WO2023088991A1 - Verfahren zur aufkonzentrierung mindestens einer zielsubstanz in einem flüssigkeitsvolumen - Google Patents

Verfahren zur aufkonzentrierung mindestens einer zielsubstanz in einem flüssigkeitsvolumen Download PDF

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WO2023088991A1
WO2023088991A1 PCT/EP2022/082182 EP2022082182W WO2023088991A1 WO 2023088991 A1 WO2023088991 A1 WO 2023088991A1 EP 2022082182 W EP2022082182 W EP 2022082182W WO 2023088991 A1 WO2023088991 A1 WO 2023088991A1
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WO
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liquid
sample
volume
target substance
superabsorbent
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Application number
PCT/EP2022/082182
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English (en)
French (fr)
Inventor
Timo Hillebrand
Elmara Graser
Wiebke JACOBI
Original Assignee
Ist Innuscreen Gmbh
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers

Definitions

  • the invention relates to a method for concentrating at least one target substance in a liquid volume and for generating a sample containing at least one target substance.
  • Target substances to be detected or monitored can be biomolecules such as eukaryotic cells, prokaryotic cells, subcellular vesicles, bacteriophages, viruses, toxins, antibodies or also nucleic acids or proteins.
  • Analysis methods are used for the qualitative or quantitative determination of target substances in samples taken from a liquid to be examined.
  • laboratory methods that can be carried out manually or automatically or at least partially automatically, or analytical devices that work completely automatically are available.
  • the automated analyzers also include online analyzers that continuously or discontinuously take samples from the liquid to be monitored and carry out a qualitative or quantitative determination of the target substance.
  • the problem arises of providing a sufficient amount of the target substance for the subsequent analysis when taking the sample.
  • the target substance is present in an untreated fluid sample at a concentration too low for subsequent processing or analysis. This results in the need for a concentration of the target substance in the sample.
  • An example of this is the detection of biomolecules in water or wastewater, e.g. the detection of SARS-CoV-2 in water using molecular genetic techniques such as PCR or real-time PCR.
  • the concentration of the virus particles to be detected or of viral fragments in the waste water is often too low to be able to be detected using the methods known to those skilled in the art. While a volume of 200 pl is sufficient when examining blood samples for the presence of a virus infection, the sample volume required when examining water/wastewater is significantly larger. Starting quantities of up to several liters are described in the literature.
  • the concentration of target molecules in a liquid volume not only plays an important role in the preparation of samples for molecular genetic analysis techniques, but also for all immunological technologies and spectroscopic technologies such as molecular spectroscopy or mass spectroscopy.
  • the concentration of target substances, in particular biomolecules, in a liquid volume also plays a role in the production of substances containing the target substances or biomolecules Raw products or products intended for further use for research purposes, for industrial purposes or for therapeutic purposes.
  • a sample collection device for flow-through sampling in bodies of water is known from US 2015/0224502 A1.
  • the way to concentrate low concentrations of target substances in water is to retain the target substances in a filter or adsorption medium and release the substances adsorbed on the filter for subsequent analysis by elution or as lysate and make them available to an analysis module.
  • This method is also expensive in terms of apparatus and cannot be used universally.
  • the object of the invention is to provide a simple, fast and universally applicable method for generating a sample containing at least one target substance from a volume of a sample liquid containing the at least one target substance for subsequent analysis or as a raw product or product for subsequent use research purposes, for therapeutic purposes or for industrial purposes, e.g. for product manufacture.
  • the method according to the invention for generating a sample containing at least one target substance from a first liquid volume of a sample liquid containing at least one target substance by concentrating the at least one target substance in the first liquid volume comprises: - adding a super absorber to the first volume of liquid or adding the first volume of liquid to the super absorber,
  • Another method according to the invention for generating a sample containing at least one target substance from a first liquid volume of a sample liquid containing at least one target substance comprises:
  • the second mixture formed from the superabsorbent and the second volume of liquid can be incubated before the sample of the liquid portion of the second mixture is taken, for example in order to set a specific concentration range of the target substance or a specific volume of the liquid portion.
  • the aqueous liquid added in this method after incubating the first mixture can, for example, comprise a lysis buffer.
  • the incubation of the first mixture formed from the superabsorbent and the first volume of liquid can be carried out until the liquid portion of the first mixture is greatly reduced.
  • the liquid portion can also disappear completely or at least be reduced to such an extent that liquid can no longer be taken up from the mixture using a pipette or a swab.
  • a sample containing at least one target substance is generated, which can subsequently be analyzed and/or used further as a raw product or product in a process or method.
  • the term sample is therefore used to describe a volume of substance, for example a liquid, which contains the target substance in one of the inventive generation of the sample contains influenceable or adjustable concentration.
  • the sample can thus not only be available for a subsequent analysis, but it can also be used as a raw product or product for further research purposes or for industrial product manufacture, for example, or for therapeutic purposes.
  • Such samples serving as a raw product or product can, for example, comprise concentrated viruses, nucleic acids, antibodies or proteins.
  • Superabsorbers also: superabsorbent polymers, SAP
  • SAP superabsorbent polymers
  • Liquids suitable for absorption by the superabsorbent are polar solvents such as water or aqueous solutions. When the liquid is absorbed, the superabsorbent swells and forms a hydrogel. Hydrogels can form any crosslinked polymer that is polar, e.g., polyacrylamide, polyvinylpyrrolidone, amylopectin, gelatin, cellulose.
  • plastics in particular the plastics mentioned here and below, are preferred over biological polymers.
  • Other polyacrylates or other polymers or copolymers based on acrylic acid or acrylate as a monomer are also suitable.
  • a so-called core crosslinker (CXL) can be added to the monomer solution during the production of the copolymer, which connects (crosslinks) the long-chain polymer molecules formed with one another in places using chemical bridges. These bridges make the polymer insoluble in water.
  • This so-called base polymer is optionally subjected to what is known as surface post-crosslinking (surface cross-linking, SXL).
  • SXL surface cross-linking
  • Another chemical is applied to the surface of the particles, which, when heated, forms a second network only on the outer layer of the grain. This shell supports the swollen gel to hold it together even under external stress (movement, pressure).
  • Superabsorbents in the form of granules are used, for example, in baby diapers, monthly hygiene products, in incontinence care and in bandages. The use in cable sheathing for deep sea lines is also known. Furthermore, superabsorbents are used as gel-forming extinguishing agents in firefighting, as mechanical stabilizers for cut flowers in a vase or as an additive for potting soil for permanent water storage. Because of its better environmental compatibility, potassium hydroxide-neutralized acrylic acid is used here. In the form of spherical particles, the use of superabsorbents under designations such as "water beads", “aqua beads” or “water beads” is known as toys.
  • super absorbers which are commercially available in the form of small beads of variable sizes from submillimeters to centimeters.
  • a high proportion of the liquid is absorbed by the superabsorbent, but the target substance is remains in the liquid portion not taken up by the superabsorbent or, with substantially complete disappearance of the liquid portion, remains on the surface of the superabsorbent.
  • the concentration of the at least one target substance in a liquid portion of the first mixture remaining after incubation or the concentration of the target substance in a solution that is obtained by adding an aqueous solution to the after SAP remaining after incubating the first mixture is substantially proportional to the concentration of the target substance in the original sample liquid.
  • This effect can also be used for a targeted setting of a desired concentration of the target substance in a sample that is used as a raw product or product for further research purposes, therapy purposes or product manufacture.
  • the first liquid volume can contain a polar liquid, in particular as the main component.
  • the first volume of liquid can contain a polar solvent, in particular as the main component.
  • the first liquid volume can consist of a polar solvent to a mass fraction of at least 50%.
  • the polar liquid or polar solvent can be water, for example.
  • the target substance can be a biomolecule. It can be selected from the following substances: eukaryotic cells, components of eukaryotic cells, prokaryotic cells, components of prokaryotic cells, subcellular vesicles, bacteriophages, viruses or virus components, toxins, antibodies, nucleic acids and proteins.
  • the superabsorber can be a plastic or comprise a plastic that absorbs a proportion of the liquid volume, eg a polar solvent contained in the liquid volume, such as water, to form a gel or hydrogel.
  • the plastic is advantageously selected in such a way that it essentially does not contain any biomolecules or the substances specified above, such as eukaryotic cells, components of eukaryotic cells, prokaryotic cells, components of prokaryotic cells, subcellular vesicles, bacteriophages, viruses or virus components, toxins, antibodies, absorbs nucleic acids and proteins.
  • the super absorber should therefore not absorb the target substance, eg biomolecules, or only to a negligible extent for the purpose of enriching the target substance in the sample to be produced. This is the case, for example, with the superabsorbers mentioned the polymer or copolymer materials mentioned, for example with the commercially available water beads, water beads etc. the case.
  • the superabsorbent can be used in the form of particles, e.g. as a powder, as granules or in the form of geometric bodies, in particular spheres (spherical particles). It can thus be added to the volume of liquid in the form of such particles, or the volume of liquid can be added to the superabsorbent in this form.
  • the particles or spheres can have a diameter of between 100 and 5000 ⁇ m.
  • the super absorber is a commercially available super absorber bead, for example a super absorber bead available under the designations “Aquabeads”, “Water Beads”, “Water Beads”, “Aqua Beads”, “Hydro Balls”, “Gel Balls”.
  • the volume of the liquid portion of the above-mentioned first and/or second mixture remaining after the incubation step, and thus the concentration of the target substance in the remaining liquid portion can be determined by the duration of the incubation, by the size and number of superabsorbent particles or superabsorbent beads from the superabsorbent added to the volume of liquid, and/or by the temperature prevailing during incubation.
  • the invention also includes the use of a superabsorbent to concentrate a target substance, in particular a biomolecule, in a volume of liquid.
  • the volume of liquid can contain a polar liquid, in particular water, with the superabsorbent being set up to absorb the polar liquid, e.g. water, or at least part of the polar liquid, with the formation of a hydrogel.
  • the superabsorber can be formed from the materials described above and, in the configurations described above, can be used as granules or, particularly preferably, in the form of spheres, in particular commercially available water beads, water beads or aqua beads.
  • the use may comprise adding the superabsorbent to the volume of liquid or adding the volume of liquid to the volume of liquid and incubating the mixture so formed, as explained above with regard to the methods of the invention described above.
  • the use can also be the control of a temperature and/or an incubation time in order to specifically set a concentration or a concentration range of the target substance in the liquid portion of the mixture.
  • the invention includes a method for concentrating a superabsorbent for concentrating a target substance, in particular a biomolecule, in a volume of liquid by adding a superabsorbent to the volume of liquid or by adding the volume of liquid to the superabsorbent and incubating.
  • a sample taken from the remaining liquid portion of the mixture of the liquid and the superabsorbent after the incubation can be used for further analysis or for further use, for example in a production process or for therapeutic or research purposes.
  • the volume of the sample taken can essentially correspond to the volume of the remaining liquid portion or be significantly less than the volume of the remaining liquid portion.
  • the invention also includes a kit for carrying out the methods and/or method variants described above.
  • the kit can include the super absorber and other substances and/or means for carrying out the method.
  • the kit can, for example, comprise at least one container containing a superabsorbent, into which an initial volume of liquid can be added for concentration.
  • the sample obtained according to the methods described or according to the use described can be fed manually or automatically to a laboratory device for further treatment or analysis. Further analysis can be carried out using molecular genetic analysis techniques, immunological technologies and spectroscopic technologies, e.g. molecular spectroscopy or mass spectroscopy, sensor-based, e.g. using optical or electrochemical sensors, by cultivation, sequencing or flow cytometry.
  • molecular genetic analysis techniques immunological technologies and spectroscopic technologies, e.g. molecular spectroscopy or mass spectroscopy, sensor-based, e.g. using optical or electrochemical sensors, by cultivation, sequencing or flow cytometry.
