EP4118201A1 - Verfahren zum behandeln einer biologischen probe und vorrichtung zum isolieren von zellen aus einem transportmedium - Google Patents

Verfahren zum behandeln einer biologischen probe und vorrichtung zum isolieren von zellen aus einem transportmedium

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Publication number
EP4118201A1
EP4118201A1 EP21710470.2A EP21710470A EP4118201A1 EP 4118201 A1 EP4118201 A1 EP 4118201A1 EP 21710470 A EP21710470 A EP 21710470A EP 4118201 A1 EP4118201 A1 EP 4118201A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
transport medium
membrane filter
complexing agent
ammonium
ions
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21710470.2A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Franz Laermer
Eva WEIMER
Tanja Maucher
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of EP4118201A1 publication Critical patent/EP4118201A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes

Definitions

  • the present invention relates to a method for treating a biological sample in a transport medium, for example in an Amies medium.
  • the present invention also relates to a device for isolating cells from the transport medium.
  • transport media for biological samples, for example for bacterial samples, have established themselves as clinical standards. These make it possible to transport patient swabs or patient samples to a diagnostic laboratory without damaging the bacteria in the transport medium or changing the bacterial composition in a falsified manner. Transport media create a controlled “feel-good atmosphere” for the pathogens so that they can, for example, be introduced into a special nutrient medium at their destination and can continue to multiply.
  • the bacterial multiplication in a bacterial culture is an important diagnostic parameter that makes statements about the identity, viability, proliferation rate and also about the antibiotic sensitivities of such germs removed from the patient.
  • the transport medium must therefore ensure that the later diagnosis is not falsified at this point, for example in that particularly sensitive, but possibly quite dangerous germs die prematurely and can then no longer be detected in the microbiological culture.
  • a widely used transport medium is the so-called Amies medium. Disclosure of the invention
  • the transport medium is in particular an Amies medium. Since Amies media exist in numerous variants, all media are understood as Amies media for the purposes of this process, which contain calcium ions, magnesium ions, hydrogen phosphate ions and dihydrogen phosphate ions in a composition in which at least one of the solubility products of calcium hydrogen phosphate, calcium dihydrogen phosphate, magnesium hydrogen phosphate and magnesium dihydrogen phosphate is exceeded will.
  • the method is particularly advantageously suitable for treating biological samples which are contained in an Amies medium in which all four solubility products are exceeded.
  • the Amies medium thus contains a suspension of alkaline earth metal hydrogen phosphates and / or alkaline earth metal dihydrogen phosphates, some of which are present undissolved as suspended matter.
  • the problem with these compounds is the fact that they are emulsifiers which are insoluble or only sparingly soluble in water themselves, but can very well bind water-like substances in their molecular structure.
  • Such salts are therefore often used as emulsifiers for water in fatty phases.
  • Calcium salts of this type in particular are used in foods, for example for emulsifying water in sausage products.
  • this effect leads to an undesired binding of free nucleic acids to the undissolved calcium salt and magnesium salt molecule clusters when the biological sample is lysed, so that the nucleic acids are subsequently no longer available for a PCR detection reaction and, since they can no longer be detected, must be considered lost.
  • the addition of the complexing agent has the effect that the poorly soluble alkaline earth metal hydrogen phosphates and / or alkaline earth metal hydrogen phosphates are converted into a dissolved form which no longer has the undesirable binding properties with respect to free nucleic acids.
  • the complexing agent is preferably added immediately after the Amies medium has been entered into a lab-on-chip system, which is provided for the analysis of the biological sample.
  • the complexing agent is particularly preferably stored upstream in the lab-on-chip system at a suitable location and in a suitable form, for example as a solid or as a liquid reagent.
  • a complexing agent presented as a solid can, for example, be dissolved on contact with the Amies sample and then convert the alkaline earth phosphates into a soluble form by complex formation.
  • the complexing agent preferably contains [NR 1 R 2 R 3 R 4 ] + ions, where R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are independently selected from hydrogen and alkyl groups.
  • the complexing agent particularly preferably contains ammonium ions (NH4 + ). Ammonium ions form readily soluble diamminocalcium complexes and diamminomagnesium complexes with calcium ions and magnesium ions.
