CN115190913A - 处理生物样品的方法和用于从运输培养基中分离细胞的装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及处理包含在运输培养基中的生物样品的方法。将至少一种与碱土金属离子形成络合物的络合剂添加到运输培养基中。在该方法中可以使用装置(20),该装置依次具有多孔性容积过滤器(21)和孔径为0.2µm至2.0µm的膜过滤器(22)。
Description
本发明涉及处理运输培养基,例如Amies培养基中的生物样品的方法。此外,本发明涉及用于从运输培养基中分离细胞的装置。
现有技术
在诊断学中,用于生物样品,例如细菌样品的许多所谓的运输培养基已成为临床标准。这使得可能将患者拭子或患者样品运输到诊断实验室,而不会在此损坏位于运输培养基中的细菌或以掺假的方式改变细菌组成。运输培养基为病原体创造了受控的“健康氛围”,以使得它们例如可以在其目的地被引入特殊的营养培养基中并继续繁殖。细菌培养中的细菌繁殖是重要的诊断参数,其提供关于从患者身上提取的这类病菌的身份、活力、增殖速度和抗生素敏感性的信息。因此,运输培养基必须确保在这一点上不出现随后诊断的掺假,例如其中特别敏感、但可能完全危险的病菌过早死亡,然后在微生物培养物中不再能被检测。一种广泛传播的运输培养基是所谓的Amies培养基。
发明公开
在所述处理包含在运输培养基中的生物样品的方法中设置,将至少一种与碱土金属离子,特别是与钙离子和镁离子形成络合物的络合剂添加到运输培养基中。运输培养基特别是Amies培养基。由于Amies培养基存在多种变体,在该方法的意义上,以组合物形式包含钙离子、镁离子、磷酸氢根离子和磷酸二氢根离子的所有培养基都被理解为Amies 培养基,在该组合物中超过磷酸氢钙、磷酸二氢钙、磷酸氢镁和磷酸二氢镁的溶度积的至少之一。该方法特别有利地适用于处理包含在其中超过所有四种溶度积的Amies培养基中的生物样品。例如,Amies培养基包含碱土金属磷酸氢盐和/或碱土金属磷酸二氢盐的悬浮液,其中一些未溶解地作为悬浮物存在。这些化合物的问题在于如下事实:它们是虽然本身不溶于水或仅难溶于水、但可在其分子结构中很好地结合类水物质的乳化剂。因此,这类盐通常用作脂肪相中的水的乳化剂。这种钙盐特别地用于食品中,例如用于香肠产品中的水的乳化。在分子生物学过程中,当生物样品被裂解时,这种效应导致游离核酸与未溶解的钙盐和镁盐分子簇发生不希望的结合,从而使核酸此后不再能用于PCR检测反应,并且由于它们不再能被检测,必须被视为丢失。所述络合剂的添加的效果是将难溶性碱土金属磷酸氢盐和/或碱土金属磷酸二氢盐转化为可溶形式,该可溶形式不再对游离核酸具有不希望的结合性能。优选在将Amies培养基引入到被设置用于分析生物样品的芯片实验室系统后立即添加络合剂。络合剂特别优选在芯片实验室系统中以合适的形式预先位于合适位置,例如作为固体或作为液体试剂。例如,作为固体预先存在的络合剂可以例如在与Amies样品接触时溶解,然后通过形成络合物而将碱土金属磷酸盐转化为可溶形式。
所述络合剂优选包含[NR1R2R3R4]+离子,其中R1、R2、R3和R4彼此独立地选自氢和烷基。所述络合剂特别优选包含铵离子(NH4 +)。铵离子与钙离子和镁离子形成易溶的二氨合钙络合物和二氨合镁络合物。
为了提供铵离子或烷基铵离子,该络合剂优选包含至少一种盐,所述盐选自柠檬酸氢铵(“二元柠檬酸铵”)、柠檬酸铵(“三元柠檬酸铵”)、巯基乙酸铵、氯化铵、乙酸铵、柠檬酸四甲基铵和巯基乙酸四甲基铵。虽然氯化铵可以容易且廉价的方式用作铵离子源,但所述组中包含的其它铵盐和四甲基铵盐提供额外的阴离子,所述阴离子在运输培养基中形成缓冲体系。
运输培养基由于所提及的添加剂优选调节到5至6的pH值。由此还进一步促进难溶性碱土金属盐的溶解,因为在酸性pH下,磷酸氢盐向更易溶解的磷酸二氢盐转移,如以下反应平衡所示:
例如包含在生物样品中的细菌在该pH范围内仍保持完好。虽然它们在该pH值范围内可能在其活力方面受到严重损害,但对于随后的分子生物学过程而言,重要的只是细胞膜未受损的细胞保持完好。优选在添加络合剂的同时或以添加络合剂的形式调节pH值,因为在适当选择的情况下,其本身单独地就已能具有上述缓冲效果。在所述方法的该实施方案中,络合剂同时用作缓冲剂。这适用于例如柠檬酸氢铵,即所谓的“二元柠檬酸铵”(NH4)2H柠檬酸盐,其本身调节到5至6的pH值。如果取而代之地使用“三元柠檬酸铵”,即(NH4)3 柠檬酸盐,则实现约7的几乎中性pH值。此时,以组合形式作为缓冲体系进一步添加柠檬酸允许调节到5至6的所需pH范围。
