain the target substances in a filter or adsorption medium and release the substances adsorbed on the filter for subsequent analysis by elution or as lysate and make them available to an analysis module.
  • This method is also expensive in terms of apparatus and cannot be used universally.
  • the object of the invention is to provide a simple, quick and universally applicable method for concentrating target substances, in particular biomolecules, in a sample liquid.
  • the method according to the invention for concentrating at least one target substance in a sample liquid comprises:
  • the superabsorbent absorbs liquid, particularly a polar component of the sample liquid such as water or other polar solvent, to form a gel or hydrogel, thereby reducing the volume of the liquid portion of the mixture during the first period.
  • the length of the first period can be set individually and variably and correlates with the reduction in the initial liquid volume that took place after the end of the incubation.
  • Superabsorbers also: superabsorbent polymers, SAP
  • SAP superabsorbent polymers
  • Liquids suitable for absorption by the superabsorbent are polar solvents such as water or aqueous solutions. When the liquid is absorbed, the superabsorbent swells and forms a gel or hydrogel. Hydrogels can form any crosslinked polymer that is polar, e.g., polyacrylamide, polyvinylpyrrolidone, amylopectin, gelatin, cellulose.
  • plastics in particular the plastics mentioned here and below, are preferred over biological polymers.
  • a so-called core crosslinker (CXL) can be added to the monomer solution during the production of the copolymer, which connects (crosslinks) the long-chain polymer molecules formed with one another in places using chemical bridges. These bridges make the polymer insoluble in water.
  • This so-called base polymer is optionally subjected to what is known as surface post-crosslinking (surface cross-linking, SXL).
  • SXL surface cross-linking
  • Another chemical is applied to the surface of the particles, which, when heated, forms a second network only on the outer layer of the grain. This shell supports the swollen gel to hold it together even under external stress (movement, pressure).
  • Superabsorbents in the form of granules are used, for example, in baby diapers, monthly hygiene products, in incontinence care and in bandages. The use in cable sheathing for deep sea lines is also known. Furthermore, superabsorbents are used as gel-forming extinguishing agents in firefighting, as mechanical stabilizers for cut flowers in a vase or as an additive for potting soil for permanent water storage. Because of its better environmental compatibility, potassium hydroxide-neutralized acrylic acid is used here. In the form of spherical particles, the use of superabsorbents under designations such as "water beads", “aqua beads” or “water beads” is known as toys.
  • the first sample taken from the liquid portion of the mixture of liquid and superabsorbent present after incubation can be the entire remaining liquid portion. However, it is also possible to take only a partial volume of the liquid portion present as the first sample.
  • the first sample can be used immediately for subsequent analysis, e.g., using a molecular genetic analysis technique. However, it can also be further concentrated in a cascading process in one or more additional stages, e.g. by adding a superabsorbent again or adding it again to a superabsorbent and incubating again, or by means of a conventional method for concentrating target substances, e.g. by one of the initially specified Procedure. If only part of the liquid portion is taken as the first sample, the target substance in the liquid portion of the mixture remaining after sampling can be further concentrated by renewed incubation for a second period of time. Both variants of the method can be repeated several times, so that a higher concentration of the target substance is obtained at each stage of the cascaded concentration.
  • the method can comprise a further concentration of the target substance in the first sample taken.
  • the further concentration of the target substance in the first sample taken can be carried out by means of a filtration, ultrafiltration or precipitation reaction technique.
  • the further concentration of the target substance in the first sample taken can also be carried out again - and optionally repeated one or more times in a cascading manner - by carrying out the following method steps:
  • the concentrated first sample, the concentrated first sample taken from the liquid portion remaining after the incubation can comprise the entire volume of the liquid portion.
  • the concentrated first sample can be a partial volume of the remaining liquid portion.
  • the target substance can be further concentrated in the concentrated first sample or in a further concentrated first sample obtained by further concentration, in particular by means of a super absorber, by means of a filtration, ultrafiltration or precipitation reaction. This is advantageous if the volume of the concentrated first sample is only a few milliliters, e.g. 1 to 10 ml.
  • the method according to the invention for concentrating the target substance in the after removal of the first sample from the remaining liquid portion of the mixture of the liquid volume originally used and the superabsorbent can comprise the following additional steps: renewed - and optionally repeated in a cascading manner once or several times - Concentrating the target substance in the liquid portion of the mixture remaining after taking the first sample
  • the renewed incubation reduces the volume of the liquid part further and correspondingly further concentrates the target substance in the liquid part.
  • the concentration of the target substance is determined, among other things, by the predefinable duration of the third time period and the conditions prevailing during the incubation.
  • the volume of liquid initially used can contain a polar liquid, in particular as the main component.
  • the volume of liquid can contain a polar solvent, in particular as the main component.
  • the liquid volume can consist of a polar solvent to a mass fraction of at least 50%.
  • the polar liquid or polar solvent can be water, for example.
  • the target substance can be a biomolecule. It can be selected from the following substances: eukaryotic cells, components of eukaryotic cells, prokaryotic cells, components prokaryotic cells, subcellular vesicles, bacteriophages, viruses or virus components, toxins, antibodies, nucleic acids and proteins.
  • the superabsorber can be a plastic or comprise a plastic that absorbs a proportion of the liquid volume, e.g. a polar solvent contained in the liquid volume, such as water, to form a gel or hydrogel.
  • the plastic is advantageously selected in such a way that it does not absorb any biomolecules. This is the case, for example, with the superabsorbers mentioned made from the polymer or copolymer materials mentioned, e.g. with the commercially available water beads, water beads, etc.
  • the superabsorbent can be used in the form of particles, e.g. as a powder, as granules or in the form of geometric bodies, in particular spheres (spherical particles). It can thus be added to the liquid volume or the first sample in the form of such particles, or the liquid volume or the first sample can be added to the superabsorbent in this form.
  • the particles or spheres can have a diameter of between 100 and 5000 ⁇ m.
  • the super absorber is a commercially available super absorber bead, for example a super absorber bead available under the designations “Aquabeads”, “Water Beads”, “Water Beads”, “Aqua Beads”, “Hydro Balls”, “Gel Balls”.
  • the volume of the liquid portion remaining after the incubation step, and thus the concentration of the target substance in the remaining liquid portion can be reduced by the length of the period or periods of incubation, by the size and number of the liquid volume initially used Sample liquid or superabsorbent particles or superabsorbent beads added to the first sample, and/or by the temperature prevailing during incubation.
  • the invention also includes the use of a superabsorbent for the one-time or multiple cascading concentration of a target substance, in particular a biomolecule, in a liquid sample.
  • the liquid sample can contain a polar liquid, in particular water, with the superabsorber being set up to absorb the polar liquid, e.g. water, or at least part of the polar liquid, with the formation of a hydrogel.
  • the superabsorber can be formed from the materials described above and, in the configurations described above, can be used as granules or, particularly preferably, in the form of spheres, in particular commercially available water beads, water beads or aqua beads.
  • the cascaded concentration can include several stages. After each stage, a sample can be taken for analysis and the process of concentration can continue or the after Incubation of the sample with the superabsorbent in at least one stage. The sample or part of the sample can be further concentrated using other known methods.
  • the invention also includes a kit for carrying out the method described above.
  • the kit can, for example, comprise one or more containers with a superabsorber in it, into which a user can then add an initial volume of liquid for concentration or a sample that has already been concentrated in a first stage.
  • the liquid concentrated according to the method described or according to the use described i.e. the liquid portion present after incubation, or a sample taken from the concentrated liquid can be fed manually or automatically to a laboratory device for further treatment or analysis.