  • the complexing agent preferably contains at least one salt selected from the group consisting of ammonium hydrogen citrate (“binary ammonium citrate”), ammonium citrate (“ternary ammonium citrate”), ammonium thioglycolate, ammonium chloride, ammonium acetate, tetramethylammoniumthiamethylammonium acetate, tetramethylammoniumthiamethylammonium. While ammonium chloride can serve as a source of ammonium ions in a simple and inexpensive manner, the other ammonium salts and tetramethylammonium salts contained in the group provide additional anions which form a buffer system in the transport medium.
  • the transport medium is preferably adjusted to a pFI value in the range from 5 to 6 by virtue of the additives mentioned. This further promotes the dissolution of the poorly soluble alkaline earth salts, because at acidic pH there is a shift in the plyrogen phosphates to the more soluble dihydrogen phosphates, as the following reaction equilibrium shows:
  • the bacteria contained in the biological sample for example, still remain intact in this pPI range. You will be in this pPI area though possibly severely impaired in their vitality, but for subsequent molecular biological processes it is only important that the cells with undamaged cell membranes remain intact.
  • the setting of the pH is preferably carried out simultaneously with the addition of the complexing agent or in the form of the addition of the complexing agent, since with a suitable selection this can already have the above-mentioned buffer effect on its own.
  • the complexing agent also functions as a buffer. This applies, for example, to ammonium hydrogen citrate, the so-called “binary ammonium citrate" (NH ⁇ H-citrate, which automatically sets a pH value of 5 to 6.
  • ternary ammonium citrate which is (NH4) 3- citrate
  • the result is an approximately neutral pH value of about 7.
  • citric acid allows the desired pH range between 5 and 6 to be set in the combination as a buffer system.
  • a citric acid / citrate buffer and / or an acetic acid / acetate buffer and / or a thioglycolic acid / thioglycolate buffer is added to the transport medium.
  • These buffers are particularly suitable for setting a pH value in the range from 5 to 6.
  • the complexing agent is preferably ammonium hydrogen citrate, ammonium citrate or
  • Tetramethylammonium citrate and citric acid is added to this.
  • the buffer is to be an acetic acid / acetate buffer
  • the complexing agent is preferably ammonium acetate and acetic acid is added to this.
  • a thioglycolic acid / thioglycolate buffer is to be used, the complexing agent is preferably ammonium thioglycolate or tetramethylammonium thioglycolate and thioglycolic acid, which is also referred to as mercaptoacetic acid, is added to this.
  • the complexing agent contains only one of the salts suitable for buffer formation, i.e.
  • a hydrogen citrate, a citrate, an acetate or a thioglycolate, and the corresponding acid is then released from this by adding another organic acid.
  • Mandelic acid is particularly suitable for this.
  • the addition of a further organic acid such as mandelic acid to an already existing system of salt and corresponding acid can also be provided. It is very difficult to produce sufficiently chaotropic conditions in transport media, as would be required for binding nucleic acids to a filter frit, without diluting the sample very strongly.
  • the transport medium is first filtered through a porous volume filter after the complexing agent has been added. It is then filtered through a membrane filter with a pore size in the range from 0.2 ⁇ m to 2.0 ⁇ m.
  • the two filters are preferably combined in the form of a single filter stack stacked one on top of the other.
  • the pore size of the membrane filter is particularly preferably in the range from 0.4 ⁇ m to 1.2 ⁇ m and very particularly preferably in the range from 0.8 ⁇ m to 1.0 ⁇ m.
  • the specification of a numerical value for a pore size always relates to the membrane filter and not to the upstream porous volume filter. Due to this pore size, the membrane filter, in conjunction with the upstream porous volume filter, can hold back cells such as bacterial cells without clogging themselves. Other substances such as dissolved mucus or blood components or other impurities from the biological sample pass through the filter arrangement or are already retained by the volume filter without clogging the membrane filter.
  • the porous volume filter connected upstream of the membrane filter can in particular have a constant porosity or a sequence of porosity values that decrease towards the membrane filter. It enables suspended matter contained in the transport medium, such as activated carbon or sample contaminants, to be retained so that these cannot clog the membrane filter and only the cells from the biological sample collect on the membrane filter.
