WO2023117616A1 - Verfahren zum aufkonzentrieren sowie zur automatisierten online-detektion mindestens einer biologischen zielsubstanz in einer probeflüssigkeit, und konzentrator-einheit - Google Patents

Verfahren zum aufkonzentrieren sowie zur automatisierten online-detektion mindestens einer biologischen zielsubstanz in einer probeflüssigkeit, und konzentrator-einheit Download PDF

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WO2023117616A1
WO2023117616A1 PCT/EP2022/085796 EP2022085796W WO2023117616A1 WO 2023117616 A1 WO2023117616 A1 WO 2023117616A1 EP 2022085796 W EP2022085796 W EP 2022085796W WO 2023117616 A1 WO2023117616 A1 WO 2023117616A1
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WO
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sample liquid
concentrator
unit
liquid
chamber
Prior art date
Application number
PCT/EP2022/085796
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English (en)
French (fr)
Inventor
Timo Hillebrand
Original Assignee
Ist Innuscreen Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ist Innuscreen Gmbh filed Critical Ist Innuscreen Gmbh
Publication of WO2023117616A1 publication Critical patent/WO2023117616A1/de

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption

Definitions

  • the invention relates to a method for concentrating at least one biological target substance in a sample liquid, e.g. water or waste water, and a concentrator unit for the automated concentration of at least one biological target substance in a sample liquid.
  • the invention also relates to a method for automated online detection of at least one biological target substance using molecular genetic methods in a sample liquid, e.g. water or waste water, and an online analysis device for detecting at least one biological target substance using molecular genetic methods in a sample liquid.
  • Target substances to be detected or monitored can be, for example, viruses, bacteria and plasmid-associated bacterial resistance genes.
  • Such biological target substances can be detected in liquids using molecular genetic methods, preferably using amplification techniques such as PCR or real-time PCR.
  • samples of the liquid to be analyzed are taken and analyzed in specialized laboratories that have the necessary equipment systems.
  • Manually manageable or automatic sampling devices and sample collectors are known for automated sampling from processes, e.g.
  • the collected samples are usually transported to a laboratory for further analysis, where the extraction of the sample nucleic acids and the specific and possibly quantitative detection of the biological target substance is carried out manually or at least partially automatically.
  • online analysis devices which take a sample and carry out a quantitative determination of a mostly inorganic analyte in the sample in a fully automated manner.
  • Such an online analysis can be carried out continuously or discontinuously.
  • a sample collection device for flow-through sampling in bodies of water is known from US 2015/0224502 A1.
  • the device has several flow-through sample cartridges that are designed to take water from the water to be monitored and, if necessary, to retain samples of components of the liquid or solids in a filter or adsorption medium, while the water taken back from the cartridges into the body of water is returned.
  • the samples can either be stored for later laboratory analysis or analyzed directly in the device.
  • biological substances adsorbed on the filter or adsorption medium can be released as lysate and made available to an analysis module for further analysis, eg by means of qPCR.
  • the object of the invention is to enable improved automated online detection of a biological target substance in a sample liquid and to specify an improved method and an improved device for automated online detection of a biological target substance in a sample liquid.
  • the method and the device should enable an efficient concentration of the target substance and a low-loss forwarding of the sample liquid with the concentrated target substance to a subsequent detection unit.
  • This object is achieved by the method for concentrating at least one biological target substance in a sample liquid according to claim 1, by the method for automated online detection of at least one biological target substance in a sample liquid using an online analysis device according to claim 14, by the concentrator unit for automated implementation of a concentration of a target substance in a sample liquid according to claim 20 and by the online analysis device for detecting at least one biological target substance in a sample liquid according to claim 26.
  • Advantageous configurations are specified in the dependent claims. The solution is based on the use of so-called super absorbers, with which any aqueous sample liquid can be processed in order to concentrate the biomolecules contained in the sample liquid.
  • Superabsorbers are plastics that are able to absorb many times their own weight in polar liquids. These are primarily water or aqueous solutions. When the liquid is absorbed, the superabsorbent swells and forms a hydrogel. Hydrogels can form any crosslinked polymer that is polar (eg, polyacrylamide, polyvinylpyrrolidone, amylopectin, gelatin, cellulose).
  • the product is used, for example, conventionally as white granules with particle sizes from 100 to 1000 ⁇ m. It is mainly used in baby diapers, sanitary napkins, in incontinence care, in bandages and in small quantities in cable sheathing for deep-sea pipelines. Other areas of application are so-called gel beds, gel-forming extinguishing agents in firefighting, as a mechanical stabilizer for cut flowers in a vase or as an additive for potting soil to permanently store water.
  • potassium hydroxide-neutralized acrylic acid is used because of its better environmental compatibility.
  • the use of superabsorbents under designations such as "water beads", "aqua beads” or “water beads” is known as toys. These are super absorbers, which are commercially available in the form of spheres of variable size (submillimeters to centimeters).
  • water beads commercially available so-called water beads (commercially available under the designations aqua beads, water beads, water beads, or gel beads, among others) were added to a liquid volume of 1 liter. These water beads are made from a super absorber material. The liquid was surface water that had been taken from a fire-fighting pond with suspended matter. After an incubation period, the beads swelled to many times their size original volume. The volume of the liquid portion of the mixture of the liquid and the water beads was reduced. Surprisingly, it turned out that the suspended matter in the liquid was not absorbed by the swelling beads. The liquid portion of the mixture including the suspended solids (volume 400 ml) was transferred to a new vessel. A sample with a volume of 50 ml was taken from this liquid portion.
  • a comparison sample with a volume of 50 ml was taken directly from the liquid, i.e. the surface water mentioned, without previously concentrating the liquid according to the method described. Both samples were centrifuged at 5000 x g for 10 min. The supernatant was removed and the pellet used for nucleic acid extraction. The nucleic acid extraction was carried out using a commercial kit (innuprep Stool DNA Mini Kit; IST Innuscreen GmbH). The DNA from both samples was then examined for the amount of total bacterial count using real-time PCR.
  • the method according to the invention for concentrating at least one biological target substance in a sample liquid comprises:
  • concentrated sample liquid by reducing the first initial volume of the sample liquid in the concentrator unit and the associated concentration of biomolecules contained in the first volume of the sample liquid using a first amount of a superabsorbent, the reduction and the associated concentration by incubating a the mixture formed by the first initial volume of the sample liquid with the first amount of the superabsorbent.
  • concentration-reduced sample liquid obtained after incubation with the superabsorber with a correspondingly increased concentration of the biomolecules contained therein or the at least one biological target substance contained therein is also referred to here and below as “concentrated sample liquid”.
  • the method according to the invention not only brings about an efficient concentration of the target substance to be determined in the sample liquid, but also makes it possible, even with a low concentration of the target substance in the sample liquid to be examined, to keep the volume determined for the subsequent analysis, e.g.
  • the target substance can be a biomolecule, for example.
  • the biomolecule can be selected from the group consisting of: eukaryotic cells, components of eukaryotic cells, prokaryotic cells, components of prokaryotic cells, subcellular vesicles, bacteriophages, viruses or virus components, toxins, antibodies, nucleic acids and proteins.
  • any aqueous solution can be used as a sample liquid, e.g. water and waste water samples, fermentation liquids, liquids from food technology, chemical, pharmaceutical or biochemical production processes.
  • the superabsorbent can comprise a plastic that absorbs water molecules to form a hydrogel.
  • the super absorber can be, for example, one of the materials mentioned above.
  • the plastic advantageously absorbs water or other polar solvent molecules, it does not absorb any biomolecules, in particular not the target substance. This is the case, for example, with the materials mentioned above and with the superabsorbent balls commercially available under the designations “water beads”, “aqua beads” or “water beads”.
  • the superabsorber can be used, for example, in the form of particles, for example as a powder, as granules or in the form of geometric bodies, in particular spheres. A suitable diameter of the particles, in particular of the spheres, is 100 to 5000 ⁇ m.
  • the generation of concentrated sample liquid can include dosing the first initial volume of the sample liquid to the first amount of superabsorbent present in the first concentrator chamber or dosing the first amount of superabsorbent to the first initial volume of sample liquid present in the first concentrator chamber.
  • the incubation of the mixture formed from the first initial volume of the sample liquid with the first quantity of the superabsorbent can be carried out over a predetermined, in particular selectable, period of time.
  • the increase in concentration of a target substance in the sample liquid that can be achieved within a period of time depends on the type of superabsorbent, the particle size of the superabsorbent, the size of the first amount of superabsorbent added, the temperature prevailing during incubation and the length of the selected period of time for the incubation.
  • the period of time during which the incubation is carried out can be monitored by means of control electronics. In an alternative embodiment, it is also possible to monitor the volume of the liquid portion and to end the incubation when a desired, predetermined target volume is reached.
  • the temperature of the concentrator chamber and the mixture contained therein can be controlled during the incubation by means of a temperature control device of the concentrator unit.
  • the temperature control device can be a heating and/or cooling device that can be operated automatically by means of control electronics for controlling and/or regulating a temperature of the mixture present in the concentrator chamber.
  • the method can further include the following step: after the incubation, removing at least part of the concentrated sample liquid from the first concentrator chamber.
  • the removed liquid can be fed directly to a detection unit of an analysis device.
  • the concentrated sample liquid can first be fed to a collection vessel. This allows the target substance to be concentrated in several initial liquid volumes taken as samples, e.g. from a process or a body of water, using the method described and combined for further detection.
  • the pooled, concentrated samples can optionally be further concentrated again using the method described. This procedure is particularly advantageous when the concentration of the target substance in the original, untreated sample liquid is particularly low. The procedure is described in more detail below.
  • the sample liquid taken from the concentrator chamber and concentrated in a first stage can first be transported to a collection vessel. Subsequently, residues of the concentrated sample liquid and the first quantity of the super absorber can be removed from the concentrator chamber, for example by flushing the concentrator chamber with a flushing fluid, for example a flushing liquid or a flushing gas.
  • a flushing fluid for example a flushing liquid or a flushing gas.
  • At least part of the concentrated sample liquid from the collection vessel can be dosed and transported into the first concentrator chamber or into a second concentrator chamber different from the first concentrator chamber for further concentration of the target substance by means of a third amount of superabsorbent.
  • This further concentration is carried out in a completely analogous manner to that described for the first concentration, namely by creating a mixture of the concentrated sample liquid and the third quantity of the superabsorbent and incubating the mixture, which reduces the volume of the concentrated sample liquid again and the biomolecules contained, including the target substance, to be further concentrated.
  • the further concentrated sample liquid obtained in this way can be concentrated again in the same way or fed directly to a detection unit of an analysis device for further analysis. In this way, the sensitivity of the method can be further increased.
  • the method can advantageously be carried out completely automatically by control electronics.
  • the concentrator unit can have means for transporting liquids and for transporting the superabsorbent within the concentrator unit, which can include pumps and/or valves, for example.
  • the invention also relates to a method for automated online detection of at least one biological target substance in a sample liquid using an online analysis device. This procedure includes:
  • the qualitative or quantitative determination can be carried out using molecular genetic methods.
  • the method further includes the following steps:
  • the target nucleic acid to be amplified can be either the target substance to be detected or a nucleic acid of the target substance to be detected.
  • the release and/or isolation of nucleic acids from the biomolecules contained in the concentrated sample liquid and the generation of the solution comprising the released and/or isolated nucleic acids are carried out in a first microfluidic unit of the detection unit.
  • the solution is transported into a second microfluidic unit that can be fluidically connected to the first microfluidic unit, and the amplification and acquisition of the measurement signal is carried out in the second microfluidic unit.
  • the first and the second microfluidic unit can be accommodated in two separate cartridges or in a common cartridge.
  • the release and/or isolation of nucleic acids from the biomolecules contained in the concentrated sample liquid and the generation of the solution containing the released and/or isolated nucleic acids can include at least the following steps:
  • the eluate obtained in this way forms the mentioned solution comprising the released and/or isolated nucleic acids.
  • the release and/or isolation of nucleic acids from the biomolecules contained in the concentrated sample liquid and the generation of the solution containing the released and/or isolated nucleic acids can include the following steps:
  • the buffer solution with the nucleic acids released by the thermal treatment forms the aforementioned solution comprising the released and/or isolated nucleic acids.
  • Thermal release may involve dispersing the sample in the buffered solution and incubating.
  • This variant of the method is suitable, for example, for applications in which the target substance to be determined is a nucleic acid that is already freely present in the liquid to be analyzed.
  • a classic lysis can therefore be omitted.
  • the method when the target substance is a bacterium or a virus as a biomolecule. In this case, the biomolecules contained in the sample can be thermally/chemically destroyed and the nucleic acid contained can be released.
  • the amplification carried out, for example, in the second microfluidic unit can be carried out, for example, using conventional PCR-based methods.
  • the qualitative or quantitative determination of the target substance can also be carried out in a conventional manner by using a sensor to record at least one measured value of a measured variable at a specific point in time or at a plurality of points in time, which corresponds to the number of values present at the respective point in time due to the amplification generated copies of a target nucleic acid.
  • the presence of the target nucleic acid and thus the biological target substance in the sample liquid can be qualitatively detected from the measured value obtained or the course of the measured value as a function of time, or a quantitative value, e.g. a concentration, of the biological target substance in the original sample liquid or in the sample liquid after concentration using the determine the method described above and output it as a measurement result from the control electronics.
  • All steps of the method according to the invention described here for online detection of at least one biological target substance in a sample liquid in all specified configurations can be carried out automatically using the control electronics of the online analysis device.
  • it can, for example, transport liquid (sample liquid and/or reagents) or transport solids (superabsorber material) by actuating controllable valves and/or pumps and control the incubation time and temperature when concentrating and/or releasing nucleic acids by means of a predetermined sequence program and/or regulate.
  • the invention also includes a concentrator unit for the automated implementation of a concentration of a target substance in a sample liquid, in particular according to the method described above, comprising: - a first concentrator chamber;
  • the concentrator unit being set up to add a first quantity of a superabsorbent to an initial liquid volume of the sample liquid introduced into the first concentrator chamber via the liquid feed line, or being set up to add the initial liquid volume to the to add the first quantity of the superabsorbent.
  • the first amount of superabsorbent can be placed in the first concentrator chamber.
  • the concentrator chamber can be configured as an exchangeable cartridge.
  • the replaceable cartridge with the super absorber can be exchanged for a new cartridge for the concentration of the target substance in each new batch of the sample liquid.
  • the concentrator unit can have at least one reservoir or be connected to a reservoir containing superabsorbent, in particular in the form of particles.
  • superabsorbent in particular in the form of particles.
  • Super absorber spheres of this size can be dispersed very well in the concentrator chamber.
  • the reservoir can be connected to the first concentrator chamber, for example, via a superabsorbent supply line that can be closed with a valve that can be controlled in particular by means of control electronics, such that when the valve is open, at least part of the superabsorbent contained in the reservoir can flow into the first as a first quantity of the superabsorbent reached the concentrator chamber.
  • the transport of superabsorbent can be effected by gravity.
  • the concentrator unit it is also possible for the concentrator unit to have means for transporting the superabsorbent present, for example, in the form of particles, e.g. a pump and/or means for generating a gas flow which transports the superabsorbent particles.
  • Control electronics designed for automatic operation of the concentrator unit can be used for metering and transporting the superabsorbent, which is set up to actuate the mentioned means and/or the mentioned valve in order to meter the first amount of superabsorbent and transport it into the concentrator chamber.
  • These control electronics can be set up accordingly in interaction with pumps and/or valves to meter the initial volume of the sample liquid into the concentrator chamber.
