EP4326438A1 - Verfahren zur automatisierten online-detektion mindestens einer biologischen zielsubstanz in einer flüssigkeit und online-analysegerät - Google Patents

Verfahren zur automatisierten online-detektion mindestens einer biologischen zielsubstanz in einer flüssigkeit und online-analysegerät

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Publication number
EP4326438A1
EP4326438A1 EP22722145.4A EP22722145A EP4326438A1 EP 4326438 A1 EP4326438 A1 EP 4326438A1 EP 22722145 A EP22722145 A EP 22722145A EP 4326438 A1 EP4326438 A1 EP 4326438A1
Authority
EP
European Patent Office
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particles
reaction chamber
biomolecules
unit
liquid
Prior art date
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Pending
Application number
EP22722145.4A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Timo Hillebrand
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IST Innuscreen GmbH
Original Assignee
IST Innuscreen GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by IST Innuscreen GmbH filed Critical IST Innuscreen GmbH
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Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/14—Process control and prevention of errors
    • B01L2200/143—Quality control, feedback systems
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/16—Reagents, handling or storing thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1805—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics

Definitions

  • the invention relates to a method for automated online detection of at least one biological target substance in a liquid and an online analysis device that is designed to carry out the method automatically.
  • Target substances to be detected or monitored can be, for example, viruses, bacteria and plasmid-associated bacterial resistance genes.
  • Such biological target substances in liquids are detected using molecular genetic methods, preferably using amplification techniques such as PCR or real-time PCR.
  • samples of the liquid to be analyzed are taken and analyzed in specialized laboratories that have the necessary equipment systems.
  • Manually manageable or automatic sampling devices and sample collectors are known for automated sampling from processes, e.g.
  • the collected samples are usually transported to a laboratory for further analysis, where the extraction of the sample nucleic acids and the specific and possibly quantitative detection of the biological target substance is carried out manually or at least partially automatically.
  • online analysis devices which take a sample and carry out a quantitative determination of a mostly inorganic analyte in the sample in a fully automated manner.
  • Such an online analysis can be carried out continuously or discontinuously.
  • a sample collection device for flow-through sampling in bodies of water is known from US 2015/0224502 A1.
  • the device has several flow-through sample cartridges that are set up to receive water from the water to be monitored and, if necessary, to retain samples of components of the liquid or solids in a filter or adsorption medium, while the water received is returned from the cartridges to the body of water is routed back.
  • the samples can either be stored for later laboratory analysis or analyzed directly in the device.
  • biological substances adsorbed on the filter or adsorption medium can be released as lysate and made available to an analysis module for further analysis, e.g. by means of qPCR.
  • the object of the invention is to provide an improved method for automated online detection of a biological target substance in a liquid and an online analysis device suitable for carrying out the method.
  • the method and the device should enable an efficient concentration of the target substance during sampling and a low-loss forwarding of the concentrated target substance to a subsequent analysis unit.
  • the method according to the invention for the automated online detection of at least one biological target substance in a liquid, in particular water or waste water, using an online analysis device comprises the following steps:
  • the detection unit having a first microfluidic unit and a second microfluidic unit which can be fluidically connected to the first microfluidic unit; - Releasing and/or isolating nucleic acids from the biomolecules bound to the particles; - transporting an eluate comprising the released and/or isolated nucleic acids into the second microfluidic unit;
  • biomolecules are understood to mean bacteria, bacteriophages, viruses, subcellular particles and free nucleic acids or nucleic acid fragments.
  • the target nucleic acid to be amplified in the second microfluidic unit can either be the target substance to be detected or a nucleic acid of the target substance to be detected.
  • the first and the second microfluidic unit can be accommodated in two separate cartridges or in a common cartridge.
  • biomolecules By the biomolecules being bound to particles and transported with them into a first microfluidic unit in order to release and/or isolate nucleic acids for further analysis in the first microfluidic unit, a method in which biomolecules are bound to a filter medium are released by rinsing out the filter medium, a comparatively high proportion of the biomolecules obtained from the first volume of the liquid are concentrated in a small eluate volume.
  • the method according to the invention not only brings about an efficient concentration of the target substance to be determined, but also makes it possible to select a comparatively small first volume of liquid to be removed from the process, even with a low concentration of the target substance in the liquid to be examined.
  • the method is therefore universally suitable for monitoring liquids in a large number of different industrial processes, regardless of whether the first volume transported into the process unit has to be discarded after enrichment and, if necessary, disposed of, or whether it can be returned to the process.
  • the sample feed line can be fluidically connected to a sample receiver.
  • the sample template can contain a supply of the liquid to be examined. It can be connected to a sampling device which is set up to take liquid from a body of water, a liquid-carrying line of a supply network, or a process container, e.g. Alternatively, the sampling device can also be connected directly to the sample feed line of the online be connected to the analyzer. The transport of liquid into the process unit of the online analysis device can be automatically controlled by the control electronics of the analysis device.
  • the first volume of liquid can be drained from the reaction chamber and a second volume of liquid can be introduced into the reaction chamber.
  • Biomolecules contained in the second volume of the liquid can be concentrated in the reaction chamber by binding to the particles remaining in the reaction chamber.
  • the particles can be magnetic or paramagnetic particles to which the biomolecules bind, in particular non-selectively.
  • the concentration of biomolecules contained in the liquid can include introducing one or more reaction components into the reaction chamber of the process unit.
  • the reaction components can, for example, comprise an alginate solution and a salt of a di- or polyvalent cation or an acid into the reaction chamber, so that an alginate gel-biomolecule complex is formed on the particles.
  • the particles can be added to the reaction chamber at the same time as the reaction components, or can also be placed in the latter before or after the first volume of liquid has been transported into the reaction chamber.
  • the particles are first moved by means of the magnet (for example in the direction of an opening through which the particles can be removed) and then by means of the needle, the magnetic needle or the pipetting device in the said area be transferred to the reaction chamber.
  • the reverse order can be provided, so that the particles are first transferred by means of the needle, the magnetic needle or the pipetting device and are then moved by means of the magnet.
  • the magnet can be a permanent magnet or an electromagnet.
  • the magnetic part of the magnetic needle can also be designed as a permanent magnet or as an electromagnet.
  • the particles can be flushed into the first microfluidic unit by introducing a small partial volume of the liquid contained in the reaction chamber.
  • the transport of the liquid and the particles can be brought about by the effect of gravity or a hydrostatic pressure of the liquid in the reaction chamber by arranging the area in which the fluid line opens into the reaction chamber somewhat lower than the bottom of the reaction chamber.
  • the liquid remaining in the reaction chamber can be drained out of the reaction chamber via an outlet.
  • the majority of the liquid can first be drained from the reaction chamber while the particles are still retained in the reaction chamber by means of the magnet. The particles can then be flushed into the detection unit or into the first microfluidic unit with a remainder of the liquid.
  • Releasing and/or isolating nucleic acids from the biomolecules bound to the particles in the first microfluidic unit can include at least the following steps:
  • the same particles are advantageously used not only for extracting and enriching the biomolecules from the liquid to be monitored, but also for binding and purifying the released nucleic acids.
  • the method can include detaching the nucleic acids from the particles by elution and transporting an eluate comprising the nucleic acids into the second microfluidic unit for subsequent amplification.
  • the release and/or isolation of nucleic acids from the biomolecules bound to the particles in the first microfluidic unit can include the following steps:
  • a buffer solution for example in a phosphate-buffered saline solution, in water or a Tris buffer, which optionally contains a complexing reagent for complexing of divalent or polyvalent cations bound to the particles with the biomolecules, and
  • the thermal release can include dispersing the particles in the buffered solution, optionally containing the complexing agent, and incubation.
  • the alginate gel structure present on the particle surfaces is thereby dissolved and the biomolecules bound therein are dissolved.
  • This variant of the method is suitable, for example, for applications in which the target substance to be determined is a nucleic acid that is already freely present in the liquid to be analyzed. In this alternative embodiment of the method, a classic lysis can therefore be omitted.
  • the nucleic acids bound to the particles in an alginate complex can only be dissolved by adding the buffer solution to the particles, optionally with further addition of the complexing agent, eg a chelating agent such as EDTA. It is also possible to use the method when the target substance is a bacterium or a virus as a biomolecule. In this case, the biomolecules bound to the particles can be thermally destroyed and the nucleic acid contained can be released.
  • the complexing agent eg a chelating agent such as EDTA.
  • the amplification carried out in the second microfluidic unit can be carried out, for example, using conventional PCR-based methods.
  • the qualitative or quantitative determination of the target substance can also be carried out in a conventional manner by using a sensor to record at least one measured value of a measured variable at a specific point in time or at a plurality of points in time, which corresponds to the number present at the respective point in time due to the amplification generated copies of a target nucleic acid. From the measured value obtained or the course of measured values as a function of time, the presence of the target nucleic acid and thus the biological target substance in the liquid to be monitored can be qualitatively detected, or a quantitative value, e.g. a concentration, of the biological target substance in the liquid can be determined and used by the control electronics as a measurement result spend.
  • a quantitative value e.g. a concentration
  • control electronics of the online analysis device advantageously carry out all the method steps described here in an automated manner.
  • it can, for example, effect liquid transport by actuating controllable valves and/or pumps or a relative movement of the magnet with respect to the reaction chamber by a drive moving the magnet and/or the reaction chamber.
  • the invention also includes an online analysis device for detecting at least one biological target substance in a liquid, in particular according to the method described above.
  • the online analysis device comprises at least the following components: control electronics, a processing unit and a detection unit, with the processing unit having at least one reaction chamber and a sample feed line opening into the reaction chamber, and with the processing unit being set up to measure a predetermined volume of the liquid in the reaction chamber absorb and concentrate biomolecules contained in the liquid by binding to particles; and wherein the detection unit comprises: a first microfluidic unit which can be fluidically connected to the reaction chamber and is set up to release and/or isolate nucleic acids from the biomolecules bound to the particles; a second microfluidic unit which is connected to the first microfluidic unit and is set up to receive an eluate comprising the released and/or isolated nucleic acids and to amplify a target nucleic acid; and a sensor, in particular an optical sensor, which is set up to generate a measurement signal dependent on the progress of an amplification carried out in
  • the analysis device can also have a sample pump, with the control electronics being set up to control the sample pump to transport a predetermined volume of the sample into the reaction chamber.
  • the sample feed line can be fluidically connectable to a sample receiver or directly to a body of water or a line in a process plant, a fermenter or another process container.
  • the analysis device can comprise at least one reaction component reservoir, which contains at least one reaction component for concentrating the biomolecules in the reaction chamber.
  • the analyzer can, for example, hold an alginate solution, a solution containing a salt of a di- or polyvalent cation, or alternatively a weak acid as a reaction component in one or more separate reservoirs.
  • the reaction component reservoir can be a container that can be fluidically connected to the reaction chamber via a reaction component supply line that can be selectively blocked or released, for example with a valve.
  • the particles can be placed in the reaction chamber or can also be added as reaction components from a reaction component reservoir to the liquid transported into the reaction chamber to enrich the biomolecules.
  • the particles can be magnetic and/or paramagnetic particles.
  • the control electronics of the analysis device can advantageously be set up to meter a predeterminable amount of the at least one reaction component or all reaction components into the reaction chamber.
  • one or more pumps can be provided for transporting the at least one reaction component, which controls the control electronics.
  • the control electronics can control the already mentioned valve.
  • the analysis device can have means for moving, in particular stirring, the liquid contained in the reaction chamber.
  • the means can include, for example, a stirrer, a feed line for an inert gas into the reaction chamber and a discharge line for the inert gas, which are arranged such that the inert gas flows through the liquid contained in the reaction chamber, or have a drive for moving the reaction chamber.
  • the analysis device can further comprise a magnet, which can be oriented relative to the reaction chamber by means of the control electronics in such a way that magnetic or paramagnetic particles contained in the reaction chamber are transported by magnetic force into an area of the reaction chamber in which a fluid line opens into the reaction chamber, which contains the reaction chamber fluidly connected to the first microfluidic unit.
  • the analysis device can have a switchable electromagnet, which is arranged with respect to the reaction chamber in such a way that magnetic or paramagnetic particles contained in the reaction chamber are transported by magnetic force into an area of the reaction chamber in which a fluid line opens into the reaction chamber fluidically connects the reaction chamber to the first microfluidic device.