  • a liquid or sample of the liquid can be placed in a cartridge, in particular a microfluidic cartridge, of an automatic analysis device for automated detection of the target substance using molecular genetic techniques such as PCR or real-time PCR. This can be done manually or automatically.
  • 1 shows a schematic representation of the cascading concentration of a target substance in a liquid: a) liquid before the addition of a superabsorbent; b) liquid after adding an SAP and incubating the mixture; c) a first sample taken from the mixture after adding a further superabsorbent and incubating the mixture; d) Remaining mixture of liquid and superabsorbent, possibly after taking the first sample and after renewed incubation;
  • water beads commercially available so-called water beads (commercially available under the designations aqua beads, water beads, water beads, or gel beads, among others) were added to a liquid volume of 1 liter. These water beads are made from a super absorber material. The liquid was surface water taken from a fire-fighting pond with suspended matter had been. After an incubation period, the water beads swelled to many times their original volume. The volume of the liquid portion of the mixture of the liquid and the water beads was reduced. Surprisingly, it turned out that the suspended matter in the liquid was not absorbed by the swelling beads. The liquid portion of the mixture including the suspended solids (volume 400 ml) was transferred to a new vessel. A sample with a volume of 50 ml was taken from this liquid portion.
  • a comparison sample with a volume of 50 ml was taken directly from the liquid, i.e. the surface water mentioned, without previously concentrating the liquid according to the method described. Both samples were centrifuged at 5000 x g for 10 min. The supernatant was removed and the pellet used for nucleic acid extraction. The nucleic acid extraction was carried out using a commercial kit (innuprep Stool DNA Mini Kit; IST Innuscreen GmbH). The DNA from both samples was then examined for the amount of total bacterial count using real-time PCR.
  • Further processing can be, for example, a nucleic acid extraction, a measurement or a direct analysis with a wide variety of technologies, such as NGS applications, immunological technologies, spectroscopic technologies, molecular spectroscopic or mass spectrometric technologies, etc.
  • the degree of concentration and the speed of this process can be controlled very precisely by means of the type of superabsorbent used, by means of the amount used, or by means of the incubation time and/or the incubation temperature.
  • the problem of processing low-concentration samples for further processing of the target substances of interest, in particular biomolecules, or their detection can thus be easily solved with the method.
  • the method shown in Fig. 1a and b does not require devices such as ultracentrifuges, expensive ultrafiltration membranes, complex methods such as PEG precipitation or general precipitation reactions for concentrating nucleic acids, etc.
  • the method can be used universally with regard to the target substances, in particular for biomolecules.
  • the superabsorbents are non-toxic and harmless and often biodegradable. The examination of low-concentration biomolecules can thus be greatly simplified with the method according to the invention.
  • a cascading concentration of the target substance is an option.
  • the method described with steps 1-3 above can be used to concentrate the target substance.
  • the volume of the first sample 4 can be reduced in order to reconcentrate the target substance. This can be done using either a conventional filtration or precipitation process or other conventional methods.
  • the renewed concentration of the target substance in the first sample 4 can also take place, as shown in FIG. 1c, by adding fresh superabsorber 5 to the first sample 4 and renewed incubation for a second time period t2.
  • the liquid portion 6 remaining in the mixture with the superabsorbent 2 after the removal of the first sample 4 can be further reduced by incubating the mixture for a third period of time t3, as shown in FIG. 1d.
  • Example 1 Two-stage concentration of bacteriophages from a water sample of 10 ml (combination of two different concentration methods) Tap water with a volume of 10 ml was mixed with 5 ⁇ l of a bacteriophage suspension (Leibniz Institute DSMZ: DSM 13767) as the sample liquid. Two volumes of 10 ml each of the sample liquid were each transferred to a 50 ml vial. In each case 200 ⁇ l of the initial sample liquid were taken as reference samples (reference samples 1 and 2) for the subsequent nucleic acid extraction. In a first concentration step, 40 super absorber beads, which are commercially available under the name “Water Beads” (diameter approx. 1 mm), were added to each 50 ml sample vessel.
  • the nucleic acid extraction was carried out using an automated method on the automatic KingFisher Flex (Thermo Fisher) and a commercially available kit (deltaPREP AniPath DNA/RNA Kit KFFLX; IST Innuscreen GmbH).
  • the extracted phage RNA was used to detect the MS2 phage RNA using real-time PCR.
  • a commercial kit was used as the detection system (innuDETECT Internal Control DNA/RNA Assay; IST Innuscreen GmbH).
  • a commercial OneStep RT master mix was used for the reverse transcription and amplification of the MS2 phage RNA (innuDRY qRT-PCR MasterMix Probe; IST Innuscreen GmbH).
  • Two real-time PCR batches (samples 3 to 6) were carried out for each sample.
  • the curves (circles) show the course of the amplification curves of reference samples 1 and 2 of the sample liquid which has not been concentrated.
  • the curves (line and cross) are the amplification curves of samples 3 to 6 of the sample liquid concentrated according to the method according to the invention.
  • Table 1 gives the Ct values for the individual samples.
  • the differences in the Ct values show a concentration of the original sample that is approx. 50 times higher than the initial amount of bacteriophages. This corresponds to the concentration of the sample liquid from an initial volume of 10 ml to a final sample volume of 200 ⁇ l (a 50-fold reduction in volume).
  • MS2 bacteriophage 0.5 l tap water with added MS2 bacteriophage was used as the sample liquid, with 0.5 l water 5 ⁇ l of an MS2 bacteriophage solution (Leibniz Institute DSMZ: DSM 13767) being added as a spike.
  • MS2 bacteriophage solution Leibniz Institute DSMZ: DSM 13767
  • sample 50 ml was then completely transferred as a sample from the 1 liter bottle into a 50 ml reaction vessel for a second stage of the concentration cascade.
  • 1.5 g of new “Waterbeads” (diameter approx. 1 mm) were added to the sample.
  • the sample was incubated with the beads until the volume was reduced to 5 mL.
  • the 5 ml was then transferred to a 15 ml reaction vessel and 200 ⁇ l samples were taken from the 5 ml (sample 5 and sample 6).
  • the sample was thus concentrated from 500 ml to 50 ml in the first concentration stage (factor 10) and in the second concentration stage from 50 ml to 5 ml (factor 10). Both cascading steps resulted in a concentration of the sample from 500 ml to 5 ml (factor 100).
  • the phage RNA extraction was carried out using an automated method on the automated KingFisher Flex (Thermo Fisher) and a commercially available kit (deltaprep AniPath DNA/RNA Kit KFFLX; IST Innuscreen GmbH).
  • the extracted phage RNA was used to detect the MS2 phage RNA using real-time PCR.
  • a commercial kit was used as the detection system (innuDETECT Internal Control DNA/RNA Assay; IST Innuscreen GmbH).
  • a commercial OneStep RT master mix was used for the reverse transcription and amplification of the MS2 phage RNA (innuDRY qRT-PCR MasterMix Probe; IST Innuscreen GmbH). 3 shows the amplification curves of samples 1 to 6.
  • the curves (circle) show the course of the amplification curves of reference samples 1 and 2 of the non-concentrated sample liquid.
  • the curves (cross) are the amplification curves of samples 3 and 4 (1st cascade) and the curves (triangle) are the amplification curves of samples 5 and 6 (2nd cascade).
  • Example 3 Measurement of the change in concentration of a DNA solution over time using the method according to the invention
  • the exemplary embodiment is intended to demonstrate that the concentration of an analyte can be adjusted as desired using the method according to the invention.
  • a lambda DNA solution 200 ⁇ l of a lambda DNA solution were used as sample liquid.