  • cells remaining on the membrane filter are freed from alkaline earth metal hydrogen phosphates, alkaline earth metal dihydrogen phosphates and impurities in the transport medium. Since these have been converted into a soluble form by the addition of the complexing agent, this can be achieved in a simple manner by washing using a washing buffer. In particular, a polysorbal / water mixture can be used for this purpose. Other residues of the transport medium and remaining small impurities such as mucus are washed down from the biological sample.
  • Suitable methods of lysing are, in particular, heating to a temperature of preferably more than 60 ° C. and / or the addition of a lysis medium such as, in particular, Octoxinol 9 and / or mechanical stress, in particular through the action of ultrasound.
  • these are preferably eluted from the membrane filter. This can take place both during the lysing and after the lysing. If the elution is to take place at the same time as the lysing, the lysis medium functions at the same time as the eluent. In a subsequent elution, the nucleic acids are rinsed out of the membrane filter by means of a suitable eluent after the completion of the lysis. After mixing the eluate with a PCR master mix, for example in the form of a lyophilized PCR bead presented in a lab-on-chip, a PCR amplification and detection reaction can then take place.
  • a PCR master mix for example in the form of a lyophilized PCR bead presented in a lab-on-chip
  • a device for isolating cells from a transport medium which has, one behind the other, a porous volume filter and a membrane filter with a pore size in the range from 0.2 ⁇ m to 2.0 ⁇ m.
  • the pore size of the membrane filter is preferably in the range from 0.4 to 1.2 ⁇ m and particularly preferably in the range from 0.8 to 1.0 ⁇ m.
  • FIG. 1 shows a flow chart of an exemplary embodiment of the method according to the invention.
  • Figure 2 shows a schematic representation of an embodiment of the device according to the invention.
  • a biological sample which is a bacterial sample in the form of a patient swab, is introduced into an Amies medium as a transport medium.
  • the Amies medium contains in the present embodiment
  • the Amies medium with the biological sample has been transported to a diagnostic laboratory, it is treated there by means of an exemplary embodiment of the method according to the invention.
  • the Amies medium with the biological sample is introduced 11 into a lab-on-chip system.
  • the complex-forming buffer mixture contains ammonium hydrogen citrate and citric acid in a mixing ratio by means of which the Amies medium is buffered to a pFI value in the range from 5 to 6.
  • the device 20 has a porous volume filter 21. Arranged immediately downstream of this is a porous membrane filter 22 which, in the present exemplary embodiment, has a pore size of 0.9 ⁇ m.
  • the Amies medium is introduced into the device 20 at an introduction position 23 on the volume filter 21.
  • the Amies medium is first filtered 13 through the volume filter 21. Agar and larger particles or sample contaminants are retained in the volume filter 21, while bacterial cells hold them back Easily pass through the volume filter and thus reach the membrane filter 22.
  • the Amies medium is then filtered 14 further through the membrane filter 22.
  • the bacterial cells of the biological sample remain on the membrane filter 22, while all soluble components of the Amies medium pass through the device 20 through the membrane filter 22 and a subsequent outlet position 24 as aqueous Exit solution.
  • a washing is carried out of the cells on the membrane filter 22 by a Tween ® water mixture (Polysorbal / water mixture) is introduced into the device 20 through the inlet point 23 /.
  • the cells are then lysed 16 by introducing a 0.1% strength by weight solution of Triton® X-100 (Octoxinol 9) into the device 20 through the introduction position 23.
  • the eluate is mixed with a PCR master mix in the form of a lyophilized PCR bead and a PCR detection reaction carried out 17. The process is then ended 18.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Behandeln einer biologischen Probe, die in einem Transportmedium enthalten ist. Dem Transportmedium wird mindestens ein Komplexbildner zugesetzt, der Komplexe mit Erdalkaliionen bildet. In dem Verfahren kann eine Vorrichtung (20) verwendet werden, die hintereinander einen porösen Volumenfilter (21) und einen Membranfilter (22) mit einer Porengröße im Bereich von 0,2 μm bis 2,0 μm aufweist.

Description

Beschreibung
Titel
Verfahren zum Behandeln einer biologischen Probe und Vorrichtung zum
Isolieren von Zellen aus einem Transportmedium
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Behandeln einer biologischen Probe in einem Transportmedium, z.B. in einem Amies-Medium. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zum Isolieren von Zellen aus dem Transportmedium.