  • the control electronics can be designed to switch the electromagnet.
  • the first and the second microfluidic unit can be arranged together in one, in particular replaceable, cartridge.
  • the first microfluidic unit can be arranged in a first cartridge and the second microfluidic unit can be arranged in a second cartridge that is different from the first cartridge, the first and second cartridges being fluidically connectable to one another in order to transport liquid from the first cartridge into the second .
  • the first and the second cartridge can be designed to be exchangeable.
  • the first microfluidic unit can be set up to receive the particles with biomolecules bound thereto and to add one or more lysis reagents to release nucleic acid of the adsorbed biomolecules, then to bind the released nucleic acids to the particles and to absorb the particles with the nucleic acids bound thereto. or to wash several times with a washing solution.
  • the control electronics can be set up to control a transport of the particles and optionally the reagents through the first microfluidic unit.
  • the first microfluidic unit can also be set up to detach the nucleic acids from the particles by elution and to transport the eluate into the second microfluidic unit via a fluid line connecting the first microfluidic unit to the second microfluidic unit.
  • the control electronics can be set up to control the elution and the transport of the eluate.
  • the first microfluidic unit can be set up to receive the particles with biomolecules bound to them and the biomolecules bound to the particles or the nucleic acids contained in these biomolecules in a buffer solution, for example in a phosphate-buffered saline solution (PBS buffer), water or a Tris buffer, which optionally contains a complexing agent, for example a chelating agent such as EDTA, thermally release, the control electronics being set up to control the thermal release of the biomolecules and the buffer solution with the biomolecules or nucleic acids dissolved therein in the second microfluidic unit to be transported for subsequent amplification.
  • PBS buffer phosphate-buffered saline solution
  • Tris buffer which optionally contains a complexing agent, for example a chelating agent such as EDTA
  • thermally release the control electronics being set up to control the thermal release of the biomolecules and the buffer solution with the biomolecules or nucleic acids dissolved therein in the second microfluidic unit to be transported for
  • the first microfluidic unit can contain reaction components required for the release and/or isolation of the nucleic acid in solid form, for example in the form of pellets obtained by lyophilization, or in reagent chambers closed by microvalves or in reagent packs closed by foils, which are automated by the action of force or heat, in particular by means of the control electronics, can be opened.
  • Reagents for the amplification can be stored in a corresponding manner in the second microfluidic unit. It can also contain one or more detection chambers, in which the amplification of a target nucleic acid or else several different target nucleic acids can be carried out in parallel.
  • the second microfluidic unit can include a temperature control device for the detection chambers.
  • the temperature control device can, for example, have thermoelectric elements that can be controlled by the control electronics.
  • the control electronics can have an electronic data processing device with at least one processor and a memory in which one or more operating programs are stored that can be executed by the processor in order to automatically control the analysis device and to determine qualitative or quantitative analysis results from the measurement signals of the sensor .
  • the operating programs can be designed in such a way that the control electronics control the analysis device to carry out the method described above.
  • the control electronics can also have a user interface, e.g., a touch screen or other display in combination with an input keyboard.
  • the control electronics can be set up to be connected wirelessly by radio or via a data line to another data processing device, e.g. a computer, a process controller, a display or operating device, in particular a portable one, for communication.
  • the analyzer can thus perform on-line determinations of biological target substances in a liquid without requiring manual sampling or preparation or transport of samples to a laboratory.
  • the analysis device can carry out sampling and detection cycles fully automatically, which can be event-controlled by the electronic control system or carried out at predetermined time intervals, for example.
  • FIG. 2 shows an exemplary embodiment of a process unit of the online system shown in FIG.
  • the analysis device 1 shows an exemplary embodiment of an online analysis device 1 for detecting a biological target substance in a liquid according to the invention.
  • the analysis device 1 has a housing 2 in which all the components of the device are accommodated. These components include in detail a process unit 3, a detection unit 4 and control electronics 5.
  • the process unit 3 forms the core of the invention, since it is designed to enrich biological target molecules in a volume of a liquid to be analyzed and for detection and, if necessary, preparatory steps such as Extraction and / or isolation of nucleic acids to the detection unit 4 pass.
  • the process unit 3 is fluidically connected via a sample feed line 6 to a sample receiver 7 or to a process container, e.g. a pipeline or a reactor or a fermenter, in which the liquid to be analyzed is contained.
  • a pump 9 which can be controlled by the electronic control unit 5 according to an operating program stored in the electronic control unit 5 and executed by it, is used to transport and dose the liquid from the sample receiver 7 into a reaction chamber 8 contained in the process unit 3.
  • the reaction chamber 8 can also be fluidically connected to reaction component reservoirs 10, 11.
  • the reaction component reservoirs 10, 11 contain reagents which serve to enrich the biomolecules contained in the liquid.
  • each reaction component reservoir 10, 11 is fluidically connected to the reaction chamber in the process unit 3 via a fluid line.
  • a pump 12 , 13 is used to transport the reaction components through the fluid lines. It is also possible for the reaction components to be integrated directly into the process unit 3 .
  • the transport of the reaction components can, of course, be effected by other means known to those skilled in the art, for example pneumatically or by utilizing hydrostatic pressure.
  • the process unit 3 can optionally have a temperature control unit (not shown in FIG. 1 ), which is used to set a specific temperature in the reaction chamber 8 .
  • the temperature control unit can include resistance heating, cooling and/or thermoelectric elements for selective heating or cooling. It can be connected to the control electronics 5 , the control electronics 5 being set up to control or regulate the temperature in the reaction chamber 8 .
  • the process unit 3 can also have a device 14 for moving or stirring a liquid or liquid mixture contained in the reaction chamber 8 .
  • the device 14 comprises a drive for moving, for example shaking, the reaction chamber 8 .
  • the device 14 in particular the drive, can be controlled by the control electronics 5 .
  • the reaction chamber 8 can be fluidically connected to the detection unit 4 and to a liquid outlet 17 via the fluid line 15 optionally by means of a valve 16 that can be actuated by the control unit 5 .
  • the detection unit 4 has an analysis cartridge in which two microfluidic units fluidically connected to one another via the fluid line 18, namely a first microfluidic unit 19 and a second microfluidic unit 20, are integrated.
  • the microfluidic units can also be accommodated in separate cartridges.
  • the analysis cartridge can be replaced.
  • the first microfluidic unit 19 is set up to receive a sample containing the concentrated biomolecules from the reaction chamber and to prepare it for subsequent amplification and detection in the second microfluidic unit 20 . This can be done by means of extraction and isolation processes known per se.
  • the first microfluidic unit 19 includes reagents and optionally a temperature control unit for incubating reaction mixtures produced in the microfluidic unit 19 .
  • the detection unit comprises suitable means known to those skilled in the art, which can be controlled by the control electronics 5 .
  • the second microfluidic unit 20 includes means for amplification, i.e.
  • the detection unit has a sensor 21 which can, for example, carry out fluorescence measurements in the second microfluidic unit 20 and can output measurement signals to the control electronics 5 .
  • the control electronics 5 are set up to determine a qualitative or quantitative analysis result based on the measurement signals.
  • the control electronics 5 can be a central processing unit, e.g. a CPU with a processor and memory and operating programs stored therein. It can also be divided among several computing units within the analysis device, e.g. the process unit 3 and the detection unit 4 can each have their own on-site electronics, which are connected to higher-level electronics for communication, with the higher-level electronics and the on-site electronics together Control electronics 5 form.
  • a central processing unit e.g. a CPU with a processor and memory and operating programs stored therein. It can also be divided among several computing units within the analysis device, e.g. the process unit 3 and the detection unit 4 can each have their own on-site electronics, which are connected to higher-level electronics for communication, with the higher-level electronics and the on-site electronics together Control electronics 5 form.
  • FIG. 2 shows the process unit 4 of the online analysis device 1 in detail.
  • the structure of the process unit 4 shown in FIG. 2 is only one possible exemplary embodiment. A person skilled in the art can find numerous variants without departing from the spirit of the invention.
  • the process unit 4 has a reaction chamber 8 with various inlets and outlets.
  • the supply lines 22, 23, 24 are connected to storage containers for reagents, which serve as reaction component reservoirs 10, 11.
  • the opening 25 is connected to the sample feed line 6 .
  • a specific volume of the liquid to be analyzed is fed into the reaction chamber 8 via it.
  • a further opening 26 is connected to the fluid line 15 which connects the reaction chamber 8 to a sample outlet and to the detection unit 4 .
  • valves are arranged in the supply lines, which can be actuated by the control electronics.
  • the process unit 3 in the present exemplary embodiment includes a magnet 27 that is movably arranged on the housing of the reaction chamber 8.
  • the process steps according to the invention running in the process unit 3 are as follows.
  • the control electronics 5 controls the pump 9 to transport a first volume of the liquid from the sample template 7 via the sample feed line 6 and the opening 25 into the reaction chamber 8.
  • the Liquid can be, for example, water from a body of water, a water network or from a water treatment process.
  • reaction components are added to the liquid in the reaction chamber 8 via the feed lines 22 , 23 and 24 . This can take place before, during or after the liquid is introduced into the reaction chamber 8 via the sample feed line 6 .
  • magnetic or paramagnetic particles, an alginate solution and a calcium chloride solution are added as reaction components.
  • reaction components make it possible to enrich the biomolecules present in the liquid and to prepare them for a nucleic acid extraction.
  • the method is basically described in DE 10 015215 894 A1. If particles, calcium chloride and alginate are present, it is therefore possible to bind biomolecules, e.g. viruses, bacteria or also free nucleic acids to the particles in the form of an alginate complex. This makes it possible to reduce a large-volume water sample to a much smaller sample volume in such a way that the biomolecules from the first volume of the liquid then accumulate on the particles.
  • a further advantage results from the fact that it is possible with the approach according to the invention to bind bacteria, viruses and also free nucleic acids to one and the same type of particle in a completely unselective manner.
  • no modified particles ie for example particles coupled to an antibody or other ligands, are required for the enrichment of the target substance.
  • methods that use particles modified with antibodies or other ligands for the enrichment of the target substance a large number of different particles are required for the parallel determination of several target substances in a sample. Such a method is significantly more complex and so expensive that its use for a continuous monitoring of biological parameters in process industry applications would not be profitable.
  • the target substance to be detected is a bacterium. Bacteria adsorb non-specifically to small particles. Although this adsorption is not as efficient as the binding in the presence of alginate and calcium ions, the bacteria contained in the liquid can be enriched on the particles in this way, while the free nucleic acids and viruses remain in the liquid and therefore not in the subsequent extraction and analysis steps.
  • biomolecules to the particles, they can be dispersed in the liquid, e.g. by means of a stirring device that can be actuated by the control electronics 5 or by means of a drive that causes the processing unit 3 to move (not shown in FIG. 2).
  • the particles with the bound biomolecules are subsequently sedimented and concentrated by means of the movable magnet 27 .
  • the magnet 27 then moves the particles to the opening 26 on the processing unit 4. This opening 26 is arranged somewhat recessed. The particles are moved into this depression by means of the magnet 27 and placed there.
  • the reaction chamber 8 can be moved with respect to the magnet.
  • the magnet can be a switchable electromagnet, which is arranged in the area of the opening 26 and is switched on by the control electronics 5 in order to attract the particles into the area of the opening 26 by means of its magnetic field.
  • a needle which can also be designed magnetically
  • a pipetting device or a combination of magnet, needle and/or pipetting device is used for the movement or the transfer of the particles.
  • the opening 26 is fluidly connected to the fluid line 15 which can be connected via the valve 16 to the detection unit 4 on the one hand and to the liquid outlet 17 on the other hand.
  • the particles together with a small volume of the liquid contained in the reaction chamber are flushed through the fluidic line 15 into the first microfluidic unit 19 via the fluidic line 15 by means of the control electronics 5 .
  • a further pump, which is controlled by the control electronics 5, can be used for this purpose.
  • the valve 16 is also actuated by the control electronics 5 . Automated nucleic acid extraction and/or isolation takes place in the first microfluidic unit 19, and automated amplification and detection by means of PCR or real-time PCR takes place in the second microfluidic unit 20 connected downstream of the first microfluidic unit 19.