  • the starting concentration of the DNA was 132 ng/pl.
  • the concentration was carried out by adding a super absorber bead, commercially available under the name “Waterbeads” (0.006 g; approx. 1 mm diameter).
  • the concentration was determined every 10 minutes after the start of incubation, in each case 10 minutes in the form of a spectrophotometric measurement of the sample.
  • the volume of the liquid fraction decreased continuously over the incubation period.
  • the concentration of the DNA in the solution was cascaded in 5 steps (measurement after 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes and 50 minutes). After 30 minutes of incubation, the volume of the liquid portion was still approx. 70 pl and the DNA concentration had increased to 335 ng/pl.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufkonzentrierung mindestens einer Zielsubstanz in einer Probenflüssigkeit, umfassend: - Zugeben eines Superabsorbers (2) zu einem initialen Flüssigkeitsvolumen (1) der Probenflüssigkeit oder Zugeben des Flüssigkeitsvolumens (1) zu dem Superabsorber (2), - Inkubieren des aus dem Superabsorber (2) und dem Flüssigkeitsvolumen (1) gebildeten Gemisches über einen ersten Zeitraum (t1), und - Entnehmen einer ersten Probe (4) des nach dem Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteils (3) des Gemisches.

Description

Verfahren zur kaskadierbaren Aufkonzentrierung mindestens einer Zielsubstanz in einer Probenflüssigkeit
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kaskadierbaren Aufkonzentrierung mindestens einer Zielsubstanz in einer Probenflüssigkeit.
Die Detektion von Zielsubstanzen, insbesondere von biologischen Zielsubstanzen, spielt in der Flüssigkeits-Analytik eine wichtige Rolle. Zu detektierende bzw. zu überwachende Zielsubstanzen können Biomoleküle, wie beispielsweise eukaryotische Zellen, prokaryotische Zellen, subzelluläre Vesikel, Bakteriophagen, Viren, Toxine, Antikörper oder auch Nukleinsäuren oder Proteine sein. Zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Zielsubstanzen in aus einer zu untersuchenden Flüssigkeit entnommenen Proben werden Analyseverfahren angewendet. Hierzu stehen manuell oder automatisiert bzw. zumindest teilautomatisiert durchführbare Laborverfahren oder vollständig automatisiert arbeitende Analysegeräte zur Verfügung. Zu den automatisiert arbeitenden Analysegeräten gehören auch Online-Analysegeräte, die kontinuierlich oder diskontinuierlich Proben aus der zu überwachenden Flüssigkeit entnehmen und eine qualitative oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz durchführen.
Bei geringen Konzentrationen der Zielsubstanz in der zu analysierenden Flüssigkeit stellt sich das Problem, bei der Probennahme eine für die anschließende Analyse ausreichende Menge der Zielsubstanz zur Verfügung zu stellen. In manchen Anwendungen liegt die Zielsubstanz in einer unbehandelten Flüssigkeitsprobe in einer Konzentration vor, die zu gering für die nachfolgende Bearbeitung oder Analyse ist. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit einer Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der Probe. Als Beispiel hierfür sei der Nachweis von Biomolekülen in Wasser oder Abwasser, z.B. der Nachweis von SARS-CoV-2 in Wasser mittels molekulargenetischer Techniken wie PCR oder Real Time PCR, genannt. Die Konzentrationen der nachzuweisenden Viruspartikel oder von viralen Fragmenten im Abwasser ist häufig zu gering, als dass man sie mittels der dem Fachmann bekannten Methoden nachweisen kann. Reicht bei der Untersuchung von Blutproben auf das Vorliegen einer Virusinfektion ein Volumen von 200 pl aus, so ist das erforderliche Probenvolumen bei der Untersuchung von Wasser/Abwasser deutlich größer. In der Literatur werden Ausgangsmengen von bis zu mehreren Litern beschrieben.
Die Aufkonzentrierung von Zielmolekülen in einem Flüssigkeitsvolumen spielt nicht nur für die Vorbereitung von Proben für molekulargenetische Analyse-Techniken eine wichtige Rolle, sondern gleichermaßen auch für alle immunologischen Technologien und spektroskopischen Technologien, wie beispielsweise Molekülspektroskopie oder Massenspektroskopie.
Im Stand der Technik sind für die Anreicherung von Viren oder subzellulären Partikeln aus einer biologischen Probe verschiedene Techniken bekannt, z.B. Ultrazentrifugationstechniken oder die Technik der Ultrafiltration. Diese Methoden sind zeitaufwändig und verhältnismäßig teuer. Alternative Verfahren bestehen in der Präzipitation von Viruspartikeln mittels Polyethylenglycol/Natriumchlorid und einer nachfolgenden Zentrifugation (Yamamoto et al., Virology 40 (1970) 734; Morandi et al., J. Clin. Microbiol. 36 (1998) 1543-1538). Dabei nutzt man verschiedene Mischungen von PEG und Natriumchlorid und mischt diese Reagenzien mit der biologischen Probe. Nachfolgend wird der Ansatz bei Kälte längere Zeit inkubiert und nachfolgend werden die Virus- (Protein)-NaCIZPEG- Präzipitate durch Zentrifugation gewonnen. Auch diese Verfahren sind aufwändig und benötigen viel Zeit. Problematisch ist darüber hinaus die Weiterbearbeitung der Präzipitate für die Isolierung der viralen Nukleinsäuren. Oftmals lassen sich die Präzipitate nur sehr schwer wieder in Lösung bringen. Dies beeinflusst die Effizienz und die Qualität der Nukleinsäureisolierung erheblich.
Nachteilig bei diesen Techniken ist auch, dass die Aufkonzentrierung einer großvolumigen Probe zum Beispiel mittels bekannter Ultrafiltrationsverfahren nur sehr aufwendig umgesetzt werden kann. Dies betrifft auch das in der Patentschrift EP 2283026 B1 beschriebene Verfahren. Dieses erlaubt effizient die Bearbeitung von Probenvolumen von 5 - 10 ml, ist aber bei größeren Probenvolumina weniger effizient.
Aus US 2015/0224502 A1 ist ein Probensammel-Gerät für die Durchfluss-Probennahme in Gewässern bekannt. Hier wird zur Aufkonzentrierung von in Gewässern in geringer Konzentration vorliegenden Zielsubstanzen der Weg gegangen, die Zielsubstanzen in einem Filter oder Adsorptionsmedium zurückzuhalten und die am Filter adsorbierten Substanzen für eine nachfolgende Analyse durch Elution oder als Lysat freizusetzen und einem Analysemodul zur Verfügung zu stellen. Auch dieses Verfahren ist apparativ aufwändig und nicht universell einsetzbar.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches, schnelles und universell einsetzbares Verfahren zur Aufkonzentrierung von Zielsubstanzen, insbesondere Biomolekülen, in einer Probeflüssigkeit bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird in überraschend einfacher und universell anwendbarer Weise mittels des in Anspruch 1 definierten Verfahrens und der Verwendung gemäß Anspruch 15 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Aufkonzentrierung mindestens einer Zielsubstanz in einer Probenflüssigkeit, umfasst:
- Zugeben eines Superabsorbers zu einem initialen Flüssigkeitsvolumen der Probenflüssigkeit oder Zugeben des Flüssigkeitsvolumens zu dem Superabsorber,
- Inkubieren des aus dem Superabsorber und dem Flüssigkeitsvolumen gebildeten Gemisches über einen ersten Zeitraum; und
- Entnehmen einer ersten Probe des nach dem Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteils des Gemisches. Während des Inkubierens nimmt der Superabsorber Flüssigkeit, insbesondere einen polaren Bestandteil der Probenflüssigkeit, wie z.B. Wasser oder ein anderes polares Lösungsmittel, unter Bildung eines Gels oder Hydrogels, auf, wodurch sich das Volumen des flüssigen Anteils des Gemisches während des ersten Zeitraums verringert. Die Länge des ersten Zeitraums kann individuell und variabel festgelegt werden und korreliert mit der nach dem Ende des Inkubierens stattgefundenen Reduzierung des initialen Flüssigkeitsvolumens.