  • the invention also includes a method for the qualitative or quantitative determination of at least one target substance in a sample liquid, comprising: generating a sample containing the at least one target substance from a first liquid volume of a sample liquid containing the at least one target substance according to one of the above-described methods according to the invention in a of the embodiments described above, and the qualitative or quantitative detection of the at least one target substance in the sample using at least one of the following methods: nucleic acid-based detection methods, sequencing, immunological detection methods, microbiological analyses, microscopic methods, mass spectrometry, sensor-based detection and flow cytometric techniques .
  • the target substance can be one of the biological substances mentioned further above.
  • Nucleic acid-based detection methods can include, for example, PCR, real-time PCR, digital PCR-based methods or sequencing.
  • Immunological detection methods can be immunological assays such as ELISA or lateral flow tests. Microbiological analysis may involve culturing live cells in the sample.
  • Sensor-based detections can include detection methods using optical, spectroscopic or electrochemical sensors.
  • the sample produced or the further treated sample can be placed in a cartridge, in particular a microfluidic cartridge, of a automatic analysis device for automated detection of the target substance using molecular genetic techniques such as PCR or real-time PCR. This can be done manually or automatically.
  • the invention also includes a kit for carrying out the method described for the qualitative or quantitative determination of at least one target substance in the sample liquid.
  • This kit can contain at least the superabsorber in a dosage form suitable for the method and, if necessary, other chemicals such as buffer solutions or lysis buffer.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a liquid before (a) and after addition of a superabsorbent in the form of spheres and incubation (b);
  • FIG. 5 shows a gel electrophoretic representation of genomic DNA from a water sample without concentration and after concentration using the method according to the invention
  • 6 shows a gel electrophoretic representation of the DNA of eukaryotic cells from a water sample without concentration and after concentration using the method according to the invention; and 7 Amplification curves of various samples of water containing DNA in very low concentration, without concentration and after concentration by means of the method according to the invention using superabsorbent beads of different sizes.
  • water beads commercially available so-called water beads (commercially available under the designations aqua beads, water beads, water beads, or gel beads, among others) were added to a liquid volume of 1 liter. These water beads are made from a super absorber material. The liquid was surface water that had been taken from a fire-fighting pond with suspended matter. After an incubation period, the beads swelled to many times their original volume. The volume of the liquid portion of the mixture of the liquid and the water beads was reduced. Surprisingly, it turned out that the suspended matter in the liquid was not absorbed by the swelling beads. The liquid portion of the mixture including the suspended solids (volume 400 ml) was transferred to a new vessel. A sample with a volume of 50 ml was taken from this liquid portion.
  • a comparison sample with a volume of 50 ml was taken directly from the liquid, i.e. the surface water mentioned, without previously concentrating the liquid according to the method described. Both samples were centrifuged at 5000 x g for 10 min. The supernatant was removed and the pellet used for nucleic acid extraction. The nucleic acid extraction was carried out using a commercial kit (innuprep Stool DNA Mini Kit; IST Innuscreen GmbH). The DNA from both samples was then examined for the amount of total bacterial count using real-time PCR.
  • Further processing can be, for example, a nucleic acid extraction, a measurement or a direct analysis with a wide variety of technologies, such as NGS applications, immunological technologies, spectroscopic technologies, molecular spectroscopic or mass spectrometric technologies, etc.
  • the transferred part of the liquid fraction can also be used as a product for further research purposes, for therapeutic purposes or as a raw product in a production process.
  • the degree of concentration and the speed of this process can be controlled very precisely by means of the type of superabsorbent used, by means of the amount used, or by means of the incubation time and/or the incubation temperature.
  • the problem of processing low-concentration samples for further processing of the target substances of interest, in particular biomolecules, or their detection can thus be easily solved with the method.
  • the process does not require expensive devices such as ultracentrifuges, expensive ultrafiltration membranes, complex processes such as PEG precipitation or general precipitation reactions for concentrating nucleic acids, etc.
  • the method can be used universally with regard to the target substances, in particular for biomolecules.
  • the superabsorbents are non-toxic and harmless and often biodegradable. The examination of low-concentration biomolecules can thus be greatly simplified with the method according to the invention.
  • the following method can be used to generate a sample of a sample liquid that can be used for a qualitative or quantitative analysis and that contains biomolecules such as eukaryotic cells, prokaryotic cells, viruses, phages or subcellular compartments as the target substance to be determined qualitatively or quantitatively:
  • a first volume of the sample liquid are treated with a super absorber in such a way that the entire liquid is absorbed by the super absorber.
  • the so-called water beads already described are preferably used as superabsorbers.
  • a lysis buffer is added to the superabsorbent and the resulting mixture is incubated.
  • the type of lysis buffer and/or the incubation time can be chosen at will.
  • the lysis buffer is then separated from the superabsorbent.
  • the liquid sample thus obtained contains the target substance. If necessary, the biomolecules contained in the sample as target substance can be further lysed. After lysis, the sample can be used for nucleic acid extraction. Provided that the lysis has already been successfully implemented, the lysate is used for a nucleic acid extraction without further incubation.
  • Example 1 Concentration of a dirty water sample with a volume of 1 liter
  • samples 1 and 2 were concentrated sample liquid and, for comparison, two samples of the non-concentrated sample contained in the second sample bottle Sample liquid (samples 3 and 4) is centrifuged in a 15 ml reaction tube at 5000 rpm for 10 min and the supernatant is removed. The resulting sediment pellet was subsequently used for DNA extraction.
  • the DNA extraction was carried out using a commercial kit (innuPREP Stool DNA Kit; IST Innuscreen GmbH).
  • the extracted DNA was used to determine the total bacterial count using real-time PCR.
  • a commercial kit was used as the detection system (innuDETECT Bacteria Quantification Assay; IST Innuscreen GmbH).
  • Standard DNA from the assay was used to determine the bacterial copy number in the sample.
  • Curves A (solid line) are the amplification curves of the three standards.
  • Curves B (long and short dashes) are the amplification curves of samples 1 and 2 taken from the concentrated sample liquid, and curves C (equal length dashes) are the amplification curves of samples 3 and 4 taken from the untreated sample liquid.
  • Table 1 gives the Ct values and copy numbers for each standard and sample.
  • Tap water with added salmonella was used as the sample liquid, with 1 ⁇ 10 6 salmonella being added as a spike to a volume of 10 ml of the tap water.
  • sample 1 and 2 Two samples (sample 1 and 2) of 200 ⁇ l each were taken as comparison samples from such an unconcentrated sample liquid volume.
  • Two further sample liquid volumes of 10 ml were concentrated using the method according to the invention.
  • Super absorber beads commercially available under the name “Water Beads” were used for the constriction have a mass of approx. 0.006 g and a diameter of approx. 1 mm per sphere. 40 pieces of the "Water Beads” were placed in each of the two sample liquid volumes. By incubating the mixture thus obtained, its liquid portion was concentrated to a volume of about 500 ⁇ l.
  • sample liquid volume of 10 ml was processed with a standard method using a filtration membrane.
  • the sample liquid volume was filtered through a filter membrane (0.45 ⁇ m MCE membrane; Millipore) using a vacuum pump.
  • the filter was cut up and mixed with 600 ⁇ l of 1 ⁇ PBS solution and homogenized in a lysis tube using a homogenizer (SpeedMill, Analytik Jena GmbH). From the approximately 500 ⁇ l liquid obtained after homogenization, two samples with a volume of 200 ⁇ l each were also used for the DNA extraction (samples 7, 8).
  • the DNA was extracted using an automated method on the KingFisher Flex (Thermo Fisher) machine and a commercially available kit (deltaPREP AniPath DNA/RNA Kit KFFLX; IST Innuscreen GmbH).
  • the extracted DNA was used to detect salmonella using real-time PCR.
  • a commercial kit was used as the detection system (innuDETECT Salmonella enterica Assay; IST Innuscreen GmbH).
  • the curves A (long and short dashes) show the courses of the amplification curves of samples 1 and 2 of the unconcentrated sample liquid.
  • the curves B (lines of equal length) are the amplification curves of samples 3 to 6 of the sample liquid concentrated according to the method according to the invention.
  • Curves C (solid line) are the amplification curves of samples 7 and 8 obtained by filter-based enrichment.
  • Table 2 gives the Ct values for the individual samples.
  • Table 2 The differences in the Ct values arithmetically show a 32-fold concentration of the original sample with regard to the Salmonella number. The accumulation of bacteria on a filter shows poorer efficiency compared to the method according to the invention.
  • Tap water with added MS2 bacteriophages was used as the sample liquid, with 5 ⁇ l of an MS2 bacteriophage solution (Leibniz Institute DSMZ: DSM 13767) being added as a spike to a volume of 10 ml of tap water.
  • MS2 bacteriophage solution Leibniz Institute DSMZ: DSM 13767
  • sample 1 and 2 Two samples (sample 1 and 2) of 200 ⁇ l each were taken as comparison samples from such a sample liquid volume.
  • Two further sample liquid volumes of 10 ml each of the sample liquid were concentrated using the method according to the invention.
  • commercially available super absorber beads were used under the designation “Water Beads”, which have a mass of approx. 0.006 g and a diameter of approx. 1 mm per bead. 40 pieces of the "Water Beads" were placed in each of the two sample liquid volumes. By incubating the mixture thus obtained, its liquid portion was concentrated to a volume of about 500 ⁇ l. 2 ⁇ 200 ⁇ l each of this liquid portion were used for the subsequent phage RNA extraction (samples 3 to 6).
  • sample liquid volume of 10 ml was processed with a standard method using a filtration membrane.
  • the sample liquid volume was filtered through a filter membrane (0.45 ⁇ m MCE membrane; Millipore) using a vacuum pump.
  • the filter was cut up and mixed with 600 ⁇ l of 1 ⁇ PBS solution and homogenized in a lysis tube using a homogenizer (SpeedMill, Analytik Jena GmbH). From the approximately 500 ⁇ l liquid obtained after homogenization, two samples with a volume of 200 ⁇ l each were used for the phage RNA extraction (samples 7, 8).
  • the phage RNA extraction was carried out using an automated method on the automated KingFisher Flex (Thermo Fisher) and a commercially available kit (deltaprep AniPath DNA/RNA Kit KFFLX; IST Innuscreen GmbH).
  • the extracted phage RNA was used to detect the MS2 phage RNA using real-time PCR.
  • a commercial kit was used as the detection system (innuDETECT Internal Control DNA/RNA Assay; IST Innuscreen GmbH).
  • a commercial OneStep RT master mix was used for the reverse transcription and amplification of the MS2 phage RNA (innuDRY qRT-PCR MasterMix Probe; IST Innuscreen GmbH).
  • the curves A (long and short dashes) indicate the courses of the amplification curves of samples 1 and 2 of the unconcentrated sample liquid.
  • Curves B (lines of equal length) are the amplification curves of samples 3 to 6 of the after inventive method concentrated sample liquid.
  • Curves C (solid line) are the amplification curves of samples 7 and 8 obtained by filter-based enrichment.
  • Example 4 Concentration of genomic DNA in a water sample and spectrophotometric measurement
  • genomic DNA was isolated from a blood sample.
  • the DNA was dissolved in water and the concentration of the DNA was adjusted to 10 ng/pl.
  • the initial volume of the sample liquid produced in this way was 2 ml.
  • the concentration was carried out by adding 10 commercially available "Water Beads" (weight per piece approx. 0.006 g; diameter: approx. 1 mm).
  • the volume of the sample liquid was reduced to a residual volume of 500 ⁇ l and a first spectrophotometric measurement was carried out to determine the concentration of the DNA in the liquid portion of the mixture.
  • Example 5 Concentration of genomic DNA from a 2 ml sample and detection of the increase in concentration on an agarose gel
  • Genomic DNA was isolated from a blood sample to demonstrate that the method according to the invention is also suitable for concentrating genomic DNA in a sample liquid.