  • Microfluidic units suitable for the method described here for automated nucleic acid extraction, amplification and detection are basically known in the prior art.
  • a centrifugal platform such as that described in WO 2013/045631 A1 and EP 2 621 632, for example, is advantageous for the present application A1 is described, but it is also possible to use other microfluidic platforms or lab-on-chip systems that transport liquids and reagents by means of capillary forces,
  • the nucleic acids are extracted and/or isolated in the first microfluidic unit 19 using known reagents and methods, as already described in the introduction. If the biological target substance is not already freely present in the liquid taken from the sample, the biomolecules bound to the particles are lysed. The free nucleic acids are bound to the particles again. The same particles are therefore used to enrich the biomolecules in the original sample as well as for the subsequent isolation of the released nucleic acids. The particles with the bound nucleic acids are then washed in a known manner and the nucleic acids are finally detached from the particles. The eluate containing the dissolved nucleic acids is transported into the second microfluidic unit 20, again controlled by the control electronics 5.
  • the second microfluidic unit 20 specific volumes of the eluate are transported into one or more detection chambers and amplification reagents are added. An amplification then takes place in the detection chambers, the progress of which is monitored by means of fluorescence measurements with the sensor 21 .
  • the sensor 21 outputs measurement signals to the control electronics 5 . From the measurement signals, this determines either a qualitative value that indicates whether the specific biological target substance is contained in the liquid taken from the sample holder 7 .
  • the control electronics 5 can also determine a quantitative value from the measurement signals, which represents a concentration of the biological target substance in the liquid.
  • different target nucleic acids can be amplified in a number of detection chambers and a number of different biological target substances in the liquid can thus be determined qualitatively or quantitatively in parallel.
  • the liquid remaining in the reaction chamber 8 is discharged from the process unit 3 through the liquid outlet 17 .
  • the process unit 8 can be sufficiently rinsed with a rinsing medium, in particular with liquid sucked in from the sample holder 7, and the process can now be repeated for a further measurement.
  • the microfluidic units 19, 20 in the detection unit can be replaced by new microfluidic units 19, 20 for further measurement.
  • the liquid in an alternative embodiment of the method, which is particularly advantageous if the biological target substance is present in the liquid in a very low concentration, it is possible for the liquid to be discharged from the process unit 3 after the biomolecules contained in the liquid have been enriched by binding to the particles , but the particles are not yet transferred to the detection unit 4 for the subsequent nucleic acid extraction, but remain in the process unit 3 .
  • second volume of liquid from the sample template 7 in the Reaction chamber 8 are initiated.
  • the particles are resuspended in the second volume of liquid and the alginate solution and calcium chloride are again added. This starts a cumulative process that allows a larger volume of liquid to be used and, if necessary, also to increase sensitivity. Such runs can be repeated several times.
  • Example detection of bacteria and free DNA in a water sample
  • a sample volume of 50 ml of the water was transferred via the opening 26 into an exemplary process unit 3 .
  • a volume of 100 ⁇ l of an alginate solution was added to the sample via the opening 24 from a reservoir.
  • the process unit 3 was briefly swiveled for the purpose of mixing.
  • a volume of 100 ⁇ l of a calcium chloride solution from a reservoir was then added to the sample via the opening 23 and the process unit was pivoted again.
  • 50 ml of paramagnetic particles (MAG Suspension; AJ Innuscreen GmbH) from a reservoir were added to the sample via a further opening 22 and the process unit 3 was swiveled again. After an incubation time of 20 min, the particles were collected with the movable magnet 27 and transported to the depression at the outlet opening 26 and fixed there.
  • MAG Suspension AJ Innuscreen GmbH
  • the reaction chamber 8 was subsequently emptied via the outlet opening 26 .
  • the collected particles were removed from the process unit via the outlet opening 26 together with the remainder of the water sample (approx. 200 ml) remaining in the reaction chamber.
  • the particles are transported from this position into the detection unit 4 for extraction and further detection. Here the extraction of the nucleic acid and subsequent specific target detection takes place.
  • the entire process unit 3 is subsequently rinsed with water via the inlet opening 25 and outlet opening 26 and can subsequently be filled with a new sample for the next measurement.
  • the extraction and detection was carried out manually in order to demonstrate that it is possible using the method according to the invention to convert a large sample volume into a small sample volume as an online process and thus enable detection of biological target substances.
  • the extraction was carried out as follows. A lysis buffer (Lysis Solution RL; AJ Innuscreen GmbH) and proteinase K were added to the derived particles.
  • a binding buffer (Binding Solution SBS; AJ Innuscreen GmbH) was added. This binding buffer in combination with the lysis buffer causes the DNA released from the bacteria and the free control fragment DNA to bind to the particles.
  • the batch was mixed briefly and incubated for 2 minutes. The magnetic particles were then separated using a magnet. The supernatant was removed and the magnetic particles were washed with 1 ml of a washing buffer (Washing Solution HS; AJ Innuscreen GmbH). After the magnetic particles had been separated again, the supernatant was completely removed and the magnetic particles were washed twice more with 80% ethanol.
  • the bound DNA was eluted by adding 100 ⁇ l of RNAse-free water and incubating at 60° C. for 5 minutes. After separating the magnetic particles, the supernatant was removed and used in a real-time PCR device for the subsequent detection of the salmonella DNA and the control fragment DNA. Real Time PCR results are shown in the table below.
  • results show that it is possible to bind both bacteria and free DNA to particles from a volume of 50 ml of water, remove the initial water sample and concentrate the particles to a volume of 200 ⁇ l.
  • the process took place in the process unit according to the invention.
  • the particles were then used to extract the nucleic acid and finally the bacteria and free DNA were detected using real-time PCR.
  • the analysis device and method according to the invention thus solves the task in an ideal way by linking available device systems and enrichment technologies and enables online liquid analysis of biological targets to be carried out, which is particularly advantageous for monitoring water or waste water in networks, sewage treatment plants or treatment plants as well as bodies of water appears.
  • the method according to the invention makes it possible for the first time to implement molecular genetic monitoring of biological targets in a practical and economical manner without manual intervention, starting with a large-volume sample up to detection.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatisierten Online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Flüssigkeit, insbesondere Wasser oder Abwasser, mittels eines Online-Analysegeräts, umfassend: - Transportieren eines vorgegebenen ersten Volumens der Flüssigkeit über eine Probenzuleitung in eine Reaktionskammer einer Prozesseinheit des Online-Analysegeräts; - Aufkonzentrieren von in dem ersten Volumen der Flüssigkeit enthaltenen Biomolekülen durch Bindung an eine Vielzahl von Partikeln in der Reaktionskammer; - Transportieren der Partikel mit den daran gebundenen Biomolekülen in eine Detektionseinheit des Online-Analysegeräts, wobei die Detektionseinheit eine erste Mikrofluidikeinheit und eine mit der ersten Mikrofluidikeinheit fluidisch verbindbare zweite Mikrofluidikeinheit aufweist; - Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den an die Partikel gebundenen Biomolekülen; - Transportieren eines die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Eluats in die zweite Mikrofluidikeinheit; - Amplifizierung einer Ziel-Nukleinsäure in der zweiten Mikrofluidikeinheit; - Erfassen eines Messsignals, das eine von dem Fortschritt der Amplifizierung und/oder von einer Anzahl von Kopien der Ziel-Nukleinsäure in der zweiten Mikrofluidikeinheit abhängige Messgröße repräsentiert, und - Qualitative und/oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz in der Probe anhand des erfassten Messsignals durch eine Steuerelektronik des Analysegeräts. Die Erfindung betrifft außerdem ein Online-Analysegerät zur automatisierten Durchführung des Verfahrens.

Description

Verfahren zur automatisierten Online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Flüssigkeit und Online-Analysegerät
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatisierten Online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Flüssigkeit und ein Online-Analysegerät, das zur automatisierten Durchführung des Verfahrens ausgestaltet ist.
Die Detektion biologischer Parameter spielt in der Prozessindustrie, beispielsweise bei der Überwachung und Reinigung von Industriewasser oder Klärwasser, in der Lebensmittelproduktion und im Pharma- und Lifescience-Bereich, beispielsweise bei der Überwachung von in Fermentoren durchgeführten biotechnologischen Prozessen, eine zunehmend wichtige Rolle. Zu detektierende bzw. zu überwachende Zielsubstanzen können beispielsweise Viren, Bakterien sowie Plasmid-assoziierte bakterielle Resistenzgene sein.
Der Nachweis solcher biologischer Zielsubstanzen in Flüssigkeiten erfolgt mit molekulargenetischen Methoden, vorzugsweise mittels Amplifizierungstechniken wie PCR oder Real Time PCR. Hierzu werden Proben der zu analysierenden Flüssigkeit genommen und in spezialisierten Laboren, die über die notwendigen Gerätesysteme verfügen, analysiert. Zur automatisierten Probennahme aus Prozessen, z.B. aus Klärbecken, Fermentern, Produktionsgefäßen oder Leitungen, sind manuell handhabbare oder automatische Probennahmevorrichtungen und Probensammler bekannt. Die gesammelten Proben werden in der Regel zur weiteren Analyse in ein Labor transportiert, wo die Extraktion der Proben-Nukleinsäuren und der spezifische und gegebenenfalls quantitative Nachweis der biologischen Zielsubstanz manuell oder zumindest in Teilen automatisiert durchgeführt wird.
Insbesondere im Bereich der Wasser- und Abwasseranalyse sind Online-Analysegeräte bekannt, die eine Probennahme und eine quantitative Bestimmung eines, meist anorganischen, Analyten in der Probe vollständig automatisiert durchführen. Eine solche Online-Analyse kann kontinuierlich oder auch diskontinuierlich durchgeführt werden.
Aus US 2015/0224502 A1 ist ein Probensammel-Gerät für die Durchfluss-Probennahme in Gewässern bekannt. Das Gerät weist mehrere Durchfluss-Probenkartuschen auf, die dazu eingerichtet sind, Wasser aus dem zu überwachenden Gewässer aufzunehmen und gegebenenfalls Proben von Bestandteilen der Flüssigkeit oder von Feststoffen in einem Filter- oder Adsorptionsmedium zurückzuhalten, während das aufgenommene Wasser wieder aus den Kartuschen in das Gewässer zurück geleitet wird. Die Proben können entweder für eine spätere Laboranalyse aufbewahrt werden oder direkt in dem Gerät analysiert werden. Hierzu können beispielsweise an dem Filter- oder Adsorptionsmedium adsorbierte biologische Substanzen als Lysat freigesetzt werden und einem Analysemodul zur weiteren Analyse, z.B. mittels qPCR, zur Verfügung gestellt werden.
Bei geringen Konzentrationen der Zielsubstanzen in der zu analysierenden Flüssigkeit stellt sich das Problem, bei der Probennahme einerseits eine für die anschließende Analyse ausreichende Menge der Zielsubstanz zur Verfügung zu stellen. Bei einer Durchfluss-Probennahme wie sie in US 2015/0224502 A1 beschrieben ist, können auch in geringen Konzentrationen im Wasser vorliegende gelöste Substanzen oder Feststoffe durch Durchleiten eines entsprechend großen Wasservolumens im Filtermedium zurückgehalten werden. Dies ist jedoch nur praktikabel, wenn die zu analysierende Flüssigkeit nach der Probe wieder ohne Einschränkungen zurück in das Medium geleitet werden kann, wie dies z.B. bei der Gewässeranalyse der Fall ist. Bei der Überwachung von Prozessen, z.B. in der Wasseraufbereitung, der Lebensmittelindustrie oder im Pharmabereich ist eine Wiedereinleitung der entnommenen Flüssigkeit oft nicht möglich. Hier besteht Bedarf nach einem Verfahren zur effizienten Aufkonzentration von zu detektierenden Probenbestandteilen, das es ermöglicht, das aus dem Prozess für die Analyse zu entnehmende Flüssigkeitsvolumen gering zu halten.