  • the concentrator device can have means for moving, in particular stirring, in the
  • the funds can, for example, a stirrer, a Comprising a supply line for an inert gas into the reaction chamber and a discharge line for the inert gas, which are arranged in such a way that the inert gas flows through the liquid contained in the reaction chamber, or have a drive for moving the reaction chamber.
  • the concentrator unit can also have a temperature control device, which is designed to control the temperature of the first concentrator chamber.
  • the temperature control device can have heating and/or cooling elements, for example, which can be operated by means of the control electronics in order to control and/or regulate a temperature of a liquid held in the concentrator chamber.
  • the liquid discharge line for discharging at least part of the liquid volume of the sample liquid present in the first concentrator chamber can be fluidically connectable to a collecting vessel.
  • the collection vessel can have a collection vessel outlet line which can be fluidically connected to the first concentrator chamber.
  • sample liquid in the collection vessel that has already been concentrated in a first stage can be fed back into the first concentrator chamber in order to be further concentrated in a second stage by again feeding superabsorbent to the concentrated sample liquid in the first concentrator chamber and incubating the mixture.
  • the concentrator unit can comprise an additional second concentrator chamber, with the liquid discharge line of the first concentrator chamber connecting it to the second concentrator chamber, in particular via a collecting vessel; and a further liquid discharge line opening into the second concentrator chamber, the concentrator unit being set up to add a second amount of the superabsorbent to a volume of the sample liquid concentrated in the first concentrator chamber introduced into the second concentrator chamber or to add the liquid volume to the second amount of superabsorbent .
  • the invention also includes an online analysis device for detecting at least one biological target substance in a sample liquid, in particular according to the method described above.
  • the analyzer includes: control electronics; a concentrator unit according to one of the configurations described above, wherein the concentrator unit has a liquid outlet for concentrated sample liquid produced from the sample liquid in the concentrator unit; and a detection unit that can be fluidically connected to the liquid outlet of the concentrator unit; and at least one transport device that can be controlled by the control electronics, e.g.
  • a pump which is set up to transport concentrated sample liquid from the liquid outlet of the concentrator unit to the detection unit, wherein the control electronics are set up to use the detection unit to qualitatively or quantitatively determine the target substance in the concentrated sample liquid and/or in the sample liquid before concentration based on a molecular genetic method.
  • the online analysis device can also have a sample pump, with the control electronics being set up to control the sample pump to transport a specified volume of the sample liquid into the concentrator unit.
  • the sample feed line can be fluidly connectable to a sample template or directly to a body of water or a line in a process plant, a fermenter or another process container.
  • the detection unit can have the following components: a first microfluidic unit that can be fluidically connected to a liquid outlet for concentrated sample liquid of the concentrator unit and is set up to release and/or to release nucleic acids from biomolecules contained in the concentrated sample liquid, in particular the at least one biological target substance isolating, a second microfluidic unit which is connected to the first microfluidic unit and is set up to receive an eluate comprising the released and/or isolated nucleic acids and to amplify a target nucleic acid; and a sensor, in particular an optical sensor, which is set up to generate a measurement signal dependent on the progress of an amplification carried out in the second microfluidic unit and/or on a number of copies of the target nucleic acid in the second microfluidic unit and to output it to the control electronics; and wherein the control electronics are set up to qualitatively and/or quantitatively determine the biological target substance in the liquid based on the measurement signal output by the sensor.
  • the liquid outlet of the concentrator unit can be fluidically connectable to the aforementioned first concentrator chamber and/or to a second concentrator chamber that may be present and/or to a collection vessel that is also optionally present.
  • concentrated sample liquid can thus be transported directly from the first or the optionally available second concentrator chamber or via the optionally available collection vessel into the detection unit.
  • the first and the second microfluidic unit can be arranged together in one, in particular replaceable, cartridge.
  • the first microfluidic unit can be arranged in a first cartridge and the second microfluidic unit can be arranged in a second cartridge that is different from the first cartridge, the first and second cartridges being fluidically connectable to one another in order to transport liquid from the first cartridge into the second .
  • the first and the second cartridge can be designed to be exchangeable.
  • the first microfluidic unit can be set up to take up the concentrated sample with the biomolecules it contains and to add one or more lysis reagents to release the nucleic acid of the biomolecules contained in the sample, then absorb the released nucleic acids, if necessary with the addition of a binding of the nucleic acid to a To bind nucleic acid-binding material reinforcing / mediating component and to wash the nucleic acids bound to this material one or more times with a washing solution.
  • the control electronics can be set up to control a transport of the particles and optionally the reagents through the first microfluidic unit.
  • the first microfluidic unit can also be set up to detach the nucleic acids from the nucleic acid-binding material by elution and to transport the eluate into the second microfluidic unit via a fluid line connecting the first microfluidic unit to the second microfluidic unit.
  • the control electronics can be set up to control the elution and the transport of the eluate.
  • the first microfluidic unit can be set up to take up the concentrated sample with the biomolecules it contains and to absorb the biomolecules in a buffer solution, for example in a phosphate-buffered saline solution (PBS buffer), water or a Tris buffer, or optionally a buffer containing a detergent, thermally/chemically released, the control electronics being set up to control the thermal release of the biomolecules and to transport the buffer solution with the biomolecules or nucleic acids dissolved therein into the second microfluidic unit for the subsequent amplification.
  • PBS buffer phosphate-buffered saline solution
  • Tris buffer Tris buffer
  • the control electronics being set up to control the thermal release of the biomolecules and to transport the buffer solution with the biomolecules or nucleic acids dissolved therein into the second microfluidic unit for the subsequent amplification.
  • This configuration is suitable, for example, for use in an application in which the biological target substance to be detected is a nucleic acid that is freely present in the liquid.
  • the first microfluidic unit can contain the reaction components required for releasing and/or isolating the nucleic acid in solid form, for example in the form of pellets obtained by lyophilization, or in reagent chambers closed by microvalves or in reagent packs closed by foils, which are automated by the action of force or heat, in particular by means of the control electronics, can be opened.
  • Reagents for the amplification can be stored in a corresponding manner in the second microfluidic unit. It can also contain one or more detection chambers, in which the amplification of a target nucleic acid or else several different target nucleic acids can be carried out in parallel.
  • the second microfluidic unit can include a temperature control device for the detection chambers.
  • the temperature control device can, for example, have thermoelectric elements that can be controlled by the control electronics.
  • the control electronics described here and above in connection with the method according to the invention and the concentrator unit according to the invention can be electronic Have a data processing device with at least one processor and a memory in which one or more operating programs are stored, which can be executed by the processor in order to automatically control the analysis device and to determine qualitative or quantitative analysis results from the measurement signals of the sensor.
  • the operating programs can be designed in such a way that the control electronics control the analysis device to carry out the method described above.
  • the control electronics can also have a user interface, for example a touch screen or another display in combination with an input keyboard.
  • the control electronics can be set up to be connected wirelessly by radio or via a data line to another data processing device, eg a computer, a process controller, a particularly portable display or operating device for communication.
  • the automatic control of the concentration carried out in the concentrator unit can be carried out by means of the same control electronics that are also used to control the other components of the analysis device.
  • the concentrator unit can also have its own electronic control system, which is set up to carry out the concentration of the sample liquid automatically in the manner described.
  • the control electronics of the concentrator unit are advantageously connected for communication to the control electronics of the analysis device, which control the other components of the analysis device, namely in particular the detection unit.
  • the analyzer can thus perform on-line determinations of biological target substances in a liquid without requiring manual sampling or preparation or transport of samples to a laboratory.
  • the analysis device can carry out sampling and detection cycles fully automatically, which can be event-controlled by the electronic control system or carried out at predetermined time intervals, for example.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of an online analysis device for the qualitative or quantitative determination of a biological target substance in a liquid
  • FIG. 2 shows a first exemplary embodiment of a concentrator unit of the online analysis device shown in FIG. 1 according to a first exemplary embodiment
  • FIG 3 shows a second exemplary embodiment of a concentrator unit for an online analysis device.
  • the analysis device 1 shows an exemplary embodiment of an online analysis device 1 for detecting a biological target substance in a sample liquid.
  • the analysis device 1 has a housing 2 in which all the components of the device are accommodated. These components include, in detail, a concentrator unit 3, a detection unit 4 and control electronics 5.
  • the concentrator unit 3 enables the detection of biomolecules contained in a sample liquid even in very low concentrations, since it is designed to contain biological target molecules in a volume of a to concentrate the sample liquid to be analyzed and to forward the concentrated sample liquid to the detection unit 4 for detection and, if necessary, preparatory steps such as extraction and/or isolation of nucleic acids.
  • the concentrator unit 3 is fluidly connected via a sample feed line 6 to a sample receiver 7 or to a process container, e.g. a pipeline or a reactor or a fermenter, in which the liquid to be analyzed is contained.
  • a pump 9, which can be controlled by the electronic control unit 5 according to an operating program stored in the electronic control unit 5 and executed by it, is used to transport and meter the liquid from the sample receiver 7 into a first concentrator chamber 8 contained in the concentrator unit 3.
  • the first concentrator chamber 8 can also be fluidically connected to reservoirs 10, 11.
  • the reservoirs 10, 11 contain substances which serve to enrich the biomolecules contained in the liquid.
  • each reservoir 10, 11 is fluidically connected to the concentrator chamber in the concentrator unit 3 via a fluid line.
  • a pump 12 , 13 is used to transport the substances contained in the reservoirs through the fluid lines. It is also possible for the reservoirs 10 , 11 to be integrated directly into the concentrator unit 3 .
  • the substances can of course be transported by other means known to those skilled in the art, e.g. pneumatically or by utilizing gravity or a pressure, e.g. hydrostatic.
  • the concentrator unit 3 can optionally have a temperature control unit (not shown in FIG. 1 ), which is used to set a specific temperature in the concentrator chamber 8 .
  • the temperature control unit can include resistance heating, cooling and/or thermoelectric elements for selective heating or cooling. It can be connected to the control electronics 5 , the control electronics 5 being set up to control or regulate the temperature in the concentrator chamber 8 .
  • the concentrator unit 3 can also have a device 14 for moving or stirring a liquid or liquid mixture contained in the reaction chamber 8 .
  • the device 14 comprises a drive for moving, e.g. shaking, the reaction chamber 8.
  • the device 14, in particular the drive, can be controlled by the control electronics 5.
  • the concentrator chamber 8 can be fluidically connected to the detection unit 4 or to a liquid outlet 17 via the fluid line 15 either by means of a valve 16 that can be actuated by the control unit 5 .
  • the detection unit 4 has an analysis cartridge in which two microfluidic units fluidically connected to one another via the fluid line 18, namely a first microfluidic unit 19 and a second microfluidic unit 20, are integrated.
  • the microfluidic units can also be accommodated in separate cartridges.
  • the analysis cartridge can be replaced.
  • the first microfluidic unit 19 is set up to receive a sample containing the concentrated biomolecules from the reaction chamber and to prepare it for subsequent amplification and detection in the second microfluidic unit 20 . This can be done by means of extraction and isolation processes known per se.
  • the first microfluidic unit 19 includes reagents and optionally a temperature control unit for incubating reaction mixtures produced in the microfluidic unit 19 .
  • the detection unit 4 comprises suitable means known to the person skilled in the art, which can be controlled by the control electronics 5 .
  • the second microfluidic unit 20 includes means for amplification, i.e.
  • the detection unit has a sensor 21 which can, for example, carry out fluorescence measurements in the second microfluidic unit 20 and can output measurement signals to the control electronics 5 .
  • the control electronics 5 are set up to determine a qualitative or quantitative analysis result based on the measurement signals.
  • the control electronics 5 can be a central processing unit, e.g. a CPU with a processor and memory and operating programs stored therein. It can also be divided among several computing units within the analysis device, e.g. the concentrator unit 3 and the detection unit 4 can each have their own on-site electronics, which are connected to higher-level electronics for communication, with the higher-level electronics and the on-site electronics together form the control electronics 5.
  • a central processing unit e.g. a CPU with a processor and memory and operating programs stored therein. It can also be divided among several computing units within the analysis device, e.g. the concentrator unit 3 and the detection unit 4 can each have their own on-site electronics, which are connected to higher-level electronics for communication, with the higher-level electronics and the on-site electronics together form the control electronics 5.
  • FIG. 2 shows a first exemplary embodiment of a concentrator unit 3 of the online analysis device 1 shown in FIG. 1 in detail.
  • the structure of the concentrator unit 3 shown in FIG. 2 is only one possible exemplary embodiment. A person skilled in the art can find numerous variants without departing from the spirit of the invention.
  • the concentrator unit 3 has a concentrator chamber 8 with various inlets and outlets.
  • the feed line 23 is connected to a reservoir which serves as a reservoir 10 and contains a super absorber 24, for example in the form of balls made of the super absorber material.
  • the super absorber 24 is added to the concentrator chamber 8 via the feed line 23.
  • a first opening 25 serves to feed in the sample liquid. They are used to enter a specific initial volume of the liquid to be sampled into the concentrator chamber 8.
  • a second opening 26 is connected to the fluid line which connects the reaction chamber (1) to a sample outlet and to the detection unit.
  • the second opening 26 can have a diameter that is smaller than the diameter of the super absorber spheres, so that only the liquid portion of the mixture of sample liquid and adsorber can be drained from the concentrator chamber 8 via the second opening 26 in the direction of the detection unit 4 .
  • the second opening 26 can also have a size selector, for example a grid or a filter, which retains the super absorber spheres in the concentrator chamber 8 .
  • the super absorber contained in the concentrator chamber 8 and residues of the sample liquid can be removed from the concentrator chamber 8 through a third opening 27 serving as a drain, which in the present example can be introduced into the concentrator chamber 8 via the sample liquid opposite the opening 25 .
  • a rinsing liquid or a rinsing gas can be passed through the concentrator chamber 8 in order to completely remove the super absorber 24 and the residues of the sample liquid.
  • the rinsing liquid can either be the sample liquid that is conducted from the sample holder 7 through the concentrator chamber 8 .
  • the rinsing liquid can be a liquid stored in the reservoir 11 . In the latter case, the reservoir 11 is fluidically connected to the first opening 25 . Valves that can be actuated by the control electronics 5 are optionally arranged in the respective supply lines.
  • the control electronics 5 can include an operating program that it can execute to carry out the following procedure:
  • the super absorber absorbs polar solvents, for example water in the present embodiment, from the sample liquid to form a gel.
  • biomolecules in particular the biological target substance to be determined, are not absorbed by the superabsorber.
  • the incubation time can be selected such that it is ensured that the concentration of the target substance in the concentrated sample liquid after the incubation is above a threshold value, eg above a detection limit specified by the detection unit.
  • the length of time until the desired reduction in volume or the desired concentration depends on the following factors: type of superabsorbent, particle size of the superabsorbent particles, amount of superabsorbent added, temperature during incubation.
  • a quantity of super absorber and incubation time suitable for a specific type of sample liquid can be determined by means of preliminary tests and stored in the control electronics.
  • the control unit 5 can be designed to set or regulate the temperature of the liquid contained in the concentrator chamber 8 or of the mixture of sample liquid and superabsorbent to a constant value by means of the previously mentioned temperature control device. All of these steps can be carried out automatically using the control unit 5 .
  • the liquid part is a concentrated sample liquid, i.e. sample liquid that contains the biological target substance in an increased concentration due to the volume reduction caused by the absorption of water by the superabsorbent.
  • the concentrated sample liquid can be transported directly into the detection unit 4 .
