DE102008035771B4

DE102008035771B4 - Vorrichtung und Verfahren zur automatischen Detektion von biologischen Partikeln

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Publication number: DE102008035771B4
Application number: DE102008035771A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Dr. rer. nat. Reidt; Alois Dr. rer. nat. Friedberger; Christoph Dr. rer. nat. Heller; Thomas Ziemann; Harald Dr. rer. nat. Waltenberger; Günter Dr. rer. nat. Müller
Original assignee: EADS Deutschland GmbH; Microcoat GmbH
Current assignee: Airbus Defence and Space GmbH; Microcoat GmbH
Priority date: 2008-07-31
Filing date: 2008-07-31
Publication date: 2011-04-07
Anticipated expiration: 2028-08-01
Also published as: US20110263044A1; EP2313755A1; DE102008035771A1; WO2010012641A1

Abstract

Vorrichtung (70) zur automatischen Detektion von Partikeln (13) mit einer Einrichtung zum Verbinden der Partikel (13) mit selektiv an die Partikel anbindbaren Trennpartikelkörpern, einer Trenneinrichtung zum Extrahieren der Trennpartikelkörpern (16) mit angebundenen Partikeln (13) aus einer Sammelflüssigkeit (40) und einer Detektionseinheit (84) zum Erfassen einer Anzahl und/oder Konzentration der derart getrennten Partikel (13),
dadurch gekennzeichnet,
dass die Vorrichtung eine Dosiereinheit (41), die automatisch gesteuert mit vorbestimmten Volumen befüllbar ist und die zum Befüllen einer Sammeleinrichtung (72) mit Sammelflüssigkeit (40) ausgebildet ist, aufweist,
dass die Einrichtung zum Verbinden der Partikel (13) mit den Trennpartikelkörpern die Sammeleinrichtung (72) zum Sammeln der Partikel (13) aus einem zu untersuchenden Partikel-Fluidgemisch (39, 134) ist, die durch das Partikel-Fluidgemisch durchströmbar ist und automatisch mit einer mit den Trennpartikeln (16) versetzten Sammelflüssigkeit (40) befüllbar ist,
wobei die Dosiereinheit (41) die Trenneinrichtung aufweist, welche derart automatisch schaltbar ausgebildet ist, dass Trennpartikelkörper (16) wahlweise in...