Ein weiterer Nachteil des in US 2015/0224502 A1 beschriebenen Geräts besteht darin, dass die in dem Filter- oder Adsorptionsmedium zurückgehaltene Substanz durch Lyse und Elution aus dem Filter- oder Adsorptionsmedium in das Analysemodul geleitet wird. Hierbei ist zum einen zu erwarten, dass nur ein verhältnismäßig geringer Anteil der Zielsubstanz aus dem Filter- oder Adsorptionsmedium in das Analysemodul gelangt, zum anderen ist zum Ausspülen des Filters ein gewisses Mindestvolumen an Flüssigkeit erforderlich, so dass die in das Analysemodul gelangende Lösung ein verhältnismäßig großes Volumen bei einer entsprechend geringen Konzentration der Zielsubstanz aufweist.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur automatisierten Online-Detektion einer biologischen Zielsubstanz in einer Flüssigkeit und ein zur Durchführung des Verfahrens geeignetes Online-Analysegerät zur Verfügung zu stellen. Insbesondere sollen das Verfahren und die Vorrichtung eine effiziente Aufkonzentration der Zielsubstanz bei der Probennahme und eine verlustarme Weiterleitung der aufkonzentrierten Zielsubstanz in eine nachfolgende Analyseeinheit ermöglichen.
Die Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 und die Vorrichtung gemäß Anspruch 10. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen und in der folgenden Beschreibung angegeben.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur automatisierten Online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Flüssigkeit, insbesondere Wasser oder Abwasser, mittels eines Online- Analysegeräts, umfasst die folgenden Schritte:
- T ransportieren eines vorgegebenen ersten Volumens der Flüssigkeit über eine Probenzuleitung in eine Reaktionskammer einer Prozesseinheit des Online-Analysegeräts;
- Aufkonzentrieren von in dem ersten Volumen der Flüssigkeit enthaltenen Biomolekülen durch Bindung an eine Vielzahl von Partikeln in der Reaktionskammer;
- Transportieren der Partikel mit den daran gebundenen Biomolekülen in eine Detektionseinheit des Online-Analysegeräts, wobei die Detektionseinheit eine erste Mikrofluidikeinheit und eine mit der ersten Mikrofluidikeinheit fluidisch verbindbare zweite Mikrofluidikeinheit aufweist; - Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den an die Partikel gebundenen Biomolekülen; - Transportieren eines die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Eluats in die zweite Mikrofluidikeinheit;
- Amplifizierung einer Ziel-Nukleinsäure in der zweiten Mikrofluidikeinheit;
- Erfassen eines Messsignals, das eine von dem Fortschritt der Amplifizierung und/oder von einer Anzahl von Kopien der Ziel-Nukleinsäure in der zweiten Mikrofluidikeinheit abhängige Messgröße repräsentiert, und
- Qualitative und/oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz in der Probe anhand des erfassten Messsignals durch eine Steuerelektronik des Analysegeräts.
Unter Biomolekülen werden hier und im Folgenden Bakterien, Bakteriophagen, Viren, subzelluläre Partikel und freie Nukleinsäuren oder Nukleinsäurefragmente verstanden. Die in der zweiten Mikrofluidikeinheit zu amplifizierende Ziel-Nukleinsäure kann entweder die zu detektierende Zielsubstanz oder eine Nukleinsäure der zu detektierenden Zielsubstanz sein.
Die erste und die zweite Mikrofluidikeinheit können in zwei voneinander getrennten oder in einer gemeinsamen Kartusche untergebracht sein.
Indem die Biomoleküle an Partikel gebunden und mit diesen in eine erste Mikrofluidikeinheit transportiert werden, um in der ersten Mikrofluidikeinheit Nukleinsäuren für die weitere Analyse freizusetzen und/oderzu isolieren, kann ein, gegenüber dem im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, bei dem Biomoleküle nach Bindung an ein Filtermedium durch Ausspülen des Filtermediums freigesetzt werden, vergleichsweise hoher Anteil der aus dem ersten Volumen der Flüssigkeit gewonnenen Biomoleküle in einem geringen Eluatvolumen aufkonzentriert werden. Somit bewirkt das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur eine effiziente Aufkonzentrierung der zu bestimmenden Zielsubstanz, sondern ermöglicht es, auch bei einer niedrigen Konzentration der Zielsubstanz in der zu untersuchenden Flüssigkeit das aus dem Prozess zu entnehmende erste Volumen der Flüssigkeit vergleichsweise gering zu wählen. Damit ist das Verfahren universell zur Überwachung von Flüssigkeiten in einer Vielzahl verschiedenartiger industrieller Prozesse geeignet, unabhängig davon, ob das in die Prozesseinheit transportierte erste Volumen nach dem Anreichern verworfen und ggfs entsorgt werden muss, oder ob es zurück in den Prozess gegeben werden kann.
Die Probenzuleitung kann in einer möglichen Ausgestaltung des Verfahrens fluidisch mit einer Probenvorlage verbunden werden. Die Probenvorlage kann einen Vorrat der zu untersuchenden Flüssigkeit enthalten. Sie kann mit einer Probenentnahmevorrichtung verbunden sein, die dazu eingerichtet ist, anlassbezogen oder mit einer vorgegebenen Probennahmefrequenz Flüssigkeit aus einem Gewässer, einer flüssigkeitsführenden Leitung eines Versorgungsnetzwerks, oder einem Prozessbehälter, z.B. einem Fermenter, zu entnehmen und in die Probenvorlage zu transportieren. Alternativ kann die Probenentnahmevorrichtung auch unmittelbar mit der Probenzuleitung des Online- Analysegeräts verbunden sein. Der Transport von Flüssigkeit in die Prozesseinheit des Online- Analysegeräts kann von der Steuerelektronik des Analysegeräts automatisiert gesteuert werden.
Nach dem Aufkonzentrieren von in dem ersten Volumen der Flüssigkeit enthaltenen Biomolekülen kann das erste Volumen der Flüssigkeit aus der Reaktionskammer abgeleitet und ein zweites Volumen der Flüssigkeit in die Reaktionskammer eingeleitet werden. In dem zweiten Volumen der Flüssigkeit enthaltene Biomoleküle können in der Reaktionskammer durch Anbindung an die in der Reaktionskammer verbliebenen Partikel aufkonzentriert werden. Diese Schritte können mehrfach wiederholt werden, um auf diese Weise kumulativ die Menge der an die Partikel gebundenen Biomoleküle zu erhöhen. Auf diese Weise kann die Sensitivität des Verfahrens erhöht werden.
Die Partikel können magnetische oder paramagnetische Partikel sein, an die die Biomoleküle, insbesondere unselektiv, binden.
Das Aufkonzentrieren von in der Flüssigkeit enthaltenen Biomolekülen kann das Einleiten einer oder mehrerer Reaktionskomponenten in die Reaktionskammer der Prozesseinheit umfassen. Die Reaktionskomponenten können beispielsweise eine Alginatlösung und ein Salz eines di- bzw. polyvalenten Kations oder einer Säure in die Reaktionskammer umfassen, so dass sich an den Partikeln ein Alginatgel-Biomolekül-Komplex bildet. Die Partikel können gleichzeitig mit den Reaktionskomponenten in die Reaktionskammer gegeben werden oder auch in dieser vor oder nach dem Transport des ersten Volumens der Flüssigkeit in die Reaktionskammer vorgelegt werden.
Das Transportieren der Partikel mit den daran gebundenen Biomolekülen in die Detektionseinheit umfasst in einer möglichen Verfahrensausgestaltung mindestens folgende Schritte:
- Transportieren der Partikel mittels eines, insbesondere relativ zu der Reaktionskammer beweglichen, Magneten, mittels einer Nadel, mittels einer Magnetnadel und/oder mittels einer Pipettiervorrichtung in einen Bereich der Reaktionskammer, in dem eine Fluidleitung in die Reaktionskammer mündet, die die Reaktionskammer fluidisch mit der ersten Mikrofluidikeinheit verbindet, und - Spülen der Partikel durch die Fluidleitung in die erste Mikrofluidikeinheit.
Für den T ransport der Partikel kann es vorgesehen sein, eine der beschriebenen Möglichkeiten des Partikeltransfers (Magnet, Nadel, etc.) zu verwenden, oder aber verschiedene Möglichkeiten zu kombinieren. So kann es in einem ersten Beispiel vorgesehen sein, dass die Partikel zuerst mittels des Magneten bewegt werden (beispielsweise in Richtung einer Öffnung, über welche die Partikel entnommen werden können) und anschließend mittels der Nadel, der magnetischen Nadel oder der Pipettiervorrichtung in den genannten Bereich der Reaktionskammer transferiert werden. In einem zweiten Beispiel kann die umgekehrte Reihenfolge vorgesehen sein, so dass die Partikel zuerst mittels der Nadel, der magnetischen Nadel oder der Pipettiervorrichtung transferiert werden und anschließend mittels des Magneten bewegt werden. Bei dem Magneten kann es sich um einen Permanentmagneten oder einen Elektromagneten handeln. Der Magnetanteil der magnetischen Nadel kann ebenfalls als Permanentmagnet oder als Elektromagnet ausgestaltet sein.
Das Spülen der Partikel in die erste Mikrofluidikeinheit kann durch Einleiten eines geringen Teilvolumens der in der Reaktionskammer enthaltenen Flüssigkeit erfolgen. Der Transport der Flüssigkeit und der Partikel kann durch die Wirkung der Schwerkraft bzw. eines hydrostatischen Drucks der Flüssigkeit in der Reaktionskammer bewirkt werden, indem der Bereich, in dem die Fluidleitung in die Reaktionskammer mündet, etwas vertieft gegenüber dem Boden der Reaktionskammer angeordnet ist. Nachdem die Partikel in die Detektionseinheit überführt sind, kann die in der Reaktionskammer verbliebene Flüssigkeit über einen Ablauf aus der Reaktionskammer abgeleitet werden. Alternativ kann zunächst der Großteil der Flüssigkeit aus der Reaktionskammer abgeleitet werden, während die Partikel noch mittels des Magneten in der Reaktionskammer zurückgehalten werden. Mit einem verbliebenen Rest der Flüssigkeit können die Partikel danach in die Detektionseinheit bzw. in die erste Mikrofluidikeinheit gespült werden.
Das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den an die Partikel gebundenen Biomolekülen in der ersten Mikrofluidikeinheit kann mindestens folgende Schritte umfassen:
- Versetzen der Partikel mit den daran gebundenen Biomolekülen mit einem oder mehreren Lysereagenzien, um Nukleinsäuren der adsorbierten Biomoleküle freizusetzen;
- Binden der freigesetzten Nukleinsäuren an die Partikel; und
- Waschen der Partikel mit den gebundenen Nukleinsäuren mit einer Waschlösung.
In dieser Verfahrensausgestaltung dienen dieselben Partikel vorteilhaft somit nicht nur zur Extraktion und Anreichung der Biomoleküle aus der zu überwachenden Flüssigkeit, sondern auch zur Bindung und Aufreinigung der freigesetzten Nukleinsäuren.
Weiter kann das Verfahren das Ablösen der Nukleinsäuren von den Partikeln durch Eluieren und das Transportieren eines die Nukleinsäuren umfassenden Eluats in die zweite Mikrofluidikeinheit zur nachfolgenden Amplifizierung umfassen.
In einer alternativen Ausgestaltung kann das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den an die Partikel gebundenen Biomolekülen in der ersten Mikrofluidikeinheit folgende Schritte umfassen:
- thermisches Freisetzen der an die Partikel gebundenen Biomoleküle (z.B. freie DNA) bzw. der in diesen Biomolekülen (z.B. Bakterien) enthaltenen Nukleinsäure in einer Pufferlösung, beispielsweise in einer phosphatgepufferten Salzlösung, in Wasser oder einem T ris-Puffer, die optional ein Komplexierungsreagenz zur Komplexierung von an den Partikeln mit den Biomolekülen gebundenen di- bzw. polyvalenter Kationen umfasst, und
- Transportieren der Pufferlösung mit den darin gelösten Biomolekülen bzw. Nukleinsäuren in die zweite Mikrofluidikeinheit zur nachfolgenden Amplifikation. Die thermische Freisetzung kann eine Dispergierung der Partikel in der gepufferten, ggfs den Komplexbildner enthaltenden, Lösung und eine Inkubation umfassen. Dabei wird die an den Partikel- Oberflächen vorliegende Alginat-Gelstruktur aufgelöst und die darin gebundenen Biomoleküle aufgelöst. Diese Verfahrensvariante eignet sich beispielsweise für Anwendungen, in denen die zu bestimmende Zielsubstanz eine Nukleinsäure ist, die bereits frei in der zu analysierenden Flüssigkeit vorliegt. Bei dieser alternativen Verfahrensausgestaltung kann also eine klassische Lyse unterbleiben. Die an die Partikel in einem Alginat-Komplex gebundenen Nukleinsäuren können hingegen lediglich durch Zugabe der Pufferlösung zu den Partikeln ggfs unter weiterem Zusatz des Komplexierungsreagenz, z.B. eines Chelatbildners wie EDTA, in Lösung gebracht werden. Es ist auch möglich, das Verfahren anzuwenden, wenn die Zielsubstanz als Biomolekül ein Bakterium oder ein Virus ist. In diesem Fall können die an die Partikel gebundenen Biomoleküle thermisch zerstört und die enthaltene Nukleinsäure freigesetzt werden.