  • the concentrator unit 3 described here for carrying out this method it is possible to reduce a large-volume water sample to a much smaller sample volume and correspondingly to achieve a large increase in the concentration of biomolecules. This facilitates and/or accelerates subsequent detection using molecular genetic methods. If the concentration of the biomolecules in the sample liquid is originally very low, the method described here can even make molecular-genetic detection of the target substance possible in the first place.
  • a further advantage results from the fact that it is possible with the approach according to the invention to concentrate both bacteria, viruses and free nucleic acids in a completely unselective manner. Accordingly, it is also possible in a very simple manner to first concentrate and extract several different biological target substances with the method and then to determine them using a PCR-based method.
  • the opening 26 of the concentrator unit 3 is fluidically connected to the fluid line 15 of the analysis device 1 , which can be connected via the valve 16 to the detection unit 4 on the one hand and to the liquid outlet 17 on the other hand.
  • the detection of the target substance is described in more detail below:
  • the concentrated sample liquid is transported through the fluidic line 15 into the first microfluidic unit 19 via the fluidic line 15 by means of the control electronics 5 .
  • a further pump, which is controlled by the control electronics 5, can be used for this purpose.
  • the valve 16 is also actuated by the control electronics 5 .
  • Automated nucleic acid extraction and/or isolation takes place in the first microfluidic unit 19, and automated amplification and detection by means of PCR or real-time PCR takes place in the second microfluidic unit 20 connected downstream of the first microfluidic unit 19.
  • Microfluidic units suitable for the method described here for automated nucleic acid extraction, amplification and detection are basically known in the prior art.
  • a centrifugal platform such as that is advantageous for the present application is described for example in WO 2013/045631 A1 and EP 2 621 632 A1, but it is also possible to use other microfluidic platforms or lab-on-chip systems that transport liquids and reagents by means of capillary forces, pumps or pneumatics instead of with Provide centrifugal force.
  • the nucleic acids are extracted and/or isolated in the first microfluidic unit 19 using known reagents and methods, as already described in the introduction. If the biological target substance is not already freely present in the liquid taken from the sample, the biomolecules contained in the concentrated sample liquid are lysed. The free nucleic acids are bound to a nucleic acid-binding material, e.g. in particle form. The nucleic acid-binding material with the nucleic acids bound to it is then washed in a known manner and the nucleic acids are finally detached from the material. The eluate containing the dissolved nucleic acids is transported into the second microfluidic unit 20, again controlled by the control electronics 5.
  • the second microfluidic unit 20 specific volumes of the eluate are transported into one or more detection chambers and amplification reagents are added. An amplification then takes place in the detection chambers, the progress of which is monitored by means of fluorescence measurements with the sensor 21 .
  • the sensor 21 outputs measurement signals to the control electronics 5 . From the measurement signals, this determines either a qualitative value that indicates whether the specific biological target substance is contained in the liquid taken from the sample holder 7 .
  • the control electronics 5 can also determine a quantitative value from the measurement signals, which represents a concentration of the biological target substance in the liquid.
  • different target nucleic acids can be amplified in a number of detection chambers and a number of different biological target substances in the liquid can thus be determined qualitatively or quantitatively in parallel.
  • the liquid remaining in the concentrator unit 3 is discharged from the process unit 3 through the liquid outlet 17 .
  • the concentrator unit 3 can be sufficiently rinsed with a rinsing medium, for example with liquid sucked in from the sample receiver 7, and the process can now be repeated for a further measurement.
  • the microfluidic units 19, 20 in the detection unit can be replaced by new microfluidic units 19, 20 for further measurement. All of the steps described here can be carried out automatically by the control electronics 5 .
  • FIG. 3 schematically shows an alternative exemplary embodiment of a concentrator unit 33, which can be used in the analysis device of FIG. 1 instead of the concentrator unit 3 shown in FIG.
  • the concentrator unit 33 is set up to concentrate a sample liquid in several stages and thus allows the concentration itself of Target substances that are only present in an extremely low concentration in the original sample liquid.
  • the concentrator unit 33 has a first concentrator chamber 8, which has an inlet 25 for sample liquid, a supply line 23 for super absorbers, eg in the form of balls with a diameter of the order of 1 mm, and two discharge lines 26,27.
  • the feed line 23 for the superabsorbent can be connected to a reservoir 10 in which a supply of superabsorbent is contained.
  • the first derivation 26 from the concentrator chamber 8 leads to a collection vessel 28, the second derivation 27 serves as a derivation for used liquid and used superabsorbent and can be connected, for example, to a waste collection container.
  • the collection vessel 28 can be fluidically connected to a second concentrator chamber 30 via a liquid discharge line 29 .
  • the second concentrator chamber 30 can be designed identically to the first concentrator chamber 8. In the present example, it has a further feed line 31 for superabsorbents, which can be fluidically connected to the same reservoir 10 of the analysis device as the feed line 23 to the first concentrator chamber 8.
  • the second concentrator chamber has a first derivative 15 which can be fluidically connected to the detector unit 4 of the analysis device in order to supply the detector unit with concentrated sample liquid for the qualitative and/or quantitative detection of the biological target substance.
  • the concentrator chamber 8 has a second drain line 32 for draining used liquid and/or used superabsorbent.
  • a multi-stage concentration of a target substance in a sample liquid can be carried out using the concentrator unit 33, in particular automatically using control electronics, e.g. the control electronics 5 of the analysis device, in the following way:
  • control electronics e.g. the control electronics 5 of the analysis device
  • a first stage a first initial volume of the to analyzing sample liquid are introduced.
  • the mixture thus formed can be incubated for a predetermined period of time or until a certain final volume of the liquid portion is reached.
  • At least part of the liquid portion remaining after the inking can then be routed from the concentrator chamber 8 into the collection vessel 28 via the first discharge line 26 . Residual liquid and used super absorber can be discharged from the concentrator chamber via the discharge line 27 .
  • one or more additional initial volumes of the sample liquid in the first concentrator chamber 8 can be reduced in order to concentrate the target substance in these additional volumes. After the respective incubation, at least part of the respectively remaining liquid portion is correspondingly transferred into the collection vessel 28 .
  • the collected sample liquid which has already been concentrated in a first stage, can be further concentrated in a second stage by means of the second concentrator chamber 30 .
  • at least part of the concentrated sample liquid contained in the collection vessel 28 can be introduced into the second concentrator chamber 30 via the outlet line 29 of the collection vessel 28 .
  • a second amount of superabsorbent is introduced into the second concentrator chamber 30 via the feed line 31 for superabsorbent.
  • the mixture thus formed is incubated in the second concentrator chamber 30 for a predetermined period of time and/or until a desired volume of the liquid portion is reached. At least part of the liquid portion can then be fed via the liquid line 15 to the detector unit 4 of the analysis device. Liquid that is not required and/or the used super absorber can be discharged from the second concentrator chamber 30 via the discharge line 32 .
  • control electronics e.g. the control electronics 5 of the analysis device 1.
  • the concentrator unit has suitable means for transporting liquid and superabsorbent particles through the fluid lines into the various chambers, in particular pumps and valves (not shown in FIG. 3), which control electronics for carrying out the described method for concentrating the target substance in the sample liquid.
  • the analysis device and method according to the invention thus ideally solves the task by linking available device systems for detection and enables online liquid analysis of biological targets to be carried out, which is particularly advantageous for monitoring water or waste water in networks, sewage treatment plants or treatment plants as well as water bodies appears.
  • the method according to the invention makes it possible for the first time to implement molecular genetic monitoring of biological targets in a practical and economical manner without manual intervention, starting with a large-volume sample up to detection.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein, insbesondere automatisiert mittels einer Steuerelektronik durchführbares Verfahren zum Aufkonzentrieren mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit umfassend: - Dosieren und Transportieren eines ersten initialen Volumens der Probeflüssigkeit über eine Flüssigkeitszuleitung (25) in eine erste Konzentratorkammer (8) einer Konzentrator-Einheit (3, 33); und - Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit durch Reduzieren des ersten initialen Volumens der Probeflüssigkeit in der Konzentrator-Einheit (3, 33) und damit verbundenem Aufkonzentrieren der im ersten Volumen der Probeflüssigkeit enthaltenen mindestens einen biologischen Zielsubstanz mittels einer ersten Menge eines Superabsorbers (24), wobei das Reduzieren und das damit verbundene Aufkonzentrieren durch Inkubieren eines aus dem ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mit der ersten Menge des Superabsorbers (24) gebildeten Gemisches erfolgt. Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Description

VERFAHREN ZUM AUFKONZENTRIEREN SOWIE ZUR AUTOMATISIERTEN ONLINE-DETEKTION MINDESTENS EINER BIOLOGISCHEN ZIELSUBSTANZ IN EINER PROBEFLÜSSIGKEIT, UND KONZENTRATOR-EINHEIT
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufkonzentrieren mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit, z.B. Wasser oder Abwasser, sowie eine Konzentrator-Einheit zur automatisierten Aufkonzentrierung mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur automatisierten online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz mittels molekulargenetischer Methoden in einer Probeflüssigkeit, z.B. Wasser oder Abwasser, und ein Online-Analysegerät zur Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz mittels molekulargenetischer Methoden in einer Probeflüssigkeit.
Die Detektion biologischer Parameter spielt in der Prozessindustrie, beispielsweise bei der Überwachung und Reinigung von Industriewasser oder Klärwasser, in der Lebensmittelproduktion und im Pharma- und Lifescience-Bereich, beispielsweise bei der Überwachung von in Fermentoren durchgeführten biotechnologischen Prozessen, eine zunehmend wichtige Rolle. Zu detektierende bzw. zu überwachende Zielsubstanzen können beispielsweise Viren, Bakterien sowie Plasmid-assoziierte bakterielle Resistenzgene sein.
Der Nachweis solcher biologischer Zielsubstanzen in Flüssigkeiten kann mit molekulargenetischen Methoden erfolgen, vorzugsweise mittels Amplifizierungstechniken wie PCR oder Real Time PCR. Hierzu werden Proben der zu analysierenden Flüssigkeit genommen und in spezialisierten Laboren, die über die notwendigen Gerätesysteme verfügen, analysiert. Zur automatisierten Probennahme aus Prozessen, z.B. aus Klärbecken, Fermentern, Produktionsgefäßen oder Leitungen, sind manuell handhabbare oder automatische Probennahmevorrichtungen und Probensammler bekannt. Die gesammelten Proben werden in der Regel zur weiteren Analyse in ein Labor transportiert, wo die Extraktion der Proben-Nukleinsäuren und der spezifische und gegebenenfalls quantitative Nachweis der biologischen Zielsubstanz manuell oder zumindest in Teilen automatisiert durchgeführt wird.
Beispielsweise im Bereich der Wasser- und Abwasseranalyse sind Online-Analysegeräte bekannt, die eine Probennahme und eine quantitative Bestimmung eines, meist anorganischen, Analyten in der Probe vollständig automatisiert durchführen. Eine solche Online-Analyse kann kontinuierlich oder auch diskontinuierlich durchgeführt werden.
Aus US 2015/0224502 A1 ist ein Probensammel-Gerät für die Durchfluss-Probennahme in Gewässern bekannt. Das Gerät weist mehrere Durchfluss-Probenkartuschen auf, die dazu eingerichtet sind, Wasser aus dem zu überwachenden Gewässer aufzunehmen und gegebenenfalls Proben von Bestandteilen der Flüssigkeit oder von Feststoffen in einem Filter- oder Adsorptionsmedium zurückzuhalten, während das aufgenommene Wasser wieder aus den Kartuschen in das Gewässer zurückgeleitet wird. Die Proben können entweder für eine spätere Laboranalyse aufbewahrt werden oder direkt in dem Gerät analysiert werden. Hierzu können beispielsweise an dem Filter- oder Adsorptionsmedium adsorbierte biologische Substanzen als Lysat freigesetzt werden und einem Analysemodul zur weiteren Analyse, z.B. mittels qPCR, zur Verfügung gestellt werden.
Bei geringen Konzentrationen der Zielsubstanzen in der zu analysierenden Flüssigkeit stellt sich das Problem, bei der Probennahme einerseits eine für die anschließende Analyse ausreichende Menge der Zielsubstanz zur Verfügung zu stellen. Bei einer Durchfluss-Probennahme wie sie in US 2015/0224502 A1 beschrieben ist, können auch in geringen Konzentrationen im Wasser vorliegende gelöste Substanzen oder Feststoffe durch Durchleiten eines entsprechend großen Wasservolumens im Filtermedium zurückgehalten werden. Dies ist jedoch nur praktikabel, wenn die zu analysierende Flüssigkeit nach der Probe wieder ohne Einschränkungen zurück in das Medium geleitet werden kann, wie dies z.B. bei der Gewässeranalyse der Fall ist. Bei der Überwachung von Prozessen, z.B. in der Wasseraufbereitung, der Lebensmittelindustrie oder im Pharmabereich ist eine Wiedereinleitung der entnommenen Flüssigkeit oft nicht möglich. Hier besteht Bedarf nach einem Verfahren zur effizienten Aufkonzentration von zu detektierenden Probenbestandteilen, das es ermöglicht, das aus dem Prozess für die Analyse zu entnehmende Flüssigkeitsvolumen gering zu halten.
Ein weiterer Nachteil des in US 2015/0224502 A1 beschriebenen Geräts besteht darin, dass die in dem Filter- oder Adsorptionsmedium zurückgehaltene Substanz durch Lyse und Elution aus dem Filter- oder Adsorptionsmedium in das Analysemodul geleitet wird. Hierbei ist zum einen zu erwarten, dass nur ein verhältnismäßig geringer Anteil der Zielsubstanz aus dem Filter- oder Adsorptionsmedium in das Analysemodul gelangt, zum anderen ist zum Ausspülen des Filters ein gewisses Mindestvolumen an Flüssigkeit erforderlich, so dass die in das Analysemodul gelangende Lösung ein verhältnismäßig großes Volumen bei einer entsprechend geringen Konzentration der Zielsubstanz aufweist.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte automatisierte Online-Detektion einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit zu ermöglichen und ein verbessertes Verfahren bzw. eine verbesserte Vorrichtung zur automatisierten Online-Detektion einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit anzugeben. Insbesondere sollen das Verfahren und die Vorrichtung eine effiziente Aufkonzentrierung der Zielsubstanz und eine verlustarme Weiterleitung der Probeflüssigkeit mit der aufkonzentrierten Zielsubstanz in eine nachfolgende Detektionseinheit ermöglichen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren zum Aufkonzentrieren mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit gemäß Anspruch 1 , durch das Verfahren zur automatisierten online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit mittels eines Online-Analysegeräts gemäß Anspruch 14, durch die Konzentrator-Einheit zur automatisierten Durchführung einer Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit gemäß Anspruch 20 und durch das Online-Analysegerät zur Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit gemäß Anspruch 26. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben. Die Lösung basiert auf der Verwendung sogenannter Superabsorber, mit welchen jede wässrige Probeflüssigkeit bearbeitet werden kann, um die in der Probeflüssigkeit enthaltenen Biomoleküle aufzukonzentrieren.