  • the DNA was dissolved in water and the concentration of the DNA was adjusted to 10 ng/pl.
  • the starting volume of the sample liquid produced in this way was 2 ml.
  • a first sample was taken from this starting volume as a comparison sample for gel electrophoresis.
  • the initial volume was reduced by adding 10 pieces of commercially available “Water
  • FIG. 5 shows the gel electrophoretic representation of the DNA, with the DNA ladder being in the first lane (1), the comparison sample being in the second lane (2) and the second sample from the restricted residual volume being in the third lane (3).
  • the gel image clearly shows the greatly increased amount of DNA after concentration compared to the sample liquid that was not concentrated.
  • Example 6 Enrichment of eukaryotic cells in a sample liquid and subsequent extraction of the DNA from these cells
  • nucleated cells were isolated from a blood sample. The cells were then completely resuspended in an initial volume of 2 ml of water. Before the sample liquid was concentrated, 200 ⁇ l of the starting cell suspension were taken as a reference sample and used for DNA extraction. The sample liquid was concentrated by adding 8 super absorber beads, which are commercially available under the name “Water Beads” and have a mass of approx. 0.009 g and a diameter of approx. 2 mm. After a short incubation period, the initial volume of the sample liquid was reduced to a remaining volume of approx. 400 ⁇ l. From these approx. 400 ⁇ l, 200 ⁇ l were taken as a sample and used for the DNA extraction.
  • the DNA was extracted using a commercial kit (innuPREP DNA Mini Kit 2.0; IST Innuscreen GmbH). The DNA was measured spectrophotometrically and analyzed on an agarose gel.
  • FIG. 6 shows the gel electrophoretic representation of the DNA, with the DNA ladder being in the first lane (1), the comparison sample being in the second lane (2) and the second sample from the restricted residual volume being in the third lane (3).
  • the data show that eukaryotic cells can be enriched from a sample using the methods of the invention.
  • the DNA is of high quality.
  • aqueous albumin solution was prepared to demonstrate that the method according to the invention is also suitable for the concentration of proteins in a sample liquid.
  • the protein concentration in the untreated starting solution was determined spectrophotometrically at 280 nm to be 11.8 mg/ml. Different concentrations were carried out.
  • an initial volume of 100 ⁇ l of the protein solution was transferred to a reaction vessel and the solution was incubated for different periods of time with a ball of commercially available “Water Beads” (mass approx. 0.006 g; diameter: approx. 1 mm). This led to the starting solution being reduced from 100 ⁇ l to approx. 60 ⁇ l, approx. 40 ⁇ l and approx. 20 ⁇ l.
  • the residual volumes reduced in this way were then measured as individual samples at 280 nm and the protein concentration was determined. The results are summarized in Table 6. Table 6:
  • proteins can also be concentrated by means of the method and the concentrations increase continuously as a function of the concentration.
  • Example 8 Increase in sensitivity of the real-time PCR after concentration of a sample with human DNA at a very low concentration
  • a sample liquid with human genomic DNA in a very low concentration was prepared.
  • the DNA concentration of the sample was 8 ng/pl, which corresponds approximately to the amount of genomic DNA in a diploid eukaryotic cell.
  • 100 ⁇ l of the sample liquid were used as starting volumes for the concentration.
  • 1 piece of commercially available "Water Beads" (mass approx. 0.006 g; diameter: approx. 1 mm) was added to a first initial volume of the sample liquid and 1 piece of commercially available "Water Beads" (mass approx. 0.009 g) was added to a second initial volume of the sample liquid g; diameter: approx. 2 mm).
  • sample 1 taken from the non-concentrated sample liquid and samples taken from the concentrated liquid portions of the two mixtures (sample 2-5) were used in real-time PCR to detect a human-specific target sequence (single copy gene estrogen receptor 1, in-house method ) used.
  • Curves A solid line
  • curves B long and short dashes
  • Table 7 gives the Ct values for the individual samples. Table 7:
  • Example 9 Generating a sample by incubating a DNA solution with a super absorber until the liquid has been completely absorbed and then adjusting the sample concentration by adding an aqueous solution
  • a DNA solution with a concentration of 100 ng/pl (lambda DNA) was prepared as a sample liquid.
  • Two commercially available “water beads” (0.006 g; diameter approx. 1 mm) were added to 500 ⁇ l of this DNA solution and the first mixture obtained in this way was incubated until the liquid part of the mixture had completely disappeared. Then 250 ⁇ l of a buffer (10 mM Tris HCl, pH 8.5) were added to the remaining “Water Beads”.
  • the second mixture produced in this way was mixed using a vortex mixer and then the liquid portion of the second mixture was separated from the "water beads" as a sample to be analyzed and analyzed spectrophotometrically.
  • Table 8 gives the original DNA concentration in the original DNA solution serving as sample liquid and the spectrophotometrically determined concentration in the sample.
  • Example 10 Concentration of a sample liquid for the detection of a protein (CRP) by means of an immunological detection method
  • CRP C-reactive protein
  • PBS buffer solution A dilution of C-reactive protein (CRP) in a PBS buffer solution was used as a sample liquid.
  • the immunological detection of the C-reactive protein in various samples generated from the sample liquid was carried out using a CRP-ELISA kit from Bio-Techne GmbH (h C-Reactive Protein DuoSet, DY1707).
  • the positive standard control (human CRP) of the kit served as the starting sample.
  • the measurements were carried out in an ELISA reader (Thermofisher) at 405 nm.
  • samples 1, 2 and 3 Three solutions (samples 1, 2 and 3) of different concentrations of CRP were produced from the initial sample. A first portion of approx. 80 ⁇ l was taken from each of these samples, diluted with 120 ⁇ l of the dilution buffer of the kit and placed on the ELISA plate. A further portion of 500 ⁇ l each was removed from samples 1, 2 and 3, mixed with 6 “water beads” each (0.006 g, diameter 1 mm) and incubated until the samples 1A, 2A and 3A thus obtained had a volume of about 70-80 pl were narrowed. These concentrated samples 1A, 2A and 3A were also diluted with 120 ⁇ l of the kit's Dilution Buffer and added to the ELISA plate.
  • Table 9 Due to the insufficient binding capacity, range and linearity of the ELISA method, the theoretically expected protein amounts could not be measured exactly. The enrichment calculated theoretically was a factor of 6.5. The enrichment rate measured by ELISA is between 2.1 and 5.4.
  • the concentration of the unmeasurable sample 3 could be determined in the sample 3A generated from sample 3 by enrichment. This shows that it is possible using the method according to the invention to concentrate a specific target protein in a sample liquid and to detect it using an ELISA. A sensitivity advantage can thus be achieved via the concentration.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) einer die mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit durch Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in dem ersten Flüssigkeitsvolumen (1), umfassend: - Zugeben eines Superabsorbers (2) zu dem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) oder Zugeben des Flüssigkeitsvolumens (1) zu dem Superabsorber (2), - Inkubieren des aus dem Superabsorber (2) und dem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) gebildeten ersten Gemisches, und - Entnehmen einer Probe des nach dem Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteils (3) des ersten Gemisches. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Erzeugung einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) einer die mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit, umfassend: - Zugeben eines Superabsorbers (2) zu dem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) oder Zugeben des ersten Flüssigkeitsvolumens (1) zu dem Superabsorber (2), - Inkubieren des aus dem Superabsorber (2) und dem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) gebildeten ersten Gemisches, - danach Zugeben eines zweiten Flüssigkeitsvolumens einer wässrigen Lösung zum verbliebenen Superabsorber, - Inkubieren des aus dem Superabsorber und dem zweiten Flüssigkeitsvolumen gebildeten zweiten Gemisches, - Entnehmen einer Probe des nach dem Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteils des zweiten Gemisches.

Description

Verfahren zur Aufkonzentrierung mindestens einer Zielsubstanz in einem Flüssigkeitsvolumen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufkonzentrierung mindestens einer Zielsubstanz in einem Flüssigkeitsvolumen und zur Erzeugung einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe.
Die Detektion von Zielsubstanzen, insbesondere von biologischen Zielsubstanzen, spielt in der Flüssigkeits-Analytik eine wichtige Rolle. Zu detektierende bzw. zu überwachende Zielsubstanzen können Biomoleküle, wie beispielsweise eukaryotische Zellen, prokaryotische Zellen, subzelluläre Vesikel, Bakteriophagen, Viren, Toxine, Antikörper oder auch Nukleinsäuren oder Proteine sein. Zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Zielsubstanzen in aus einer zu untersuchenden Flüssigkeit entnommenen Proben werden Analyseverfahren angewendet. Hierzu stehen manuell oder automatisiert bzw. zumindest teilautomatisiert durchführbare Laborverfahren oder vollständig automatisiert arbeitende Analysegeräte zur Verfügung. Zu den automatisiert arbeitenden Analysegeräten gehören auch Online-Analysegeräte, die kontinuierlich oder diskontinuierlich Proben aus der zu überwachenden Flüssigkeit entnehmen und eine qualitative oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz durchführen.
Bei geringen Konzentrationen der Zielsubstanz in der zu analysierenden Flüssigkeit stellt sich das Problem, bei der Probennahme eine für die anschließende Analyse ausreichende Menge der Zielsubstanz zur Verfügung zu stellen. In manchen Anwendungen liegt die Zielsubstanz in einer unbehandelten Flüssigkeitsprobe in einer Konzentration vor, die zu gering für die nachfolgende Bearbeitung oder Analyse ist. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit einer Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der Probe. Als Beispiel hierfür sei der Nachweis von Biomolekülen in Wasser oder Abwasser, z.B. der Nachweis von SARS-CoV-2 in Wasser mittels molekulargenetischer Techniken wie PCR oder Real Time PCR, genannt. Die Konzentrationen der nachzuweisenden Viruspartikel oder von viralen Fragmenten im Abwasser ist häufig zu gering, als dass man sie mittels der dem Fachmann bekannten Methoden nachweisen kann. Reicht bei der Untersuchung von Blutproben auf das Vorliegen einer Virusinfektion ein Volumen von 200 pl aus, so ist das erforderliche Probenvolumen bei der Untersuchung von Wasser/Abwasser deutlich größer. In der Literatur werden Ausgangsmengen von bis zu mehreren Litern beschrieben.
Die Aufkonzentrierung von Zielmolekülen in einem Flüssigkeitsvolumen spielt nicht nur für die Vorbereitung von Proben für molekulargenetische Analyse-Techniken eine wichtige Rolle, sondern gleichermaßen auch für alle immunologischen Technologien und spektroskopischen Technologien, wie beispielsweise Molekülspektroskopie oder Massenspektroskopie.
Die Aufkonzentrierung von Zielsubstanzen, insbesondere Biomolekülen, in einem Flüssigkeitsvolumen spielt außerdem eine Rolle bei der Erzeugung von die Zielsubstanzen bzw. Biomoleküle umfassenden Rohprodukten oder Produkten, die für die weitere Verwendung für Forschungszwecken, zu industriellen Zwecken oder für therapeutische Zwecke dienen.
Im Stand der Technik sind für die Anreicherung von Viren oder subzellulären Partikeln aus einer biologischen Probe verschiedene Techniken bekannt, z.B. Ultrazentrifugationstechniken oder die Technik der Ultrafiltration. Diese Methoden sind zeitaufwändig und verhältnismäßig teuer. Alternative Verfahren bestehen in der Präzipitation von Viruspartikeln mittels Polyethylenglycol/Natriumchlorid und einer nachfolgenden Zentrifugation (Yamamoto et al., Virology 40 (1970) 734; Morandi et al., J. Clin. Microbiol. 36 (1998) 1543-1538). Dabei nutzt man verschiedene Mischungen von PEG und Natriumchlorid und mischt diese Reagenzien mit der biologischen Probe. Nachfolgend wird der Ansatz bei Kälte längere Zeit inkubiert und nachfolgend werden die Virus- (Protein)-NaCIZPEG- Präzipitate durch Zentrifugation gewonnen. Auch diese Verfahren sind aufwändig und benötigen viel Zeit. Problematisch ist darüber hinaus die Weiterbearbeitung der Präzipitate für die Isolierung der viralen Nukleinsäuren. Oftmals lassen sich die Präzipitate nur sehr schwer wieder in Lösung bringen. Dies beeinflusst die Effizienz und die Qualität der Nukleinsäureisolierung erheblich.