Stand der Technik
In der Diagnostik haben sich zahlreiche sogenannte Transportmedien für biologische Proben beispielsweise für bakterielle Proben, als klinische Standards etabliert. Diese machen es möglich, Patientenabstriche oder Patientenproben zu einem Diagnostiklabor zu transportieren, ohne die im Transportmedium befindlichen Bakterien dabei zu schädigen oder die Bakterienzusammensetzung verfälschend zu verändern. Transportmedien schaffen für die Pathogene eine kontrollierte „Wohlfühlatmosphäre“, damit diese beispielsweise an ihrem Ziel in ein spezielles Nährmedium eingebracht werden und sich weiter vermehren können. Die Bakterienvermehrung in einer Bakterienkultur ist ein wichtiger diagnostischer Parameter, der Aussagen über die Identität, Viabilität, Proliferationsgeschwindigkeit und auch über Antibiotikasensitivitäten solcher am Patienten entnommener Keime macht. Das Transportmedium muss daher sicherstellen, dass es an dieser Stelle nicht zu Verfälschungen der späteren Diagnose kommt, etwa indem besonders sensitive, aber unter Umständen durchaus gefährliche Keime frühzeitig sterben und in der mikrobiologischen Kultur dann nicht mehr nachgewiesen werden können. Ein weit verbreitetes Transportmedium ist das sogenannte Amies-Medium. Offenbarung der Erfindung
In dem Verfahren zum Behandeln einer biologischen Probe, die in einem Transportmedium enthalten ist, ist vorgesehen, dass dem Transportmedium mindestens ein Komplexbildner zugesetzt wird, der Komplexe mit Erdalkaliionen, insbesondere mit Calciumionen und mit Magnesiumionen, bildet. Bei dem Transportmedium handelt es sich insbesondere um ein Amies-Medium. Da Amies-Medien in zahlreichen Varianten existieren, werden im Sinne dieses Verfahrens alle Medien als Amies-Medien verstanden, die Calciumionen, Magnesiumionen, Hydrogenphosphationen und Dihydrogenphosphationen in einer Zusammensetzung enthalten, bei der zumindest eines der Löslichkeitsprodukte von Calciumhydrogenphosphat, Calciumdihydrogenphosphat, Magnesiumhydrogenphosphat und Magnesiumdihydrogenphosphat überschritten wird. Besonders vorteilhaft geeignet ist das Verfahren zum Behandeln biologischer Proben, die in einem Amies-Medium enthalten sind, in dem alle vier Löslichkeitsprodukte überschritten werden. Das Amies-Medium enthält also eine Suspension von Erdalkalihydrogenphosphaten und/oder Erdakali- Dihydrogenphosphaten, die teilweise ungelöst als Schwebstoffe vorliegen. Problematisch an diesen Verbindungen ist die Tatsache, dass es sich dabei um Emulgatoren handelt, die zwar selbst nicht oder nur schwer wasserlöslich sind, jedoch wasserähnliche Stoffe in ihrer Molekülstruktur sehr gut binden können. Daher finden solche Salze häufig Verwendung als Emulgatoren von Wasser in Fettphasen. Insbesondere derartige Calciumsalze werden in Lebensmitteln, beispielsweise zur Emulgation von Wasser in Wurstwaren verwendet. In einem molekularbiologischen Ablauf führt dieser Effekt zu einer unerwünschten Bindung von freien Nukleinsäuren an die ungelösten Calciumsalz- und Magnesiumsalzmolekülcluster, wenn die biologische Probe lysiert wird, sodass die Nukleinsäuren nachfolgend nicht mehr für eine PCR-Nachweisreaktion zur Verfügung stehen und, da nicht mehr nachweisbar, als verloren betrachtet werden müssen. Der Zusatz des Komplexbildners bewirkt, dass die schwer löslichen Erdalkalihydrogenphosphate und/oder Erdakalidihydrogenphosphate in eine gelöste Form überführt werden, welche die unerwünschten Bindeeigenschaften gegenüber freien Nukleinsäuren nicht mehr aufweist. Das Zusetzen des Komplexbildners erfolgt vorzugsweise unmittelbar nach Eingabe des Amies-Mediums in ein Lab-on-Chip-System, das zur Analyse der biologischen Probe vorgesehen ist. Besonders bevorzugt ist der Komplexbildner im Lab-on-Chip-System an geeigneter Stelle und in geeigneter Form vorgelagert, z.B. als Feststoff oder als Flüssigreagenz. Ein als Feststoff vorgelegter Komplexbildner kann z.B. bei Kontakt mit der Amies- Probe gelöst werden und dann die Erdalkalkaliphosphate durch Komplexbildung in eine lösliche Form überführen.