Superabsorber (Superabsorbent Polymers, SAP) werden Kunststoffe genannt, die in der Lage sind, ein Vielfaches ihres Eigengewichts an polaren Flüssigkeiten aufzusaugen. Dies sind vor allem Wasser bzw. wässrige Lösungen. Bei der Aufnahme der Flüssigkeit quillt der Superabsorber auf und bildet ein Hydrogel. Hydrogele können alle vernetzten Polymere bilden, die polar sind (z. B. Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon, Amylopektin, Gelatine, Cellulose). Meist wird jedoch ein Copolymer aus Acrylsäure (Propensäure, H2C=CH-COOH) oder Natriumacrylat (Natriumsalz der Acrylsäure, H2C=CH-COONa) einerseits und Acrylamid andererseits verwendet, wobei das Verhältnis der beiden Monomere zueinander variieren kann. Zusätzlich wird ein so genannter Kernvernetzer (Core-Cross-Linker, CXL) der Monomerlösung zugesetzt, der die gebildeten langkettigen Polymermoleküle stellenweise untereinander durch chemische Brücken verbindet, auch als Vernetzen bezeichnet. Durch diese Brücken wird das Polymer wasserunlöslich. Dieses sogenannte Basispolymer wird eventuell einer sogenannten Oberflächen-Nachvernetzung, Surface-Cross-Linking (SXL) genannt, unterzogen. Dabei wird eine weitere Chemikalie auf die Oberfläche der Partikel aufgebracht, die durch Erwärmung ein zweites Netzwerk nur auf der äußeren Schicht des Korns knüpft. Diese Hülle stützt das aufgequollene Gel, um auch bei äußerer Belastung (Bewegung, Druck) zusammen zu halten. In Frage kommen als Superabsorber-Materialien neben den hier genannten auch weitere Polyacrylate oder andere auf Acrylsäure oder Acrylat als Monomere basierende Polymere oder Copolymere.
Das Produkt kommt beispielsweise herkömmlich als weißes Granulat mit Partikelgrößen von 100 - bis 1000 pm zum Einsatz. Es findet größtenteils in Babywindeln, Damenbinden, bei der Inkontinenzversorgung, in Verbandmaterial und in geringen Mengen auch in Kabelummantelungen für Tiefseeleitungen Verwendung. Weitere Anwendungsgebiete sind sogenannte Gelbetten, gelbildende Löschmittel in der Brandbekämpfung, als mechanischer Stabilisator für Schnittblumen in einer Vase oder als Zusatz für Pflanzenerde, um dauerhaft Wasser zu speichern. Hierbei kommt jedoch wegen der besseren Umweltverträglichkeit kalilaugeneutralisierte Acrylsäure zum Einsatz. In Form von kugelförmigen Partikeln ist die Verwendung von Superabsorbern unter Bezeichnungen wie „Wasserperlen“, „Aqua Beads“ oder „Water beads“ als Spielzeug bekannt. Hierbei handelt es sich um Superabsorber, welche in Form von Kugeln von variabler Größe (Submillimeter bis Zentimeter) kommerziell angeboten werden.
Der hier beschriebenen Erfindung lag folgende unerwartete Beobachtung zu Grunde. Kommerziell verfügbare sog. Wasserperlen (kommerziell unter anderem unter den Bezeichnungen Aqua Beads, Water Beads, Wasserbeads, oder Gelperlen erhältlich) wurden einem Flüssigkeitsvolumen von 1 Liter zugegeben. Diese Wasserperlen sind aus einem Superabsorber-Material gebildet. Bei der Flüssigkeit handelte es sich um Oberflächenwasser, das einem Löschwasserteich mit Schwebstoffen entnommen worden war. Nach einer Inkubationszeit quollen die Kügelchen zu einem Vielfachen ihres ursprünglichen Volumens auf. Das Volumen des flüssigen Anteils des Gemisches aus der Flüssigkeit und den Wasserperlen reduzierte sich. Überraschenderweise zeigte sich, dass die Schwebstoffe der Flüssigkeit von den aufquellenden Kügelchen nicht aufgenommen wurden. Der flüssige Anteil des Gemisches einschließlich der Schwebstoffe (Volumen 400 ml) wurde in ein neues Gefäß überführt. Diesem flüssigen Anteil wurde eine Probe mit einem Volumen von 50 ml entnommen.
Eine Vergleichsprobe mit einem Volumen von 50 ml wurde direkt aus der Flüssigkeit, d.h. dem erwähnten Oberflächenwasser, entnommen, ohne die Flüssigkeit zuvor nach dem beschriebenen Verfahren einzuengen. Beide Proben wurden bei 5000 x g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Sediment für eine Nukleinsäureextraktion eingesetzt. Die Nukleinsäureextraktion erfolgte mittels eines kommerziellen Kits (innuprep Stool DNA Mini Kit; IST Innuscreen GmbH). Die DNA von beiden Proben wurde dann mittels Real Time PCR auf die Menge an bakterielle Gesamtkeimzahl untersucht.
Hierbei zeigte sich, dass in der unbehandelten Vergleichsprobe weniger Bakterien nachgewiesen wurden als in der mit dem Superabsorber eingeengten Probe. Dies bedeutet, dass die in der Flüssigkeit enthaltenen Bakterien nicht in die Wasserperlen aufgenommen wurde. Sie wurden aufkonzentriert und waren Bestandteil des verbliebenen flüssigen Anteils des Gemisches aus der Flüssigkeit und den Superabsorber-Kugeln. Diese Beobachtungen konnten nachfolgend auch für andere Biomoleküle (Viren oder eukaryotische Zellen) bestätigt werden: Nach Zugabe des Superabsorbers zu einem diese Biomoleküle enthaltenen Flüssigkeitsvolumen wurde das Volumen eingeengt und die Biomoleküle wurden in der verbleibenden Restflüssigkeit aufkonzentriert. Noch überraschender war, dass man mit dem beschriebenen Verfahren auch Proteine sowie freie genomische DNA, die sich in geringen Konzentrationen in einer wässrigen Lösung befinden, aufkonzentrieren kann.
Auf der Basis dieser Beobachtung konnte die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe gelöst werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Aufkonzentrieren mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit umfasst:
- Dosieren und Transportieren eines ersten initialen Volumens der Probeflüssigkeit über eine Flüssigkeitszuleitung in eine erste Konzentratorkammer einer Konzentrator-Einheit; und
- Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit durch Reduzieren des ersten initialen Volumens der Probeflüssigkeit in der Konzentrator-Einheit und damit verbundenem Aufkonzentrieren von in dem ersten Volumen der Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen mittels einer ersten Menge eines Superabsorbers, wobei das Reduzieren und das damit verbundene Aufkonzentrieren durch Inkubieren eines aus dem ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mit der ersten Menge des Superabsorbers gebildeten Gemisches erfolgt. Die nach dem Inkubieren mit dem Superabsorber erhaltene, in ihrem Volumen reduzierte Probeflüssigkeit mit entsprechend erhöhter Konzentration der darin enthaltenen Biomoleküle bzw. der darin enthaltenen mindestens einen biologischen Zielsubstanz wird hier und im Folgenden auch kurz als „aufkonzentrierte Probeflüssigkeit“ bezeichnet.
Indem das initiale Volumen der Probeflüssigkeit nach Inkubation mit dem Superabsorber-Material auf ein beliebig einstellbares Volumen reduziert wird, was mit dem Anstieg der Konzentration der biologischen Zielsubstanz im verbleibenden Volumen der Probeflüssigkeit einhergeht, kann ein, gegenüber dem im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, bei dem Biomoleküle nach Bindung an ein Filtermedium durch Ausspülen des Filtermediums freigesetzt werden, vergleichsweise hoher Anteil der aus dem ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit gewonnenen Biomoleküle in einem geringen Flüssigkeitsvolumen aufkonzentriert werden. Somit bewirkt das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur eine effiziente Aufkonzentrierung der zu bestimmenden Zielsubstanz in der Probeflüssigkeit, sondern ermöglicht es, auch bei einer niedrigen Konzentration der Zielsubstanz in der zu untersuchenden Probeflüssigkeit das für die anschließende Analyse bestimmte, z.B. aus einem Prozess zu entnehmende Volumen vergleichsweise gering zu wählen. Damit ist das Verfahren universell zur Überwachung von Flüssigkeiten in einer Vielzahl verschiedenartiger industrieller Prozesse geeignet, unabhängig davon, ob das in die Prozesseinheit transportierte Volumen der Probeflüssigkeit nach dem Anreichern verworfen und ggfs. entsorgt werden muss, oder ob es zurück in den Prozess gegeben werden kann.
Die Zielsubstanz kann beispielsweise ein Biomolekül sein. Das Biomolekül kann ausgewählt sein aus der Gruppe gebildet aus: eukaryotischen Zellen, Bestandteilen von eukaryotischen Zellen, prokaryotischen Zellen, Bestandteilen prokaryotischer Zellen, subzellulären Vesikeln, Bakteriophagen, Viren oder Virusbestandteilen, Toxinen, Antikörpern, Nukleinsäuren und Proteinen.
Als Probeflüssigkeit kommen beispielsweise jegliche wässrige Lösungen in Frage, z.B. Wasser- und Abwasserproben, Fermentationsflüssigkeiten, Flüssigkeiten aus lebensmitteltechnischen, chemischen, pharmazeutischen oder biochemischen Produktionsprozessen.
Der Superabsorber kann einen Kunststoff umfassen, der Wassermoleküle unter Bildung eines Hydrogels aufnimmt. Der Superabsorber kann beispielsweise eines der oben genannten Materialien sein. Vorteilhaft nimmt der Kunststoff zwar Wasser oder andere polare Lösungsmittel-Moleküle, aber keine Biomoleküle, insbesondere nicht die Zielsubstanz, auf. Dies ist beispielsweise bei den oben genannten Materialien und bei den unter den Bezeichnungen „Wasserperlen“, „Aqua Beads“ oder „Water beads“ kommerziell erhältlichen Superabsorber-Kugeln der Fall. Der Superabsorber kann beispielsweise in Form von Partikeln, z.B. als Pulver, als Granulat oder in Form geometrischer Körper, insbesondere Kugeln, eingesetzt werden. Ein geeigneter Durchmesser der Partikel, insbesondere der Kugeln liegt bei 100 bis 5000 pm. Das Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit kann das Dosieren des ersten initialen Volumens der Probeflüssigkeit zu der in der ersten Konzentratorkammer vorgelegten ersten Menge des Superabsorbers oder das Dosieren der ersten Menge des Superabsorbers zu dem in der ersten Konzentratorkammer vorgelegten ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit umfassen.
Das Inkubieren des aus dem ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mit der ersten Menge des Superabsorbers gebildeten Gemisches kann über eine vorgegebene, insbesondere wählbare, Zeitspanne ausgeführt werden. Generell ist die innerhalb einer Zeitspanne erreichbare Konzentrationserhöhung einer Zielsubstanz in der Probeflüssigkeit abhängig von der Art des Superabsorbers, von der Partikelgröße des Superabsorbers, von der Größe der zugegebenen ersten Menge des Superabsorbers, von der beim Inkubieren herrschenden Temperatur und von der Länge der gewählten Zeitspanne für die Inkubation. Die Zeitspanne, während der die Inkubation ausgeführt wird, kann mittels einer Steuerelektronik überwacht werden. In einer alternativen Ausgestaltung ist es auch möglich, das Volumen des flüssigen Anteils zu überwachen, und das Inkubieren zu beenden, wenn ein gewünschtes, vorgegebenes Zielvolumen erreicht ist.
Die Konzentratorkammer und das darin enthaltene Gemisch können während des Inkubierens mittels einer Temperiervorrichtung der Konzentrator-Einheit temperiert werden. Die Temperiervorrichtung kann eine Heiz- und/oder Kühlvorrichtung sein, die automatisiert mittels einer Steuerelektronik zur Steuerung und/oder Regelung einer Temperatur des in der Konzentratorkammer vorliegenden Gemisches betrieben werden kann.
Das Verfahren kann weiter den folgenden Schritt umfassen: nach dem Inkubieren Entnehmen mindestens eines Teils der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit aus der ersten Konzentratorkammer. Die entnommene Flüssigkeit kann direkt einer Detektionseinheit eines Analysegeräts zugeleitet werden. Alternativ kann, wie im Folgenden beschrieben, die aufkonzentrierte Probeflüssigkeit zunächst einem Sammelgefäß zugeführt werden. Dies erlaubt es, die Zielsubstanz in mehreren, z.B. einem Prozess oder einem Gewässer als Proben entnommenen, initialen Flüssigkeitsvolumina mittels des beschriebenen Verfahrens aufzukonzentrieren und für die weitere Detektion zusammenzuführen. Die zusammengeführten aufkonzentrierten Proben können optional erneut mittels des beschriebenen Verfahrens weiter aufkonzentriert werden. Dieses Vorgehen ist besonders vorteilhaft, wenn die Konzentration der Zielsubstanz in der ursprünglichen, unbehandelten Probeflüssigkeit besonders niedrig ist. Das Vorgehen wird im Folgenden genauer beschrieben.
Die aus der Konzentrator-Kammer entnommene in einer ersten Stufe aufkonzentrierte Probeflüssigkeit kann zunächst in ein Sammelgefäß transportiert werden. Anschließend können Reste der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und die erste Menge des Superabsorbers aus der Konzentratorkammer entfernt werden, z.B. durch Spülen der Konzentratorkammer mit einem Spülfluid, z.B. einer Spülflüssigkeit oder einem Spülgas. Weiter kann das Verfahren folgende Schritte umfassen:
- Dosieren und Transportieren eines zweiten initialen Volumens der Probeflüssigkeit über eine Flüssigkeitszuleitung in die erste Konzentratorkammer der Konzentrator-Einheit; und
- Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit durch Reduzieren des zweiten initialen Volumens der Probeflüssigkeit in der Konzentrator-Einheit und damit verbundenem Aufkonzentrieren von in dem zweiten initialen Volumen der Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen mittels einer zweiten Menge des Superabsorbers, wobei das Reduzieren und das damit verbundene Aufkonzentrieren durch Inkubieren eines aus dem zweiten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mit der zweiten Menge des Superabsorbers gebildeten Gemisches erfolgt, und
- Transportieren mindestens eines Teils der durch Reduzieren des zweiten initialen Volumens der Probeflüssigkeit erhaltenen aufkonzentrierten Probeflüssigkeit aus der ersten Konzentratorkammer in das Sammelgefäß.
Auf diese Weise können mehrere Chargen aufkonzentrierter Probeflüssigkeit erzeugt und im Sammelgefäß zusammengegeben werden. Dies ermöglicht es, eine sehr große Volumenmenge an Probe aufzukonzentrieren.
Mindestens ein Teil der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit aus dem Sammelgefäß kann zur weiteren Aufkonzentrierung der Zielsubstanz mittels einer dritten Menge des Superabsorbers in die erste Konzentratorkammer oder in eine zweite, von der ersten Konzentratorkammer verschiedene, Konzentratorkammer dosiert und transportiert werden. Diese weitere Aufkonzentrierung erfolgt in ganz analoger Weise wie für die erste Aufkonzentrierung beschrieben, nämlich durch Erzeugen eines Gemisches aus der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und der dritten Menge des Superabsorbers und Inkubieren des Gemisches, wodurch sich das Volumen der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit erneut reduziert und die enthaltenen Biomoleküle, einschließlich die Zielsubstanz, weiter aufkonzentriert werden. Die so erhaltene weiter aufkonzentrierte Probeflüssigkeit kann in gleicher weise erneut aufkonzentriert oder zur weiteren Analyse direkt einer Detektionseinheit eines Analysegeräts zugeleitet werden. Auf diese Weise kann die Sensitivität des Verfahrens weiter erhöht werden.