Die in der zweiten Mikrofluidikeinheit durchgeführte Amplifikation kann beispielsweise mittels herkömmlicher PCR-basierter Verfahren durchgeführt werden. Die qualitative oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz kann, in ebenfalls herkömmlicher weise, durchgeführt werden, indem mittels eines Sensors zu einem bestimmten Zeitpunkt oder zu mehreren Zeitpunkten jeweils mindestens ein Messwert einer Messgröße erfasst wird, die mit der zum jeweiligen Zeitpunkt vorliegenden Anzahl der durch die Amplifikation erzeugten Kopien einer Zielnukleinsäure korreliert. Aus dem erhaltenen Messwert oder Messwertverlauf als Funktion der zeit lässt sich, das Vorliegen der Zielnukleinsäure und damit der biologischen Zielsubstanz in der zu überwachenden Flüssigkeit qualitativ detektieren oderein quantitativer Wert, z.B. eine Konzentration, der biologischen Zielsubstanz in der Flüssigkeit ermitteln und von der Steuerelektronik als Messergebnis ausgeben.
Die Steuerelektronik des Online-Analysegeräts führt vorteilhafterweise alle hier beschriebenen Verfahrensschritte automatisiert durch. Hierzu kann sie beispielsweise einen Flüssigkeitstransport durch Betätigung steuerbarer Ventile und/oder Pumpen oder eine Relativbewegung des Magneten bezüglich der Reaktionskammer durch einen den Magneten und/oder die Reaktionskammer bewegenden Antrieb bewirken.
Die Erfindung umfasst auch ein Online-Analysegerät zur Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Flüssigkeit, insbesondere nach dem voranstehend beschriebenen Verfahren. Das Online-Analysegerät umfasst mindestens die folgenden Komponenten: eine Steuerelektronik, eine Prozesseinheit und eine Detektionseinheit, wobei die Prozesseinheit mindestens eine Reaktionskammer und eine in die Reaktionskammer mündende Probenzuleitung aufweist, und wobei die Prozesseinheit dazu eingerichtet ist, ein vorgegebenes Volumen der Flüssigkeit in der Reaktionskammer aufzunehmen, und in der Flüssigkeit enthaltene Biomoleküle durch Bindung an Partikel aufzukonzentrieren; und wobei die Detektionseinheit aufweist: eine mit der Reaktionskammer fluidisch verbindbare erste Mikrofluidikeinheit, die dazu eingerichtet ist, aus den an die Partikel gebundenen Biomolekülen Nukleinsäuren freizusetzen und/oderzu isolieren; eine mit der ersten Mikrofluidikeinheit verbundene zweite Mikrofluidikeinheit, die dazu eingerichtet ist, ein die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassendes Eluat aufzunehmen und eine Ziel-Nukleinsäure zu amplifizieren; und einen, insbesondere optischen, Sensor, der dazu eingerichtet ist, ein von dem Fortschritt einer in der zweiten Mikrofluidikeinheit durchgeführten Amplifizierung und/oder von einer Anzahl von Kopien der Ziel-Nukleinsäure in der zweiten Mikrofluidikeinheit abhängiges Messsignal zu erzeugen und an die Steuerelektronik auszugeben; und wobei die Steuerelektronik dazu eingerichtet ist, anhand des von dem Sensor ausgegebenen Messsignals die biologische Zielsubstanz in der Flüssigkeit qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen.
Das Analysegerät kann weiter eine Probenpumpe aufweisen, wobei die Steuerelektronik dazu eingerichtet ist, die Probenpumpe zum Transport eines vorgegebenen Volumens der Probe in die Reaktionskammer zu steuern. Die Probenzuleitung kann, wie bereits erwähnt, fluidisch mit einer Probenvorlage oder unmittelbar mit einem Gewässer oder einer Leitung in einer Prozessanlage, einem Fermenter oder einem sonstigen Prozessbehälter verbindbar sein.
Das Analysegerät kann mindestens ein Reaktionskomponenten-Reservoir umfassen, das mindestens eine Reaktionskomponente für die Aufkonzentrierung der Biomoleküle in der Reaktionskammer enthält. Das Analysegerät kann beispielsweise ein eine Alginatlösung, eine Lösung, die ein Salz eines di- bzw. polyvalenten Kations enthält, oder alternativ eine schwache Säure als Reaktionskomponente in einem oder in mehreren getrennten Reservoiren Vorhalten. Das Reaktionskomponenten-Reservoir kann ein Behälter sein, der über eine, beispielsweise mit einem Ventil wahlweise sperrbare oder freigebbare, Reaktionskomponenten-Zuleitung fluidisch mit der Reaktionskammer verbindbar ist. Die Partikel können in der Reaktionskammer vorgelegt werden oder ebenfalls als Reaktionskomponenten zu der in die Reaktionskammer zur Anreicherung der Biomoleküle transportierten Flüssigkeit aus einem Reaktionskomponenten-Reservoir zugegeben werden. Die Partikel können magnetische und/oder paramagnetische Partikel sein. Die Steuerelektronik des Analysegeräts kann vorteilhaft dazu eingerichtet sein, eine vorgebbare Menge der mindestens einen Reaktionskomponente bzw. aller Reaktionskomponenten in die Reaktionskammer zu dosieren. Hierzu können eine oder mehrere Pumpen für den Transport der mindestens einen Reaktionskomponente vorgesehen sein, die die Steuerelektronik steuert. Zusätzlich oder alternativ kann die Steuerelektronik das bereits erwähnte Ventil steuern.
Das Analysegerät kann Mittel zum Bewegen, insbesondere Rühren, der in der Reaktionskammer enthaltenen Flüssigkeit aufweisen. Die Mittel können z.B. einen Rührer, eine Zuleitung für ein Inertgas in die Reaktionskammer und eine Ableitung für das Inertgas umfassen, die so angeordnet sind, dass das Inertgas durch die in der Reaktionskammer enthaltene Flüssigkeit hindurchströmt, oder einen Antrieb zum Bewegen der Reaktionskammer aufweisen.
Das Analysegerät kann weiter einen Magneten umfassen, der mittels der Steuerelektronik relativ zur Reaktionskammer so orientierbar ist, dass in der Reaktionskammer enthaltene magnetische oder paramagnetische Partikel durch Magnetkraft in einen Bereich der Reaktionskammer transportiert werden, in dem eine Fluidleitung in die Reaktionskammer mündet, die die Reaktionskammer fluidisch mit der ersten Mikrofluidikeinheit verbindet. In einer möglichen alternativen Ausgestaltung kann das Analysegerät einen schaltbaren Elektromagneten aufweisen, der bezüglich der Reaktionskammer so angeordnet ist, dass in der Reaktionskammer enthaltene magnetische oder paramagnetische Partikel durch Magnetkraft in einen Bereich der Reaktionskammer transportiert werden, in dem eine Fluidleitung in die Reaktionskammer mündet, die die Reaktionskammer fluidisch mit der ersten Mikrofluidikeinheit verbindet. Die Steuerelektronik kann dazu ausgestaltet sein, den Elektromagneten zu schalten.
Die erste und die zweite Mikrofluidikeinheit können zusammen in einer, insbesondere austauschbaren, Kartusche angeordnet sein. Alternativ kann die erste Mikrofluidikeinheit in einer ersten Kartusche angeordnet und die zweite Mikrofluidikeinheit in einer zweiten, von der ersten Kartusche verschiedenen Kartusche angeordnet sein, wobei die erste und die zweite Kartusche fluidisch miteinander verbindbar sind, um Flüssigkeit aus der ersten Kartusche in die zweite zu transportieren. Die erste und die zweite Kartusche können austauschbar ausgestaltet sein.
Die erste Mikrofluidikeinheit kann dazu eingerichtet sein, die Partikel mit daran gebundenen Biomolekülen aufzunehmen und mit einem oder mehreren Lysereagenzien zu versetzen, um Nukleinsäure der adsorbierten Biomoleküle freizusetzen, anschließend die freigesetzten Nukleinsäuren an die Partikel zu binden und die Partikel mit den daran gebundenen Nukleinsäuren ein- oder mehrmals mit einer Waschlösung zu waschen. Die Steuerelektronik kann dazu eingerichtet sein, einen Transport der Partikel und optional der Reagenzien durch die erste Mikrofluidikeinheit zu steuern.
Die erste Mikrofluidikeinheit kann weiter dazu eingerichtet sein, die Nukleinsäuren von den Partikeln durch Eluieren zu abzulösen und das Eluat über eine die erste Mikrofluidikeinheit mit der zweiten Mikrofluidikeinheit verbindende Fluidleitung in die zweite Mikrofluidikeinheit zu transportieren. Die Steuerelektronik kann dazu eingerichtet sein, das Eluieren und den Transport des Eluats zu steuern.
In einer alternativen Ausgestaltung kann die erste Mikrofluidikeinheit dazu eingerichtet sein, die Partikel mit daran gebundenen Biomolekülen aufzunehmen und die an die Partikel gebundenen Biomoleküle oder die in diesen Biomolekülen enthaltenen Nukleinsäuren in einer Pufferlösung, beispielsweise in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS-Puffer), Wasser oder einem Tris-Puffer, die optional ein Komplexierungsreagenz, z.B. einen Chelatbildner wie EDTA, enthält, thermisch freizusetzen, wobei die Steuerelektronik dazu eingerichtet ist, die thermische Freisetzung der Biomoleküle zu steuern und die Pufferlösung mit den darin gelösten Biomolekülen bzw. Nukleinsäuren in die zweite Mikrofluidikeinheit zur nachfolgenden Amplifikation zu transportieren. Diese Ausgestaltung ist beispielsweise zur Verwendung in einer Anwendung geeignet, bei der die zu detektierende biologische Zielsubstanz eine in der Flüssigkeit frei vorliegende Nukleinsäure ist.
Die erste Mikrofluidikeinheit kann zur Freisetzung und/oder Isolierung der Nukleinsäure benötigten Reaktionskomponenten in fester Form, beispielsweise in Form von durch Lyophilisierung gewonnenen Pellets, oder in durch Mikroventile verschlossenen Reagenzienkammern oder in durch Folien verschlossenen Reagenzienpacks enthalten, die durch Kraft- oder Wärmeeinwirkung automatisiert, insbesondere mittels der Steuerelektronik, geöffnet werden können.
In der zweiten Mikrofluidikeinheit können Reagenzien für die Amplifikation in entsprechender weise vorgehalten sein. Sie kann weiter ein oder mehrere Detektionskammern enthalten, in denen die Amplifikation einer Ziel-Nukleinsäure oder auch parallel mehrerer verschiedener Ziel-Nukleinsäuren durchgeführt werden können. Die zweite Mikrofluidikeinheit kann eine Temperiereinreichtung für die Detektionskammern umfassen. Die Temperiereinrichtung kann zum Beispiel durch die Steuerelektronik steuerbare thermoelektrische Elemente aufweisen.
Die Steuerelektronik kann eine elektronische Datenverarbeitungseinrichtung mit mindestens einem Prozessor und einem Speicher aufweisen, in dem ein oder mehrere Betriebsprogramme hinterlegt sind, die mittels des Prozessors ausführbar sind, um das Analysegerät automatisch zu steuern und um aus den Messsignalen des Sensors qualitative oder quantitative Analyseergebnisse zu ermitteln. Die Betriebsprogramme können so ausgestaltet sein, dass die Steuerelektronik das Analysegerät zur Durchführung des weiter oben beschriebenen Verfahrens steuert. Die Steuerelektronik kann außerdem ein Benutzerinterface aufweisen, z.B. einen Touch-Screen oder ein anderes Anzeige-Display in Kombination mit einer Eingabetastatur. Die Steuerelektronik kann dazu eingerichtet sein, drahtlos per Funk oder über eine Datenleitung mit einer anderen Datenverarbeitungseinrichtung, z.B. einem Computer, einer Prozesssteuerung, einem, insbesondere tragbaren, Anzeige- oder Bediengerät zur Kommunikation verbunden zu werden.