Aus US 2015/0224502 A1 ist ein Probensammel-Gerät für die Durchfluss-Probennahme in Gewässern bekannt. Hier wird zur Aufkonzentrierung von in Gewässern in geringer Konzentration vorliegenden Zielsubstanzen der Weg gegangen, die Zielsubstanzen in einem Filter oder Adsorptionsmedium zurückzuhalten und die am Filter adsorbierten Substanzen für eine nachfolgende Analyse durch Elution oder als Lysat freizusetzen und einem Analysemodul zur Verfügung zu stellen. Auch dieses Verfahren ist apparativ aufwändig und nicht universell einsetzbar.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches, schnelles und universell einsetzbares Verfahren zur Erzeugung einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem Volumen einer Probeflüssigkeit, die die mindestens eine Zielsubstanz enthält, für die nachfolgende Analyse oder als Rohprodukt oder Produkt für die nachfolgende Verwendung für Forschungszwecke, für therapeutische Zwecke oder für industrielle Zwecke, z.B. zur Produktherstellung, bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird in überraschend einfacher und universell anwendbarer Weise mittels des in Anspruch 1 definierten Verfahrens gelöst. Gleichermaßen wird die Aufgabe mittels des in Anspruch 2 definierten Verfahrens gelöst. Die Aufgabe wird auch durch die in Anspruch 18 angegebene Verwendung und das in Anspruch 20 angegebene Kit gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem ersten Flüssigkeitsvolumen einer die mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit durch Aufkonzentrierung der mindestens einen Zielsubstanz in dem ersten Flüssigkeitsvolumen, umfasst: - Zugeben eines Superabsorbers zu dem ersten Flüssigkeitsvolumen oder Zugeben des ersten Flüssigkeitsvolumens zu dem Superabsorber,
- Inkubieren des aus dem Superabsorber und dem Flüssigkeitsvolumen gebildeten ersten Gemisches, und
- Entnehmen einer Probe des nach dem Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteils des ersten Gemisches.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Erzeugung einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem ersten Flüssigkeitsvolumen einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit umfasst:
- Zugeben eines Superabsorbers zu dem ersten Flüssigkeitsvolumen oder Zugeben des ersten Flüssigkeitsvolumens zu dem Superabsorber,
- Inkubieren des aus dem Superabsorber und dem ersten Flüssigkeitsvolumen gebildeten ersten Gemisches, insbesondere bis zum im Wesentlichen vollständigen Verschwinden des flüssigen Anteils des ersten Gemisches,
- danach Zugeben eines zweiten Flüssigkeitsvolumens einer wässrigen Lösung zum verbliebenen Superabsorber oder Zugeben des verbliebenen Superabsorbers zu dem zweiten Flüssigkeitsvolumen und somit Erzeugen eines zweiten Gemisches aus dem Superabsorber und dem zweiten Flüssigkeitsvolumen, und
- Entnehmen einer Probe des flüssigen Anteils des zweiten Gemisches.
Das aus dem Superabsorber und dem zweiten Flüssigkeitsvolumen gebildete zweite Gemisch kann vor dem Entnehmen der Probe des flüssigen Anteils des zweiten Gemisches inkubiert werden, beispielsweise um einen bestimmten Konzentrationsbereich der Zielsubstanz oder ein bestimmtes Volumen des flüssigen Anteils einzustellen.
Die bei diesem Verfahren nach dem Inkubieren des ersten Gemisches zugegebene wässrige Flüssigkeit kann beispielsweise einen Lysepuffer umfassen.
Das Inkubieren des aus dem Superabsorber und dem ersten Flüssigkeitsvolumen gebildeten ersten Gemisches kann bis zu einer starken Reduzierung des flüssigen Anteils des ersten Gemisches durchgeführt werden. Dabei kann der flüssige Anteil auch vollständig verschwinden oder zumindest so weit reduziert werden, dass mittels einer Pipette oder eines Tupfers keine Flüssigkeit mehr aus dem Gemisch aufnehmbar ist.
Bei beiden erfindungsgemäßen Verfahren wird eine mindestens eine Zielsubstanz enthaltene Probe erzeugt, die nachfolgend analysiert und/oder als Rohprodukt oder Produkt in einem Prozess oder Verfahren weiterverwendet werden kann. Hier und im Folgenden ist mit dem Begriff Probe daher ein, beispielsweise flüssiges, Stoffvolumen bezeichnet, das die Zielsubstanz in einer bei der erfindungsgemäßen Erzeugung der Probe beeinflussbaren oder einstellbaren Konzentration enthält. Die Probe kann somit nicht nur für eine anschließende Analyse zur Verfügung stehen, sondern sie kann auch als Rohprodukt oder Produkt für weitere Forschungszwecke oder auch zur, beispielsweise industriellen, Produktherstellung oder für therapeutische Zwecke eingesetzt werden. Solche als Rohprodukt oder Produkt dienende Proben können beispielsweise aufkonzentrierte Viren, Nukleinsäuren, Antikörper oder Proteine umfassen.
Superabsorber (auch: Superabsorbent Polymers, SAP) werden Kunststoffe genannt, die in der Lage sind, ein Vielfaches ihres Eigengewichts an polaren Flüssigkeiten aufzusaugen. Als zur Aufnahme durch den Superabsorber geeignete Flüssigkeiten kommen polare Lösungsmittel wie beispielsweise Wasser bzw. wässrige Lösungen in Frage. Bei Aufnahme der Flüssigkeit quillt der Superabsorber auf und bildet ein Hydrogel. Hydrogele können alle vernetzten Polymere bilden, die polar sind, z.B. Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon, Amylopektin, Gelatine, Cellulose. Für die vorliegende Erfindung sind indes Kunststoffe, insbesondere die hier und im Folgenden genannten Kunststoffe, gegenüber biologischen Polymeren bevorzugt.
Geeignet für die Erfindung ist z.B. ein Copolymer aus Acrylsäure (Propensäure, H2C=CH-COOH) oder Natriumacrylat (Natriumsalz der Acrylsäure, H2C=CH-COONa) einerseits und Acrylamid andererseits, wobei das Verhältnis der beiden Monomere zueinander variieren kann. In Frage kommen auch weitere Polyacrylate oder andere auf Acrylsäure oder Acrylat als Monomer basierende Polymere oder Copolymere. Zusätzlich kann bei der Herstellung des Copolymers ein so genannter Kernvernetzer (Core-Cross-Linker, CXL) der Monomerlösung zugesetzt werden, der die gebildeten langkettigen Polymermoleküle stellenweise untereinander durch chemische Brücken verbindet (vernetzt). Durch diese Brücken wird das Polymer wasserunlöslich. Dieses sogenannte Basispolymer wird optional einer sogenannten Oberflächen-Nachvernetzung, (Surface-Cross-Linking, SXL) genannt, unterzogen. Dabei wird eine weitere Chemikalie auf die Oberfläche der Partikel aufgebracht, die durch Erwärmung ein zweites Netzwerk nur auf der äußeren Schicht des Korns knüpft. Diese Hülle stützt das aufgequollene Gel, um auch bei äußerer Belastung (Bewegung, Druck) zusammen zu halten.
Superabsorber in Form von Granulat kommt beispielsweise herkömmlich in Babywindeln, Monatshygiene-Produkten, bei der Inkontinenzversorgung und in Verbandmaterial zum Einsatz. Auch die Verwendung in Kabelummantelungen für Tiefseeleitungen ist bekannt. Weiter werden Superabsorber ais gelbildende Löschmittel in der Brandbekämpfung, als mechanische Stabilisatoren für Schnittblumen in einer Vase oder als Zusatz für Pflanzenerde für eine dauerhafte Wasserspeicherung verwendet. Hierbei kommt wegen der besseren Umweltverträglichkeit kalilaugeneutralisierte Acrylsäure zum Einsatz. In Form von kugelförmigen Partikeln ist die Verwendung von Superabsorbern unter Bezeichnungen wie „Wasserperlen“, „Aqua Beads“ oder „Water beads“ als Spielzeug bekannt. Hierbei handelt es sich um Superabsorber, welche in Form von Kügelchen von variablen Größen von Submillimetern bis Zentimetern kommerziell angeboten werden. Wie weiter unten noch ausführlicher beschrieben wird, hat sich überraschend gezeigt, dass während der Inkubation eines Gemisches aus einem derartigen Superabsorber und einer mindestens eine, insbesondere biologische, Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit zwar ein hoher Anteil der Flüssigkeit von dem Superabsorber aufgenommen wird, die Zielsubstanz aber im nicht vom Superabsorber aufgenommenen flüssigen Anteil verbleibt oder, bei im Wesentlichen vollständigem Verschwinden des flüssigen Anteils, an der Oberfläche des Superabsorbers verbleibt. Da die Zielsubstanzen, insbesondere biologische Zielsubstanzen, vom Superabsorber also nicht aufgenommen werden, ist die Konzentration der mindestens einen Zielsubstanz in einem nach Inkubation verbliebenen flüssigen Anteil des ersten Gemisches oder die Konzentration der Zielsubstanz in einer Lösung, die durch Zugeben einer wässrigen Lösung zum nach dem Inkubieren des ersten Gemisches verbliebenen Superabsorber gebildet wird, im Wesentlichen proportional zur Konzentration der Zielsubstanz in der ursprünglichen Probeflüssigkeit. Dies erlaubt eine quantitative Ermittlung der Konzentration der Zielsubstanz in der Probeflüssigkeit anhand der nach den erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Probe. Dieser Effekt kann auch zu einer gezielten Einstellung einer gewünschten Konzentration der Zielsubstanz in einer Probe genutzt werden, die als Rohprodukt oder Produkt für weitere Forschungszwecke, Therapiezwecke oder eine Produktherstellung dient.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren kann das erste Flüssigkeitsvolumen eine polare Flüssigkeit, insbesondere als Hauptbestandteil, enthalten. In einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verfahren kann das erste Flüssigkeitsvolumen ein polares Lösungsmittel, insbesondere als Hauptbestandteil, enthalten. Beispielsweise kann das erste Flüssigkeitsvolumen zu einem Massenanteil von mindestens 50 % aus einem polaren Lösungsmittel bestehen. Die polare Flüssigkeit bzw. das polare Lösungsmittel kann beispielsweise Wasser sein.
Die Zielsubstanz kann ein Biomolekül sein. Sie kann ausgewählt sein aus den folgenden Substanzen: eukaryotische Zellen, Bestandteile von eukaryotischen Zellen, prokaryotische Zellen, Bestandteile von prokaryotischen Zellen, subzelluläre Vesikel, Bakteriophagen, Viren oder Virusbestandteile, Toxine, Antikörper, Nukleinsäuren und Proteine.
Wie erwähnt, kann der Superabsorber in einer vorteilhaften Ausgestaltung ein Kunststoff sein oder einen Kunststoff umfassen, der einen Anteil des Flüssigkeitsvolumens, z.B. ein in dem Flüssigkeitsvolumen enthaltenes polares Lösungsmittel wie beispielsweise Wasser, unter Bildung eines Gels bzw. Hydrogels aufnimmt. Vorteilhaft ist der Kunststoff so ausgewählt, dass er im Wesentlichen keine Biomoleküle bzw. die weiter oben angegebenen Substanzen wie eukaryotische Zellen, Bestandteile von eukaryotischen Zellen, prokaryotische Zellen, Bestandteile von prokaryotischen Zellen, subzelluläre Vesikel, Bakteriophagen, Viren oder Virusbestandteile, Toxine, Antikörper, Nukleinsäuren und Proteine aufnimmt. Der Superabsorber soll also die Zielsubstanz, z.B. Biomoleküle, nicht oder nur zu einem für den Zweck der Anreicherung der Zielsubstanz in der zu erzeugenden Probe vernachlässigbaren Anteil aufnehmen. Dies ist beispielsweise bei den erwähnten Superabsorbern aus den genannten Polymer- bzw. Copolymermaterialien, z.B. bei den kommerziell erhältlichen Wasserperlen, Waterbeads etc. der Fall.