Der Komplexbildner enthält bevorzugt [NR1R2R3R4]+-lonen, wobei R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind, aus Wasserstoff und Alkylgruppen. Besonders bevorzugt enthält der Komplexbildner Ammoniumionen (NH4+). Ammoniumionen bilden mit Calciumionen und Magnesiumionen gut lösliche Diamminocalciumkomplexe und Diamminomagnesiumkomplexe.
Zur Bereitstellung von Ammoniumionen oder Alkylammoniumionen enthält der Komplexbildner vorzugsweise mindestens ein Salz, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ammoniumhydrogencitrat („binäres Ammoniumcitrat“), Ammoniumcitrat (,, ternäres Ammoniumcitrat“), Ammoniumthioglycolat, Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat, Tetramethylammoniumcitrat und Tetramethylammoniumthioglycolat. Während Ammoniumchlorid in einfacher und kostengünstiger Weise als Quelle für Ammoniumionen dienen kann, stellen die anderen in der Gruppe enthaltenen Ammoniumsalze und Tetramethylammoniumsalze zusätzliche Anionen bereit, die ein Puffersystem in dem Transportmedium bilden.
Das Transportmedium wird vermöge der angeführten Zusätze vorzugsweise auf einen pFI-Wert im Bereich von 5 bis 6 eingestellt. Plierdurch wird die Auflösung der schwer löslichen Erdalkalisalze noch weiter begünstigt, weil es bei saurem pH zu einer Verschiebung der Plydrogenphosphate zu den besser löslichen Dihydrogenphosphaten kommt, wie folgendes Reaktionsgleichgewicht verdeutlicht:
H2POT ~ HPOT + H+
Die beispielsweise in der biologischen Probe enthaltenen Bakterien bleiben in diesem pPI-Bereich noch intakt. Sie werden zwar in diesem pPI-Bereich möglicherweise in ihrer Vitalität stark beeinträchtigt, aber für anschließende molekularbiologische Prozesse kommt es nur darauf an, dass die Zellen mit unbeschädigter Zellmembran intakt bleiben. Das Einstellen des pH-Werts erfolgt vorzugsweise gleichzeitig mit dem Zusetzen des Komplexbildners oder in Form des Zusetzens des Komplexbildners, da dieser bei geeigneter Auswahl die vorstehend erwähnte Pufferwirkung bereits für sich alleine aufweisen kann. In dieser Ausführungsform des Verfahrens fungiert der Komplexbildner gleichzeitig als Puffer. Dies gilt zum Beispiel für Ammoniumhydrogencitrat, das sogenannte „binäre Ammoniumcitrat“ (NH^H-citrat, das von sich aus einen pH-Wert von 5 bis 6 einstellt. Wird stattdessen das „ternäre Ammoniumcitrat“ verwendet, das ist (NH4)3-citrat, so wird ein annähernd neutraler pH-Wert von ca. 7 bewirkt. Ein weiterer Zusatz von Citronensäure erlaubt dann in der Kombination als Puffersystem die Einstellung des gewünschten pH-Bereichs zwischen 5 und 6.