Superabsorber (auch: Superabsorbent Polymers, SAP) werden Kunststoffe genannt, die in der Lage sind, ein Vielfaches ihres Eigengewichts an polaren Flüssigkeiten aufzunehmen. Als zur Aufnahme durch den Superabsorber geeignete Flüssigkeiten kommen polare Lösungsmittel wie beispielsweise Wasser bzw. wässrige Lösungen in Frage. Bei Aufnahme der Flüssigkeit quillt der Superabsorber auf und bildet ein Gel oder Hydrogel. Hydrogele können alle vernetzen Polymere bilden, die polar sind, z.B. Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon, Amylopektin, Gelatine, Cellulose. Für die vorliegende Erfindung sind indes Kunststoffe, insbesondere die hier und im Folgenden genannten Kunststoffe, gegenüber biologischen Polymeren bevorzugt.
Geeignet für die Erfindung ist z.B. ein Copolymer aus Acrylsäure (Propensäure, H2C=CH-COOH) oder Natriumacrylat (Natriumsalz der Acrylsäure, H2C=CH-COONa) einerseits und Acrylamid andererseits, wobei das Verhältnis der beiden Monomere zueinander variieren kann. Zusätzlich kann bei der Herstellung des Copolymers ein so genannter Kernvernetzer (Core-Cross-Linker, CXL) der Monomerlösung zugesetzt werden, der die gebildeten langkettigen Polymermoleküle stellenweise untereinander durch chemische Brücken verbindet (vernetzt). Durch diese Brücken wird das Polymer wasserunlöslich. Dieses sogenannte Basispolymer wird optional einer sogenannten Oberflächen- Nachvernetzung, (Surface-Cross-Linking, SXL) genannt, unterzogen. Dabei wird eine weitere Chemikalie auf die Oberfläche der Partikel aufgebracht, die durch Erwärmung ein zweites Netzwerk nur auf der äußeren Schicht des Korns knüpft. Diese Hülle stützt das aufgequollene Gel, um auch bei äußerer Belastung (Bewegung, Druck) zusammen zu halten.
Superabsorber in Form von Granulat kommt beispielsweise herkömmlich in Babywindeln, Monatshygiene-Produkten, bei der Inkontinenzversorgung und in Verbandmaterial zum Einsatz. Auch die Verwendung in Kabelummantelungen für Tiefseeleitungen ist bekannt. Weiter werden Superabsorber ais gelbildende Löschmittel in der Brandbekämpfung, als mechanische Stabilisatoren für Schnittblumen in einer Vase oder als Zusatz für Pflanzenerde für eine dauerhafte Wasserspeicherung verwendet. Hierbei kommt wegen der besseren Umweltverträglichkeit kalilaugeneutralisierte Acrylsäure zum Einsatz. In Form von kugelförmigen Partikeln ist die Verwendung von Superabsorbern unter Bezeichnungen wie „Wasserperlen“, „Aqua Beads“ oder „Water beads“ als Spielzeug bekannt. Hierbei handelt es sich um Superabsorber, welche in Form von Kügelchen von variablen Größen von Submillimetern bis Zentimetern kommerziell angeboten werden. Bei dem oben angegebenen erfindungsgemäßen Verfahren kann die erste Probe, die aus dem nach dem Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteil des Gemisches aus Flüssigkeit und Superabsorber entnommen wird, der gesamte verbliebene flüssige Anteil sein. Es ist aber auch möglich, nur ein Teilvolumen des vorliegenden flüssigen Anteils als erste Probe zu entnehmen.
Die erste Probe kann unmittelbar für eine nachfolgende Analyse verwendet werden, z.B. mittels einer molekulargenetischen Analysetechnik. Sie kann aber auch in einem kaskadierenden Verfahren in einer oder mehreren zusätzlichen Stufen weiter aufkonzentriert werden, z.B. durch erneute Zugabe eines Superabsorbers bzw. erneutes Zugeben zu einem Superabsorber und erneutes Inkubieren oder mittels eines herkömmliches Verfahren zur Aufkonzentrierung von Zielsubstanzen, z.B. durch eines der einleitend angegebenen Verfahren. Wird nur ein Teil des flüssigen Anteils als erste Probe entnommen, kann die Zielsubstanz im nach der Probenentnahme verbliebenen flüssigen Anteil des Gemisches durch erneutes Inkubieren über einen zweiten Zeitraum weiter aufkonzentriert werden. Beide Varianten des Verfahrens können mehrmals wiederholt durchgeführt werden, so dass auf jeder Stufe der kaskadierten Aufkonzentrierung eine höhere Konzentration der Zielsubstanz erhalten wird.
Vorteilhaft ist es, in einer ersten Stufe das initiale Probenvolumen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung eines Superabsorbers zu reduzieren, und in einer nachfolgenden zweiten Stufe eine weitere Aufkonzentrierung der Zielsubstanz mittels einer herkömmlichen Aufkonzentrierungs-Technik, z.B. Filtration, Ultrafiltration, Präzipitationsreaktion, Ultrazentrifugation oder einer Anreichung mittels des in EP 2283026 B1 beschriebenen Verfahrens, durchzuführen. Diese bekannten Techniken sind in bereits reduzierten Probenvolumina deutlich effizienter als in stärker verdünnten Lösungen einsetzbar. Somit eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren dazu, bekannte Verfahren zur Aufkonzentrierung von Biomolekülen für großvolumige und/oder die Zielsubstanz nur in geringer Konzentration enthaltende Probenflüssigkeiten deutlich zu vereinfachen.
Wie erwähnt, kann das Verfahren in einer vorteilhaften Ausgestaltung nach dem Entnehmen der ersten Probe eine weitere Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der entnommenen ersten Probe umfassen.
Die weitere Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der entnommenen ersten Probe kann mittels einer Filtrations-, Ultrafiltrations- oder Präzipitationsreaktions-Technik durchgeführt werden.
Die weitere Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der entnommen ersten Probe kann alternativ aber auch erneut - und optional kaskadierend ein- oder mehrfach wiederholt - durchgeführt werden durch Ausführen der folgenden Verfahrensschritte:
- Zugeben eines Superabsorbers zu der ersten Probe oder Zugeben der ersten Probe zu dem Superabsorber,
- Inkubieren des aus dem Superabsorber und der ersten Probe gebildeten Gemisches über einen zweiten Zeitraum, und - Entnehmen einer aufkonzentrierten ersten Probe des nach dem Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteils des Gemisches.
Ganz analog wie zuvor bei der ersten Stufe der Kaskade beschrieben, kann die aufkonzentrierte erste Probe, die aus dem nach dem Inkubieren verbliebenen flüssigen Anteil entnommene aufkonzentrierte erste Probe das gesamte Volumen des flüssigen Anteils umfassen. Alternativ kann die aufkonzentrierte erste Probe ein Teilvolumen des verbliebenen flüssigen Anteils sein.
Die Zielsubstanz kann in der aufkonzentrierten ersten Probe oder in einer durch weitere Aufkonzentrierung, insbesondere mittels eines Superabsorbers, erhaltenen weiter aufkonzentrierten ersten Probe mittels einer Filtrations-, Ultrafiltrations- oder Präzipitationsreaktion noch weiter aufkonzentriert werden. Dies ist vorteilhaft, wenn das Volumen der aufkonzentrierten ersten Probe nur noch einigen Millilitern, z.B. 1 bis 10 ml, entspricht.