Das Verfahren kann in all seinen voranstehend beschriebenen Varianten vorteilhafterweise vollständig automatisiert durch eine Steuerelektronik durchgeführt werden. Die Konzentrator-Einheit kann zu diesem Zweck Mittel zum Transport von Flüssigkeiten und zum Transport des Superabsorbers innerhalb der Konzentrator-Einheit aufweisen, die z.B. Pumpen und/oder Ventile umfassen können.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur automatisierten online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit mittels eines Online-Analysegeräts. Dieses Verfahren umfasst:
- Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit aus mindestens einem ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mittels des voranstehend beschriebenen Verfahrens zum Aufkonzentrieren mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit, - Transportieren mindestens eines Teils der erzeugten aufkonzentrierten Probeflüssigkeit aus der Konzentrator-Einheit in eine Detektionseinheit des Online-Analysegeräts, und
- Qualitative oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und/oder in der Probeflüssigkeit, d.h. der ursprünglichen Probeflüssigkeit vor Aufkonzentrierung, mittels der Detektionseinheit und einer Steuerelektronik des Online-Analysegeräts.
Die qualitative oder quantitative Bestimmung kann mittels molekulargenetischer Methoden erfolgen. In einer solchen vorteilhaften Ausgestaltung umfasst das Verfahren weiter die folgenden Schritte:
- Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen, insbesondere der mindestens einen biologischen Zielsubstanz, und Erzeugen einer die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Lösung,
- Amplifizieren mindestens einer in der Lösung enthaltenen Ziel-Nukleinsäure, und
- Erfassen eines Messsignals, das eine von dem Fortschritt der Amplifizierung und/oder von einer Anzahl von Kopien der Ziel-Nukleinsäure abhängige Messgröße repräsentiert, wobei die Steuerelektronik des Analysegeräts anhand des erfassten Messsignals die qualitative oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und/oder in der Probeflüssigkeit vor Aufkonzentrierung durchführt. Die zu amplifizierende Ziel-Nukleinsäure kann entweder die zu detektierende Zielsubstanz oder eine Nukleinsäure der zu detektierenden Zielsubstanz sein.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung wird das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen und das Erzeugen der die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Lösung in einer ersten Mikrofluidikeinheit der Detektionseinheit durchgeführt. Die Lösung wird in eine mit der ersten Mikrofluidikeinheit fluidisch verbindbare zweite Mikrofluidikeinheit transportiert, und das Amplifizieren und das Erfassen des Messsignals wird in der zweiten Mikrofluidikeinheit durchgeführt. Die erste und die zweite Mikrofluidikeinheit können in zwei voneinander getrennten Kartuschen oder in einer gemeinsamen Kartusche untergebracht sein.
Das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen und das Erzeugen der die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Lösung kann mindestens folgende Schritte umfassen:
- Versetzen der flüssigen Probe mit einem oder mehreren Lysereagenzien, um Nukleinsäuren der Biomoleküle freizusetzen,
- Binden der freigesetzten Nukleinsäuren an ein Nukleinsäure bindendes Material; und - Waschen der gebundenen Nukleinsäuren mit einer Waschlösung, und
- Ablösen der Nukleinsäuren von dem Nukleinsäure bindenden Material durch Eluieren.
Das hierbei erhaltene Eluat bildet in dieser Ausgestaltung die erwähnte, die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassende Lösung. In einer alternativen Ausgestaltung kann das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen und das Erzeugen der die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Lösung folgende Schritte umfassen:
- thermisches Behandeln der in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomoleküle in einer Pufferlösung, beispielsweise in einer phosphatgepufferten Salzlösung, in Wasser, in einem Tris-Puffer oder in einem Puffer, der eine geringe Konzentration an einem Detergenz enthält. In diesem Fall bildet die Pufferlösung mit den durch die thermische Behandlung freigesetzten Nukleinsäuren die zuvor erwähnte, die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassende Lösung.
Die thermische Freisetzung kann eine Dispergierung der Probe in der gepufferten Lösung und eine Inkubation umfassen. Diese Verfahrensvariante eignet sich beispielsweise für Anwendungen, in denen die zu bestimmende Zielsubstanz eine Nukleinsäure ist, die bereits frei in der zu analysierenden Flüssigkeit vorliegt. Bei dieser alternativen Verfahrensausgestaltung kann also eine klassische Lyse unterbleiben. Es ist auch möglich, das Verfahren anzuwenden, wenn die Zielsubstanz als Biomolekül ein Bakterium oder ein Virus ist. In diesem Fall können die in der Probe enthaltenene Biomoleküle thermisch/chemisch zerstört und die enthaltene Nukleinsäure freigesetzt werden.
Die, beispielsweise in der zweiten Mikrofluidikeinheit durchgeführte, Amplifikation kann beispielsweise mittels herkömmlicher PCR-basierter Verfahren durchgeführt werden. Die qualitative oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz kann, in ebenfalls herkömmlicher Weise, durchgeführt werden, indem mittels eines Sensors zu einem bestimmten Zeitpunkt oder zu mehreren Zeitpunkten jeweils mindestens ein Messwert einer Messgröße erfasst wird, die mit der zum jeweiligen Zeitpunkt vorliegenden Anzahl der durch die Amplifikation erzeugten Kopien einer Zielnukleinsäure korreliert. Aus dem erhaltenen Messwert oder Messwertverlauf als Funktion der zeit lässt sich das Vorliegen der Zielnukleinsäure und damit der biologischen Zielsubstanz in der Probeflüssigkeit qualitativ detektieren oder ein quantitativer Wert, z.B. eine Konzentration, der biologischen Zielsubstanz in der ursprünglichen Probeflüssigkeit oder in der Probeflüssigkeit nach Aufkonzentrieren mittels des weiter oben beschriebenen Verfahrens ermitteln und von der Steuerelektronik als Messergebnis ausgeben.
Alle Schritte des hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens zur Online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit in allen angegebenen Ausgestaltungen können mittels der Steuerelektronik des Online-Analysegeräts automatisiert durchgeführt werden. Hierzu kann sie beispielsweise einen Flüssigkeitstransport (Probeflüssigkeit und/oder Reagenzien) oder Feststofftransport (Superabsorber-Material) durch Betätigung steuerbarer Ventile und/oder Pumpen bewirken und die Inkubationsdauer und -Temperatur beim Aufkonzentrieren und/oder bei der Freisetzung von Nukleinsäuren mittels eines vorgegebenen Ablaufprogramms steuern und/oder regeln.
Die Erfindung umfasst auch eine Konzentrator-Einheit zur automatisierten Durchführung einer Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit, insbesondere nach dem weiter oben beschriebenen Verfahren, umfassend: - eine erste Konzentratorkammer;
- mindestens eine in die erste Konzentratorkammer mündende Flüssigkeitszuleitung; und
- mindestens eine in die erste Konzentratorkammer mündende Flüssigkeitsableitung, wobei die Konzentrator-Einheit dazu eingerichtet ist, eine erste Menge eines Superabsorbers zu einem über die Flüssigkeitszuleitung in die erste Konzentratorkammer eingeleiteten initialen Flüssigkeitsvolumen der Probeflüssigkeit zuzugeben, oder dazu eingerichtet ist, das initiale Flüssigkeitsvolumen zu der ersten Menge des Superabsorbers zuzugeben.
In einer möglichen Ausgestaltung kann die erste Menge des Superabsorbers in der ersten Konzentratorkammer vorgelegt sein. Die Konzentratorkammer kann in dieser Ausgestaltung als austauschbare Kartusche ausgestaltet sein. Bei Verwendung dieser Ausgestaltung kann für die Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in jeder neuen Charge der Probeflüssigkeit die austauschbare Kartusche mit dem Superabsorber gegen eine neue Kartusche ausgewechselt werden.
In einer alternativen Ausgestaltung kann die Konzentrator-Einheit mindestens ein Reservoir aufweisen oder mit einem Reservoir verbunden sein, in dem Superabsorber, insbesondere in Form von Partikeln, enthalten ist. Vorzugsweise wird als Superabsorber eines der weiter oben genannte Materialien, insbesondere in Kugelform, eingesetzt. Als sehr vorteilhaft haben sich kommerziell erhältliche Superabsorber-Kugeln mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 1 mm erwiesen, die auch kommerziell unter der Bezeichnung „Wasser-Beads“, „Aqua Beads“, „Water Beads“ oder „Gelkügelchen“ erhältlich sind. Superabsorber-Kugeln in dieser Größenordnung lassen sich in der Konzentratorkammer sehr gut dispergieren.
Das Reservoir kann beispielsweise über eine mit einem, insbesondere mittels einer Steuerelektronik steuerbaren, Ventil verschließbare Superabsorber-Zuleitung mit der ersten Konzentratorkammer verbunden sein, derart, dass bei geöffnetem Ventil mindestens ein Teil des in dem Reservoir enthaltenen Superabsorbers als erste Menge des Superabsorbers in die erste Konzentratorkammer gelangt. Der T ransport von Superabsorber kann mittels der Schwerkraft bewirkt werden. Es ist aber auch möglich, dass die Konzentrator-Einheit Mittel zum Transport des beispielweise in Partikeln vorliegenden Superabsorbers aufweist, z.B. eine Pumpe und/oder Mittel zum Erzeugen eines Gasstroms, der die Superabsorber-Partikel transportiert. Zum Dosieren und zum Transport des Superabsorbers kann eine zum automatischen Betrieb der Konzentrator-Einheit ausgestaltete Steuerelektronik dienen, die dazu eingerichtet ist, die erwähnten Mittel und/oder das erwähnte Ventil zu betätigen, um die erste Menge Superabsorber abzumessen und in die Konzentratorkammer zu transportieren. Diese Steuerelektronik kann entsprechend im Zusammenspiel mit Pumpen und/oder Ventilen dazu eingerichtet sein, das initiale Volumen der Probenflüssigkeit in die Konzentratorkammer zu dosieren.
Die Konzentrator-Einrichtung kann Mittel zum Bewegen, insbesondere Rühren, der in der
Reaktionskammer enthaltenen Flüssigkeit aufweisen. Die Mittel können z.B. einen Rührer, eine Zuleitung für ein Inertgas in die Reaktionskammer und eine Ableitung für das Inertgas umfassen, die so angeordnet sind, dass das Inertgas durch die in der Reaktionskammer enthaltene Flüssigkeit hindurchströmt, oder einen Antrieb zum Bewegen der Reaktionskammer aufweisen.
Die Konzentrator-Einheit kann weiter eine Temperiervorrichtung aufweisen, die dazu ausgestaltet ist, die erste Konzentratorkammer zu temperieren. Die Temperiervorrichtung kann beispielsweise Heiz- und/oder Kühlelemente aufweisen, die mittels der Steuerelektronik betreibbar sind, um eine Temperatur einer in der Konzentratorkammer aufgenommenen Flüssigkeit zu steuern und/oder zu regeln.
Die Flüssigkeitsableitung zur Ableitung mindestens eines Teils des in der ersten Konzentratorkammer vorliegenden Flüssigkeitsvolumens der Probeflüssigkeit kann fluidisch mit einem Sammelgefäß verbindbar sein.
In einerweiteren Ausgestaltung kann das Sammelgefäß eine Sammelgefäßableitung aufweisen, die fluidisch mit der ersten Konzentratorkammer verbindbar ist. Auf diese Weise kann im Sammelgefäß vorliegende, bereits in einer ersten Stufe aufkonzentrierte Probeflüssigkeit erneut in die erste Konzentratorkammer geleitet werden, um in einer zweiten Stufe weiter aufkonzentriert zu werden, indem erneut Superabsorber zur aufkonzentrierten Probeflüssigkeit in der ersten Konzentratorkammer geleitet und das Gemisch inkubiert wird.
In einer alternativen Ausgestaltung kann die Konzentrator-Einheit eine zusätzliche zweite Konzentratorkammer umfassen, wobei die Flüssigkeitsableitung der ersten Konzentratorkammer diese, insbesondere über ein Sammelgefäß, mit der zweiten Konzentratorkammer verbindet; und eine in die zweite Konzentratorkammer mündende weitere Flüssigkeitsableitung, wobei die Konzentrator-Einheit dazu eingerichtet ist, eine zweite Menge des Superabsorbers zu einem in die zweite Konzentratorkammer eingeleiteten Volumen der in der ersten Konzentratorkammer aufkonzentrierten Probenflüssigkeit zuzugeben oder das Flüssigkeitsvolumen zu der zweiten Menge des Superabsorbers zuzugeben.
Die Erfindung umfasst auch ein Online-Analysegerät zur Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit, insbesondere nach dem weiter oben beschriebenen Verfahren. Das Analysegerät umfasst: eine Steuerelektronik; eine Konzentrator-Einheit nach einer der voranstehend beschriebenen Ausgestaltungen, wobei die Konzentrator-Einheit einen Flüssigkeitsausgang für in der Konzentrator-Einheit aus der Probeflüssigkeit erzeugte aufkonzentrierte Probeflüssigkeit aufweist; und eine mit dem Flüssigkeitsausgang der Konzentrator-Einheit fluidisch verbindbare Detektionseinheit; und mindestens eine von der Steuerelektronik steuerbare Transporteinrichtung, z.B. eine Pumpe, die dazu eingerichtet ist, aufkonzentrierte Probeflüssigkeit vom Flüssigkeitsausgang der Konzentrator-Einheit in die Detektionseinheit zu transportieren, wobei die Steuerelektronik dazu eingerichtet ist, mittels der Detektionseinheit die Zielsubstanz in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und/oder in der Probeflüssigkeit vor Aufkonzentrierung qualitativ oder quantitativ basierend auf einem molekulargenetischen Verfahren zu bestimmen.
Das Online-Analysegerät kann weiter eine Probenpumpe aufweisen, wobei die Steuerelektronik dazu eingerichtet ist, die Probenpumpe zum Transport eines vorgegebenen Volumens der Probenflüssigkeit in die Konzentrator-Einheit zu steuern. Die Probenzuleitung kann fluidisch mit einer Probenvorlage oder unmittelbar mit einem Gewässer oder einer Leitung in einer Prozessanlage, einem Fermenter oder einem sonstigen Prozessbehälter verbindbar sein.
Die Detektionseinheit kann die folgenden Komponenten aufweisen: eine mit einem Flüssigkeitsausgang für aufkonzentrierte Probenflüssigkeit der Konzentrator- Einheit fluidisch verbindbare erste Mikrofluidikeinheit, die dazu eingerichtet ist, aus in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen, insbesondere der mindestens einen biologischen Zielsubstanz, Nukleinsäuren freizusetzen und/oder zu isolieren, eine mit der ersten Mikrofluidikeinheit verbundene zweite Mikrofluidikeinheit, die dazu eingerichtet ist, ein die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassendes Eluat aufzunehmen und eine Ziel-Nukleinsäure zu amplifizieren; und einen, insbesondere optischen, Sensor, der dazu eingerichtet ist, ein von dem Fortschritt einer in der zweiten Mikrofluidikeinheit durchgeführten Amplifizierung und/oder von einer Anzahl von Kopien der Ziel-Nukleinsäure in der zweiten Mikrofluidikeinheit abhängiges Messsignal zu erzeugen und an die Steuerelektronik auszugeben; und wobei die Steuerelektronik dazu eingerichtet ist, anhand des von dem Sensor ausgegebenen Messsignals die biologische Zielsubstanz in der Flüssigkeit qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen.
Der Flüssigkeitsausgang der Konzentrator-Einheit kann mit der zuvor erwähnten ersten Konzentratorkammer und/oder mit einer ggfs. vorhandenen zweiten Konzentratorkammer und/oder mit einem ebenfalls optional vorhandenen Sammelgefäß fluidisch verbindbar sein. In verschiedenen Ausgestaltungs- oder Betriebsalternativen des Online-Analysegerät kann somit aufkonzentrierte Probeflüssigkeit direkt aus der ersten oder der optional vorhandenen zweiten Konzentratorkammer oder über das optional vorhandene Sammelgefäß in die Detektionseinheit transportiert werden.