Der Superabsorber kann in Form von Partikeln, z.B. als Pulver, als Granulat oder in Form geometrischer Körper, insbesondere Kugeln (kugelförmige Partikel), eingesetzt werden. Er kann dem Flüssigkeitsvolumen somit in Form solcher Partikel zugegeben werden oder das Flüssigkeitsvolumen kann dem Superabsorber in dieser Form zugegeben werden. Die Partikel oder Kugeln können einen Durchmesser zwischen 100 bis 5000 pm aufweisen.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Superabsorber um kommerziell erhältliche Superabsorber- Kugeln, beispielsweise um unter den Bezeichnungen „Aquabeads“, „Water Beads“, „Wasserperlen“, „Aquaperlen“, „Hydrokugeln“, „Gelkugeln“ erhältliche Superabsorber-Kugeln.
In einer vorteilhaften Verfahrensausgestaltung kann das Volumen des nach dem Schritt des Inkubierens verbleibenden flüssigen Anteils des oben erwähnten ersten und/oder zweiten Gemisches, und damit die Konzentration der Zielsubstanz im verbleibenden flüssigen Anteil, durch die zeitliche Dauer des Inkubierens, durch die Größe und Anzahl der dem Flüssigkeitsvolumen zugesetzten Superabsorber-Partikel oder Superabsorber-Kugeln aus dem Superabsorber, und/oder durch die während des Inkubierens herrschenden Temperatur gesteuert werden.
Die Erfindung umfasst außerdem eine Verwendung eines Superabsorbers zur Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz, insbesondere eines Biomoleküls, in einem Flüssigkeitsvolumen. Das Flüssigkeitsvolumen kann eine polare Flüssigkeit, insbesondere Wasser, enthalten, wobei der Superabsorber dazu eingerichtet ist, die polare Flüssigkeit, z.B. Wasser, bzw. mindestens einen Teil der polaren Flüssigkeit, unter Bildung eines Hydrogels aufzunehmen. Der Superabsorber kann aus den oben beschriebenen Materialien gebildet sein und in den zuvor beschriebenen Ausgestaltungen als Granulat oder, besonders bevorzugt, in Form von Kugeln, insbesondere kommerziell erhältlichen Wasserperlen, Water Beads oder Aqua Beads, verwendet werden. Die Verwendung kann das Zugeben des Superabsorbers zu dem Flüssigkeitsvolumen oder das Zugeben des Flüssigkeitsvolumens zu dem Flüssigkeitsvolumens und Inkubieren des so gebildeten Gemisches, wie weiter oben anhand der beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erläutert, umfassen. Die Verwendung kann außerdem die Steuerung einer Temperatur und/oder einer Inkubationszeit sein, um gezielt eine Konzentration oder einen Konzentrationsbereich der Zielsubstanz im flüssigen Anteil des Gemisches einzustellen.
Ganz allgemein beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zur Aufkonzentrierung eines Superabsorbers zur Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz, insbesondere eines Biomoleküls, in einem Flüssigkeitsvolumen durch Zugabe eines Superabsorbers zu dem Flüssigkeitsvolumen oder durch zugeben des Flüssigkeitsvolumens zu dem Superabsorber und Inkubieren. Eine nach dem Inkubieren aus dem verbliebenen flüssigen Anteil des Gemisches aus der Flüssigkeit und dem Superabsorber entnommene Probe kann zur weiteren Analyse oder zur weiteren Verwendung, z.B. in einem Produktionsprozess oder für therapeutische Zwecke oder zu Forschungszwecken dienen. Das Volumen der entnommenen Probe kann im wesentlichen dem Volumen des verbliebenen flüssigen Anteils entsprechen oder deutlich geringer als das Volumen des verbliebenen flüssigen Anteils sein.
Die Erfindung umfasst außerdem ein Kit zur Durchführung der voranstehend beschriebenen Verfahren und/oder Verfahrensvarianten. Das Kit kann den Superabsorber und weitere Substanzen und/oder Mittel zur Durchführung des Verfahrens umfassen. Das Kit kann beispielsweise mindestens ein Behältnis mit vorgelegtem Superabsorber umfassen, in das ein initiales Flüssigkeitsvolumen zur Aufkonzentrierung zugegeben werden kann.
Die gemäß den beschriebenen Verfahren bzw. gemäß der beschriebenen Verwendung erhaltene Probe kann manuell oder automatisiert einem Laborgerät für die weitere Behandlung oder Analyse zugeführt werden. Die weitere Analyse kann mittels molekulargenetischen Analyse-Techniken, immunologischen Technologien und spektroskopischen Technologien, z.B. Molekülspektroskopie oder Massenspektroskopie, sensorbasiert, z.B. mittels optischer oder elektrochemischer Sensoren, durch Kultivierung, Sequenzierung oder Durchflusszytometrie durchgeführt werden.
Die Erfindung beinhaltet entsprechend auch ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung mindestens einer Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit, umfassend: das Erzeugen einer die mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem ersten Flüssigkeitsvolumen einer die mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit nach einem der voranstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren in einer der voranstehend beschriebenen Ausgestaltungen, und den qualitativen oder quantitativen Nachweis der mindestens einen Zielsubstanz in der Probe mittels mindestens einer der folgenden Methoden: Nukleinsäure-basierte Nachweisverfahren, Sequenzierungen, immunologische Nachweisverfahren, mikrobiologische Analysen, mikroskopische Verfahren, Massenspektrometrie, Sensor-basierte Nachweise und Durchflusszytometrische Techniken.
Wie in den voranstehend beschriebenen Verfahren und Verfahrensausgestaltungen kann die Zielsubstanz eine der weiter oben genannten biologischen Substanzen sein.
Nukleinsäure-basierte Nachweisverfahren können z.B. PCR-, Realtime PCR-, digitale PCR-basierte Verfahren oder Sequenzierung umfassen. Immunologische Nachweisverfahren können immunologische Assays wie ELISA oder Lateral Flowtests sein. Mikrobiologische Analysen können die Kultivierung lebender Zellen in der Probe umfassen. Sensor-basierte Nachweise können Nachweisverfahren mittels optischer, spektroskopischer oder elektrochemischer Sensoren umfassen.
In einer möglichen Ausgestaltung des Verfahrens oder der Verwendung kann die erzeugte Probe oder die weiter behandelte Probe in eine Kartusche, insbesondere eine mikrofluidische Kartusche, eines automatischen Analysegeräts zur automatisierten Durchführung eines Nachweises der Zielsubstanz mittels molekulargenetischer Techniken wie PCR oder Real Time PCR gegeben werden. Dies kann manuell oder automatisiert erfolgen.
Die Erfindung beinhaltet auch einen Kit zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung mindestens einer Zielsubstanz in der Probeflüssigkeit. Dieses Kit kann mindestens den Superabsorber in einer für das Verfahren geeigneten Darreichungsform sowie ggfs. weitere Chemikalien, wie z.B. Pufferlösungen oder Lyse-Puffer, beinhalten.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren und einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert. Diese Beispiele stellen keine Limitierung der erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren dar.
Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Flüssigkeit vor (a) und nach Zusetzen eines Superabsorbers in Form von Kugeln und Inkubieren (b);
Fig. 2 Amplifikationskurven verschiedener Proben aus Oberflächenwasser ohne Aufkonzentrierung und nach Aufkonzentrierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 3 Amplifikationskurven verschiedener Proben aus Salmonellen enthaltendem Wasser ohne Aufkonzentrierung, nach Aufkonzentrierung mittels eines Filtrationsverfahrens und nach Aufkonzentrierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 4 Amplifikationskurven verschiedener Proben aus MS2-Phagen RNA enthaltendem Wasser ohne Aufkonzentrierung, nach Aufkonzentrierung mittels eines Filtrationsverfahrens und nach Aufkonzentrierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 5 eine gelelektrophoretische Darstellung genomischer DNA aus einer Wasserprobe ohne Aufkonzentrierung und nach Aufkonzentrierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 6 eine gelelektrophoretische Darstellung der DNA eukaryotischer Zellen aus einer Wasserprobe ohne Aufkonzentrierung und nach Aufkonzentrierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens; und Fig. 7 Amplifikationskurven verschiedener Proben von Wasser, das DNA in sehr geringer Konzentration enthält, ohne Aufkonzentrierung und nach Aufkonzentrierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von Superabsorber-Kugeln unterschiedlicher Größen.
Der hier beschriebenen Erfindung lag folgende unerwartete Beobachtung zu Grunde. Kommerziell verfügbare sog. Wasserperlen (kommerziell unter anderem unter den Bezeichnungen Aqua Beads, Water Beads, Wasserbeads, oder Gelperlen erhältlich) wurden einem Flüssigkeitsvolumen von 1 Liter zugegeben. Diese Wasserperlen sind aus einem Superabsorber-Material gebildet. Bei der Flüssigkeit handelte es sich um Oberflächenwasser, das einem Löschwasserteich mit Schwebstoffen entnommen worden war. Nach einer Inkubationszeit quollen die Kügelchen zu einem Vielfachen ihres ursprünglichen Volumens auf. Das Volumen des flüssigen Anteils des Gemisches aus der Flüssigkeit und den Wasserperlen reduzierte sich. Überraschenderweise zeigte sich, dass die Schwebstoffe der Flüssigkeit von den aufquellenden Kügelchen nicht aufgenommen wurden. Der flüssige Anteil des Gemisches einschließlich der Schwebstoffe (Volumen 400 ml) wurde in ein neues Gefäß überführt. Diesem flüssigen Anteil wurde eine Probe mit einem Volumen von 50 ml entnommen.
Eine Vergleichsprobe mit einem Volumen von 50 ml wurde direkt aus der Flüssigkeit, d.h. dem erwähnten Oberflächenwasser, entnommen, ohne die Flüssigkeit zuvor nach dem beschriebenen Verfahren einzuengen. Beide Proben wurden bei 5000 x g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Sediment für eine Nukleinsäureextraktion eingesetzt. Die Nukleinsäureextraktion erfolgte mittels eines kommerziellen Kits (innuprep Stool DNA Mini Kit; IST Innuscreen GmbH). Die DNA von beiden Proben wurde dann mittels Real Time PCR auf die Menge an bakterielle Gesamtkeimzahl untersucht.
Hierbei zeigte sich, dass in der unbehandelten Vergleichsprobe weniger Bakterien nachgewiesen wurden als in der mit dem Superabsorber eingeengten Probe. Dies bedeutet, dass die in der Flüssigkeit enthaltenen Bakterien nicht in die Wasserperlen aufgenommen wurde. Sie wurden aufkonzentriert und waren Bestandteil des verbliebenen flüssigen Anteils des Gemisches aus der Flüssigkeit und den Superabsorber-Kugeln. Diese Beobachtungen konnten nachfolgend auch für andere Biomoleküle (Viren oder eukaryotische Zellen) bestätigt werden: Nach Zugabe des Superabsorbers zu einem diese Biomoleküle enthaltenen Flüssigkeitsvolumen wurde das Volumen eingeengt und die Biomoleküle wurden in der verbleibenden Restflüssigkeit aufkonzentriert. Noch überraschender war, dass man mit dem beschriebenen Verfahren auch Proteine sowie freie genomische DNA, die sich in geringen Konzentrationen in einer wässrigen Lösung befinden, aufkonzentrieren kann.