Das Analysegerät kann somit Online-Bestimmungen biologischer Zielsubstanzen in einer Flüssigkeit durchführen, ohne dass es einer manuellen Probennahme- oder Vorbereitung oder den Transport von Proben in ein Labor erfordert. Das Analysegerät kann insbesondere vollständig automatisch Probennahme- und Detektions-Zyklen ausführen, die z.B. von der Steuerelektronik ereignisgesteuert oder in vorgegebenen Zeitabständen ausgeführt werden können.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispiele beschrieben. Dabei bezeichnen gleiche Bezugszeichen gleiche Komponenten der in den Figuren gezeigten Bauteile. Es zeigen: Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Online-Analysegeräts zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung einer biologischen Zielsubstanz in einer Flüssigkeit; und
Fig. 2 ein Ausführungsbeispiel einer Prozesseinheit des in Fig. 1 dargestellten Online-
Analysegeräts.
In Fig. 1 ist schematisch ein Ausführungsbeispiel für ein Online-Analysegerät 1 zur Detektion einer biologischen Zielsubstanz in einer Flüssigkeit gemäß der Erfindung dargestellt. Das Analysegerät 1 weist im vorliegenden Beispiel ein Gehäuse 2 auf, in dem alle Komponenten des Geräts untergebracht sind. Diese Komponenten umfassen im Einzelnen eine Prozesseinheit 3, eine Detektionseinheit 4 und eine Steuerelektronik 5. Die Prozesseinheit 3 bildet das Kernstück der Erfindung, da sie dazu eingerichtet ist, biologische Zielmoleküle in einem Volumen einer zu analysierenden Flüssigkeit anzureichern und zur Detektion und ggfs vorbereitenden Schritten wie Extraktion und/oder Isolierung von Nukleinsäuren an die Detektionseinheit 4 weiterzugeben.
Die Prozesseinheit 3 ist fluidisch über eine Probenzuleitung 6 mit einer Probenvorlage 7 oder mit einem Prozessbehälter, z.B. einer Rohrleitung oder einem Reaktor oder einem Fermenter, verbunden, in der bzw. dem die zu analysierende Flüssigkeit enthalten ist. Zum Transport und zur Dosierung der Flüssigkeit aus der Probenvorlage 7 in eine in der Prozesseinheit 3 enthaltenen Reaktionskammer 8 dient eine Pumpe 9, die von der Steuerelektronik 5 gemäß einem in der Steuerelektronik 5 hinterlegten und von dieser ausgeführten Betriebsprogramm steuerbar ist. Die Reaktionskammer 8 ist auch fluidisch mit Reaktionskomponenten-Reservoiren 10, 11 verbindbar. In den Reaktionskomponenten-Reservoiren 10, 11 sind Reagenzien enthalten, die der Anreicherung von in der Flüssigkeit enthaltenen Biomolekülen dienen. Jedes Reaktionskomponenten-Reservoir 10, 11 ist im vorliegenden Beispiel über eine Fluidleitung fluidisch mit der Reaktionskammer in der Prozesseinheit 3 verbunden. Zum Transport der Reaktionskomponenten durch die Fluidleitungen dient jeweils eine Pumpe 12, 13. Es ist auch möglich, dass die Reaktionskomponenten direkt in die Prozesseinheit 3 integriert sind. Der Transport der Reaktionskomponenten kann selbstverständlich mit anderen dem Fachmann bekannten Mitteln bewerkstelligt werden, z.B. pneumatisch oder durch Ausnutzung eines hydrostatischen Drucks.
Die Prozesseinheit 3 kann optional eine Temperiereinheit aufweisen (nicht in Fig. 1 dargestellt), die der Einstellung einer bestimmten Temperatur in der Reaktionskammer 8 dient. Die Temperiereinheit kann eine Widerstandsheizung, eine Kühlung und/oder thermoelektrische Elemente zum wahlweisen Heizen oder Kühlen umfassen. Sie kann mit der Steuerelektronik 5 verbunden sein, wobei die Steuerelektronik 5 dazu eingerichtet ist, die Temperatur in der Reaktionskammer 8 zu steuern oder zu regeln.
Die Prozesseinheit 3 kann außerdem eine Vorrichtung 14 zum Bewegen oder Rühren einer in der Reaktionskammer 8 enthaltenen Flüssigkeit bzw. Flüssigkeitsmischung aufweisen. Die Vorrichtung 14 umfasst im vorliegenden Beispiel einen Antrieb zum Bewegen, z.B. Rütteln, der Reaktionskammer 8. Die Vorrichtung 14, insbesondere der Antrieb, kann von der Steuerelektronik 5 gesteuert werden. Die Reaktionskammer 8 ist fluidisch über die Fluidleitung 15 wahlweise mittels eines von der Steuereinheit 5 betätigbaren Ventils 16 mit der Detektionseinheit 4 und mit einem Flüssigkeitsauslass 17 verbindbar.
Die Detektionseinheit 4 weist im vorliegenden Beispiel eine Analysekartusche auf, in der zwei miteinander über die Fluidleitung 18 fluidisch verbundene Mikrofluidikeinheiten, nämlich eine erste Mikrofluidikeinheit 19 und eine zweite Mikrofluidikeinheit 20, integriert sind. In einer anderen Ausgestaltung können die Mikrofluidikeinheiten auch in getrennten Kartuschen untergebracht sein. Die Analysekartusche ist im vorliegenden Beispiel auswechselbar.
Die erste Mikrofluidikeinheit 19 ist dazu eingerichtet, eine die aufkonzentrierten Biomoleküle aus der Reaktionskammer enthaltende Probe aufzunehmen und für eine nachfolgende Amplifikation und Detektion in der zweiten Mikrofluidikeinheit 20 vorzubereiten. Dies kann mittels an sich bekannter Extraktions- und Isolationsverfahren erfolgen. Hierzu umfasst die erste Mikrofluidikeinheit 19 Reagenzien und optional eine Temperiereinheit zur Inkubation von in der Mikrofluidikeinheit 19 hergestellten Reaktionsmischungen. Zur Steuerung eines Transports der Probe durch die erste Mikrofluidikeinheit und zur Durchführung der Extraktion und/oder Isolation von Nukleinsäuren umfasst die Detektionseinheit geeignete, dem Fachmann bekannte Mittel, die von der Steuerelektronik 5 steuerbar sind. Die zweite Mikrofluidikeinheit 20 umfasst Mittel zur Amplifikation, d.h. Reagenzien und Temperierelemente, z.B. thermoelektrische Elemente, sowie Mittel zum Transport und zur Aliquotierung von Fluiden innerhalb der zweiten Mikrofluidikeinheit 20. Zur Detektion eines Fortschritts der Amplifikation in an sich bekannter Weise, z.B. mittels eines Real Time PCR-basierten Verfahrens weist die Detektionseinheit einen Sensor 21 auf, der beispielsweise Fluoreszenz-Messungen in der zweiten Mikrofluidikeinheit 20 durchführen kann und Messsignale an die Steuerelektronik 5 ausgeben kann. Die Steuerelektronik 5 ist dazu eingerichtet, anhand der Messignale ein qualitatives oder quantitatives Analyseergebnis zu ermitteln.
Die Steuerelektronik 5 kann eine zentrale Recheneinheit, z.B. eine CPU mit Prozessor und Speicher und darin gespeicherten Betriebsprogrammen sein. Sie kann auch auf mehrere Recheneinheiten innerhalb des Analysegeräts aufgeteilt sein, z.B. können die Prozesseinheit 3 und die Detektionseinheit 4 jeweils eine eigene Vorort-Elektronik aufweisen, die mit einer übergeordneten Elektronik zur Kommunikation verbunden sind, wobei die übergeordnete Elektronik und die Vorort-Elektroniken zusammen die Steuerelektronik 5 bilden.
In Fig. 2 ist die Prozesseinheit 4 des Online-Analysegeräts 1 im Detail dargestellt. Der in Fig. 2 dargestellte Aufbau der Prozesseinheit 4 ist lediglich ein mögliches Ausführungsbeispiel. Der Fachmann kann eine Vielzahl von Varianten auffinden, ohne vom Erfindungsgedanken abzuweichen.
Die Prozesseinheit 4 weist eine Reaktionskammer 8 mit verschiedenen Einlässen und Auslässen auf. Die Zuleitungen 22, 23, 24 sind mit Vorratsbehältern für Reagenzien verbunden, die als Reaktionskomponenten-Reservoire 10, 11 dienen. Die Öffnung 25 ist mit der Probenzuleitung 6 verbunden. Über sie erfolgt die Eingabe eines bestimmten Volumens der zu analysierenden Flüssigkeit in die Reaktionskammer 8. Eine weitere Öffnung 26 ist mit der Fluidleitung 15 verbunden, die die Reaktionskammer 8 mit einem Probenauslass sowie der Detektionseinheit 4 verbindet. Optional sind in den Zuleitungen Ventile angeordnet, die von der Steuerelektronik betätigbar sind.
Darüber hinaus umfasst die Prozesseinheit 3 im vorliegenden Ausführungsbeispiel einen am Gehäuse der Reaktionskammer 8 beweglich angeordneten Magneten 27.
Die in der Prozesseinheit 3 ablaufenden erfindungsgemäßen Verfahrensschritte stellen sich wie folgt dar. In einem ersten Schritt steuert die Steuerelektronik 5 die Pumpe 9 zum Transport eines ersten Volumens der Flüssigkeit aus der Probenvorlage 7 über die Probenzuleitung 6 und die Öffnung 25 in die Reaktionskammer 8. Die Flüssigkeit kann beispielsweise Wasser aus einem Gewässer, einem Wassernetz oder aus einem Wasseraufbereitungsprozess sein. In der Reaktionskammer 8 werden, gesteuert von der Steuereinheit 5, über die Zuleitungen 22, 23 und 24 Reaktionskomponenten zu der Flüssigkeit in der Reaktionskammer 8 gegeben. Dies kann vor, während oder nach dem Einleiten der Flüssigkeit über die Probenzuleitung 6 in die Reaktionskammer 8 erfolgen. Als Reaktionskomponenten werden im hier beschriebenen Beispiel magnetische oder paramagnetische Partikel, eine Alginatlösung und eine Calciumchlorid-Lösung zugegeben.
Die Zugabe dieser Reaktionskomponenten ermöglicht es, in der Flüssigkeit vorliegende Biomoleküle anzureichern und für eine Nukleinsäureextraktion vorzubereiten. Das Verfahren ist grundsätzlich in DE 10 015215 894 A1 beschrieben. Unter Vorhandensein von Partikeln, Calciumchlorid und Alginat ist es demnach möglich Biomoleküle, z.B. Viren, Bakterien oder auch freie Nukleinsäuren in Form eines Alginatkomplexes an die Partikel zu binden. Damit wird es möglich, eine großvolumige Wasserprobe auf ein sehr viel kleineres Probenvolumen zu reduzieren, derart, dass die Biomoleküle aus dem ersten Volumen der Flüssigkeit sich nachfolgend an den Partikeln anreichern.
Ein weiterer Vorteil ergibt sich daraus, dass es mit dem erfindungsgemäßen Ansatz möglich ist, völlig unselektiv sowohl Bakterien, Viren, als auch freie Nukleinsäuren an ein und dieselbe Art von Partikeln zu binden. Somit werden keinerlei modifizierten Partikel, d.h. beispielsweise Partikel, die mit einem Antikörper oder anderen Liganden gekoppelt sind, für die Anreicherung der Zielsubstanz benötigt. Entsprechend ist es auch in sehr einfacher Weise möglich, mit dem Verfahren mehrere verschiedene biologische Zielsubstanzen zunächst mittels der Partikel anzureichern, zu extrahieren und nachfolgend mittels eines PCR-basierten Verfahrens zu bestimmen. Bei Verfahren, die mit Antikörpern oder anderen Liganden modifizierte Partikel für die Anreicherung der Zielsubstanz einsetzen, wird für die parallele Bestimmung mehrerer Zielsubstanzen in einer Probe eine Vielzahl unterschiedlicher Partikel benötigt. Ein solches Verfahren ist deutlich aufwändiger und so kostspielig, dass sein Einsatz für eine kontinuierliche Überwachung biologischer Parameter in Anwendungen der Prozessindustrie nicht rentabel wäre.