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur automatischen Detektion von biologischen Partikeln.
In der US 6 268 143 B1 sowie der US 5 972 721 A sind Verfahren und Vorrichtungen zur automatischen Extraktion und Detektion von biologischen Partikeln, insbesondere Mikroorganismen wie Bakterien beschrieben. Dabei wird das Prinzip der paramagnetischen Separation oder der immunomagnetischen Untersuchung angewandt. Hierzu werden Trennpartikelkörper, die derart beschichtet sind, dass sie ganz spezielle zu untersuchende Partikel an sich binden, aus paramagnetischem Material verwendet. Diese Trennpartikelkörper – Beads genannt – lassen sich in einem Magnetfeld festhaften und damit extrahieren. Dadurch werden auch die daran anhaftenden speziellen Partikel mit extrahiert.
Weitere Beispiele sowie spezielle Beads sind in der WO 03/010563 A2 , der WO 2006/112771 A1 , der WO 2006/021410 A1 , EP 0 687 501 A2 , US 6 207 463 B1 und der US 5 821 066 A beschrieben.
Die paramagnetische Separation wird außerdem in den folgenden Publikationen näher erläutert:
• Olsvik O, Popovic T, Skjerve E, Cudjoe KS, Hornes E, Ugelstad J, Uhlen M Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology.
Clin Microbiol Rev. 1994 Jan; 7(1): 43–54. Review und
• Mullane NR, Murray J, Drudy D, Prentice N, Whyte P, Wall PG, Parton A, Fanning S.
Detection of Enterobacter sakazakii in dried infant milk formula by cationic-magnetic-bead capture.
Appl. Environ Microbiol. 2006 Sep; 72(9): 6325–30.
Gegenwärtig existiert jedoch keine Möglichkeit zum vollautomatischen und schnellen Nachweis von Mikroorganismen und biologischen Partikeln aus Gasen bzw. Luft.
Eine Detektion von Mikroorganismen aus der Luft oder einem Gas erfolgt derzeit mittels sog. Airsampler, die mit Nährmedien bestückt sind. Diese müssen nach der Probennahme mehrere Stunden oder Tage inkubiert werden, bevor ein Nachweis möglich ist. Systeme zur Überprüfung und Anreicherung von Mikroorganismen aus der Luft in eine Flüssigkeit sind gleichfalls bekannt, jedoch fehlt diesen Systemen die Möglichkeit zur vollautomatischen Extraktion und Detektion.
Beispiele für zuvor genannte Airsampler finden sich in der US 5 902 385 A sowie der US 5 904 752 A .
Das Prinzip des Airsamplings ist näher in den folgenden Publikationen erläutert:
• Hogan CJ JR, Kettleson EM, Lee MH, Ramaswami B, Angenent LT, Biswas P.,
Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles.
J Appl Microbiol. 2005; 99(6): 1422–34.
• Agranovski IE, Agranovski V, Grinshpun S A, Reponen T, Willeke K,
Collection of airborne microorganisms into liquid by bubbling through porous medium.
Aerosol Science and Technology, Volume 36, Number 4, 1 April 2002, pp. 502–509(8) und
• Lödding H, Koch, W, Möhlmann C, Kolk A,
Sammelverhalten von Impingern als Bioaerosolsammler
Gefahrstoffe-Reinhaltung der Luft-Ausgabe 7–8/2007
Aus der US 2004 0038385 A1 ist eine Vorrichtung zum Sammeln, Trennen und Detektieren von Partikeln bekannt. Als Trenneinrichtung dient ein Fliehkraftabscheider, der Partikel in einer vorbestimmten Größe in einer Flüssigkeit fängt und aufkonzentriert.
Aus der US 7 183 104 B1 ist ein System zum Sammeln, Extrahieren und Detektieren von Partikeln aus der Luft bekannt. Die Abtrennung biologischer nicht-magnetischer Partikel erfolgt hier entweder durch Anwendung eines magnetischen Feldes oder durch Zentrifugieren, um die leichten und nicht-magnetischen biologischen Partikel von schweren magnetischen Partikeln abzutrennen.
Aus der DE 102 59 302 A1 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Keimen bekannt. Ein Membranfilter hält die zu detektierenden Keime zur Abtrennung der Keime zurück.
Die US 7 293 473 B2 beschreibt eine Vorrichtung zum Nachweis biologischer Partikel in der Luft. Die Vorrichtung umfasst eine mit Luft durchströmbare Sammeleinheit, eine Trenneinheit in Form eines Filters und eine Detektionseinheit.
Aus der DE 10 2006 058 374 A1 ist ein Analysesystem zum Nachweis biologischer Partikel bekannt. Der biologische Analyt wird dabei immunologisch an magnetische Trennpartikel angebunden und über eine Filtervorrichtung abgetrennt. Die magnetischen Trennpartikel werden mittels eines Magnetfeldes auf eine Oberfläche gelenkt und auf dieser nachgewiesen.
Die US 5 972 721 A offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren zur immunomagnetischen Separation und Aufkonzentration biologischer Partikel. Dabei werden die biologischen Partikel durch immunologische Anbindung an magnetische Trennpartikel extrahiert und diese durch wiederholtes Vorbeispülen an durch von außen magnetisierbaren paramagnetischen Stäben aufkonzentriert und abgetrennt, wonach sie nachgewiesen werden können.
Die DE 10 2006 026 559 A1 offenbart einen mikromechanischen Filter für pathogene Mikropartikel.
Aus der US 5 902 385 A ist eine Gassammeleinrichtung, ein sogenannter Airsampler bekannt.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Detektion von Partikeln in einem Partikel-Fluid-Gemisch zu schaffen, die vollautomatisch betreibbar bzw. durchführbar sind, universell einsetzbar und in einem kompakten und einfach aufgebauten, vorzugsweise mobilen System implementiert werden können.
Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 sowie ein Verfahren mit den Schritten des Nebenanspruches gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Mit einem besonders bevorzugten hier vorgestellten System ist eine schnelle und vollautomatische Anreicherung, Extraktion und Detektion von Mikroorganismen (z. B. Bakterien, Protozoen, Pilze, Viren) und biologischen Partikeln (z. B. Sporen) möglich. Die Anreicherung, Extraktion und Detektion kann sowohl aus Gasen, insbesondere der Luft, als auch aus Flüssigkeiten erfolgen. Neben der Detektion biologischer Materialien ist auch eine Anreicherung, Extraktion und Detektion nicht-biologischer bzw. synthetischer Materialien möglich, insbesondere Sprengstoffe, Flüssigsprengstoffe und Drogen.
Mit der hier beschriebenen neuen Technik wird insbesondere der Einsatz paramagnetischer Kügelchen (sog. Beads) in Verbindung mit einer Sammeleinrichtung, insbesondere einem Airsampler, vorgeschlagen. Die Beads sind mit Antikörpern beschichtet, welche wiederum Moleküle oder Partikel biologischen oder nicht biologischen Ursprungs binden können. Durch die Entwicklung spezieller Anreicherungstechniken wird die extreme Aufkonzentrierung und Immobilisierung der so beladenen Beads erreicht. Außerdem wird eine auf die Aufkonzentrierung folgende vollautomatische Extraktion und Detektion der gebundenen Moleküle oder Partikel vorgeschlagen. Die hohe Aufkonzentrierung ermöglicht einen hochempfindlichen Nachweis der Analyten.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Vorrichtung weist eine Gruppe von Reservoiren für unterschiedliche Mittel zur Durchführung unterschiedlicher Schritte des Detektionsvorganges auf.
Vorzugsweise enthält die Gruppe von Reservoiren eine Mehrzahl von Mittel, die aus der folgenden Gruppe von Mitteln ausgewählt sind:
Trennpartikelkörperlösung, Äquilibrierungslösung, Aufschlusslösung, Sammelflüssigkeit, Reinigungslösung und/oder Konservierungslösung.
Insbesondere werden folgende Vorteile durch die Erfindung oder deren vorteilhaften Ausgestaltungen erreicht:

• schneller und empfindlicher Nachweis von Mikroorganismen und anderen gefährlichen Substanzen (insbesondere biologische Toxine) sowie von Sprengstoffen aus einer gasförmigen Phase, insbesondere Luft;
• schnelle Detektion von Mikroorganismen und anderen gefährlichen Substanzen aus Flüssigkeiten und flüssigen Lebensmitteln aller Art;
• Zusammenfassung und Automatisierung der drei Bereiche Anreicherung, Extraktion und Detektion in einem einheitlichen, kompakten und mobilen System und/oder
• schneller Nachweis von Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Speichel, Tränenflüssigkeit und Urin (medizinische Diagnostik).

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend anhand der beigefügten Zeichnung näher erläutert. Darin zeigt:
1 eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Erkennung und Bindung von Partikeln (Antigene) durch Antikörper, die auf einer Beadoberfläche über Biotin und Streptavin immobilisiert wurden;
2 eine schematische Darstellung zur Erläuterung einer Erkennung und Bindung von Bakterien durch Phagenproteine, die auf einer Beadoberfläche via Biotin und Streptavin immobilisiert wurden;
3, 3a verschiedene Schnittansichten eines an sich bekannten Airsamplers, der bei dem hier vorgestellten System verwendbar ist, bei einer entsprechenden Anwendung;
4 eine schematische Darstellung einer Anreicherung der paramagnetischen Beads durch einen externen Magneten;
5 eine schematische Darstellung einer Anreicherung der paramagnetischen Beads durch einen magnetischen Kolben;
6 eine schematische Darstellung der Anreicherung der paramagnetischen Beads über eine dehnbare Membran;
7 eine Seitenansicht eines Gesamtsystems als Vorrichtung zur Detektion von Partikeln;
8 eine Draufsicht auf das Gesamtsystem;
9 eine DNA-Sequenz nach dem Modell eines Reißverschluss;
10 eine schematische Darstellung der Anreicherung von Partikeln aus Flüssigkeiten über eine Flusszelle; und
11 eine schematische Darstellung von zwei miteinander verbunden Mikroliterpipetten.
Im folgenden werden Ausführungsbeispiele eines Systems näher beschrieben, das zur vollautomatisierten Probennahme („Sampling”), Anreicherung, Extraktion und Analyse von Gasen und Flüssigkeiten eingesetzt werden soll.
I. Einführung:
Vorrangiges Ziel für eine Detektion sind alle Partikel, insbesondere Bakterien, Viren, Sporen, Protozoen und biologische Toxine. Ein Einsatz für die Analyse von biologischen und nicht-biologischen Substanzen ist gleichfalls mit dem hier beschriebenen Gerät möglich. Einzige Voraussetzung ist das Vorhandensein von spezifischen Bindemolekülen (z. B. Antikörper) mit ausreichender Affinität. Da ein Antikörper nahezu gegen jede Substanz gebildet werden kann, kann das hier beschriebene Gerät zur Detektion mannigfaltiger Stoffe eingesetzt werden.
II. Paramagnetische Beads mit immobilisierten Antikörpern oder anderen Bindeproteinen:
In bevorzugter Ausgestaltung werden bei der neuen Technologie als Trennpartikelkörper zum Abtrennen oder Separieren der hier interessierenden Partikel paramagnetische Kügelchen (Beads) eingesetzt, die mit Antikörpern bestückt sind und an welche die Partikel bzw. Mikroorganismen mit hoher Affinität binden. Die Beads selbst haben i. d. R. eine Größe im Bereich von unter 0,5 μm bis 10 μm und bestehen vorwiegend aus einem paramagnetischen Kern und einer Hülle aus Silikat, Latex oder Polystyren.
Zur Bestückung der Beads mit Antikörpern (sog. Coating) können verschiedene Verfahren eingesetzt werden:

a) passive Adsorption (z. B. über hydrophobe Wechselwirkungen),
b) direkte chemische Kopplung (crosslinking) via Peptidbindung o. a.,
c) Kopplung via immobilisierter Antikörper Proteine, z. B. Protein A bzw. Protein G und/oder
d) Kopplung via Biotin-Streptavidin-Bindung.

Die unter d) genannte Technik ist in 1 dargestellt. Sie nutzt die hohe Affinität (Bindungskraft) zweier biologischer Moleküle zueinander: Biotin 18 und Streptavidin 20. Hierzu wird der Antikörper 10 an der seiner spezifischen Bindungsstelle abgewandten Seite (der sog. F_C-Domäne 22) mit dem Molekül Biotin 18 markiert. Gleichzeitig wird das Protein Streptavidin 20 auf die Oberfläche 14 der paramagnetischen Beads 16 gekoppelt. Dadurch werden Antikörper 10 praktisch irreversibel an die Kugeloberfläche 14 gebunden.
Nach der Immobilisierung der Antikörper 10 auf die paramagnetischen Beads 16 können diese für das gezielte „Einfangen” der Mikroorganismen bzw. Partikel eingesetzt werden. Hierbei binden die Antikörper an ihre sog. Antigene 12 (die zu detektierenden Partikel 13); insbesondere sind dies spezielle Oberflächenstrukturen von Mikroorganismen.
Wie in 2 dargestellt, können als Alternative zu Antikörpern 10 bestimmte Phagenproteine 24 zur gezielten Erkennung und Bindung einiger Bakterienarten – ein Bakterium 26 ist als Beispiel dargestellt – eingesetzt werden. Phagen sind Viren, die ausschließlich Bakterien befallen und mit ihren speziellen Hüllproteinen an der Bakterienoberfläche andocken können. Mittels biotechnologischer Methoden ist es möglich, große Mengen dieser Phagenproteine 24 herzustellen und ebenfalls mit Biotin 18 zu markieren. Analog zu den Antikörpern 10 können diese Phagenproteine 24 ebenfalls an Streptavadin-beschichtete paramagnetische Beads 16 gekoppelt werden, wobei die so gebundenen Phagenproteine 24 ihrerseits mit den bakteriellen Andockstellen (Oberflächenproteine der Bakterien 26) interagieren.
III. Probenentnahme und Anreicherung:
In normaler Umgebungsluft sind Keime etc. üblicherweise nur in sehr geringen Konzentrationen vorhanden. Zum Nachweis von Luftkeimen (bzw. anderen Partikeln und Molekülen) ist deshalb eine Anreicherung notwendig. In der hier beschriebenen Technologie erfolgt diese Anreicherung in 3 Schritten:

1) Überführung der Partikel 13 von Luft in Flüssigkeit,
2) Bindung der Partikel 13 an paramagnetische Beads 16 und
3) Aufkonzentrierung der Beads 16 mittels magnetischem Feld.