Es ist bevorzugt, dass dem Transportmedium ein Citronensäure/Citrat- Puffer und/oder ein Essigsäure-/Acetatpuffer und/oder ein Thioglykolsäure/Thioglycolat- Puffer zugesetzt wird. Diese Puffer sind besonders dazu geeignet, einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 6 einzustellen. Wenn ein Citronensäure/Citrat- Puffer verwendet werden soll, so handelt es sich bei dem Komplexbildner vorzugsweise um Ammoniumhydrogencitrat, Ammoniumcitrat oder um
Tetramethylammoniumcitrat und diesem wird zusätzlich Citronensäure beigefügt. Wenn es sich bei dem Puffer um ein Essigsäure-/Acetatpuffer handeln soll, so handelt es sich bei dem Komplexbildner vorzugsweise um Ammoniumacetat und diesem wird Essigsäure zugesetzt. Wenn ein Thioglykolsäure-/Thioglycolatpuffer verwendet werden soll, so handelt es sich bei dem Komplexbildner vorzugsweise um Ammoniumthioglycolat oder Tetramethylammoniumthioglycolat und diesem wird Thioglykolsäure zugesetzt, die auch als Mercaptoessigsäure bezeichnet wird. Grundsätzlich ist es auch möglich, dass der Komplexbildner lediglich eines der für die Pufferbildung geeigneten Salze, also ein Hydrogencitrat, ein Citrat, ein Acetat oder ein Thioglykolat enthält und die korrespondierende Säure dann aus diesem durch Zusatz einer anderen organischen Säure freigesetzt wird. Hierzu ist insbesondere Mandelsäure geeignet. Auch der Zusatz einer weiteren organischen Säure wie beispielsweise Mandelsäure zu einem bereits vorhandenen System aus Salz und korrespondierender Säure kann vorgesehen sein. Es ist nur sehr schwer möglich, in Transportmedien hinreichend chaotrope Verhältnisse herzustellen, wie sie für eine Bindung von Nukleinsäuren an eine Filterfritte erforderlich wären, ohne die Probe dabei sehr stark zu verdünnen.
Dies führt entweder zu einer Beschränkung der zu prozessierenden Menge an Probenmaterial, beispielsweise hinsichtlich limitierten Fassungsvermögens einer Lab-on-Chip-Kartusche und Verbrauchsmengen an Reagenzien und dadurch einer beschränkten Menge an nachzuweisenden Analyten, oder zu einem massiven Verlust an DNA durch unzureichend chaotrope Verhältnisse mit der Folge von schlechter Nukleinsäurebindung an die Filterfritte. Beides hat die Konsequenz einer schlechten Nachweisempfindlichkeit. Um diesem Problem zu begegnen ist es in dem Verfahren bevorzugt, dass das Transportmedium nach Zusetzen des Komplexbildners zuerst durch einen porösen Volumenfilter filtriert wird. Anschließend wird es durch einen Membranfilter mit einer Porengröße im Bereich von 0,2 pm bis 2,0 pm filtriert. Die beiden Filter werden vorzugsweise in Form eines einzigen Filterstacks übereinandergestapelt kombiniert. Besonders bevorzugt liegt die Porengröße des Membranfilters im Bereich von 0,4 pm bis 1,2 pm und ganz besonders bevorzugt im Bereich von 0,8 pm bis 1,0 pm. Die Angabe eines Zahlenwertes einer Porengröße bezieht sich hierbei stets auf den Membranfilter und nicht auf den vorangeschalteten porösen Volumenfilter. Durch diese Porengröße kann der Membranfilter in Verbindung mit dem vorgeschalteten porösen Volumenfilter Zellen wie beispielsweise Bakterienzellen gut zurückhalten, ohne selbst zu verstopfen. Andere Stoffe wie beispielsweise gelöster Schleim oder Blutbestandteile oder andere Verunreinigungen aus der biologischen Probe passieren die Filteranordnung oder werden bereits vom Volumenfilter zurückgehalten, ohne den Membranfilter zu verstopfen. Der dem Membranfilter vorgeschaltete poröse Volumenfilter kann insbesondere eine konstante Porosität oder eine Folge von zum Membranfilter hin abnehmenden Porositätswerten aufweisen. Er ermöglicht es, im Transportmedium enthaltene Schwebstoffe wie beispielsweise Aktivkohle oder Probenverunreinigungen zurückzuhalten, so dass diese den Membranfilter nicht verstopfen können und sich auf dem Membranfilter lediglich die Zellen aus der biologischen Probe sammeln. Für die weitere Behandlung der biologischen Probe ist es bevorzugt, dass auf dem Membranfilter zurückbleibende Zellen von Erdalkali-Hydrogenphosphaten, Erdalkali-Dihydrogenphosphaten und Verunreinigungen des Transportmediums befreit werden. Da diese durch den Zusatz des Komplexbildners in eine lösliche Form überführt wurden, kann dies in einfacher Weise durch Waschen mittels eines Waschpuffers erreicht werden. Hierzu kann insbesondere ein Polysorbal/Wasser-Gemisch verwendet werden. Dabei werden auch andere Reste des Transportmediums und verbleibende kleine Verunreinigungen aus der biologischen Probe wie beispielsweise Schleim heruntergewaschen.