Wie bereits erwähnt, kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in dem nach Entnehmen der ersten Probe aus dem verbliebenen flüssigen Anteil des Gemisches aus dem ursprünglich eingesetzten Flüssigkeitsvolumen und dem Superabsorber folgende weitere Schritte umfassen: erneutes - und optional kaskadierend ein- oder mehrfach wiederholtes - Aufkonzentrieren der Zielsubstanz in dem nach Entnahme der ersten Probe verbliebenen flüssigen Anteil des Gemisches durch
- erneutes Inkubieren des nach dem Entnehmen der ersten Probe verbliebenen Gemisches aus dem verbliebenen flüssigen Anteil und dem Superabsorber über einen dritten Zeitraum; und
- Entnehmen einer zweiten Probe des nach dem erneuten Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteils des Gemisches.
Durch das erneute Inkubieren wird das Volumen des flüssigen Anteils weiter verringert und entsprechend die Zielsubstanz im flüssigen Anteil weiter aufkonzentriert. Die Konzentration der Zielsubstanz wird dabei unter anderem von der vorgebbaren Dauer des dritten Zeitraums und die während des Inkubierens herrschenden Bedingungen bestimmt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das initial eingesetzte Flüssigkeitsvolumen eine polare Flüssigkeit, insbesondere als Hauptbestandteil, enthalten. In einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Flüssigkeitsvolumen ein polares Lösungsmittel, insbesondere als Hauptbestandteil, enthalten. Beispielsweise kann das Flüssigkeitsvolumen zu einem Massenanteil von mindestens 50 % aus einem polaren Lösungsmittel bestehen. Die polare Flüssigkeit bzw. das polare Lösungsmittel kann beispielsweise Wasser sein.
Die Zielsubstanz kann ein Biomolekül sein. Sie kann ausgewählt sein aus den folgenden Substanzen: eukaryotische Zellen, Bestandteile von eukaryotischen Zellen, prokaryotische Zellen, Bestandteile prokaryotischer Zellen, subzelluläre Vesikel, Bakteriophagen, Viren oder Virusbestandteile, Toxine, Antikörper, Nukleinsäure und Proteine.
Wie erwähnt, kann der Superabsorber in einer vorteilhaften Ausgestaltung ein Kunststoff sein oder einen Kunststoff umfassen, der einen Anteil des Flüssigkeitsvolumens, z.B. ein in dem Flüssigkeitsvolumen enthaltenes polares Lösungsmittel wie beispielsweise Wasser, unter Bildung eines Gels bzw. Hydrogels aufnimmt. Vorteilhaft ist der Kunststoff so ausgewählt, dass er keine Biomoleküle aufnimmt. Dies ist beispielsweise bei den erwähnten Superabsorbern aus den genannten Polymer- bzw. Copolymermaterialien, z.B. bei den kommerziell erhältlichen Wasserperlen, Waterbeads etc. der Fall.
Der Superabsorber kann in Form von Partikeln, z.B. als Pulver, als Granulat oder in Form geometrischer Körper, insbesondere Kugeln (kugelförmige Partikel), eingesetzt werden. Er kann dem Flüssigkeitsvolumen bzw. der ersten Probe somit in Form solcher Partikel zugegeben werden oder das Flüssigkeitsvolumen bzw. die erste Probe kann dem Superabsorber in dieser Form zugegeben werden. Die Partikel oder Kugeln können einen Durchmesser zwischen 100 bis 5000 pm aufweisen.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Superabsorber um kommerziell erhältliche Superabsorber- Kugeln, beispielsweise um unter den Bezeichnungen „Aquabeads“, „Water Beads“, „Wasserperlen“, „Aquaperlen“, „Hydrokugeln“, „Gelkugeln“ erhältliche Superabsorber-Kugeln.
In einer vorteilhaften Verfahrensausgestaltung kann das Volumen des nach dem Schritt des Inkubierens verbleibenden flüssigen Anteils, und damit die Konzentration der Zielsubstanz im verbleibenden flüssigen Anteil, durch die Länge des Zeitraums oder der Zeiträume des Inkubierens, durch die Größe und Anzahl der dem initial eingesetzten Flüssigkeitsvolumen der Probenflüssigkeit bzw. der ersten Probe zugesetzten Superabsorber-Partikel oder Superabsorber-Kugeln, und/oder durch die während des Inkubierens herrschende Temperatur gesteuert werden.
Die Erfindung umfasst außerdem eine Verwendung eines Superabsorbers zur einmalig oder mehrfach kaskadierend durchgeführten Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz, insbesondere eines Biomoleküls, in einer Flüssigkeitsprobe. Die Flüssigkeitsprobe kann eine polare Flüssigkeit, insbesondere Wasser, enthalten, wobei der Superabsorber dazu eingerichtet ist, die polare Flüssigkeit, z.B. Wasser, bzw. mindestens einen Teil der polaren Flüssigkeit, unter Bildung eines Hydrogels aufzunehmen. Der Superabsorber kann aus den oben beschriebenen Materialien gebildet sein und in den zuvor beschriebenen Ausgestaltungen als Granulat oder, besonders bevorzugt, in Form von Kugeln, insbesondere kommerziell erhältlichen Wasserperlen, Water Beads oder Aqua Beads, verwendet werden.
Die kaskadierte Aufkonzentrierung kann mehrere Stufen umfassen. Nach jeder Stufe kann eine Probe zur Analyse entnommen und der Prozess der Aufkonzentrierung fortgesetzt werden oder die nach Inkubation der Probe mit dem Superabsorber in mindestens einer Stufe aufkonzentrierte Probe oder ein Teil der Probe kann nachfolgend mit anderen bekannten Verfahren weiter aufkonzentriert werden.
Die Erfindung umfasst außerdem ein Kit zur Durchführung des voranstehend beschriebenen Verfahrens. Das Kit kann beispielsweise ein oder mehrere Behältnisse mit vorgelegtem Superabsorber umfassen, in das ein Nutzer dann ein initiales Flüssigkeitsvolumen zur Aufkonzentrierung oder eine bereits in einer ersten Stufe aufkonzentrierte Probe zugeben kann.
Die gemäß dem beschriebenen Verfahren bzw. gemäß der beschriebenen Verwendung aufkonzentrierte Flüssigkeit, d.h. der nach dem Inkubieren vorliegende flüssige Anteil, oder eine aus der aufkonzentrierten Flüssigkeit entnommene Probe kann manuell oder automatisiert einem Laborgerät für die weitere Behandlung oder Analyse zugeführt werden. In einer möglichen Ausgestaltung des Verfahrens oder der Verwendung kann eine solche Flüssigkeit oder Probe der Flüssigkeit in eine Kartusche, insbesondere eine mikrofluidische Kartusche, eines automatischen Analysegeräts zur automatisierten Durchführung eines Nachweises der Zielsubstanz mittels molekulargenetischer Techniken wie PCR oder Real Time PCR gegeben werden. Dies kann manuell oder automatisiert erfolgen.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren und einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert. Diese Beispiele stellen keine Limitierung der erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren dar.