Die erste und die zweite Mikrofluidikeinheit können zusammen in einer, insbesondere austauschbaren, Kartusche angeordnet sein. Alternativ kann die erste Mikrofluidikeinheit in einer ersten Kartusche angeordnet und die zweite Mikrofluidikeinheit in einer zweiten, von der ersten Kartusche verschiedenen Kartusche angeordnet sein, wobei die erste und die zweite Kartusche fluidisch miteinander verbindbar sind, um Flüssigkeit aus der ersten Kartusche in die zweite zu transportieren. Die erste und die zweite Kartusche können austauschbar ausgestaltet sein. Die erste Mikrofluidikeinheit kann dazu eingerichtet sein, die aufkonzentrierte Probe mit den enthaltenen Biomolekülen aufzunehmen und mit einem oder mehreren Lysereagenzien zu versetzen, um Nukleinsäure der in der Probe enthaltenen Biomoleküle freizusetzen, anschließend die freigesetzten Nukleinsäuren ggf. unter Zugabe eines die Bindung der Nukleinsäure an ein Nukleinsäure-bindendes Material verstärkenden/vermittelnden Komponente zu binden und die an diesem Material gebundenen Nukleinsäuren ein- oder mehrmals mit einer Waschlösung zu waschen. Die Steuerelektronik kann dazu eingerichtet sein, einen Transport der Partikel und optional der Reagenzien durch die erste Mikrofluidikeinheit zu steuern.
Die erste Mikrofluidikeinheit kann weiter dazu eingerichtet sein, die Nukleinsäuren vom Nukleinsäurebindenden Material durch Eluieren abzulösen und das Eluat über eine die erste Mikrofluidikeinheit mit der zweiten Mikrofluidikeinheit verbindende Fluidleitung in die zweite Mikrofluidikeinheit zu transportieren. Die Steuerelektronik kann dazu eingerichtet sein, das Eluieren und den Transport des Eluats zu steuern.
In einer alternativen Ausgestaltung kann die erste Mikrofluidikeinheit dazu eingerichtet sein, die aufkonzentrierte Probe mit den enthaltenen Biomolekülen aufzunehmen und die Biomoleküle in einer Pufferlösung, beispielsweise in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS-Puffer), Wasser oder einem Tris-Puffer, oder optional einem Puffer, der ein Detergenz enthält, thermisch/chemisch freizusetzen, wobei die Steuerelektronik dazu eingerichtet ist, die thermische Freisetzung der Biomoleküle zu steuern und die Pufferlösung mit den darin gelösten Biomolekülen bzw. Nukleinsäuren in die zweite Mikrofluidikeinheit zur nachfolgenden Amplifikation zu transportieren. Diese Ausgestaltung ist beispielsweise zur Verwendung in einer Anwendung geeignet, bei der die zu detektierende biologische Zielsubstanz eine in der Flüssigkeit frei vorliegende Nukleinsäure ist.
Die erste Mikrofluidikeinheit kann die zur Freisetzung und/oder Isolierung der Nukleinsäure benötigten Reaktionskomponenten in fester Form, beispielsweise in Form von durch Lyophilisierung gewonnenen Pellets, oder in durch Mikroventile verschlossenen Reagenzienkammern oder in durch Folien verschlossenen Reagenzienpacks enthalten, die durch Kraft- oder Wärmeeinwirkung automatisiert, insbesondere mittels der Steuerelektronik, geöffnet werden können.
In der zweiten Mikrofluidikeinheit können Reagenzien für die Amplifikation in entsprechender Weise vorgehalten sein. Sie kann weiter ein oder mehrere Detektionskammern enthalten, in denen die Amplifikation einer Ziel-Nukleinsäure oder auch parallel mehrerer verschiedener Ziel-Nukleinsäuren durchgeführt werden können. Die zweite Mikrofluidikeinheit kann eine Temperiereinreichtung für die Detektionskammern umfassen. Die Temperiereinrichtung kann zum Beispiel durch die Steuerelektronik steuerbare thermoelektrische Elemente aufweisen.
Die hier und voranstehend im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Konzentrator-einheit beschriebene Steuerelektronik kann eine elektronische Datenverarbeitungseinrichtung mit mindestens einem Prozessor und einem Speicher aufweisen, in dem ein oder mehrere Betriebsprogramme hinterlegt sind, die mittels des Prozessors ausführbar sind, um das Analysegerät automatisch zu steuern und um aus den Messsignalen des Sensors qualitative oder quantitative Analyseergebnisse zu ermitteln. Die Betriebsprogramme können so ausgestaltet sein, dass die Steuerelektronik das Analysegerät zur Durchführung des weiter oben beschriebenen Verfahrens steuert. Die Steuerelektronik kann außerdem ein Benutzerinterface aufweisen, z.B. einen Touch-Screen oder ein anderes Anzeige-Display in Kombination mit einer Eingabetastatur. Die Steuerelektronik kann dazu eingerichtet sein, drahtlos per Funk oder über eine Datenleitung mit einer anderen Datenverarbeitungseinrichtung, z.B. einem Computer, einer Prozesssteuerung, einem, insbesondere tragbaren, Anzeige- oder Bediengerät zur Kommunikation verbunden zu werden.
Die automatische Steuerung der in der Konzentrator-Einheit durchgeführten Aufkonzentrierung kann mittels derselben Steuerelektronik durchgeführt werden, die auch der Steuerung der übrigen Komponenten des Analysegeräts dient. Die Konzentrator-Einheit kann alternativ auch eine eigene Steuerelektronik aufweisen, die dazu eingerichtet ist, die Aufkonzentrierung der Probeflüssigkeit in der beschriebenen Weise automatisiert auszuführen. Die Steuerelektronik der Konzentrator-Einheit ist in dieser Ausgestaltung vorteilhafterweise mit der Steuerelektronik des Analysegeräts, die die übrigen Komponenten des Analysegeräts steuert, nämlich insbesondere die Detektionseinheit, zur Kommunikation verbunden.
Das Analysegerät kann somit Online-Bestimmungen biologischer Zielsubstanzen in einer Flüssigkeit durchführen, ohne dass es einer manuellen Probennahme- oder Vorbereitung oder den Transport von Proben in ein Labor erfordert. Das Analysegerät kann insbesondere vollständig automatisch Probennahme- und Detektions-Zyklen ausführen, die z.B. von der Steuerelektronik ereignisgesteuert oder in vorgegebenen Zeitabständen ausgeführt werden können.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispiele beschrieben. Dabei bezeichnen gleiche Bezugszeichen gleiche Komponenten der in den Figuren gezeigten Bauteile. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eine Online-Analysegeräts zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung einer biologischen Zielsubstanz in einer Flüssigkeit;
Fig. 2 ein erstes Ausführungsbeispiel einer Konzentrator-Einheit des in Fig. 1 dargestellten Online-Analysegeräts nach einem ersten Ausführungsbeispiel; und
Fig. 3 ein zweites Ausführungsbeispiel einer Konzentrator-Einheit für ein Online-Analysegerät.
In Fig. 1 ist schematisch ein Ausführungsbeispiel für ein Online-Analysegerät 1 zur Detektion einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit dargestellt. Das Analysegerät 1 weist im vorliegenden Beispiel ein Gehäuse 2 auf, in dem alle Komponenten des Geräts untergebracht sind. Diese Komponenten umfassen im Einzelnen eine Konzentrator-Einheit 3, eine Detektionseinheit 4 und eine Steuerelektronik 5. Die Konzentrator-Einheit 3 ermöglicht die Detektion auch in sehr geringer Konzentration in einer Probeflüssigkeit enthaltener Biomoleküle, da sie dazu eingerichtet ist, biologische Zielmoleküle in einem Volumen einer zu analysierenden Probeflüssigkeit aufzukonzentrieren und die aufkonzentrierte Probeflüssigkeit zur Detektion und ggfs. vorbereitenden Schritten wie Extraktion und/oder Isolierung von Nukleinsäuren an die Detektionseinheit 4 weiterzugeben.
Die Konzentrator-Einheit 3 ist fluidisch über eine Probenzuleitung 6 mit einer Probenvorlage 7 oder mit einem Prozessbehälter, z.B. einer Rohrleitung oder einem Reaktor oder einem Fermenter, verbunden, in der bzw. dem die zu analysierende Flüssigkeit enthalten ist. Zum Transport und zur Dosierung der Flüssigkeit aus der Probenvorlage 7 in eine in der Konzentrator-Einheit 3 enthaltenen ersten Konzentratorkammer 8 dient eine Pumpe 9, die von der Steuerelektronik 5 gemäß einem in der Steuerelektronik 5 hinterlegten und von dieser ausgeführten Betriebsprogramm steuerbar ist. Die erste Konzentratorkammer 8 ist auch fluidisch mit Reservoiren 10, 11 verbindbar. In den Reservoiren 10, 11 sind Substanzen enthalten, die der Anreicherung von in der Flüssigkeit enthaltenen Biomolekülen dienen. Jedes Reservoir 10, 11 ist im vorliegenden Beispiel über eine Fluidleitung fluidisch mit der Konzentratorkammer in der Konzentrator-Einheit 3 verbunden. Zum Transport der in den Reservoiren enthaltenen Substanzen durch die Fluidleitungen dient jeweils eine Pumpe 12, 13. Es ist auch möglich, dass die Reservoire 10, 11 direkt in die Konzentrator-Einheit 3 integriert sind. Der Transport der Substanzen kann selbstverständlich mit anderen dem Fachmann bekannten Mitteln bewerkstelligt werden, z.B. pneumatisch oder durch Ausnutzung der Schwerkraft bzw. eines, beispielsweise hydrostatischen, Drucks.
Die Konzentrator-Einheit 3 kann optional eine Temperiereinheit aufweisen (nicht in Fig. 1 dargestellt), die der Einstellung einer bestimmten Temperatur in der Konzentratorkammer 8 dient. Die Temperiereinheit kann eine Widerstandsheizung, eine Kühlung und/oder thermoelektrische Elemente zum wahlweisen Heizen oder Kühlen umfassen. Sie kann mit der Steuerelektronik 5 verbunden sein, wobei die Steuerelektronik 5 dazu eingerichtet ist, die Temperatur in der Konzentratorkammer 8 zu steuern oder zu regeln.
Die Konzentrator-Einheit 3 kann außerdem eine Vorrichtung 14 zum Bewegen oder Rühren einer in der Reaktionskammer 8 enthaltenen Flüssigkeit bzw. Flüssigkeitsmischung aufweisen. Die Vorrichtung 14 umfasst im vorliegenden Beispiel einen Antrieb zum Bewegen, z.B. Rütteln, der Reaktionskammer 8. Die Vorrichtung 14, insbesondere der Antrieb, kann von der Steuerelektronik 5 gesteuert werden.
Die Konzentratorkammer 8 ist fluidisch über die Fluidleitung 15 wahlweise mittels eines von der Steuereinheit 5 betätigbaren Ventils 16 mit der Detektionseinheit 4 oder mit einem Flüssigkeitsauslass 17 verbindbar. Die Detektionseinheit 4 weist im vorliegenden Beispiel eine Analysekartusche auf, in der zwei miteinander über die Fluidleitung 18 fluidisch verbundene Mikrofluidikeinheiten, nämlich eine erste Mikrofluidikeinheit 19 und eine zweite Mikrofluidikeinheit 20, integriert sind. In einer anderen Ausgestaltung können die Mikrofluidikeinheiten auch in getrennten Kartuschen untergebracht sein. Die Analysekartusche ist im vorliegenden Beispiel auswechselbar.
Die erste Mikrofluidikeinheit 19 ist dazu eingerichtet, eine die aufkonzentrierten Biomoleküle aus der Reaktionskammer enthaltende Probe aufzunehmen und für eine nachfolgende Amplifikation und Detektion in der zweiten Mikrofluidikeinheit 20 vorzubereiten. Dies kann mittels an sich bekannter Extraktions- und Isolationsverfahren erfolgen. Hierzu umfasst die erste Mikrofluidikeinheit 19 Reagenzien und optional eine Temperiereinheit zur Inkubation von in der Mikrofluidikeinheit 19 hergestellten Reaktionsmischungen. Zur Steuerung eines Transports der Probe durch die erste Mikrofluidikeinheit 19 und zur Durchführung der Extraktion und/oder Isolation von Nukleinsäuren umfasst die Detektionseinheit 4 geeignete, dem Fachmann bekannte Mittel, die von der Steuerelektronik 5 steuerbar sind. Die zweite Mikrofluidikeinheit 20 umfasst Mittel zur Amplifikation, d.h. Reagenzien und Temperierelemente, z.B. thermoelektrische Elemente, sowie Mittel zum Transport und zur Aliquotierung von Fluiden innerhalb der zweiten Mikrofluidikeinheit 20. Zur Detektion eines Fortschritts der Amplifikation in an sich bekannter Weise, z.B. mittels eines Real Time PCR-basierten Verfahrens, weist die Detektionseinheit einen Sensor 21 auf, der beispielsweise Fluoreszenz- Messungen in der zweiten Mikrofluidikeinheit 20 durchführen kann und Messsignale an die Steuerelektronik 5 ausgeben kann. Die Steuerelektronik 5 ist dazu eingerichtet, anhand der Messignale ein qualitatives oder quantitatives Analyseergebnis zu ermitteln.
Die Steuerelektronik 5 kann eine zentrale Recheneinheit, z.B. eine CPU mit Prozessor und Speicher und darin gespeicherten Betriebsprogrammen sein. Sie kann auch auf mehrere Recheneinheiten innerhalb des Analysegeräts aufgeteilt sein, z.B. können die Konzentrator-Einheit 3 und die Detektionseinheit 4 jeweils eine eigene Vorort-Elektronik aufweisen, die mit einer übergeordneten Elektronik zur Kommunikation verbunden sind, wobei die übergeordnete Elektronik und die Vorort- Elektroniken zusammen die Steuerelektronik 5 bilden.
In Fig. 2 ist schematisch ein erstes Ausführungsbeispiel einer Konzentrator-Einheit 3 des in Fig. 1 dargestellten Online-Analysegeräts 1 im Detail dargestellt. Der in Fig. 2 dargestellte Aufbau der Konzentrator-Einheit 3 ist lediglich ein mögliches Ausführungsbeispiel. Der Fachmann kann eine Vielzahl von Varianten auffinden, ohne vom Erfindungsgedanken abzuweichen.
Die Konzentrator-Einheit 3 weist eine Konzentratorkammer 8 mit verschiedenen Einlässen und Auslässen auf. Die Zuleitung 23 ist mit einem als Reservoir 10 dienenden Vorratsbehälter verbunden, der einen Superabsorber 24, z.B in Form von Kugeln aus dem Superabsorber-Material, enthält. Über die Zuleitung 23 erfolgt die Zugabe des Superabsorbers 24 in die Konzentratorkammer 8. Eine erste Öffnung 25 dient der Zuleitung der Probeflüssigkeit. Über sie erfolgt die Eingabe eines bestimmten initialen Volumens der zu Probeflüssigkeit in die Konzentratorkammer 8. Eine zweite Öffnung 26 ist mit der Fluidleitung verbunden, die die Reaktionskammer (1) mit einem Probenauslass sowie der Detektionseinheit verbindet. Die zweite Öffnung 26 kann einen Durchmesser aufweisen, der geringer ist als der Durchmesser der Superabsorber-Kugeln, so dass lediglich der flüssige Anteil des Gemisches aus Probeflüssigkeit und Adsorber aus der Konzentratorkammer 8 über die zweite Öffnung 26 in Richtung der Detektionseinheit 4 ableitbar ist. Optional kann die zweite Öffnung 26 auch einen Größenselektor, z.B. ein Gitter oder einen Filter aufweisen, der die Superabsorber-Kugeln in der Konzentratorkammer 8 zurückhält.