Um die Nukleinsäuren aus den zurückbleibenden Zellen freizusetzen ist es bevorzugt, dass diese auf dem Membranfilter lysiert werden. Geeignete Methoden des Lysierens sind insbesondere ein Erhitzen auf eine Temperatur von vorzugsweise mehr als 60°C und/oder der Zusatz eines Lysemediums wie insbesondere Octoxinol 9 und/oder eine mechanische Belastung insbesondere durch Ultraschalleinwirkung.
Um eine PCR-Nachweisreaktion mit den freigesetzten Nukleinsäuren durchführen zu können, werden diese vorzugsweise aus dem Membranfilter eluiert. Dies kann sowohl während des Lysierens als auch im Anschluss an das Lysieren erfolgen. Soll das Eluieren gleichzeitig mit dem Lysieren erfolgen, so fungiert das Lysemedium gleichzeitig als Eluens. Bei einem anschließenden Eluieren werden die Nukleinsäuren nach Abschluss des Lysierens mittels eines geeigneten Eluens aus dem Membranfilter herausgespült. Nach Vermischen des Eluats mit einem PCR-Mastermix, beispielsweise in Form eines lyophilisierten, in einem Lab-on-Chip vorgelegten PCR-Beads kann anschließend eine PCR- Amplifikations- und -nachweisreaktion stattfinden.
In diesem Verfahren kann eine Vorrichtung zum Isolieren von Zellen aus einem Transportmedium verwendet werden, die hintereinander einen porösen Volumenfilter und einen Membranfilter mit einer Porengröße im Bereich von 0,2 pm bis 2,0 pm aufweist. Bevorzugt liegt die Porengröße des Membranfilters im Bereich von 0,4 bis 1,2 pm und besonders bevorzugt im Bereich von 0,8 bis 1,0 pm. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Figur 1 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Ausführungsbeispiele der Erfindung
In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung wird eine biologische Probe, bei der es sich um eine bakterielle Probe in Form eines Patientenabstrichs handelt, in ein Amies-Medium als Transportmedium eingebracht. Das Amies-Medium enthält im vorliegenden Ausführungsbeispiel
0,2 g/l Kaliumchlorid
0,2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat
0,1 g/l Calciumchlorid
3,0 g/l Natriumchlorid
1,15 g/l Natriumhydrogenphosphat
1,0 g/l Natriumthioglycolat
0,1 g/l Magnesiumchlorid
6,5 g/l Agar
Es weist einen pFI-Wert von circa 7,3 auf. Nachdem das Amies-Medium mit der biologischen Probe in ein Diagnostiklabor transportiert wurde, wird es dort mittels eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens behandelt. Wie in Figur 1 dargestellt ist, erfolgt nach einem Start 10 des Verfahrens ein Einführen 11 des Amies-Mediums mit der biologischen Probe in ein Lab-on-Chip- System. In diesem erfolgt ein Zusetzen 12 eines komplexbildenden Puffergemischs zu dem Amies-Medium. Das komplexbildende Puffergemisch enthält im vorliegenden Ausführungsbeispiel Ammoniumhydrogencitrat und Citronensäure in einem Mischungsverhältnis, durch welches das Amies-Medium auf einen pFI-Wert im Bereich von 5 bis 6 gepuffert wird. Im Amies-Medium suspendiertes Calciumdihydrogenphosphat, Calciumhydrogenphosphat, Magnesiumdihydrogenphosphat und Magnesiumhydrogenphosphat, welches sich aus den Chloriden der beiden Erdalkali- Elemente sowie dem Kaliumdihydrogenphosphat und dem Natriumhydrogenphosphat gebildet hat, gehen dabei unter Bildung von Diamminocalciumkomplexen und Diamminomagnesiumkomplexen wieder in Lösung. Anschließend wird das so behandelte Amies- Medium in eine in dem Lab-on-Chip angeordnete Vorrichtung 20 zum Isolieren von Zellen eingeleitet, die in Figur 2 dargestellt ist.