Fig. 1 eine schematische Darstellung der kaskadierenden Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz in einer Flüssigkeit: a) Flüssigkeit vor dem Zusetzen eines Superabsorbers; b) Flüssigkeit nach dem Zusetzen eines Superabsorbers und Inkubieren des Gemisches; c) Aus dem Gemisch entnommene erste Probe nach Zusetzen eines weiteren Superabsorbers und Inkubieren des Gemisches; d) Verbliebenes Gemisch aus Flüssigkeit und Superabsorber, ggfs. nach Entnehmen der ersten Probe und nach erneutem Inkubieren;
Fig. 2 Amplifikationskurven verschiedener Proben aus Bakteriophagen enthaltendem Wasser;
Fig. 3 Amplifikationskurven verschiedener Proben aus Phagen RNA enthaltendem Wasser.
Der hier beschriebenen Erfindung lag folgende unerwartete Beobachtung zu Grunde. Kommerziell verfügbare sog. Wasserperlen (kommerziell unter anderem unter den Bezeichnungen Aqua Beads, Water Beads, Wasserbeads, oder Gelperlen erhältlich) wurden einem Flüssigkeitsvolumen von 1 Liter zugegeben. Diese Wasserperlen sind aus einem Superabsorber-Material gebildet. Bei der Flüssigkeit handelte es sich um Oberflächenwasser, das einem Löschwasserteich mit Schwebstoffen entnommen worden war. Nach einer Inkubationszeit quollen die Wasserperlen zu einem Vielfachen ihres ursprünglichen Volumens auf. Das Volumen des flüssigen Anteils des Gemisches aus der Flüssigkeit und den Wasserperlen reduzierte sich. Überraschenderweise zeigte sich, dass die Schwebstoffe der Flüssigkeit von den aufquellenden Kügelchen nicht aufgenommen wurden. Der flüssige Anteil des Gemisches einschließlich der Schwebstoffe (Volumen 400 ml) wurde in ein neues Gefäß überführt. Diesem flüssigen Anteil wurde eine Probe mit einem Volumen von 50 ml entnommen.
Eine Vergleichsprobe mit einem Volumen von 50 ml wurde direkt aus der Flüssigkeit, d.h. dem erwähnten Oberflächenwasser, entnommen, ohne die Flüssigkeit zuvor nach dem beschriebenen Verfahren einzuengen. Beide Proben wurden bei 5000 x g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Sediment für eine Nukleinsäureextraktion eingesetzt. Die Nukleinsäureextraktion erfolgte mittels eines kommerziellen Kits (innuprep Stool DNA Mini Kit; IST Innuscreen GmbH). Die DNA von beiden Proben wurde dann mittels Real Time PCR auf die Menge an bakterielle Gesamtkeimzahl untersucht.
Hierbei zeigte sich, dass in der unbehandelten Vergleichsprobe weniger Bakterien nachgewiesen wurden als in der mit dem Superabsorber eingeengten Probe. Dies bedeutet, dass die in der Flüssigkeit enthaltenen Bakterien nicht in die Wasserperlen aufgenommen wurde. Sie wurden aufkonzentriert und waren Bestandteil des verbliebenen flüssigen Anteils des Gemisches aus der Flüssigkeit und den Superabsorber-Kugeln. Diese Beobachtungen konnten nachfolgend auch für andere Biomoleküle, z.B. Viren oder eukaryotische Zellen, bestätigt werden: Nach Zugabe des Superabsorbers zu einem diese Biomoleküle enthaltenen Flüssigkeitsvolumen wurde das Volumen eingeengt und die Biomoleküle wurden in der verbleibenden Restflüssigkeit aufkonzentriert. Noch überraschender war, dass man mit dem beschriebenen Verfahren auch Proteine sowie freie genomische DNA, die sich in geringen Konzentrationen in einer wässrigen Lösung befinden, aufkonzentrieren kann.
Die Verwendung von Superabsorbern zur Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz, insbesondere von Biomolekülen, in einer polaren Flüssigkeit als Lösungsmittel, beispielsweise Wasser, zur Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der Flüssigkeit ist sehr einfach und universell einsetzbar. Ein geeignetes Verfahren ist anhand von Fig. 1 a und b wie folgt kurz beschrieben:
1 . Zugabe eines Superabsorbers 2 zu einem Volumen einer, insbesondere wässrigen, Flüssigkeit 1 , oder alternativ: Zugabe der Flüssigkeit 1 zu einem vorgelegten Superabsorber 2;
2. Inkubation des Gemisches aus der Flüssigkeit 1 und dem Superabsorber 2 über einen ersten Zeitraum t1 zur Einengung (Volumenreduzierung) des flüssigen Anteils 3 des Gemisches; und anschließend
3. Überführung mindestens einer ersten Probe 4 des flüssigen Anteils 3 des Gemisches in ein neues Gefäß als Probe zur weiteren Bearbeitung.
Die weitere Bearbeitung kann z.B. eine Nukleinsäurextraktion sein, eine Messung oder auch eine direkte Analyse mit unterschiedlichsten Technologien, wie NGS Anwendungen, immunologischen Technologien, spektroskopischen Technologien, molekülspektroskopischen- oder massenspektrometrischen Technologien etc.
Der Grad der Aufkonzentrierung und die Geschwindigkeit dieses Prozesses können sehr genau mittels der Art des eingesetzten Superabsorbers, mittels seiner eingesetzten Menge, oder mittels der Inkubationszeit und/oder der Inkubationstemperatur gesteuert werden.
Mit dem Verfahren kann damit das Problem der Bearbeitung von niedrigkonzentrierten Proben für eine weitere Bearbeitung der interessierenden Zielsubstanzen, insbesondere Biomolekülen, oder deren Nachweis einfach gelöst werden. Das in Fig. 1 a und b dargestellte Verfahren kommt ohne Geräte wie z.B. Ultrazentrifugen, teure Ultrafiltrationsmembranen, aufwändige Verfahren wie PEG-Fällungen oder generell Fällungsreaktionen zur Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren etc. aus. Darüber hinaus ist das Verfahren in Bezug auf die Zielsubstanzen, insbesondere für Biomoleküle, universell einsetzbar. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Superabsorber ungiftig und ungefährlich und oftmals auch biologisch abbaubar sind. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann damit die Untersuchung von niedrigkonzentrierten Biomolekülen stark vereinfacht werden.
Bei großvolumigen und/oder stark verdünnten Flüssigkeiten, die die Zielsubstanz in einer sehr geringen Konzentration enthalten, kommt eine kaskadierende Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in Frage. Z. B. kann in einer ersten Stufe das beschriebene Verfahren mit den oben genannten Schritten 1-3 eingesetzt werden, um die Zielsubstanz aufzukonzentrieren. In einer zweiten Stufe kann die erste Probe 4 zur erneuten Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in ihrem Volumen reduziert werden. Dies kann entweder mittels eines herkömmlichen Filtrations- oder Präzipitationsverfahrens oder anderer herkömmlicher Methoden geschehen. Alternativ kann die erneute Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der ersten Probe 4 aber auch, wie in Fig. 1 c dargestellt, durch Zugeben von frischem Superabsorber 5 zu der ersten Probe 4 und erneutes Inkubieren über einen zweiten Zeitraum t2 erfolgen. Zusätzlich oder alternativ kann der nach der Entnahme der ersten Probe 4 im Gemisch mit dem Superabsorber 2 verbliebene flüssige Anteil 6 durch Inkubieren des Gemisches über einen dritten Zeitraum t3 weiter reduziert werden, wie in Fig. 1 d dargestellt. Dies führt zum weiteren Aufquellen unter Volumenvergrößerung der aus dem Superabsorber 2 bestehenden Kugeln und zur weiteren Volumenreduktion des flüssigen Anteils 6, die mit einer Konzentrationserhöhung der Zielsubstanz in dem flüssigen Anteil 6 einhergeht.
In beiden alternativen Verfahrenspfaden können kaskadierend weitere Aufkonzentrierungs-Stufen folgen.