Der in der Konzentratorkammer 8 enthaltene Superabsorber und Reste der Probeflüssigkeit können durch eine als Ableitung dienende dritte Öffnung 27 aus der Konzentratorkammer 8 entfernt werden, die im vorliegenden Beispiel gegenüber der Öffnung 25, über die Probeflüssigkeit in die Konzentratorkammer 8 einleitbar ist. Zum vollständigen Entfernen des Superabsorbers 24 und der Reste der Probeflüssigkeit kann eine Spülflüssigkeit oder ein Spülgas durch die Konzentratorkammer 8 geleitet werden. Im vorliegenden Beispiel kann die Spülflüssigkeit entweder die Probenflüssigkeit sein, die aus der Probenvorlage 7 durch die Konzentratorkammer 8 geleitet wird. Alternativ kann die Spülflüssigkeit eine in dem Reservoir 11 bevorratete Flüssigkeit sein. In letzterem Fall ist das Reservoir 11 fluidisch mit der ersten Öffnung 25 verbunden. Optional sind in den jeweiligen Zuleitungen Ventile angeordnet, die von der Steuerelektronik 5 betätigbar sind.
Die Steuerelektronik 5 kann ein Betriebsprogramm umfassen, das sie zur Durchführung des folgenden Verfahrens ausführen kann:
1) Einleiten eines ersten initialen Probeflüssigkeitsvolumens aus der Probevorlage 7 in die Konzentratorkammer 8,
2) Zugeben einer ersten Menge des Superabsorbers 24 aus dem Reservoir 10 in die Konzentratorkammer 8 zu dem ersten initialen Probeflüssigkeitsvolumen,
3) Inkubieren des Gemisches aus dem Superabsorber 24 und der Probeflüssigkeit während einer von der Steuerelektronik 5 gemessenen Zeitspanne, dabei reduziert sich das Volumen des flüssigen Anteils des Gemisches unter Aufkonzentrierung von Biomolekülen, insbesondere einer zu bestimmenden biologischen Zielsubstanz in dem flüssigen Anteil,
4) Nach Ablauf der Zeitspanne für die Inkubation Ableiten des flüssigen Anteils.
Wie weiter oben bereits beschrieben, nimmt der Superabsorber polare Lösungsmittel, im vorliegenden Ausführungsbeispiel z.B. Wasser aus der Probeflüssigkeit unter Bildung eines Gels auf. Biomoleküle, insbesondere die zu bestimmende biologische Zielsubstanz, werden dagegen vom Superabsorber nicht aufgenommen. Während der Inkubation verringert sich somit das Volumen des flüssigen Anteils des Gemisches aus Superabsorber und Probeflüssigkeit, dabei wird die Zielsubstanz in der Flüssigkeit aufkonzentriert. Die Inkubationszeit kann so gewählt werden, dass sichergestellt ist, dass die nach dem Inkubieren vorliegende Konzentration der Zielsubstanz in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit über einem Schwellenwert, z.B über einer durch die Detektionseinheit vorgegebenen Nachweisgrenze, liegt. Die Zeitdauer bis zur gewünschten Volumenreduktion bzw. zur gewünschten Aufkonzentrierung hängt von den folgenden Faktoren ab: Art des Superabsorbers, Partikelgröße der Superabsorberpartikel, zugesetzte Menge des Superabsorbers, Temperatur während des Inkubierens. Eine für eine bestimmte Art von Probeflüssigkeit geeignete Menge von Superabsorber und Inkubationszeit kann mittels Vorversuchen ermittelt und in der Steuerelektronik hinterlegt werden.
Die Steuereinheit 5 kann dazu ausgestaltet sein, mittels der zuvor erwähnten Temperiereinrichtung die Temperatur der in der Konzentratorkammer 8 enthaltenen Flüssigkeit bzw. des Gemischs aus Probenflüssigkeit und Superabsorber auf einen konstanten Wert einzustellen oder zu regeln. All diese Schritte können automatisiert mittels der Steuereinheit 5 durchgeführt werden. Der flüssige Anteil ist eine aufkonzentrierte Probeflüssigkeit, d.h. Probeflüssigkeit, die aufgrund der Volumenreduktion durch Aufnahme von Wasser durch den Superabsorber die biologische Zielsubstanz in einer erhöhten Konzentration enthält. Die aufkonzentrierte Probeflüssigkeit kann in einer möglichen Ausgestaltung gemäß dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel direkt in die Detektionseinheit 4 transportiert werden. Mit dem hier beschriebenen Verfahren und der hier beschriebenen Konzentrator-Einheit 3 zur Durchführung dieses Verfahrens wird es möglich, eine großvolumige Wasserprobe auf ein sehr viel kleineres Probenvolumen zu reduzieren und korrespondierend dazu eine große Konzentrationssteigerung an Biomolekülen zu erreichen. Dies erleichtert und/oder beschleunigt eine nachfolgende Detektion mit molekulargenetischen Verfahren. Ist die Konzentration der Biomoleküle in der Probeflüssigkeit ursprünglich sehr gering, kann das hier beschriebene Verfahren sogar eine molekulargenetische Detektion der Zielsubstanz überhaupt erst ermöglichen.
Ein weiterer Vorteil ergibt sich daraus, dass es mit dem erfindungsgemäßen Ansatz möglich ist, völlig unselektiv sowohl Bakterien, Viren, als auch freie Nukleinsäuren aufzukonzentrieren. Entsprechend ist es auch in sehr einfacher Weise möglich, mit dem Verfahren mehrere verschiedene biologische Zielsubstanzen zunächst aufzukonzentrieren, zu extrahieren und nachfolgend mittels eines PCR- basierten Verfahrens zu bestimmen.
Die Öffnung 26 der Konzentrator-Einheit 3 ist fluidisch mit der Fluidleitung 15 des Analysegeräts 1 verbunden, die über das Ventil 16 einerseits mit der Detektionseinheit 4 und andererseits mit dem Flüssigkeitsauslass 17 verbindbar ist. Die Detektion der Zielsubstanz wird im folgenden näher beschrieben: Über die Fluidleitung 15 wird mittels der Steuerelektronik 5 die aufkonzentrierte Probeflüssigkeit durch die Fluidikleitung 15 in die erste Mikrofluidikeinheit 19 transportiert. Hierzu kann eine weitere Pumpe dienen, die von der Steuerelektronik 5 gesteuert wird. Auch das Ventil 16 wird durch die Steuerelektronik 5 betätigt. In der ersten Mikrofluidikeinheit 19 erfolgt eine automatisierte Nukleinsäureextraktion und/oder -isolierung, in der der ersten Mikrofluidikeinheit 19 nachgeschalteten zweiten Mikrofluidikeinheit 20 erfolgt eine automatisierte Amplifizierung und Detektion mittels PCR bzw. Real Time PCR. Für das vorliegend beschriebene Verfahren geeignete Mikrofluidikeinheiten zur automatisierten Nukleinsäureextraktion, Amplifizierung und Detektion sind im Stand der Technik grundsätzlich bekannt. Vorteilhaft ist für die vorliegende Anmeldung eine Zentrifugalplattform, wie sie beispielsweise in WO 2013/045631 A1 und EP 2 621 632 A1 beschrieben ist, es ist aber auch die Verwendung anderer Mikrofluidik-Plattformen oder Lab-on-Chip-Systeme möglich, die einen Flüssigkeits- und Reagenzientransport mittels Kapillarkräften, Pumpen oder Pneumatik statt mit Zentrifugalkraft vorsehen.
Die Extraktion und/oder Isolierung der Nukleinsäuren in der ersten Mikrofluidikeinheit 19 erfolgt mittels bekannter Reagenzien und Verfahren, wie es bereits einleitend beschrieben wurde. Wenn es sich bei der biologischen Zielsubstanz nicht um bereits in der aus der Probenvorlage entnommenen Flüssigkeit frei vorliegende Nukleinsäuren handelt, werden die in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomoleküle lysiert. Die freien Nukleinsäuren werden an ein Nukleinsäuren bindendes Material, z.B. in Partikelform, gebunden. Das Nukleinsäuren bindende Material mit den daran gebundenen Nukleinsäuren wird nachfolgend in bekannter Weise gewaschen und die Nukleinsäuren final von dem Material gelöst. Das die gelösten Nukleinsäuren enthaltende Eluat wird, wiederum gesteuert durch die Steuerelektronik 5, in die zweite Mikrofluidikeinheit 20 transportiert.
In der zweiten Mikrofluidikeinheit 20 werden bestimmte Volumina des Eluats in eine oder mehrere Detektionskammern transportiert und Amplifizierungsreagenzien zugesetzt. In den Detektionskammern erfolgt dann eine Amplifizierung, deren Fortschritt mittels Fluoreszenzmessungen mit dem Sensor 21 überwacht wird. Der Sensor 21 gibt Messsignale an die Steuerelektronik 5 aus. Diese ermittelt aus den Messsignalen entweder einen qualitativen Wert, der angibt, ob die bestimmte biologische Zielsubstanz in der aus der Probevorlage 7 entnommenen Flüssigkeit enthalten ist. Alternativ oder zusätzlich kann die Steuerelektronik 5 aus den Messsignalen auch einen quantitativen Wert ermitteln, der eine Konzentration der biologischen Zielsubstanz in der Flüssigkeit repräsentiert. In einer vorteilhaften Ausgestaltung können in mehreren Detektionskammern jeweils unterschiedliche Ziel-Nukleinsäuren amplifiziert und so parallel mehrere unterschiedliche biologische Zielsubstanzen in der Flüssigkeit qualitativ oder quantitativ bestimmt werden.
Vor oder nach dem T ransfer der aufkonzentrierten Flüssigkeit aus der Konzentrator-Einheit 3 in die Detektionseinheit 4 oder nach erfolgter Detektion wird die in der Konzentrator-Einheit 3 verbliebene Flüssigkeit aus der Prozesseinheit 3 durch den Flüssigkeitsauslass 17 abgeführt. Die Konzentrator- Einheit 3 kann ausreichend mit einem Spülmedium, beispielsweise mit aus der Probevorlage 7 angesaugter Flüssigkeit, gespült werden und der Prozess kann jetzt für eine weitere Messung wiederholt werden. Die Mlkrofluidikeinheiten 19, 20 in der Detektionseinheit können für die weitere Messung durch neue Mikrofluidikeinheiten 19, 20 ersetzt werden. Alle hier beschriebenen Schritte können durch die Steuerelektronik 5 automatisiert durchgeführt werden.
In Fig. 3 ist schematisch ein alternatives Ausführungbeispiel für eine Konzentrator-Einheit 33 dargestellt, die anstelle der in Fig. 2 dargestellten Konzentrator-Einheit 3 im Analysegerät der Fig. 1 eingesetzt werden kann. Die Konzentrator-Einheit 33 ist dazu eingerichtet, eine Probeflüssigkeit in mehreren Stufen aufzukonzentrieren und erlaubt somit die Aufkonzentrierung selbst von Zielsubstanzen, die nur mit einer äußerst geringen Konzentration in der ursprünglichen Probeflüssigkeit vorliegen. Die Konzentrator-Einheit 33 weist eine erste Konzentratorkammer 8 auf, die einen Einlass 25 für Probeflüssigkeit, eine Zuleitung 23 für Superabsorber, z.B. in Form von Kugeln mit einem Durchmesser von der Größenordnung von 1 mm, und zwei Ableitungen 26, 27 aufweist. Die Zuleitung 23 für den Superabsorber kann mit einem Reservoir 10 verbunden sein, in dem ein Vorrat von Superabsorber enthalten ist. Die erste Ableitung 26 aus der Konzentratorkammer 8 führt zu einem Sammelgefäß 28, die zweite Ableitung 27 dient als Ableitung für verbrauchte Flüssigkeit und verbrauchten Superabsorber und kann beispielsweise mit einem Abfall-Sammelbehälter verbunden sein.
Das Sammelgefäß 28 ist über eine Flüssigkeitsableitung 29 mit einer zweiten Konzentratorkammer 30 fluidisch verbindbar. Die zweite Konzentratorkammer 30 kann identisch ausgestaltet sein wie die erste Konzentratorkammer 8. Sie weist im vorliegenden Beispiel eine weitere Zuleitung 31 für Superabsorber auf, die fluidisch mit demselben Reservoir 10 des Analysegeräts verbindbar ist wie die Zuleitung 23 zur ersten Konzentratorkammer 8. Die zweite Konzentratorkammer weist eine erste Ableitung 15 auf, die mit der Detektoreinheit 4 des Analysegeräts fluidisch verbindbar ist, um der Detektoreinheit aufkonzentrierte Probeflüssigkeit für den qualitativen und/oder quantitativen Nachweis der biologischen Zielsubstanz zuzuleiten. Die Konzentratorkammer 8 weist eine zweite Ableitung 32 zur Ableitung von verbrauchter Flüssigkeit und/oder verbrauchtem Superabsorber auf.
Eine mehrstufige Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit kann mittels der Konzentrator-Einheit 33, insbesondere automatisiert mittels einer Steuerelektronik, z.B. der Steuerelektronik 5 des Analysegeräts, in folgender Weise erfolgen: In einer ersten Stufe kann in die erste Konzentratorkammer 8 ein erstes initales Volumen der zu analysierenden Probeflüssigkeit eingeleitet werden. Nach Zugabe einer ersten Menge des Superabsorbers kann das so gebildete Gemisch über einen vorgegebenen Zeitraum oder bis zum Erreichen eines bestimmten Endvolumens des flüssigen Anteils inkubiert werden. Mindestens ein Teil des nach dem Inkbieren verbliebenen flüssigen Anteils kann anschließend über die erste Ableitung 26 aus der Konzentratorkammer 8 in das Sammelgefäß 28 geleitet werden. Restflüssigkeit und verbrauchter Superabsorber können über die Ableitung 27 aus der Konzentrator-Kammer abgeleitet werden.
In gleicher Weise können ein oder mehrere weitere initiale Volumina der Probeflüssigkeit in der ersten Konzentratorkammer 8 reduziert werden, um die Zielsubstanz in diesen weiteren Volumina aufzukonzentrieren. Nach der jeweiligen Inkubation, wird entsprechend mindestens ein Teil des jeweils verbliebenen flüssigen Anteils in das Sammelgefäß 28 überführt.
Die gesammelte, bereits in einer ersten Stufe aufkonzentrierte, Probeflüssigkeit kann mittels der zweiten Konzentratorkammer 30 in einer zweiten Stufe weiter aufkonzentriert werden. Hierzu kann mindestens ein Teil der in dem Sammelgefäß 28 enthaltenen aufkonzentrierten Probeflüssigkeit über die Ableitung 29 des Sammelgefäßes 28 in die zweite Konzentratorkammer 30 eingeleitet werden. Über die Zuleitung 31 für Superabsorber wird eine zweite Menge Superabsorber in die zweite Konzentratorkammer 30 eingeleitet. Das so gebildete Gemisch wird über einen vorgegebenen Zeitraum und/oder bis zum Erreichen eines gewünschten Volumens des flüssigen Anteils in der zweiten Konzentratorkammer 30 inkubiert. Mindestens ein Teil des flüssigen Anteils kann dann über die Flüssigkeitsleitung 15 der Detektoreinheit 4 des Analysegeräts zugeführt werden. Nicht benötigte Flüssigkeit und/oder der verbrauchte Superabsorber kann über die Ableitung 32 aus der zweiten Konzentratorkammer 30 abgeleitet werden.