Die Verwendung von Superabsorbern zur Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz, insbesondere von Biomolekülen, in einer polaren Flüssigkeit als Lösungsmittel, beispielsweise Wasser, zur Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in der Flüssigkeit ist sehr einfach und universell einsetzbar. Ein geeignetes Verfahren ist anhand von Fig. 1 wie folgt kurz beschrieben:
1 . Zugabe eines Superabsorbers 2 zu einem Volumen einer, insbesondere wässrigen, Flüssigkeit 1 , oder alternativ: Zugabe der Flüssigkeit zu einem vorgelegten Superabsorber 2;
2. Inkubation des Gemisches aus der Flüssigkeit 1 und dem Superabsorber 2 zur Einengung (Volumenreduzierung) des flüssigen Anteils 3 des Gemisches; und anschließend
3. Überführung mindestens eines Teils des flüssigen Anteils 3 des Gemisches in ein neues Gefäß als Probe zur weiteren Bearbeitung. Die weitere Bearbeitung kann z.B. eine Nukleinsäurextraktion sein, eine Messung oder auch eine direkte Analyse mit unterschiedlichsten Technologien, wie NGS Anwendungen, immunologischen Technologien, spektroskopischen Technologien, molekülspektroskopischen- oder massenspektrometrischen Technologien etc.
Alternativ kann der überführte Teil des flüssigen Anteils auch als Produkt für weitere Forschungszwecke, für therapeutische Zwecke oder als Rohprodukt in einem Produktionsprozess verwendet werden.
Der Grad der Aufkonzentrierung und die Geschwindigkeit dieses Prozesses können sehr genau mittels der Art des eingesetzten Superabsorbers, mittels seiner eingesetzten Menge, oder mittels der Inkubationszeit und/oder der Inkubationstemperatur gesteuert werden.
Mit dem Verfahren kann damit das Problem der Bearbeitung von niedrigkonzentrierten Proben für eine weitere Bearbeitung der interessierenden Zielsubstanzen, insbesondere Biomolekülen, oder deren Nachweis einfach gelöst werden. Das Verfahren kommt ohne teure Geräte wie z.B. Ultrazentrifugen, teure Ultrafiltrationsmembranen, aufwändige Verfahren wie PEG-Fällungen oder generell Fällungsreaktionen zur Aufkonzentrierung von Nukleinsäuren etc. aus. Darüber hinaus ist das Verfahren in Bezug auf die Zielsubstanzen, insbesondere für Biomoleküle, universell einsetzbar. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Superabsorber ungiftig und ungefährlich und oftmals auch biologisch abbaubar sind. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann damit die Untersuchung von niedrigkonzentrierten Biomolekülen stark vereinfacht werden.
Weitere Versuche zur Aufkonzentrierung von in einer Probeflüssigkeit enthaltenen genomischen DNA offenbarten aber noch einen weiteren Effekt. In diesen Versuchen wurde eine wässrige DNA-Lösung mit einem Volumen von 500 pl unter Zugabe einer Kugel aus einem Superabsorber-Material (kommerziell verfügbare Wasserperlen; Durchmesser ca. 1 mm) inkubiert. Mit zunehmender Inkubationsdauer reduzierte sich das Volumen der Probe und erhöhte sich die Konzentration der DNA. Der Prozess wurde war abgeschlossen, als das Volumen der Flüssigkeit de facto Null war. Dieses Ergebnis implizierte die Vorstellung des Verlustes der DNA. Umso überraschender war die Beobachtung, dass in einer durch Zugabe von 250 pl Wasser zur Kugel aus Superabsorber-Material und einem kurzen Schütteln des Gefäßes erzeugte Probe, DNA messbar war und zwar in ungefähr der doppelten Konzentration im Verhältnis zur Ausgangsprobe von 500 pl. Damit wurde gezeigt, dass die DNA nicht vom Superabsorber-Material aufgenommen wird, sondern sich an der Außenfläche der Kugel aus Superabsorber-Material angelagert hatte und nach Zugabe eines flüssigen Mediums wieder gewonnen werden kann. Damit ist es möglich, nicht nur Biomoleküle in einer Probeflüssigkeit mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens aufzukonzentrieren, sondern nach kompletter Flüssigkeitsaufnahme durch den eingesetzten Absorber die Biomoleküle, in diesem Falle die DNA, durch Zugabe einer wässrigen Lösung, gezielt auf eine gewünschte Konzentration einzustellen.
Auf der Basis dieser Beobachtung zeigen sich noch weitere Möglichkeiten zur Nutzung von Superabsorbern zur Aufkonzentrierung von Biomolekülen. Zur Erzeugung einer für eine qualitative oder quantitative Analyse einsetzbaren Probe einer Probeflüssigkeit, die als qualitativ oder quantitativ zu bestimmende Zielsubstanz Biomoleküle wie eukaryotische Zellen, prokaryotische Zellen, Viren, Phagen oder subzelluläre Kompartimente enthält, kann das folgende Verfahren angewendet werden: Zunächst kann ein erstes Volumen der Probeflüssigkeit mit einem Superabsorber behandelt werden, derart, dass die gesamte Flüssigkeit vom Superabsorber aufgenommen wird. Vorzugsweise werden als Superabsorber die bereits beschriebenen sog. Wasserperlen eingesetzt. Nach Inkubation und kompletter Flüssigkeitsabsorbierung wird ein Lysepuffer zum Superabsorber gegeben und das so erzeugte Gemisch inkubiert. Die Art des Lysepuffers und/oder die Inkubationszeit können beliebig gewählt werden. Nachfolgend wird der Lysepuffer vom Superabsorber getrennt. Die so erhaltene flüssige Probe enthält die Zielsubstanz. Die als Zielsubstanz in der Probe enthaltenen Biomoleküle können ggfs. weiter lysiert werden. Nach der Lyse kann die Probe für eine Nukleinsäureextraktion eingesetzt werden. Unter der Voraussetzung, dass die Lyse bereits erfolgreich umgesetzt wurde, wird das Lysat ohne weitere Inkubation für eine Nukleinsäureextraktion eingesetzt.
Im Folgenden werden einige Ausführungsbeispiele der Erfindung genauer beschrieben.
Ausführungsbeispiel 1 : Einengen einer Schmutzwasserprobe mit einem Volumen von 1 Liter
Als Probeflüssigkeit wurde Schmutzwasser aus einem Feuerlöschteich eingesetzt. Es wurden zwei Volumen-Einheiten von jeweils 1 Liter der Flüssigkeit jeweils in eine Probenflasche überführt.
Für die Einengung wurden 50 g kommerziell unter der Bezeichnung „Water Beads“ erhältlicher Superabsorber-Kugeln mit einer Masse von ca. 0,006 g pro Kugel und einem Durchmesser von ca.
1 mm in eine der Probenflaschen zugegeben. Nach Inkubation wurde der verbliebene flüssige Anteil von ca. 650 ml in ein neues Gefäß überführt. Damit erfolgte eine Einengung des ursprünglich eingesetzten Volumens Probeflüssigkeit von 1000 ml auf 650 ml. Für den Nachweis, dass die Konzentration von Bakterien in der eingeengten Probeflüssigkeit erhöht werden konnte, wurden jeweils zwei Proben (Proben 1 und 2) mit einem Volumen von 10 ml der eingeengten Probeflüssigkeit und zum Vergleich zwei Proben der in der zweiten Probenflasche enthaltenen, nicht eingeengten Probeflüssigkeit (Proben 3 und 4) in einem 15 ml Reaktionsgefäß bei 5000 rpm für 10 min zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das resultierende Sediment-Pellet wurde nachfolgend zur DNA-Extraktion eingesetzt. Die DNA- Extraktion wurde mit einem kommerziellen Kit (innuPREP Stool DNA Kit; IST Innuscreen GmbH) durchgeführt. Die extrahierte DNA wurde mittels Real Time PCR zur Bestimmung der bakteriellen Gesamtkeimzahl eingesetzt. Als Nachweis-System wurde ein kommerzieller Kit verwendet (innuDETECT Bacteria Quantification Assay; IST Innuscreen GmbH).
Zur Bestimmung der Anzahl der Bakterien-Kopien in der Probe wurde die Standard-DNA aus dem Assay verwendet.
In Fig. 2 sind die Amplifikationskurven der Proben dargestellt. Die Kurven A (durchgezogene Linie) sind die Amplifikationskurven der drei Standards. Die Kurven B (lange und kurze Striche) sind die Amplifikationskurve der aus der eingeengten Probeflüssigkeit entnommenen Proben 1 und 2 dargestellt, und die Kurven C (gleich lange Striche) sind die Amplifikationskurve der aus der unbehandelten Probeflüssigkeit entnommenen Proben 3 und 4.
Die Tabelle 1 gibt die Ct-Werte und Kopienzahlen für die einzelnen Standards und Proben an.
Die Ergebnisse der Realtime PCR demonstrieren, dass durch das erfindungsgemäße Verfahren eine ca. 3-fache Konzentrierung der Gesamtkeimzahl in der Probe nachzuweisen ist.
Tabelle 1 :
Figure imgf000014_0001
Ausführungsbeispiel 2: Nachweis von Salmonellen in Wasserproben
Als Probeflüssigkeit wurde Leitungswasser mit zugesetzten Salmonellen eingesetzt, wobei jeweils einem Volumen von 10 ml des Leitungswassers 1 x 106 Salmonellen als Spike zugegeben wurde.
Aus einem solchen nicht eingeengten Probeflüssigkeitsvolumen wurden jeweils als Vergleichsproben zwei Proben (Probe 1 und 2) von je 200 pl entnommen. Zwei weitere Probeflüssigkeitsvolumina von 10 ml wurden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eingeengt. Für die Einengung wurden kommerziell unter der Bezeichnung „Water Beads“ erhältliche Superabsorber-Kugeln verwendet, die pro Kugel eine Masse von ca. 0,006 g und einen Durchmesser von ca. 1 mm aufweisen. Es wurden 40 Stück der „Water Beads“ in jedes der beiden Probeflüssigkeitsvolumina gegeben. Durch Inkubieren des so erhaltenen Gemisches wurde dessen flüssiger Anteil auf ein Volumen von ca. 500 pl eingeengt.
Von diesem flüssigen Anteil wurden 2 xje 200 pl für die nachfolgende DNA- Extraktion eingesetzt (Proben 3 bis 6).
Parallel dazu wurde ein weiteres Probeflüssigkeitsvolumen von 10 ml mit einem Standardverfahren unter Verwendung einer Filtrationsmembran bearbeitet. Dazu wurden das Probeflüssigkeitsvolumen über eine Filtermembran (0,45 pm MCE Membran; Millipore) unter Verwendung einer Vakuumpumpe filtriert. Der Filter wurde zerschnitten und mit 600 pl 1 x PBS-Lösung versetzt und in einem Lysis Tube unter Verwendung eines Homogenisators (SpeedMill, Analytik Jena GmbH) homogenisiert. Von der nach Homogenisierung erhaltenen Flüssigkeit von ca. 500 pl wurden ebenfalls zwei Proben mit einem Volumen von jeweils 200 pl für die DNA- Extraktion eingesetzt (Proben 7, 8).
Die DNA- Extraktion erfolgte mittels eines automatisierten Verfahrens auf dem Automaten KingFisher Flex (Thermo Fisher) und einem kommerziell verfügbaren Kit (deltaPREP AniPath DNA/RNA Kit KFFLX; IST Innuscreen GmbH). Die extrahierte DNA wurde mittels Real Time PCR zum Nachweis der Salmonellen eingesetzt. Als Nachweis-System wurde ein kommerzieller Kit verwendet (innuDETECT Salmonella enterica Assay; IST Innuscreen GmbH).