Hierbei erfolgen Schritt 1) und Schritt 2) simultan.
In einem in 3 dargestellten sog. Airsampler 30 – wie beispielsweise in der US-A-5902385 , auf die für weitere Einzelheiten ausdrücklich verwiesen wird, beschrieben und gezeigt – wird die Umgebungsluft – Luftstrom 39 – durch den Einlass (Inlet) 32 angesaugt und die darin befindlichen Partikel 13 – insbesondere Luftkeime – mittels spezieller Düsen mit hoher Effizienz (ca. 90% Ausbeute) in ein kleines Flüssigkeitsvolumen überführt. Der Luftstrom 39 durch den Sampler beträgt z. B. 12,5 L/min; bei einer Probennahme-Zeit von z. B. 10 Minuten entspricht dies also einem Gesamtvolumen von 125 L Luft. Bei einem Volumen der Sammelflüssigkeit von typischerweise 5 ml wird hierdurch eine Aufkonzentrierung um den Faktor 25.000 erreicht.
3 und 3a zeigen zwei Querschnittszeichnungen, die den Airsampler 30 mit Einlass 32, Auslass 34, Sammelbehälter 36 und Tangentialdüsen 38 illustrieren. 3a zeigt einen Querschnitt entlang der Linie M-N von 3. In 3 sind weiter zur Veranschaulichung der Anordnung und Ausrichtung der Tangentialdüsen 38 die Mittelachse 11 und eine Tangente 15 dargestellt.
Die Sammelflüssigkeit 40 im Sammelbehälter 36 (collection vessel) ist beim hier beschriebenen System mit oben beschriebenen paramagnetischen Beads 16 versetzt. Die aus dem Luftstrom 39 (4) in die Sammelflüssigkeit 40 überführten Partikel 13 (Analyte) können während des Samplings an die spezifisch aktivierten paramagnetischen Beads 16 binden. Nach Beendigung der Probennahme werden die Beads 16 mittels eines magnetischen Feldes angezogen und in einem kleinen Volumen innerhalb des Dosiervolumens 43 einer Dosiereinheit 41 angereichert (4). Dieses Volumen beträgt typischerweise ca. 50 μL, wodurch eine weitere Aufkonzentrierung um den Faktor 100 erreicht wird. Mit dem Gesamtsystem lässt sich also insgesamt z. B. eine 2,5 millionenfache Anreicherung von Luftkeimen (oder anderen Partikeln) erzielen.
Der 3. Schritt, also die Anreicherung der paramagnetischen Beads 16 aus dem Sammelbehälter 36 des Airsamplers 30, kann über drei unterschiedliche technische Verfahren erfolgen, die im folgenden näher erläutert werden.
III.A. Anreicherung über einen externen Magneten:
Im folgenden wird Bezug auf 4 genommen. An der Dosiereinheit 41 – bevorzugt eine Spritze 42 – wird ein Magnet 44 an der Außenwand 46 angebracht. Die Sammelflüssigkeit 40 mit den paramagnetischen Beads 16 wird über einen Auslasskanal 45 aus dem Airsampler 30 in die Dosiereinheit 41 gezogen.
Während die Flüssigkeit 40 in die Dosiereinheit 41 strömt, lagern sich die Beads 16 automatisch an der Innenwand 48 der Dosiereinheit 41 im Bereich des magnetischen Feldes an.
Anschließend wird die Sammelflüssigkeit 40 wieder aus der Spritze 42 gedrückt. Die Beads 16 werden durch den Magneten 44 gehalten und zurückgehalten. Die Beads 16 können durch mehrmaliges Aufnehmen und Abgeben frischen Puffers gewaschen werden.
Für die Elution wird im letzten Waschschritt ein möglichst kleines Puffervolumen in der Spritze 42 belassen und der Magnet 44 wird von der Außenwand 46 der Dosiereinheit 41 entfernt.
Nach Resuspendierung der Beads 16 können diese nun zur weiteren Prozessierung in ein anderes Reaktionsgefäß – nicht dargestellt – überführt werden. Um eine vollständige Entleerung der Spritze 42 zu gewährleisten, kann erneut ein kleines Volumen Flüssigkeit aufgenommen und eluiert werden.