Alle Schritte des hier beschriebenen Verfahrens können von einer Steuerelektronik, z.B. der Steuerelektronik 5 des Analysegeräts 1 vollständig automatisiert durchgeführt werden. Hierzu weist die Konzentrator-Einheit geeignete Mittel zum Transport von Flüssigkeit und Superabsorber-Partikeln durch die Fluidleitungen in die verschiedenen Kammern, insbesondere Pumpen und Ventile auf (nicht in Fig. 3 eingezeichnet), die die Steuerelektronik zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens zum Aufkonzentrieren der Zielsubstanz in der Probeflüssigkeit betätigt.
Das erfindungsgemäße Analysegerät und Verfahren löst damit durch die Verknüpfung verfügbarer Gerätesysteme für die Detektion in idealer Weise die Aufgabenstellung und ermöglicht die Durchführung einer online-Flüssigkeits-Analytik biologischer Targets, die besonders vorteilhaft für die Überwachung von Wasser bzw. Abwasser in Netzwerken, Kläranlagen oder Aufbereitungsanlagen sowie von Gewässern erscheint. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es erstmals ohne manuelle Intervention beginnend mit einer großvolumigen Probe bis hin zur Detektion ein molekulargenetisches Monitoring von biologischen Targets in praktikabler und wirtschaftlicher weise umzu setzen.

Claims

22 WO 2023/117616 PCT/EP2022/085796 Patentansprüche
1 . Verfahren zum Aufkonzentrieren mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit umfassend:
- Dosieren und Transportieren eines ersten initialen Volumens der Probeflüssigkeit über eine Flüssigkeitszuleitung (25) in eine erste Konzentratorkammer (8) einer Konzentrator-Einheit (3, 33); und
- Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit durch Reduzieren des ersten initialen Volumens der Probeflüssigkeit in der Konzentrator-Einheit (3, 33) und damit verbundenem Aufkonzentrieren der im ersten Volumen der Probeflüssigkeit enthaltenen mindestens einen biologischen Zielsubstanz mittels einer ersten Menge eines Superabsorbers (24), wobei das Reduzieren und das damit verbundene Aufkonzentrieren durch Inkubieren eines aus dem ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mit der ersten Menge des Superabsorbers (24) gebildeten Gemisches erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die mindestens eine biologische Zielsubstanz ein Biomolekül ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Superabsorber (24) einen Kunststoff umfasst, der Wassermoleküle unter Bildung eines Hydrogels aufnimmt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Kunststoff keine Biomoleküle, insbesondere nicht die Zielsubstanz, aufnimmt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Superabsorber (24) in Form von Partikeln, z.B. als Pulver, als Granulat oder in Form geometrischer Körper, insbesondere Kugeln, eingesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit das Dosieren des ersten initialen Volumens der Probeflüssigkeit zu der in der ersten Konzentratorkammer (8) vorgelegten ersten Menge des Superabsorbers (24) oder das Dosieren der ersten Menge des Superabsorbers (24) zu dem in der ersten Konzentratorkammer (8) vorgelegten ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit umfasst.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Inkubieren des aus dem ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mit der ersten Menge des Superabsorbers gebildeten Gemisches über eine vorgegebene, insbesondere wählbare, Zeitspanne ausgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Konzentratorkammer (8) und das darin enthaltene Gemisch während des Inkubierens mittels einer Temperiervorrichtung der Konzentrator-Einheit (3, 33) temperiert wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, weiter umfassend: nach dem Inkubieren Entnehmen mindestens eines Teils der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit aus der ersten Konzentratorkammer (8).
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die aus der Konzentrator-Kammer (8) entnommene aufkonzentrierte Probeflüssigkeit in ein Sammelgefäß (28) transportiert wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, weiter umfassend:
- Dosieren und Transportieren eines zweiten initialen Volumens der Probeflüssigkeit über eine Flüssigkeitszuleitung (25) in die erste Konzentratorkammer (8) der Konzentrator-Einheit (33); und
- Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit durch Reduzieren des zweiten initialen Volumens der Probeflüssigkeit in der Konzentrator-Einheit (33) und damit verbundenem Aufkonzentrieren von in dem zweiten initialen Volumen der Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen mittels einer zweiten Menge des Superabsorbers, wobei das Reduzieren und das damit verbundene Aufkonzentrieren durch Inkubieren eines aus dem zweiten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mit der zweiten Menge des Superabsorbers gebildeten Gemisches erfolgt, und
- Transportieren mindestens eines Teils der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit aus der ersten Konzentratorkammer (8) in das Sammelgefäß (28).
12. Verfahren nach Anspruch 11 , wobei mindestens ein Teil der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit aus dem Sammelgefäß (28) zur weiteren Aufkonzentrierung mittels einer dritten Menge des Superabsorbers (24) in die erste Konzentratorkammer (8) oder in eine zweite, von der ersten Konzentratorkammer (8) verschiedene, Konzentratorkammer (30) dosiert und transportiert wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Verfahren automatisiert durch eine Steuerelektronik (5) durch geführt wird.
14. Verfahren zur automatisierten online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit mittels eines Online-Analysegeräts (1), umfassend:
- Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit aus mindestens einem ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mittels des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
- Transportieren mindestens eines Teils der erzeugten aufkonzentrierten Probeflüssigkeit aus der Konzentrator-Einheit (3) in eine Detektionseinheit (4) des Online-Analysegeräts, und - Qualitative oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und/oder in der Probeflüssigkeit vor Aufkonzentrierung mittels der Detektionseinheit (4) und einer Steuerelektronik (5) des Online-Analysegeräts (1).
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Verfahren weiter umfasst:
- Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen und Erzeugen einer die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Lösung,
- Amplifizieren mindestens einer in der Lösung enthaltenen Ziel-Nukleinsäure, und
- Erfassen eines Messsignals, das eine von dem Fortschritt der Amplifizierung und/oder von einer Anzahl von Kopien der Ziel-Nukleinsäure abhängige Messgröße repräsentiert, wobei die Steuerelektronik (5) des Analysegeräts (1) anhand des erfassten Messsignals die qualitative oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und/oder in der Probeflüssigkeit vor Aufkonzentrierung durchführt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen und das Erzeugen der die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Lösung in einer ersten Mikrofluidikeinheit (19) der Detektionseinheit durch geführt wird, die Lösung in eine mit der ersten Mikrofluidikeinheit (19) fluidisch verbindbare zweite Mikrofluidikeinheit (20) transportiert wird, und das Amplifizieren und das Erfassen des Messsignals in der zweiten Mikrofluidikeinheit (20) durch geführt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen und das Erzeugen der die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Lösung mindestens folgende Schritte umfasst:
- Versetzen der flüssigen Probe mit einem oder mehreren Lysereagenzien, um Nukleinsäuren der Biomoleküle freizusetzen,
- Binden der freigesetzten Nukleinsäuren an ein Nukleinsäure bindendes Material; - Waschen der gebundenen Nukleinsäuren mit einer Waschlösung, und
- Ablösen der Nukleinsäuren von dem Nukleinsäure bindenden Material durch Eluieren.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, wobei das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen und das Erzeugen der die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Lösung folgende Schritte umfasst: 25
WO 2023/117616 PCT/EP2022/085796
- thermisches Behandeln der in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomoleküle in einer Pufferlösung, beispielsweise in einer phosphatgepufferten Salzlösung, in Wasser, in einem Tris-Puffer oder in einem Puffer, der eine geringe Konzentration an einem Detergenz enthält.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei die Steuerelektronik des Online-Analysegeräts alle Verfahrensschritte automatisiert durchführt.
20. Konzentrator-Einheit (3, 33) zur automatisierten Durchführung einer Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit, insbesondere nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, umfassend:
- eine erste Konzentratorkammer (8);
- mindestens eine in die erste Konzentratorkammer (8) mündende Flüssigkeitszuleitung (25); und
- mindestens eine in die erste Konzentratorkammer (8) mündende Flüssigkeitsableitung (26); wobei die Konzentrator-Einheit (3, 33) dazu eingerichtet ist, eine erste Menge eines Superabsorbers (24) zu einem über die Flüssigkeitszuleitung (25) in die erste Konzentratorkammer (8) eingeleiteten initialen Flüssigkeitsvolumen der Probeflüssigkeit zuzugeben, oder dazu eingerichtet ist, das initiale Flüssigkeitsvolumen zu der ersten Menge des Superabsorbers (4) zuzugeben.
21. Konzentrator-Einheit (3, 33) nach Anspruch 20, wobei die erste Menge des Superabsorbers (24) in der ersten Konzentratorkammer (8) vorgelegt ist.
22. Konzentrator-Einheit (3, 33) nach Anspruch 20, wobei die Konzentrator-Einheit (3, 33) mindestens ein Reservoir (10) aufweist oder mit einem Reservoir (10) verbunden ist, in dem Superabsorber (24), insbesondere in Form von Partikeln, enthalten ist, und das über eine mit einem, insbesondere mittels einer Steuerelektronik (5) steuerbaren, Ventil verschließbare Superabsorber-Zuleitung (23) mit der ersten Konzentratorkammer (8) verbunden ist, derart, dass bei geöffnetem Ventil mindestens ein Teil des in dem Reservoir (10) enthaltenen Superabsorbers (24) als erste Menge des Superabsorbers (24) in die erste Konzentratorkammer (8) gelangt.
23. Konzentrator-Einheit (3, 33) nach einem der Ansprüche 20 bis 22, weiter umfassend eine Temperiervorrichtung, die dazu ausgestaltet ist, die erste Konzentratorkammer (8) zu temperieren.
24. Konzentrator-Einheit (33) nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei die Flüssigkeitsableitung (26) zur Ableitung mindestens eines Teils des in der ersten Konzentratorkammer (8) vorliegenden Flüssigkeitsvolumens der Probeflüssigkeit fluidisch mit einem Sammelgefäß (28) verbindbar ist.
25. Konzentrator-Einheit (33) nach einem der Ansprüche 20 bis 24, 26
WO 2023/117616 PCT/EP2022/085796 weiter umfassend eine zusätzliche zweite Konzentratorkammer (30), wobei die Flüssigkeitsableitung (26) der ersten Konzentratorkammer (8) diese, insbesondere über ein Sammelgefäß (28), mit der zweiten Konzentratorkammer (30) verbindet; und eine in die zweite Konzentratorkammer (30) mündende weitere Flüssigkeitsableitung (15), wobei die Konzentrator-Einheit (33) dazu eingerichtet ist, eine zweite Menge des Superabsorbers (24) zu einem in die zweite Konzentratorkammer (8) eingeleiteten Flüssigkeitsvolumen der in der ersten Konzentratorkammer (8) aufkonzentrierten Probenflüssigkeit zuzugeben oder das Flüssigkeitsvolumen zu der zweiten Menge des Superabsorbers (24) zuzugeben.
26. Online-Analysegerät (1) zur Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit, insbesondere nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, umfassend: eine Steuerelektronik (5); eine Konzentrator-Einheit (3, 33) nach einem der Ansprüche 20 bis 25, wobei die Konzentrator-Einheit (3, 33) einen Flüssigkeitsausgang für in der Konzentrator-Einheit (3, 33) aus der Probeflüssigkeit erzeugte aufkonzentrierte Probeflüssigkeit aufweist; und eine mit dem Flüssigkeitsausgang der Konzentrator-Einheit (3, 33) fluidisch verbindbare Detektionseinheit (4); und mindestens eine von der Steuerelektronik (5) steuerbare Transporteinrichtung, z.B. eine Pumpe, die dazu eingerichtet ist, aufkonzentrierte Probeflüssigkeit vom Flüssigkeitsausgang der Konzentrator- Einheit (3, 33) in die Detektionseinheit (4) zu transportieren, wobei die Steuerelektronik (5) dazu eingerichtet ist, mittels der Detektionseinheit (4) die Zielsubstanz in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und/oder in der Probeflüssigkeit vor Aufkonzentrierung qualitativ oder quantitativ basierend auf einem molekulargenetischen Verfahren zu bestimmen.
27. Online-Analysegerät (1) nach Anspruch 26, weiter umfassend eine Probenpumpe (9), wobei die Steuerelektronik (5) dazu eingerichtet ist, die Probenpumpe (9) zum Transport eines vorgegebenen Volumens der Probenflüssigkeit in die Konzentrator-Einheit (8) zu steuern.
28. Online-Analysegerät (1) nach Anspruch 26 oder 27, wobei die Detektionseinheit (4) aufweist: eine mit einem Flüssigkeitsausgang für aufkonzentrierte Probenflüssigkeit der Konzentrator- Einheit fluidisch verbindbare erste Mikrofluidikeinheit (19), die dazu eingerichtet ist, aus in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen Nukleinsäuren freizusetzen und/oder zu isolieren, eine mit der ersten Mikrofluidikeinheit (19) verbundene zweite Mikrofluidikeinheit (20), die dazu eingerichtet ist, ein die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassendes Eluat aufzunehmen und eine Ziel-Nukleinsäure zu amplifizieren; und einen, insbesondere optischen, Sensor, der dazu eingerichtet ist, ein von dem Fortschritt einer in der zweiten Mikrofluidikeinheit (20) durchgeführten Amplifizierung und/oder von einer Anzahl 27
WO 2023/117616 PCT/EP2022/085796 von Kopien der Ziel-Nukleinsäure in der zweiten Mikrofluidikeinheit (20) abhängiges Messsignal zu erzeugen und an die Steuerelektronik (5) auszugeben; und wobei die Steuerelektronik (5) dazu eingerichtet ist, anhand des von dem Sensor ausgegebenen Messsignals die biologische Zielsubstanz in der Flüssigkeit qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen.
29. Online-Analysegerät (1) nach Anspruch 28, wobei die erste (19) und die zweite Mikrofluidikeinheit (20) zusammen in einer, insbesondere austauschbaren, Kartusche angeordnet sind.
30. Online-Analysegerät (1) nach einem der Ansprüche 28 oder 29, wobei die erste Mikrofluidikeinheit (19) dazu eingerichtet ist, die aufkonzentrierte Probeflüssigkeit aufzunehmen und mit einem oder mehreren Lysereagenzien zu versetzen, um Nukleinsäure der in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomoleküle freizusetzen, anschließend die freigesetzten Nukleinsäuren an ein Nukleinsäuren bindendendes Material zu binden, gegebenenfalls unter Zugabe eines die Bindung der Nukleinsäuren an ein Nukleinsäure-bindendes Material verstärkenden oder vermittelnden Komponente, und die an dem Material gebundenen Nukleinsäuren ein- oder mehrmals mit einer Waschlösung zu waschen.
31. Online-Analysegerät nach Anspruch 30, wobei die erste Mikrofluidikeinheit (19) weiter dazu ausgestaltet ist, die Nukleinsäuren vom Nukleinsäure bindenden Material durch Eluieren abzulösen und das Eluat über eine erste Mikrofluidikeinheit (19) mit der zweiten Mikrofluidikeinheit (20) verbindende Fluidleitung in die zweite Mikrofluidikeinheit (20) zu transportieren, und wobei die Steuerelektronik (5) dazu eingerichtet ist, das Eluieren und den Transport des Eluats zu steuern.
32. Online-Analysegerät (1) nach Anspruch 29 oder 30, wobei die erste Mikrofluidikeinheit (19) weiter dazu ausgestaltet ist, die aufkonzentrierte Probe aufzunehmen und die Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probe enthaltenen Biomoleküle in einer Pufferlösung thermisch und/oder chemisch freizusetzen, wobei die Steuerelektronik (5) dazu eingerichtet ist, die thermische Behandlung in der Pufferlösung zu steuern und die Pufferlösung mit den freigesetzten Nukleinsäuren in die zweite Mikrofluidikeinheit zu transportieren.
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