优选地,将柠檬酸/柠檬酸盐缓冲剂和/或乙酸/乙酸盐缓冲剂和/或巯基乙酸/巯基乙酸盐缓冲剂添加到运输培养基中。这些缓冲剂特别适用于调节至5至6的pH值。如果应使用柠檬酸/柠檬酸盐缓冲剂,则络合剂优选为柠檬酸氢铵、柠檬酸铵或柠檬酸四甲基铵,并且还向其中添加柠檬酸。如果缓冲剂应为乙酸/乙酸盐缓冲剂,则络合剂优选为乙酸铵,并且向其中添加乙酸。如果应使用巯基乙酸/巯基乙酸盐缓冲剂,则络合剂优选为巯基乙酸铵或巯基乙酸四甲基铵,并向其中添加巯基乙酸,巯基乙酸也被称为硫代乙醇酸。原则上,络合剂也可以仅包含适合于形成缓冲剂的盐之一,即柠檬酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐或巯基乙酸盐,然后通过添加另一种有机酸从其中释放相应的酸。为此特别合适的是扁桃酸。也可以设置的是将另一种有机酸如扁桃酸添加到盐和相应酸的已有体系中。
在没有非常严重地稀释样品的情况下,仅非常困难地可能在运输培养基中建立如将核酸与过滤器玻璃料结合所需的足够的离液条件。例如鉴于芯片实验室卡盒的容量和试剂的消耗量有限和因此要检测的被分析物量受限,这导致要处理的样品材料量受到限制,或由于离液条件不足和因此核酸与过滤器玻璃料的结合差而导致DNA大量丢失。这两者的结果是检测灵敏度差。为了解决这个问题,在该方法中优选的是,在添加络合剂之后首先通过多孔性容积过滤器过滤运输培养基。然后通过孔径为0.2 µm至2.0 µm的膜过滤器过滤。这两种过滤器优选地以单个过滤器堆叠体的形式彼此堆叠组合。膜过滤器的孔径特别优选为0.4 µm至1.2 µm,非常特别优选0.8 µm至1.0 µm。孔径数值的说明在此总是基于膜过滤器,而并非上游的多孔性容积过滤器。通过这种孔径,膜过滤器可以与上游的多孔性容积过滤器结合着良好地截留细胞,例如细菌细胞,而本身不会堵塞。来自生物样品的其它物质,例如溶解的粘液或血液成分或其它杂质穿过过滤器装置,或已被容积过滤器截留而不会堵塞膜过滤器。连接在膜过滤器上游的多孔性容积过滤器尤其可以具有恒定的孔隙率或朝着膜过滤器减小的一系列孔隙率值。它使得能够截留包含在运输培养基中的悬浮物,例如活性炭或样品杂质,以使它们不能堵塞膜过滤器,而只有来自生物样品的细胞聚集在膜过滤器上。
对于生物样品的进一步处理而言优选的是,留在膜过滤器上的细胞脱除运输培养基的碱土金属磷酸氢盐、碱土金属磷酸二氢盐和杂质。由于它们已通过添加络合剂转化为可溶形式,这可以容易地通过用洗涤缓冲剂洗涤实现。为此,可以特别地使用聚山梨醇酯/水混合物。在此,运输培养基的其它残留物和来自生物样品的剩余小杂质,例如粘液也被洗去。
为了从留下的细胞中释放核酸,优选的是它们在膜过滤器上被裂解。合适的裂解方法尤其是加热至优选超过60℃的温度和/或添加裂解培养基,例如尤其是辛苯昔醇9和/或机械应力,尤其是通过超声作用。
为了能够用释放的核酸实施PCR检测反应,它们优选从膜过滤器中洗脱出来。这既可以在裂解期间、也可以在裂解之后发生。如果洗脱应与裂解同时进行,则裂解培养基也用作洗脱剂。在随后洗脱时,核酸在裂解完成后通过合适的洗脱剂从膜过滤器中冲洗出来。在将洗出液与PCR主混合物(例如以预先存在于芯片实验室中的冻干PCR珠的形式)混合后,然后可以进行PCR扩增和检测反应。
在该方法中,可以使用用于从运输培养基中分离细胞的装置,该装置依次具有多孔性容积过滤器和孔径为0.2 µm至2.0 µm的膜过滤器。膜过滤器的孔径优选为0.4至1.2 µm,特别优选0.8至1.0 µm。
附图简述
图1示出了根据本发明的方法的实施例的流程图。
图2示出了根据本发明的装置的实施例的示意图。
本发明的实施例
在本发明的一个实施例中,将生物样品,即患者拭子形式的细菌样品引入到作为运输培养基的Amies培养基中。本实施例中的Amies培养基包含
0.2 g/l 氯化钾
0.2 g/l 磷酸二氢钾
0.1 g/l 氯化钙
3.0 g/l 氯化钠
1.15 g/l 磷酸氢钠
1.0 g/l 巯基乙酸钠
0.1 g/l 氯化镁
6.5 g/l 琼脂。