Im Folgenden werden einige Ausführungsbeispiele der Erfindung genauer beschrieben.
Ausführungsbeispiel 1 : Zweistufige Konzentrierung von Bakteriophagen aus einer Wasserprobe von 10 ml (Kombination von zwei unterschiedlichen Aufkonzentrierungsmethoden) Als Probenflüssigkeit wurde Leitungswasser mit einem Volumen von 10 ml mit 5 pl einer Bakteriophagen-Suspension (Leibniz Institute DSMZ: DSM 13767) versetzt. Zwei Volumina von jeweils 10 ml der Probenflüssigkeit wurden jeweils in ein 50 ml-Gefäß überführt. Als Referenzproben (Referenzproben 1 und 2) für die nachfolgende Nukleinsäureextraktion wurden jeweils 200 pl der initialen Probenflüssigkeit entnommen. In einem ersten Aufkonzentrierungs-Schritt erfolgte die Zugabe von 40 Superabsorber-Kugeln, die kommerziell unter der Bezeichnung „Water Beads“ erhältlich sind (ca. 1 mm Durchmesser), zu jedem 50 ml Probengefäß. Die 10 ml Probenvolumina wurden mittels dieses Schrittes auf ein Volumen von 1 ml eingeengt. Dieser verbliebene flüssige Anteil wurde jeweils als erste Probe entnommen und in ein 1 ,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Hier erfolgte die weitere Aufkonzentrierung mittels eines bekannten Verfahrens (Patentschrift EP 2283026 B1). Nach Zugabe von Alginat und Kalziumchlorid und einer kurzen Inkubation wurden die Proben jeweils für 5 min bei 13.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das resultierende Pellet mit 200 pl 1 x PBS resuspendiert. Durch die Kombination der beiden Verfahren konnte die initiale Probe von 10 ml auf ein Volumen von 200 pl aufkonzentriert werden. Nachfolgend wurden sowohl die 200 pl der Referenzproben 1 und 2 als auch die beiden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Proben für eine nachfolgende Nukleinsäureextraktion eingesetzt.
Die Nukleinsäureextraktion erfolgte mittels eines automatisierten Verfahrens auf dem Automaten KingFisher Flex (Thermo Fisher) und einem kommerziell verfügbaren Kit (deltaPREP AniPath DNA/RNA Kit KFFLX; IST Innuscreen GmbH). Die extrahierte Phagen-RNA wurde mittels Real Time PCR zum Nachweis der MS2-Phagen-RNA eingesetzt. Als Nachweis-System wurde ein kommerzieller Kit verwendet (innuDETECT Internal Control DNA/RNA Assay; IST Innuscreen GmbH). Für die Reverse Transkription und Amplifikation der MS2-Phagen-RNA wurde ein kommerzieller OneStep- RT- Mastermix verwendet (innuDRY qRT-PCR MasterMix Probe; IST Innuscreen GmbH). Es wurden für jede Probe zwei Real Time PCR Ansätze (Proben 3 bis 6) durchgeführt.
In Fig. 2 sind die Amplifikationskurven der Proben dargestellt. Die Kurven (Kreise) zeigen die Verläufe der Amplifikationskurven der Referenzproben 1 und 2 der nicht eingeengten Probeflüssigkeit. Die Kurven (Strich und Kreuz) sind die Amplifikationskurven der Proben 3 bis 6 der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeengten Probeflüssigkeit.
Die Tabelle 1 gibt die Ct-Werte für die einzelnen Proben an.
Tabelle 1 :
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Die Unterschiede der Ct -Werte zeigen rechnerisch eine ca. 50-fache Konzentrierung der Ausgangsprobe in Bezug auf die initiale Menge an Bakteriophagen. Dies entspricht damit der Aufkonzentrierung der Probenflüssigkeit von einem initialen Volumen von 10 ml auf ein finales Probenvolumen von 200 pl (50fache Reduzierung des Volumens).
Ausführungsbeispiel 2: Nachweis von MS2-Phagen RNA nach kaskadierter Aufkonzentrierung einer initialen Wasserprobe von 0,5 Liter zu verschieden Aufkonzentrierungsstufen
Als Probenflüssigkeit wurde 0,5 I Leitungswasser mit zugesetzten MS2-Bakteriophagen eingesetzt, wobei 0,5 I Wasser 5 pl einer MS2-Bakteriophagen-Lösung (Leibniz Institute DSMZ: DSM 13767) als Spike zugegeben wurde.
Aus der initialen Probe von 0,5 I wurden als Vergleichsproben vor der kaskadierten Aufkonzentrierung zwei Proben (Referenzprobe 1 und 2) von je 200 pl zur späteren Nukleinsäureextraktion entnommen. Die erste Stufe der Aufkonzentrierungs-Kaskade wurde so durchgeführt, dass zur 0,5 I Wasserprobe (in einer 1-Liter Flasche) 10 g Superabsorber-Kugeln, kommerziell erhältlich unter der Bezeichnung „Waterbeads“ (Durchmesser ca. 1 mm), zugegeben wurden. Nach einer ersten Inkubationszeit von ca. 1 ,5 h betrug das Restvolumen des flüssigen Anteils des Gemisches noch 50 ml. Von diesen 50 ml der aufkonzentrierten Probenflüssigkeit wurden jeweils 200 pl entnommen (Probe 3 und Probe 4). Der verbliebene flüssige Anteil des Gemisches mit dem Volumen von ca. 50 ml wurde dann für eine zweite Stufe der Aufkonzentrierungs-Kaskade vollständig als Probe aus der 1-Liter Flasche in ein 50 ml Reaktionsgefäß überführt. In die Probe wurden 1 ,5 g neue „Waterbeads“ (Durchmesser ca. 1 mm) zugegeben. Die Probe wurde mit den Beads solange inkubiert, bis das Volumen auf 5 ml reduziert wurde. Die 5 ml wurde dann in ein 15 ml Reaktionsgefäß überführt und von den 5 ml wurden wiederum jeweils 200 pl Probe entnommen (Probe 5 und Probe 6). Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde damit in der ersten Konzentrierungsstufe die Probe von 500 ml auf 50 ml aufkonzentriert (Faktor 10) und in der zweiten Konzentrierungsstufe von 50 ml auf 5 ml (Faktor 10). Beide Kaskadierungsstufen ergaben eine Aufkonzentrierung der Probe von 500 ml auf 5 ml (Faktor 100).
Die Phagen-RNA-Extraktion erfolgte mittels eines automatisierten Verfahrens auf dem Automaten KingFisher Flex (Thermo Fisher) und einem kommerziell verfügbaren Kit (deltaprep AniPath DNA/RNA Kit KFFLX; IST Innuscreen GmbH). Die extrahierte Phagen-RNA wurde mittels Real Time PCR zum Nachweis der MS2-Phagen-RNA eingesetzt. Als Nachweis-System wurde ein kommerzieller Kit verwendet (innuDETECT Internal Control DNA/RNA Assay; IST Innuscreen GmbH). Für die Reverse Transkription und Amplifikation der MS2-Phagen-RNA wurde ein kommerzieller OneStep- RT- Mastermix verwendet (innuDRY qRT-PCR MasterMix Probe; IST Innuscreen GmbH). In Fig. 3 sind die Amplifikationskurven der Proben 1 bis 6 dargestellt. Die Kurven (Kreis) zeigen die Verläufe der Amplifikationskurven der Referenzproben 1 und 2 der nicht eingeengten Probeflüssigkeit. Die Kurven (Kreuz) sind die Amplifikationskurven der Proben 3 und 4 (1 .Kaskade) und die Kurven (Dreieck) sind die Amplifikationskurven der Proben 5 und 6 (2. Kaskade).