Die Vorrichtung 20 weist einen porösen Volumenfilter 21 auf. Diesem unmittelbar nachgelagert ist ein poriger Membranfilter 22 angeordnet, der im vorliegenden Ausführungsbeispiel eine Porengröße von 0,9 pm aufweist. Das Einleiten des Amies-Mediums in die Vorrichtung 20 erfolgt an einer Einleitposition 23 am Volumenfilter 21. Dadurch erfolgt zunächst ein Filtrieren 13 des Amies-Mediums durch den Volumenfilter 21. Dabei werden Agar und größere Partikel oder Probenverunreinigungen im Volumenfilter 21 zurückgehalten, während Bakterienzellen diesen Volumenfilter mühelos passieren und so zum Membranfilter 22 gelangen. Anschließend erfolgt ein weiteres Filtrieren 14 des Amies-Mediums durch den Membranfilter 22. Hierbei bleiben die Bakterienzellen der biologischen Probe auf dem Membranfilter 22 zurück, während alle löslichen Komponenten des Amies-Mediums die Vorrichtung 20 durch den Membranfilter 22 und eine darauffolgende Auslassposition 24 als wässrige Lösung verlassen.
Nun erfolgt ein Waschen 15 der Zellen auf dem Membranfilter 22, indem durch die Einlassstelle 23 ein Tween®/Wasser-Gemisch (Polysorbal/Wasser-Gemisch) in die Vorrichtung 20 eingeleitet wird. Dieses wäscht verbleibende lösliche Bestandteile des Amies-Mediums sowie lösliche Bestandteile der biologischen Probe, die noch auf der Oberfläche der Zellen haften, durch den Membranfilter 22 hindurch und durch die Auslassstelle 24 aus der Vorrichtung 20 hinaus. Danach erfolgt ein Lysieren 16 der Zellen, indem durch die Einleitposition 23 eine 0,1 Gew.%ige Lösung von Triton® X-100 (Octoxinol 9) in die Vorrichtung 20 eingeleitet wird. Dieses fungiert als Lysemedium und eluiert gleichzeitig die durch das Lysieren erhaltenen freien Nukleinsäuren der Bakterien aus der Auslassöffnung 24 aus der Vorrichtung 20 hinaus. Das Eluat wird mit einem PCR-Mastermix in Form eines lyophilisierten PCR-Beads vermischt und eine PCR-Nachweisreaktion durchgeführt 17. Anschließend wird das Verfahren beendet 18.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Behandeln einer biologischen Probe, die in einem Transportmedium enthalten ist, dadurch gekennzeichnet, dass dem Transportmedium mindestens ein Komplexbildner zugesetzt wird (12), der Komplexe mit Erdalkaliionen bildet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Transportmedium ein Amies-Medium ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Erdalkaliionen um Calciumionen und/oder Magnesiumionen handelt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplexbildner [NR1R2R3R4]+--lonen enthält, wobei R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H- und Alkyl-Gruppen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplexbildner mindestens ein Salz enthält, dass ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ammoniumhydrogencitrat, Ammoniumcitrat, Ammoniumthioglycolat, Ammoniumchlorid, Ammoniumacetat, Tetramethylammoniumcitrat und Tetramethylammoniumthioglycolat.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Transportmedium auf einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 6 eingestellt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass dem Transportmedium ein Citronensäure/Citrat- Puffer und/oder ein Essigsäure/Acetat- Puffer und/oder ein Thioglycolsäure/Thioglycolat- Puffer zugesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Transportmedium nach Zusetzen (12) des Komplexbildners zuerst durch einen porösen Volumenfilter (21) filtriert wird (13) und anschließend durch einen Membranfilter (22) mit einer Porengröße im Bereich von 0,2 pm bis 2,0 pm filtriert wird (14). 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem
Membranfilter (22) zurückbleibende Zellen von Erdalkalihydrogenphosphaten, Erdalkali-Dihydrogenphosphaten und Verunreinigungen des Transportmediums befreit werden (15). 10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem
Membranfilter (22) zurückbleibende Zellen lysiert werden (16).
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass beim Lysieren
(16) freigesetzte Nucleinsäuren aus dem Membranfilter eluiert werden.
12. Vorrichtung (20) zum Isolieren von Zellen aus einem Transportmedium, hintereinander aufweisend einen porösen Volumenfilter (21) und einen Membranfilter (22) mit einer Porengröße im Bereich von 0,2 pm bis 2,0 pm.
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