In Fig. 3 sind die Amplifikationskurven der Proben dargestellt. Die Kurven A (lange und kurze Striche) zeigen die Verläufe der Amplifikationskurven der Proben 1 und 2 der nicht eingeengten Probeflüssigkeit. Die Kurven B (gleich lange Striche) sind die Amplifikationskurven der Proben 3 bis 6 der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeengten Probeflüssigkeit. Die Kurven C (durchgezogene Linie) sind die Amplifikationskurven der Proben 7 und 8, die durch filterbasierte Anreicherung gewonnen wurden.
Die Tabelle 2 gibt die Ct-Werte für die einzelnen Proben an.
Tabelle 2:
Figure imgf000015_0001
Die Unterschiede der Ct -Werte zeigen rechnerisch eine 32-fache Konzentrierung der Ausgangsprobe hinsichtlich der Salmonellenzahl. Die Anreicherung der Bakterien auf einem Filter zeigt eine schlechtere Effizienz im Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Ausführungsbeispiel 3: Nachweis von MS2-Phagen RNA in Wasserproben
Als Probeflüssigkeit wurde Leitungswasser mit zugesetzten MS2-Bakteriophagen eingesetzt, wobei jeweils einem Volumen von 10 ml des Leitungswassers 5 pl einer MS2-Bakteriophagen Lösung (Leibniz Institute DSMZ: DSM 13767) als Spike zugegeben wurde.
Aus einem solchen Probeflüssigkeitsvolumen wurden als Vergleichsproben zwei Proben (Probe 1 und 2) von je 200 pl entnommen. Zwei weitere Probeflüssigkeitsvolumina von jeweils 10 ml der Probeflüssigkeit wurden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eingeengt. Für die Einengung wurden kommerziell unter der Bezeichnung „Water Beads“ erhältliche Superabsorber-Kugeln verwendet, die pro Kugel eine Masse von ca. 0,006 g und einen Durchmesser von ca. 1 mm aufweisen. Es wurden 40 Stück der „Water Beads“ in jedes der beiden Probeflüssigkeitsvolumina gegeben. Durch Inkubieren des so erhaltenen Gemisches wurde dessen flüssiger Anteil auf ein Volumen von ca. 500 pl eingeengt. Von diesem flüssigen Anteil wurden 2 xje 200 pl für die nachfolgende Phagen-RNA- Extraktion eingesetzt (Proben 3 bis 6).
Parallel dazu wurde ein weiteres Probeflüssigkeitsvolumen von 10 ml mit einem Standardverfahren unter Verwendung einer Filtrationsmembran bearbeitet. Dazu wurde das Probeflüssigkeitsvolumen über eine Filtermembran (0,45 pm MCE Membran; Millipore) unter Verwendung einer Vakuumpumpe filtriert. Der Filter wurde zerschnitten und mit 600 pl 1 x PBS-Lösung versetzt und in einem Lysis Tube unter Verwendung eines Homogenisators (SpeedMill, Analytik Jena GmbH) homogenisiert. Von der nach Homogenisierung erhaltenen Flüssigkeit von ca. 500 pl wurden zwei Proben mit einem Volumen von jeweils 200 pl für die Phagen-RNA-Extraktion eingesetzt (Proben 7, 8).
Die Phagen-RNA-Extraktion erfolgte mittels eines automatisierten Verfahrens auf dem Automaten KingFisher Flex (Thermo Fisher) und einem kommerziell verfügbaren Kit (deltaprep AniPath DNA/RNA Kit KFFLX; IST Innuscreen GmbH). Die extrahierte Phagen-RNA wurde mittels Real Time PCR zum Nachweis der MS2-Phagen-RNA eingesetzt. Als Nachweis-System wurde ein kommerzieller Kit verwendet (innuDETECT Internal Control DNA/RNA Assay; IST Innuscreen GmbH). Für die Reverse Transkription und Amplifikation der MS2-Phagen-RNA wurde ein kommerzieller OneStep- RT- Mastermix verwendet (innuDRY qRT-PCR MasterMix Probe; IST Innuscreen GmbH).
In Fig. 4 sind die Amplifikationskurven der Proben dargestellt. Die Kurven A (lange und kurze Striche) geben die Verläufe der Amplifikationskurven der Proben 1 und 2 der nicht eingeengten Probeflüssigkeit an. Die Kurven B (gleich lange Striche) sind die Amplifikationskurven der Proben 3 bis 6 der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingeengten Probeflüssigkeit. Die Kurven C (durchgezogene Linie) sind die Amplifikationskurven der Proben 7 und 8, die durch filterbasierte Anreicherung gewonnen wurden.
Die Tabelle 3 gibt die Ct-Werte für die einzelnen Proben an:
Tabelle 3:
Figure imgf000017_0001
Die Unterschiede der Ct -Werte zeigen rechnerisch eine 50-fache Konzentrierung der Ausgangsprobe. Die filterbasierte Anreicherung scheint für die Anreicherung der Phagen nur sehr schlecht geeignet zu sein.
Ausführungsbeispiel 4: Aufkonzentrierung genomischer DNA in einer Wasserprobe und spektrophotometrische Messung
Für den Nachweis, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Aufkonzentrierung genomischer DNA in einer Probeflüssigkeit eignet, wurde genomische DNA aus einer Blutprobe isoliert. Die DNA wurde in Wasser gelöst und die Konzentration der DNA auf 10 ng/pl eingestellt. Das Ausgangsvolumen der so hergestellten Probeflüssigkeit betrug 2 ml. Die Einengung erfolgte durch Zugabe von 10 Stück kommerziell verfügbaren „Water Beads“ (Masse pro Stück ca. 0,006 g; Durchmesser: ca. 1 mm). Das Volumen der Probeflüssigkeit wurde nach einer kurzen Inkubationszeit auf ein Restvolumen von 500 pl eingeengt und eine erste spektrophotometrische Messung zur Konzentrationsbestimmung der DNA in dem flüssigen Anteil des Gemisches durchgeführt. Nach Verlängerung der Inkubationszeit wurde der flüssige Anteil des Gemisches weiter bis auf 250 pl eingeengt und eine zweite spektrophotometrische Messung zur Konzentrationsbestimmung der DNA in dem flüssigen Anteil des Gemisches durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4:
Figure imgf000018_0001
Die Daten zeigen, dass nach der Aufkonzentrierung die gemessenen Werte bei nur geringer Abweichung den theoretischen Werten entsprechen.
Ausführungsbeispiel 5: Aufkonzentrierung genomischer DNA aus einer 2 ml Probe und Nachweis der Erhöhung der Konzentration auf einem Agarosegel
Für den Nachweis, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Aufkonzentrierung genomischer DNA einer Probeflüssigkeit eignet, wurde genomische DNA aus einer Blutprobe isoliert. Die DNA wurde in Wasser gelöst und die Konzentration der DNA auf 10 ng/pl eingestellt. Das Ausgangsvolumen der so hergestellten Probeflüssigkeit betrug 2 ml. Aus diesem Ausgangsvolumen wurde eine erste Probe als Vergleichsprobe für die Gelelektrophorese entnommen. Die Einengung des Ausgangsvolumens erfolgte durch Zugabe von 10 Stück kommerziell verfügbaren „Water
Beads“ (Masse ca. 0,006 g; Durchmesser: ca. 1 mm). Der flüssige Anteil des so erzeugten Gemisches wurde nach einer kurzen Inkubationszeit auf ein Restvolumen von 250 pl eingeengt. Eine aus diesem Restvolumen entnommene zweite Probe wurde nachfolgend im Vergleich zur Ausgangsprobe auf einem Agarosegel dargestellt.
Fig. 5 zeigt die gelelektrophoretische Darstellung der DNA, wobei sich in der ersten Spur (1) die DNA- Leiter, in der zweiten Spur (2) die Vergleichsprobe und in der dritten Spur (3) die zweite Probe aus dem eingeengten Restvolumen befindet. Das Gelbild zeigt deutlich die stark erhöhte Menge an DNA nach der Einengung im Vergleich zur nicht eingeengten Probeflüssigkeit.
Ausführungsbeispiel 6: Anreicherung von eukaryotischen Zellen in einer Probeflüssigkeit und nachfolgende Extraktion der DNA aus diesen Zellen
Für den Nachweis, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Aufkonzentrierung von in einer Probeflüssigkeit vorliegenden eukaryotischen Zellen eignet, wurden kernhaltige Zellen aus einer Blutprobe isoliert. Die Zellen wurden danach vollständig in einem Ausgangsvolumen von 2 ml Wasser resuspendiert. Vor der Aufkonzentration der Probeflüssigkeit wurden 200 pl der Ausgangs- Zellsuspension als Vergleichsprobe abgenommen und für eine DNA-Extraktion eingesetzt. Die Einengung der Probeflüssigkeit erfolgte durch Zugabe von 8 Superabsorber-Kugeln, die unter dem Namen „Water Beads“ kommerziell erhältlich sind und die eine Masse ca. 0,009 g und einen Durchmesser von ca. 2 mm aufweisen. Das Ausgangsvolumen der Probeflüssigkeit wurde nach einer kurzen Inkubationszeit auf ein Restvolumen von ca. 400 pl eingeengt. Von diesen ca. 400 pl wurden 200 pl als Probe entnommen und für die DNA-Extraktion eingesetzt.
Die DNA- Extraktion erfolgte mittels eines kommerziellen Kits (innuPREP DNA Mini Kit 2.0; IST Innuscreen GmbH). Die DNA wurde spektrophotometrisch gemessen und auf einem Agarosegel analysiert.
Die Ergebnisse der spektrophotometrischen Messungen und die ermittelte DNA-Menge in den jeweiligen Proben sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Tabelle 5:
Figure imgf000019_0001
Fig. 6 zeigt die gelelektrophoretische Darstellung der DNA, wobei sich in der ersten Spur (1) die DNA- Leiter, in der zweiten Spur (2) die Vergleichsprobe und in der dritten Spur (3) die zweite Probe aus dem eingeengten Restvolumen befindet.
Die Daten zeigen, dass eukaryotische Zellen aus einer Probe mittels der erfindungsgemäßen Verfahren angereichert werden können. Die DNA ist von hoher Qualität.
Ausführungsbeispiel 7: Aufkonzentrierung einer Proteinlösung
Für den Nachweis, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Aufkonzentrierung von Proteinen in einer Probeflüssigkeit eignet, wurde eine wässrige Albumin-Lösung hergestellt. Die Proteinkonzentration wurde in der unbehandelten Ausgangslösung spektrophotometrisch bei 280 nm auf 11 ,8 mg/ml bestimmt. Es wurden unterschiedliche Aufkonzentrierungen vorgenommen. Dazu wurde jeweils ein Ausgangsvolumen von 100 pl der Proteinlösung in ein Reaktionsgefäß überführt und die Lösung jeweils mit einer Kugel kommerziell verfügbarer „Water Beads“ (Masse ca. 0,006 g; Durchmesser: ca. 1 mm) über unterschiedliche Zeiträume inkubiert. Dies führte zur Einengung der Ausgangslösung von 100 pl auf ca. 60 pl, ca. 40 pl sowie ca. 20 pl. Die so eingeengten Restvolumina wurden als einzelne Proben nachfolgend bei 280 nm gemessen und die Proteinkonzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Tabelle 6:
Figure imgf000020_0001
Es zeigt sich, dass mittels des Verfahrens auch Proteine aufkonzentriert werden können und die Konzentrationen in Abhängigkeit von der Einengung kontinuierlich zunehmen.