Die Tabelle 2 gibt die Ct-Werte für die einzelnen Proben an:
Tabelle 2:
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Auch hier zeigen die Daten eindrucksvoll den Effekt der Aufkonzentrierung sowohl in Bezug auf die initialen Proben als auch innerhalb der beiden Kaskadierungsstufen.
Ausführungsbeispiel 3: Messung der Konzentrationsveränderung einer DNA-Lösung im zeitlichen Verlauf unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
Das Ausführungsbeispiel soll demonstrieren, das mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens die Konzentration eines Analyten nach Wunsch einstellbar ist.
Als Probenflüssigkeit wurden 200 pl einer Lambda DNA-Lösung eingesetzt. Die Ausgangskonzentration der DNA betrug 132 ng/pl. Die Aufkonzentrierung erfolgte durch die Zugabe von einer Superabsorber- Kugel, kommerziell erhältlich unter der Bezeichnung „Waterbeads“ (0,006 g; ca. 1 mm Durchmesser). Die Bestimmung der Konzentration erfolgte alle 10 Minuten nach Inkubationsstart jeweils 10 min in Form einer spektrophotometrische Messung der Probe. Über die Inkubationszeit reduzierte sich das Volumen des flüssigen Anteils kontinuierlich. Das Aufkonzentrieren der DNA in der Lösung erfolgte kaskadierend in 5 Stufen (Messung nach 10 Minuten, 20 Minuten, 30 Minuten, 40 Minuten und 50 Minuten). Nach 30 Minuten Inkubation betrug das Volumen des flüssigen Anteils noch ca. 70 pl und die DNA Konzentration hatte sich auf 335 ng/pl erhöht.
Die Ergebnisse der Konzentrationsmessungen sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Die Daten zeigen eindrucksvoll die Zunahme der Konzentration der DNA in Abhängigkeit der zeit. Damit ist es dem Anwender möglich eine gewünschte Konzentration eines Analyten durch geeignete Wahl der Inkubationszeit und der Anzahl der kaskadierend durchgeführten Aufkonzentrierungs-Stufen einzustellen. Dazu würde der Anwender nach einer gewünschten Inkubationszeit die Inkubation mit dem Superabsorber beenden und die Probe zur weiteren Nutzung vom Superabsorber entfernen.
Tabelle 3:
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Aufkonzentrierung mindestens einer Zielsubstanz in einer Probenflüssigkeit, umfassend:
- Zugeben eines Superabsorbers (2) zu einem initialen Flüssigkeitsvolumen (1) der Probenflüssigkeit oder Zugeben des Flüssigkeitsvolumens (1) zu dem Superabsorber (2),
- Inkubieren des aus dem Superabsorber (2) und dem Flüssigkeitsvolumen (1) gebildeten Gemisches über einen ersten Zeitraum (t1), und
- Entnehmen einer ersten Probe (4) des nach dem Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteils (3) des Gemisches.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , weiter umfassend eine weitere Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der entnommenen ersten Probe (4).
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die weitere Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der entnommenen ersten Probe (4) mittels einer Filtrations-, Ultrafiltrations- oder Präzipitationsreaktions-Technik durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die weitere Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der entnommen ersten Probe (4) erneut durchgeführt wird durch:
- Zugeben eines Superabsorbers (5) zu der ersten Probe (4) oder Zugeben der ersten Probe (4) zu dem Superabsorber (5),
- Inkubieren des aus dem Superabsorber (5) und der ersten Probe (4) gebildeten Gemisches über einen zweiten Zeitraum (t2), und
- Entnehmen einer aufkonzentrierten ersten Probe (4) des nach dem Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteils des Gemisches.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zielsubstanz in der aufkonzentrierten ersten Probe (4) oder in einer durch weitere Aufkonzentrierung, insbesondere mittels eines Superabsorbers (5), erhaltenen weiter aufkonzentrierten ersten Probe mittels einer Filtrations-, Ultrafiltrations- oder Präzipitationsreaktion noch weiter aufkonzentriert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiter umfassend: erneutes Aufkonzentrieren der Zielsubstanz in dem nach Entnahme der ersten Probe (4) verbliebenen flüssigen Anteil (6) des Gemisches durch - erneutes Inkubieren des nach dem Entnehmen der ersten Probe (4) verbliebenen Gemisches aus dem verbliebenen flüssigen Anteil (6) und dem Superabsorber (2) über einen dritten Zeitraum (t3); und
- Entnehmen einer zweiten Probe des nach dem erneuten Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteils (6) des Gemisches.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Flüssigkeitsvolumen (1) eine polare Flüssigkeit, beispielsweise Wasser, enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Zielsubstanz ein Biomolekül ist, welches beispielsweise ausgewählt ist aus der Gruppe gebildet aus: eukaryotischen Zellen, Bestandteilen von eukaryotischen Zellen, prokaryotischen Zellen, Bestandteilen prokaryotischer Zellen, subzellulären Vesikeln, Bakteriophagen, Viren oder Virusbestandteilen, Toxinen, Antikörpern, Nukleinsäuren und Proteinen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Superabsorber (2, 5) einen Kunststoff umfasst, der einen Anteil des Flüssigkeitsvolumens, Wasser, unter Bildung eines Hydrogels aufnimmt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Kunststoff keine Biomoleküle aufnimmt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Superabsorber (2, 5) in Form von Partikeln, z.B. als Pulver, als Granulat oder in Form geometrischer Körper, insbesondere Kugeln, eingesetzt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , wobei der Superabsorber (2, 5) in Form von, insbesondere kommerziell erhältlichen, Wasserperlen, Hydrokugeln, Aquaperlen, Aquabeads, Waterbeads, oder Gelkugeln, eingesetzt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Volumen des nach dem Inkubieren verbleibenden flüssigen Anteils (3) durch Länge des Zeitraums oder der Zeiträume (t1 , t2, t3) des Inkubierens und/oder durch die Art und/oder die Menge des Superabsorbers und/oder durch die während des Inkubierens herrschende Temperatur des Gemisches gesteuert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Superabsorber (2, 5) in Form von Partikeln, z.B. als Pulver, als Granulat oder in Form geometrischer Körper, insbesondere Kugeln, eingesetzt wird, und wobei das Volumen des nach dem Inkubieren verbleibenden flüssigen Anteils (3, 4, 6) durch die Größe und/oder Anzahl der Partikel gesteuert wird.
15. Verwendung eines Superabsorbers (2, 5) zur einmalig oder mehrfach kaskadierend durchgeführten Aufkonzentrierung mindestens einer Zielsubstanz in einer Flüssigkeitsprobe.
16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Zielsubstanz ein Biomolekül umfasst, welches ausgewählt ist aus der Gruppe gebildet aus: eukaryotischen Zellen, Bestandteilen von eukaryotischen Zellen, prokaryotischen Zellen, Bestandteilen prokaryotischer Zellen, subzellulären Vesikeln, Bakteriophagen, Viren oder Virusbestandteilen, Toxinen, Antikörpern, Nukleinsäuren und Proteinen.
17. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Flüssigkeitsprobe eine polare Flüssigkeit, insbesondere Wasser, enthält, und wobei der Superabsorber (2, 5) dazu eingerichtet ist, die polare Flüssigkeit unter Bildung eines Hydrogels aufzunehmen.
18. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
PCT/EP2022/082367 2021-11-22 2022-11-18 Verfahren zur kaskadierbaren aufkonzentrierung mindestens einer zielsubstanz in einer probenflüssigkeit WO2023089078A1 (de)

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