其pH值为约7.3。在将Amies培养基与生物样品一起运输到诊断实验室后,使用根据本发明的方法的实施例对其进行处理。如图1所示,在该方法的开始10之后,将具有生物样品的Amies培养基引入11到芯片实验室系统中。在此,将形成络合物的缓冲混合物添加12到Amies培养基中。在本实施例中,形成络合物的缓冲混合物包含用于将Amies培养基缓冲到5至6的pH值的混合比的柠檬酸氢铵和柠檬酸。在 Amies 培养基中悬浮的磷酸二氢钙、磷酸氢钙、磷酸二氢镁和磷酸氢镁(其由两种碱土元素的氯化物以及磷酸二氢钾和磷酸氢钠形成)在此在形成二氨合钙络合物和二氨合镁络合物的情况下再次转移到溶液中。然后将如此处理的Amies培养基引入到布置在芯片实验室中的用于分离细胞的装置20中,该装置在图2中示出。
装置20具有多孔性容积过滤器21。紧接在其下游布置多孔膜过滤器22,该多孔膜过滤器在本实施例中具有0.9 µm的孔径。在容积过滤器21的入口位置23处将Amies培养基引入到装置20中。由此,首先通过容积过滤器21过滤13 Amies培养基。在此,琼脂和较大颗粒或样品杂质截留在容积过滤器21中,而细菌细胞毫不费力地穿过容积过滤器并由此到达膜过滤器22。然后通过膜过滤器22对Amies培养基进行进一步过滤14。在此,生物样品的细菌细胞截留在膜过滤器22上,而Amies培养基的所有可溶组分作为水溶液通过膜过滤器22和随后的出口位置24离开装置20。
现在对膜过滤器22上的细胞进行洗涤15,其中通过入口位置23将Tween®/水混合物(聚山梨醇酯/水混合物)引入到装置20中。这将Amies培养基的剩余可溶成分以及仍粘附在细胞表面上的生物样品的可溶成分穿过膜过滤器22并穿过出口位置24从装置20中洗涤出来。然后对细胞进行裂解16,其中通过入口位置23将0.1重量%的Triton® X-100(辛苯昔醇9)溶液引入到装置20中。其充当裂解培养基并且同时将通过裂解获得的细菌的游离核酸从出口开口24从装置20中洗脱出来。将洗出液与冻干PCR珠形式的PCR主混合物混合,并实施17 PCR检测反应。然后终止18该方法。
Claims (12)
1.处理包含在运输培养基中的生物样品的方法,其特征在于将至少一种与碱土金属离子形成络合物的络合剂添加到运输培养基中(12)。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述运输培养基是Amies培养基。
3.根据权利要求1或2的方法,其特征在于碱土金属离子是钙离子和/或镁离子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其特征在于所述络合剂包含[NR1R2R3R4]+离子,其中R1、R2、R3和R4彼此独立地选自H和烷基。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于所述络合剂含有至少一种盐,所述盐选自柠檬酸氢铵、柠檬酸铵、巯基乙酸铵、氯化铵、乙酸铵、柠檬酸四甲基铵和巯基乙酸四甲基铵。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其特征在于,将所述运输培养基的pH值调节到5至6。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于将柠檬酸/柠檬酸盐缓冲剂和/或乙酸/乙酸盐缓冲剂和/或巯基乙酸/巯基乙酸盐缓冲剂添加到运输培养基中。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其特征在于在添加(12)所述络合剂之后,所述运输培养基首先通过多孔性容积过滤器(21)过滤(13),然后通过孔径为0.2 µm至2.0µm的膜过滤器(22)过滤(14)。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于留在所述膜过滤器(22)上的细胞脱除运输培养基的碱土金属磷酸氢盐、碱土金属磷酸二氢盐和杂质(15)。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于留在所述膜过滤器(22)上的细胞被裂解(16)。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于将裂解(16)时释放的核酸从所述膜过滤器中洗脱出来。
12.用于从运输培养基中分离细胞的装置(20),其依次具有多孔性容积过滤器(21)和孔径为0.2 µm至2.0 µm的膜过滤器(22)。
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