In einer Verfahrensvariante ist es möglich auf die Zugabe von Calciumchlorid und Alginat zu verzichten. Diese Variante ist vorteilhaft einsetzbar, wenn die zu detektierende Zielsubstanz ein Bakterium ist. Bakterien adsorbieren unspezifisch an kleine Partikel. Zwar ist diese Adsorption nicht so effizient wie die Anbindung in Gegenwart von Alginat und Calciumionen, jedoch können auf diese Weise speziell die in der Flüssigkeit enthaltenen Bakterien an den Partikeln angereichert werden, während die freien Nukleinsäuren und Viren in der Flüssigkeit verbleiben und somit auch nicht in die nachfolgenden Extraktions- und Analyseschritte gelangen.
Zum Binden der Biomoleküle an die Partikel können diese in der Flüssigkeit dispergiert werden, z.B. mittels einer von der Steuerelektronik 5 betätigbaren Rührvorrichtung oder mittels eines Antriebs, der eine Bewegung der Prozesseinheit 3 bewirkt (in Fig. 2 nicht dargestellt).
Die Partikel mit den gebundenen Biomolekülen werden nachfolgend mittels des beweglichen Magneten 27 sedimentiert und konzentriert. Der Magnet 27 bewegt die Partikel dann zur Öffnung 26 an der Prozesseinheit 4. Diese Öffnung 26 ist etwas vertieft angeordnet. Die Partikel werden mittels des Magneten 27 in diese Vertiefung bewegt und dort platziert.
In einer alternativen Ausgestaltung kann die Reaktionskammer 8 bezüglich des Magneten bewegt werden. Es ist auch möglich, dass der Magnet ein schaltbarer Elektromagnet ist, der im Bereich der Öffnung 26 angeordnet ist, und von der Steuerelektronik 5 eingeschaltet wird, um mittels seines Magnetfelds die Partikel in den Bereich der Öffnung 26 anzuziehen. Alternativ wird anstatt des Magneten eine Nadel (welche ebenfalls magnetisch ausgestaltet sein kann) oder eine Pipettiervorrichtung oder eine Kombination aus Magnet, Nadel und/oder Pipettiervorrichtung für die Bewegung, bzw. den Transfer der Partikel verwendet.
Die Öffnung 26 ist fluidisch mit der Fluidleitung 15 verbunden, die über das Ventil 16 einerseits mit der Detektionseinheit 4 und andererseits mit dem Flüssigkeitsauslass 17 verbindbar ist. Über die Fluidleitung 15 werden mittels der Steuerelektronik 5 die Partikel zusammen mit einem kleinen Volumen der in der Reaktionskammer enthaltenen Flüssigkeit durch die Fluidikleitung 15 in die erste Mikrofluidikeinheit 19 gespült. Hierzu kann eine weitere Pumpe dienen, die von der Steuerelektronik 5 gesteuert wird. Auch das Ventil 16 wird durch die Steuerelektronik 5 betätigt. In der ersten Mikrofluidikeinheit 19 erfolgt eine automatisierte Nukleinsäureextraktion und/oder -Isolierung, in der der ersten Mikrofluidikeinheit 19 nachgeschalteten zweiten Mikrofluidikeinheit 20 erfolgt eine automatisierte Amplifizierung und Detektion mittels PCR bzw. Real Time PCR. Für das vorliegend beschriebene Verfahren geeignete Mikrofluidikeinheiten zur automatisierten Nukleinsäureextraktion, Amplifizierung und Detektion sind im Stand der Technik grundsätzlich bekannt. Vorteilhaft ist für die vorliegende Anmeldung eine Zentrifugalplattform, wie sie beispielsweise in WO 2013/045631 A1 und EP 2 621 632 A1 beschrieben ist, es ist aber auch die Verwendung anderer Mikrofluidik-Plattformen oder Lab-on- Chip-Systeme möglich, die einen Flüssigkeits- und Reagenzientransport mittels Kapillarkräften,
Pumpen oder Pneumatik statt mit Zentrifugalkraft vorsehen.
Die Extraktion und/oder Isolierung der Nukleinsäuren in der ersten Mikrofluidikeinheit 19 erfolgt mittels bekannter Reagenzien und Verfahren, wie es bereits einleitend beschrieben wurde. Wenn es sich bei der biologischen Zielsubstanz nicht um bereits in der aus der Probenvorlage entnommenen Flüssigkeit frei vorliegende Nukleinsäuren handelt, werden die an die Partikel gebundenen Biomoleküle lysiert. Die freien Nukleinsäuren werden wieder an die Partikel gebunden. Es dienen also dieselben Partikel zur Anreicherung der Biomoleküle in der ursprünglichen Probe wie auch zur nachfolgenden Isolierung der freigesetzten Nukleinsäuren. Die Partikel mit den gebundenen Nukleinsäuren werden nachfolgend in bekannterWeise gewaschen und die Nukleinsäuren final von den Partikeln gelöst. Das die gelösten Nukleinsäuren enthaltende Eluat wird, wiederum gesteuert durch die Steuerelektronik 5, in die zweite Mikrofluidikeinheit 20 transportiert.
In der zweiten Mikrofluidikeinheit 20 werden bestimmte Volumina des Eluats in eine oder mehrere Detektionskammern transportiert und Amplifizierungsreagenzien zugesetzt. In den Detektionskammern erfolgt dann eine Amplifizierung, deren Fortschritt mittels Fluoreszenzmessungen mit dem Sensor 21 überwacht wird. Der Sensor 21 gibt Messsignale an die Steuerelektronik 5 aus. Diese ermittelt aus den Messsignalen entweder einen qualitativen Wert, der angibt, ob die bestimmte biologische Zielsubstanz in der aus der Probevorlage 7 entnommenen Flüssigkeit enthalten ist. Alternativ oder zusätzlich kann die Steuerelektronik 5 aus den Messsignalen auch einen quantitativen Wert ermitteln, der eine Konzentration der biologischen Zielsubstanz in der Flüssigkeit repräsentiert. In einer vorteilhaften Ausgestaltung können in mehreren Detektionskammern jeweils unterschiedliche Ziel-Nukleinsäuren amplifiziert und so parallel mehrere unterschiedliche biologische Zielsubstanzen in der Flüssigkeit qualitativ oder quantitativ bestimmt werden.
Vor oder nach dem T ransfer der Partikel aus der Reaktionskammer 8 in die Detektionseinheit 4 oder nach erfolgter Detektion wird die in der Reaktionskammer 8 verbliebene Flüssigkeit aus der Prozesseinheit 3 durch den Flüssigkeitsauslass 17 abgeführt. Die Prozesseinheit 8 kann ausreichend mit einem Spülmedium, insbesondere mit aus der Probevorlage 7 angesaugter Flüssigkeit, gespült werden und der Prozess kann jetzt für eine weitere Messung wiederholt werden. Die Mlkrofluidikeinheiten 19, 20 in der Detektionseinheit können für die weitere Messung durch neue Mikrofluidikeinheiten 19, 20 ersetzt werden.
In einer alternativen Verfahrensausgestaltung, die besonders vorteilhaft ist, wenn die biologische Zielsubstanz in der Flüssigkeit in sehr geringer Konzentration vorliegt, besteht die Möglichkeit, dass nach der Anreicherung der in der Flüssigkeit enthaltenen Biomoleküle durch Bindung an die Partikel die Flüssigkeit aus der Prozesseinheit 3 abgeführt wird, die Partikel jedoch noch nicht zur nachfolgenden Nukleinsäureextraktion an die Detektionseinheit 4 überführt werden, sondern in der Prozesseinheit 3 verbleiben. Jetzt kann ein weiteres, zweites Volumen der Flüssigkeit aus der Probenvorlage 7 in die Reaktionskammer 8 eingeleitet werden. Die Partikel werden in dem zweiten Volumen der Flüssigkeit resuspendiert und es erfolgt die erneute Zugabe von Alginatlösung und Kalziumchlorid. Damit wird ein kumulativer Prozess gestartet, der es erlaubt ein größeres Flüssigkeitsvolumen zu nutzen und damit ggf. auch die Sensitivität zu erhöhen. Solche Durchläufe können mehrmals wiederholt werden.
Ausführungsbeispiel: Nachweis von Bakterien und freier DNA in einer Wasserprobe
Als Ausgangsprobe wurde Oberflächen-Flusswasser aus der Havel genommen. Die Proben wurden mit Bakterien (Salmonellen ) und einer freien synthetischen DNA (Kontroll-Fragment DNA) gespiked.
Ein Probenvolumen von 50 ml des Wassers wurde in eine exemplarisch gefertigte Prozesseinheit 3 über die Öffnung 26 überführt. Zur Probe wurde über die Öffnung 24 ein Volumen von 100 pl aus einem Reservoir eine Alginatlösung zugegeben. Die Prozesseinheit 3 wurde zwecks Mischung kurz geschwenkt. Nachfolgend wurden der Probe über die Öffnung 23 ein Volumen von 100 pl einer Calciumchlorid-Lösung aus einem Reservoir zugegeben und die Prozesseinheit wurde erneut geschwenkt. Über eine weitere Öffnung 22 wurden 50 mI paramagnetische Partikel (MAG Suspension; AJ Innuscreen GmbH) aus einem Reservoir zur Probe gegeben und die Prozesseinheit 3 erneut geschwenkt. Nach einer Inkubationszeit von 20 min wurden die Partikel mit dem beweglichen Magneten 27 gesammelt und zur Vertiefung an der Auslassöffnung 26 transportiert und dort fixiert.
Über die Auslassöffnung 26 wurde nachfolgend die Reaktionskammer 8 entleert. Nach der Entleerung wurden die gesammelten Partikel mit einem in der Reaktionskammer verbliebenen Rest der Wasserprobe (ca. 200 mI) über die Auslassöffnung 26 aus der Prozesseinheit entfernt. Von dieser Position werden erfindungsgemäß die Partikel zur Extraktion und weiteren Detektion in die Detektionseinheit 4 transportiert. Hier erfolgt die Extraktion der Nukleinsäure und nachfolgend die spezifische Target-Detektion.
Die gesamte Prozesseinheit 3 wird nachfolgend über die Einlassöffnung 25 und Auslassöffnung 26 mit Wasser gespült und kann nachfolgend für die nächste Messung mit einer neuen Probe befüllt werden.
Im Ausführungsbeispiel wurde die Extraktion und Detektion manuell durchgeführt, um nachzuweisen, dass es mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich ist, ein großes Probenvolumen als online- Prozess in ein kleines Probenvolumen zu überführen und damit eine Detektion biologischer Zielsubstanzen zu ermöglichen. Die Extraktion wurde wie folgt durchgeführt. Die abgeleiteten Partikel wurden mit einem Lysepuffer (Lysis Solution RL; AJ Innuscreen GmbH) und Proteinase K versetzt.
Nach einer Inkubation von 20 Minuten bei 60°C erfolgte die Zugabe eines Bindungspuffers (Binding Solution SBS; AJ Innuscreen GmbH). Dieser Bindungspuffer in Kombination mit dem Lysepuffer führt zur Bindung der aus den Bakterien freigesetzten DNA und der freien Kontroll-Fragment DNA an die Partikel. Der Ansatz wurde kurz gemischt und für 2 Minuten inkubiert. Nachfolgend erfolgte die Separation der Magnetpartikel mittels eines Magneten. Der Überstand wurde entfernt und die Magnetpartikel wurden mit 1 ml eines Waschpuffers (Washing Solution HS; AJ Innuscreen GmbH) gewaschen. Nach erneuter Separation der Magnetpartikel wurde der Überstand komplett entfernt und die Magnetpartikel weitere zwei Mal mit 80%igem Ethanol gewaschen. Nach Ethanolentfernung erfolgte die Elution der gebundenen DNA durch die Zugabe von 100 pl RNAse freiem Wasser und einer Inkubation bei 60°C für 5 Minuten. Nach Separation der Magnetpartikel wurde der Überstand entfernt und in einem Real Time PCR Gerät zur nachfolgenden Detektion der Salmonellen-DNA und der Kontroll-Fragment DNA eingesetzt. Die Ergebnisse der Real Time PCR sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.