Ausführungsbeispiel 8: Sensitivitätssteigerung der Real Time PCR nach Aufkonzentrierung einer Probe mit humaner DNA sehr geringer Konzentration
Für den Nachweis, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Aufkonzentrierung von Lösungen mit sehr geringen Konzentrationen an DNA eignet, wurde eine Probeflüssigkeit mit humaner genomischer DNA in sehr geringer Konzentration hergestellt. Die DNA-Konzentration der Probe betrug 8 ng/pl, was ca. der Menge an genomischer DNA einer diploiden eukaryotischen Zelle entspricht. Für die Einengung wurden als Ausgangsvolumina jeweils 100 pl der Probeflüssigkeit eingesetzt. Zu einem ersten Ausgangsvolumen der Probeflüssigkeit wurde 1 Stück kommerziell verfügbarer „Water Beads“ (Masse ca. 0,006 g; Durchmesser: ca. 1 mm) und zu einem zweiten Ausgangsvolumen der Probeflüssigkeit wurde 1 Stück kommerziell verfügbarer „Water Beads“ (Masse ca. 0,009 g; Durchmesser: ca. 2 mm) gegeben. Nach kurzer Inkubation wurden die flüssigen Anteile der beiden Gemische auf ca. 10 pl eingeengt. Eine aus der nicht eingeengten Probeflüssigkeit entnommene Vergleichsprobe (Probe 1) und aus den aufkonzentrierten flüssigen Anteilen der beiden Gemische entnommene Proben (Probe 2-5) wurden in der Real Time PCR zum Nachweis einer humanspezifischen Targetsequenz (Single Copy Gen Östrogenrezeptor 1 , Inhouse-Methode) eingesetzt.
Die Amplifikationskurven der einzelnen Proben sind in Fig. 7 dargestellt. Die Kurven A (durchgezogene Linie) Farbe sind die Amplifikationskurven der Vergleichsprobe (Doppelbestimmung), die Kurven B (lange und kurze Striche) sind die Amplifikationskurven der Proben 2 bis 5.
Die Tabelle 7 gibt die Ct-Werte für die einzelnen Proben an. Tabelle 7:
Figure imgf000021_0001
Eine Probenentnahme aus der Ausgangslösung hat kein Amplifikationsergebnis gebracht, da die Konzentration der DNA zu gering war. Die DNA aus den eingeengten Proben konnte das Single Copy Gene detektieren, was den Erfolg des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt.
Ausführungsbeispiel 9: Erzeugung einer Probe durch Inkubation einer DNA-Lösung mit einem Superabsorber bis zur kompletten Flüssigkeitsaufnahme und nachfolgender Einstellung der Probenkonzentration durch Zugabe einer wässrigen Lösung
Als Probeflüssigkeit wurde eine DNA-Lösung mit einer Konzentration von 100 ng/pl hergestellt (lambda DNA). Zu 500 pl dieser DNA-Lösung wurden zwei kommerziell verfügbare „Water Beads“ (0,006 g; Durchmesser ca. 1 mm) zugegeben und das so erhaltene erste Gemisch inkubiert, bis der flüssige Anteil des Gemisches komplett verschwunden war. Danach erfolgte die Zugabe von 250 pl eines Puffers (10 mM Tris HCl, pH 8,5) zu den verbliebenen „Water Beads“. Das so erzeugte zweite Gemisch wurde mittels eines Vortex-Mischers durchmischt und anschließend der flüssige Anteil des zweiten Gemisches als zu analysierende Probe von den „Water Beads“ getrennt und spektrofotometrisch analysiert.
Die Tabelle 8 gibt die ursprüngliche DNA-Konzentration in der als Probeflüssigkeit dienenden, ursprünglichen DNA-Lösung und die spektrofotometrisch ermittelte Konzentation in der Probe an.
Tabelle 8:
Figure imgf000021_0002
Die Daten zeigen, dass die in der Probe nach Aufkonzentrierung und erneuter Resuspendierung ermittelte Konzentration mit nur geringer Abweichung den theoretischen Werten entsprechen. Ausführungsbeispiel 10: Aufkonzentrierung einer Probeflüssigkeit zum Nachweis eines Proteins (CRP) mittels eines immunologischen Nachweisverfahrens
Als Probeflüssigkeit wurde eine Verdünnung des C-reaktiven Proteins (CRP) in einer PBS-Pufferlösung verwendet. Der immunologische Nachweis des C-reaktiven Proteins in verschiedenen, aus der Probeflüssigkeit erzeugten Proben erfolgte mittels eines CRP-ELISA Kits von Bio-Techne GmbH (h C- Reactive Protein DuoSet, DY1707). Als Ausgangsprobe diente die Positive Standardkontrolle (humanes CRP) des Kits. Die Messungen wurde in einem ELISA Reader (Thermofisher) bei 405 nm durch geführt.
Aus der Ausgangsprobe wurden drei Lösungen (Proben 1 , 2 und 3) unterschiedlicher Konzentrationen an CRP erzeugt. Aus diesen Proben wurde jeweils ein erster Anteil von ca. 80 pl entnommen, mit 120 pl des Dilution Buffers des Kits verdünnt und auf die ELISA-Platte gegeben. Aus den Proben 1 , 2 und 3 wurde ein weiterer Anteil von jeweils 500 pl entnommen, mit jeweils 6 „Water Beads (0,006 g, Durchmesser 1 mm) versetzt und inkubiert, bis die so erhaltenen Proben 1A, 2A und 3A auf ein Volumen von ca. 70-80 pl eingeengt waren. Diese eingeengten Proben 1A, 2A und 3A wurden ebenfalls mit 120 pl des Dilution Buffers des Kits verdünnt und auf die ELISA-Platte gegeben. Die auf die ELISA-Platte aufgebrachten Lösungen aus Proben 1 , 2, 3, 1A, 2A und 3A wurden neben einer Standardreihe [S1-S4, je 200 pl] nach den Vorschriften des Herstellers semiquantitativ vermessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefasst.
Tabelle 9:
Figure imgf000022_0001
Aufgrund der unzureichenden Bindungskapazität, Spannweite und Linearität der ELISA-Methode konnten die theoretisch erwarteten Proteinmengen nicht exakt gemessen werden. Die theoretisch berechnete Anreicherung betrug den Faktor 6,5. Die mittels ELISA gemessene Anreicherungsrate liegt zwischen 2,1 und 5,4.
Die Konzentration der nicht messbaren Probe 3 konnte in der aus Probe 3 durch Anreicherung erzeugten Probe 3A bestimmt werden. Damit zeigt sich, dass es mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich ist, ein spezifisches Zielprotein in einer Probeflüssigkeit aufzukonzentrieren und mittels ELISA nachzuweisen. Über die Aufkonzentrierung ist somit ein Sensitivitätsvorteil erzielbar.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Erzeugung einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) einer die mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit durch Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in dem ersten Flüssigkeitsvolumen (1), umfassend:
- Zugeben eines Superabsorbers (2) zu dem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) oder Zugeben des ersten Flüssigkeitsvolumens (1) zu dem Superabsorber (2),
- Inkubieren des aus dem Superabsorber (2) und dem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) gebildeten ersten Gemisches, und
- Entnehmen einer Probe des nach dem Inkubieren vorliegenden flüssigen Anteils (3) des ersten Gemisches.
2. Verfahren zur Erzeugung einer mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) einer die mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit, umfassend:
- Zugeben eines Superabsorbers (2) zu dem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) oder Zugeben des ersten Flüssigkeitsvolumens (1) zu dem Superabsorber (2),
- Inkubieren des aus dem Superabsorber (2) und dem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) gebildeten ersten Gemisches,
- danach Zugeben eines zweiten Flüssigkeitsvolumens einer wässrigen Lösung zum verbliebenen Superabsorber oder Zugeben des verbliebenen Superabsorbers zu dem zweiten Flüssigkeitsvolumen und Erzeugen eines zweiten Gemisches aus dem Superabsorber und dem zweiten Flüssigkeitsvolumen, und
- Entnehmen einer Probe des flüssigen Anteils des zweiten Gemisches.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das aus dem Superabsorber und dem zweiten Flüssigkeitsvolumen gebildete zweite Gemisch vor dem Entnehmen der Probe des flüssigen Anteils des zweiten Gemisches inkubiert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die wässrige Lösung einen Lysepuffer umfasst.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das Inkubieren des ersten Gemisches bis zum im Wesentlichen vollständigen Verschwinden des flüssigen Anteils des ersten Gemisches durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das erste Flüssigkeitsvolumen (1) eine polare Flüssigkeit, insbesondere als Hauptbestandteil, enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die polare Flüssigkeit Wasser ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zielsubstanz ein Biomolekül ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Zielsubstanz ausgewählt ist aus der Gruppe gebildet aus: eukaryotischen Zellen, Bestandteilen von eukaryotischen Zellen, prokaryotischen Zellen, Bestandteilen prokaryotischer Zellen, subzellulären Vesikeln, Bakteriophagen, Viren oder Virusbestandteilen, Toxinen, Antikörpern, Nukleinsäuren und Proteinen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Superabsorber (2) einen Kunststoff umfasst, der Wasser unter Bildung eines Hydrogels aufnimmt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Kunststoff im Wesentlichen keine Biomoleküle, insbesondere im Wesentlichen keine eukaryotischen Zellen, Bestandteile von eukaryotischen Zellen, prokaryotischen Zellen, Bestandteile von prokaryotischen Zellen, subzelluläre Vesikel, Bakteriophagen, Viren oder Virusbestandteile, Toxine, Antikörper, Nukleinsäuren oder Proteine, aufnimmt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , wobei der Superabsorber (2) in Form von Partikeln, z.B. als Pulver, als Granulat oder in Form geometrischer Körper, insbesondere Kugeln, eingesetzt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Superabsorber (2) in Form von, insbesondere kommerziell erhältlichen, Wasserperlen, Hydrokugeln, Aquaperlen, Aquabeads, Waterbeads, oder Gelkugeln, eingesetzt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, wobei die Partikel einen Durchmesser zwischen 100 bis 5000 pm aufweisen.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Volumen des nach dem Inkubieren verbleibenden flüssigen Anteils des ersten oder zweiten Gemisches durch die zeitliche Dauer des Inkubierens und/oder durch die Art und/oder die Menge des Superabsorbers und/oder durch die während des Inkubierens herrschende Temperatur des Gemisches gesteuert wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Superabsorber (2) in Form von Partikeln, z.B. als Pulver, als Granulat oder in Form geometrischer Körper, insbesondere Kugeln, eingesetzt wird, und wobei das Volumen des nach dem Inkubieren verbleibenden flüssigen Anteils (3) durch die Größe und/oder Anzahl der Partikel gesteuert wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die erzeugte Probe als Rohprodukt oder Produkt in einem experimentellen Verfahren oder in einem Produktionsprozess eingesetzt wird.
18. Verwendung eines Superabsorbers (2) zur Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz, insbesondere eines Biomoleküls, in einem Flüssigkeitsvolumen (1).
19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Flüssigkeitsvolumen (1) eine polare Flüssigkeit, insbesondere Wasser, enthält, und wobei der Superabsorber (2) dazu eingerichtet ist, die polare Flüssigkeit unter Bildung eines Hydrogels aufzunehmen.
20. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17.
21. Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung mindestens einer Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit umfassend:
Erzeugen einer die mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probe aus einem ersten Flüssigkeitsvolumen (1) einer die mindestens eine Zielsubstanz enthaltenden Probeflüssigkeit nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16; und
Qualitativer oder quantitativer Nachweis der mindestens einen Zielsubstanz anhand der Probe mittels mindestens einer der folgenden Methoden: Nukleinsäure-basierte Nachweisverfahren, insbesondere PCR-, realtime PCR- oder digital PCR-basierte Verfahren, Sequenzierung, immunologische Nachweisverfahren, insbesondere ELISA, Lateral Flow Tests, mikrobiologische Analysen, mikroskopische Verfahren, Massenspektrometrie, Nachweisverfahren mittels optischer, spektroskopischer oder elektrochemischer Sensoren, und Durchflusszytometrie.
22. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 21 , welches mindestens den Superabsorber umfasst.
PCT/EP2022/082182 2021-11-22 2022-11-17 Verfahren zur aufkonzentrierung mindestens einer zielsubstanz in einem flüssigkeitsvolumen WO2023088991A1 (de)

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