Tabelle 1 : Ergebnisse der Real Time PCR
Die Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, aus einem Volumen von 50 ml Wasser sowohl Bakterien als auch freie DNA an Partikel zu binden, die initiale Wasserprobe zu entfernen und die Partikel auf ein Volumen von 200 pl einzuengen. Das Verfahren erfolgte in der erfindungsgemäßen Prozesseinheit. Nachfolgend wurden die Partikel für die Extraktion der Nukleinsäure eingesetzt und final die Bakterien und freie DNA mittels Real Time PCR detektiert.
Das erfindungsgemäße Analysegerät und Verfahren löst damit durch die Verknüpfung verfügbarer Gerätesysteme und Anreicherungstechnologien in idealerWeise die Aufgabenstellung und ermöglicht die Durchführung einer online-Flüssigkeits-Analytik biologischer Targets, die besonders vorteilhaft für die Überwachung von Wasser bzw. Abwasser in Netzwerken, Kläranlagen oder Aufbereitungsanlagen sowie von Gewässern erscheint. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es erstmals ohne manuelle Intervention beginnend mit einer großvolumigen Probe bis hin zur Detektion ein molekulargenetisches Monitoring von biologischen Targets in praktikabler und wirtschaftlicher weise umzu setzen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur automatisierten Online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Flüssigkeit, insbesondere Wasser oder Abwasser, mittels eines Online-Analysegeräts (1), umfassend: - Transportieren eines vorgegebenen ersten Volumens der Flüssigkeit über eine Probenzuleitung (6) in eine Reaktionskammer (8) einer Prozesseinheit (3) des Online-Analysegeräts (1);
- Aufkonzentrieren von in dem ersten Volumen der Flüssigkeit enthaltenen Biomolekülen durch Bindung an eine Vielzahl von Partikeln in der Reaktionskammer (8);
- Transportieren der Partikel mit den daran gebundenen Biomolekülen in eine Detektionseinheit (4) des Online-Analysegeräts, wobei die Detektionseinheit (4) eine erste Mikrofluidikeinheit (19) und eine mit der ersten Mikrofluidikeinheit (19) fluidisch verbindbare zweite Mikrofluidikeinheit (20) aufweist;
- Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den an die Partikel gebundenen Biomolekülen; - Transportieren eines die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Eluats in die zweite Mikrofluidikeinheit (20);
- Amplifizierung mindestens einer Ziel-Nukleinsäure in der zweiten Mikrofluidikeinheit (20);
- Erfassen eines Messsignals, das eine von dem Fortschritt der Amplifizierung und/oder von einer Anzahl von Kopien der Ziel-Nukleinsäure in der zweiten Mikrofluidikeinheit abhängige Messgröße repräsentiert, und
- Qualitative und/oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz in der Probe anhand des erfassten Messsignals durch eine Steuerelektronik des Analysegeräts.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei nach dem Aufkonzentrieren von in dem ersten Volumen der Flüssigkeit enthaltenen Biomolekülen das erste Volumen der Flüssigkeit aus der Reaktionskammer (8) abgeleitet und ein zweites Volumen der Flüssigkeit in die Reaktionskammer (8) eingeleitet wird, und in dem zweiten Volumen der Flüssigkeit enthaltene Biomoleküle durch Anbindung an die in der Reaktionskammer (8) verbliebenen Partikel aufkonzentriert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Partikel magnetische oder paramagnetische Partikel sind, an die die Biomoleküle, insbesondere unselektiv, binden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Aufkonzentrieren von in der Flüssigkeit enthaltenen Biomolekülen das
Einleiten einer Alginatlösung und eines Salzes eines di- bzw. polyvalenten Kations oder einer Säure in die Reaktionskammer (8) umfasst, wobei sich an den Partikeln ein Alginatgel-Biomolekül-Komplex bildet.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Transportieren der Partikel mit den daran gebundenen Biomolekülen in die Detektionseinheit (4) umfasst:
- Transportieren der Partikel mittels eines, insbesondere relativ zu der Reaktionskammer (8) beweglichen, Magneten (27), mittels einer Nadel, mittels einer Magnetnadel und/oder mittels einer Pipettiervorrichtung in einen Bereich der Reaktionskammer (8), in dem eine Fluidleitung (15) in die Reaktionskammer (8) mündet, die die Reaktionskammer (8) fluidisch mit der ersten Mikrofluidikeinheit (19) verbindet, und
- Spülen der Partikel durch die Fluidleitung (15) in die erste Mikrofluidikeinheit (19).
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den an die Partikel gebundenen Biomolekülen in der ersten Mikrofluidikeinheit (19) umfasst:
- Versetzen der Partikel mit den daran gebundenen Biomolekülen mit einem oder mehreren Lysereagenzien, um Nukleinsäuren der adsorbierten Biomoleküle freizusetzen,
- Binden der freigesetzten Nukleinsäuren an die Partikel, und
- Waschen der Partikel mit den gebundenen Nukleinsäuren mit einer Waschlösung.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Verfahren weiter umfasst:
- Ablösen der Nukleinsäuren von den Partikeln durch Eluieren; und
- Transportieren eines die Nukleinsäuren umfassenden Eluats in die zweite Mikrofluidikeinheit (20) zur nachfolgenden Amplifikation.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den an die Partikel gebundenen Biomolekülen in der ersten Mikrofluidikeinheit (19) umfasst:
- thermisches Freisetzen der an die Partikel gebundenen Biomoleküle oder von in den Biomolekülen enthaltener Nukleinsäure in einer Pufferlösung, beispielsweise in einer phosphatgepufferten Salzlösung, Wasser oder Tris-Puffer, die optional ein Komplexierungsreagenz, beispielsweise einen Chelatbildner, umfasst; und
- Transportieren der Pufferlösung mit den darin gelösten Biomolekülen oder Nukleinsäure in die zweite Mikrofluidikeinheit (20) zur nachfolgenden Amplifikation.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Steuerelektronik (5) des Online-Analysegeräts (1) alle Verfahrensschritte automatisiert durchführt.
10. Online-Analysegerät (1) zur Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Flüssigkeit, insbesondere nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend: eine Steuerelektronik (5), eine Prozesseinheit (3) und eine Detektionseinheit (4), wobei die Prozesseinheit (3) mindestens eine Reaktionskammer (8) und eine in die Reaktionskammer (8) mündende Probenzuleitung (6) aufweist, und wobei die Prozesseinheit (3) dazu eingerichtet ist, ein vorgegebenes Volumen der Flüssigkeit in der Reaktionskammer (8) aufzunehmen, und in der Flüssigkeit enthaltene Biomoleküle durch Bindung an Partikel aufzukonzentrieren; und wobei die Detektionseinheit (4) aufweist: eine mit der Reaktionskammer (3) fluidisch verbindbare erste Mikrofluidikeinheit (19), die dazu eingerichtet ist, aus den an die Partikel gebundenen Biomolekülen Nukleinsäuren freizusetzen und/oderzu isolieren; eine mit der ersten Mikrofluidikeinheit (19) verbundene zweite Mikrofluidikeinheit (20), die dazu eingerichtet ist, ein die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassendes Eluat aufzunehmen und eine Ziel-Nukleinsäure zu amplifizieren; und einen, insbesondere optischen, Sensor (21), der dazu eingerichtet ist, ein von dem Fortschritt einer in der zweiten Mikrofluidikeinheit (20) durchgeführten Amplifizierung und/oder von einer Anzahl von Kopien der Ziel-Nukleinsäure in der zweiten Mikrofluidikeinheit (19) abhängiges Messsignal zu erzeugen und an die Steuerelektronik (5) auszugeben; und wobei die Steuerelektronik (5) dazu eingerichtet ist, anhand des von dem Sensor (21) ausgegebenen Messsignals die biologische Zielsubstanz in der Flüssigkeit qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen.
11. Online-Analysegerät (1) nach Anspruch 10, weiter umfassend eine Probenpumpe (9), wobei die Steuerelektronik (5) dazu eingerichtet ist, die Probenpumpe (9) zum Transport eines vorgegebenen Volumens der Flüssigkeit in die Reaktionskammer (8) zu steuern.
12. Online-Analysegerät (1) nach Anspruch 10 oder 11 , weiter umfassend mindestens ein Reaktionskomponenten-Reservoir (10, 11), das eine Reaktionskomponente für die Aufkonzentrierung der Biomoleküle in der Reaktionskammer (8), beispielsweise eine Alginatlösung und/oder ein Salz eines di- bzw. polyvalenten Kations oder eine Säure und/oder magnetische oder paramagnetische Partikel, enthält, und eine das Reaktionskomponenten-Reservoir (10, 11) mit der Reaktionskammer (8) verbindende Reaktionskomponenten-Zuleitung, wobei die Steuerelektronik dazu eingerichtet ist, eine vorgebbare Menge der Reaktionskomponente in die Reaktionskammer (8) zu dosieren.
13. Online-Analysegerät (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 12, weiter umfassend Mittel zum Bewegen, insbesondere Rühren, der in der Reaktionskammer enthaltenen Probe.
14. Online-Analysegerät (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 13, weiter umfassend einen Magneten (27), der mittels der Steuerelektronik (5) relativ zur Reaktionskammer (8) so orientierbar ist, dass in der Reaktionskammer (8) enthaltene magnetische oder paramagnetische Partikel durch Magnetkraft in einen Bereich der Reaktionskammer (8) transportiert werden, in dem eine Fuidleitung (15) in die Reaktionskammer (8) mündet, die die Reaktionskammer (8) fluidisch mit der ersten Mikrofluidikeinheit (19) verbindet.
15. Online-Analysegerät (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei die erste (19) und die zweite Mikrofluidikeinheit (20) zusammen in einer, insbesondere austauschbaren, Kartusche angeordnet sind.
16. Online-Analysegerät (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei die erste Mikrofluidikeinheit (19) dazu eingerichtet ist, die Partikel mit daran gebundenen Biomolekülen aufzunehmen und mit einem oder mehreren Lysereagenzien zu versetzen, um Nukleinsäure der adsorbierten Biomoleküle freizusetzen, anschließend die freigesetzten Nukleinsäuren an die Partikel zu binden und die Partikel mit den daran gebundenen Nukleinsäuren ein- oder mehrmals mit einer Waschlösung zu waschen, und wobei die Steuerelektronik (5) dazu eingerichtet ist, einen Transport der Partikel und optional der Reagenzien durch die erste Mikrofluidikeinheit (19) zu steuern.
17. Online-Analysegerät (1) nach Anspruch 16, wobei die erste Mikrofluidikeinheit (19) weiter dazu eingerichtet ist, die Nukleinsäuren von den Partikeln durch Eluieren zu abzulösen und das Eluat über eine die erste Mikrofluidikeinheit (19) mit der zweiten Mikrofluidikeinheit (20) verbindende Fluidleitung (18) in die zweite Mikrofluidikeinheit (20) zu transportieren, und wobei die Steuerelektronik (5) dazu eingerichtet ist, das Eluieren und den Transport des Eluats zu steuern.
18. Online-Analysegerät (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei die erste Mikrofluidikeinheit (19) dazu eingerichtet ist, die Partikel mit daran gebundenen Biomolekülen aufzunehmen und die an die Partikel gebundenen Biomoleküle oder in diesen Biomolekülen enthaltenee Nukleinsäuren in einer Pufferlösung, beispielsweise in einer phosphatgepufferten Salzlösung, Wasser oder einem Tris-Puffer, die optional ein Komplexierungsreagenz zur Komplexierung von an den Partikeln mit den Biomolekülen gebundenen di- bzw. polyvalenten Kationen umfasst, thermisch freizusetzen, und wobei die Steuerelektronik (5) dazu eingerichtet ist, die thermische Freisetzung der Biomoleküle zu steuern und die Pufferlösung mit den darin gelösten Biomolekülen bzw. Nukleinsäuren in die zweite Mikrofluidikeinheit (20) zur nachfolgenden Amplifikation zu transportieren.
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