III.B. Anreicherung über einen Teleskopkolben:
In einem in 5 dargestellten zweiten Verfahren wird die Sammelflüssigkeit 40 ebenfalls aus dem Airsampler 30 über einen Auslasskanal 45 in die Dosiereinheit 41, bevorzugt eine Spritze 42, gezogen. Die Spritze 42 besitzt einen hohlen Spritzenkolben 50, in welchem ein zweiter, magnetischer Kolben – Magnetkolben 52 – oder Stempel – mit dem Magnet 44 auf- und ab-bewegt werden kann (Teleskop-Prinzip).
Während des Aufziehens der Sammelflüssigkeit 40 ist der Magnetkolben 52 ganz in den Spritzenkolben 50 eingefahren. Die paramagnetische Beads 16 können sich somit am Kolbenboden 54 anreichern.
Durch mehrfaches Heben und Senken des Spritzenkolbens 50 kann die Sammelflüssigkeit 40 gegen eine andere Flüssigkeit ausgetauscht werden (sog. Waschen).
Zuletzt wird ein minimales Flüssigkeitsvolumen aufgezogen (z. B. 50 μL). Zur Elution wird der Magnetkolben 52 nach oben gezogen, wodurch das Magnetfeld in der Spritze 42 quasi verschwindet und sich die Beads 16 vom Kolbenboden 54 ablösen. Dieses Konzept bietet den Vorteil, dass bei hochgezogenem Magnet 44 die Spritze 42 als normale Dosiereinheit 41 funktioniert.
In dem hier dargestellten Beispiel ist weiter im unteren Bereich der Dosiereinheit 41 ein Aufschlussmodul, insbesondere ein Ultraschallgerät 56, angebracht. Dies ist besonders bevorzugt in Verbindung mit dem Magnetkolben 52, da dann im unteren Bereich kein Magnet angebracht werden muss und Platz für das Aufschlussmodul geschaffen ist.
III.C. Anreicherung über einen Magneten, der von einer dehnbaren Membran umschlossen ist:
Bei einem in 6 dargestellten dritten Verfahren zur Anreicherung der Beads 16 wird der Magnet 44 (bevorzugt ein Stabmagnet 58) direkt in die Sammelflüssigkeit 40 getaucht. Der Magnet 44 ist beweglich montiert und von einer dehnbaren Membran 60 geschützt. Nachdem sich die Beads 10 an der Membran 60 angelagert haben, wird der Magnet 44 in ein neues Gefäß 62 mit geringem Flüssigkeitsvolumen eingetaucht. Der Magnet 44 wird entfernt und die Beads 16 können sich von der Membran 60 ablösen. Durch Verwendung von Ultraschall, der auf den Stabmagnet übertragen wird, kann eine Ablösung der Beads erleichtert werden. Auch durch den Gebrauch eines externen Ultraschallgeräts ist ein erleichtertes Ablösen der Beads möglich.
Der in 3, 3a gezeigte Airsampler 30 weist zwei Bauteile auf, ein Sammelgefäß – in Form des Sammelbehälters 36 – und einen Aufsatz mit Düsen – Düsenaufsatz 64. Durch den Einsatz einer Hub-Schwenkeinheit 66 kann der Sammelbehälter 36 automatisch vom Düsenaufsatz 64 abgetrennt und verschwenkt werden. Dadurch ist ein einfacher Zugang zur Sammelflüssigkeit 40 möglich.
6 zeigt das unter III.C. beschriebenen Verfahren in Kombination mit der Hub-Schwenkeinheit 66. Die Hub-Schwenkeinheit 66 kann jedoch ebenfalls in Kombination mit den unter III.A. bzw. III.B. beschriebenen Verfahren verwendet werden. Ein spezieller Auslasskanal 45 aus dem Sammelbehälter 36 ist dadurch nicht mehr erforderlich.
Nach der Anreicherung mit einem der oben beschriebenen Verfahren stehen die beadgebundenen Partikel 13 nun zur weiteren Analyse zur Verfügung. Sie werden zum Beispiel für eine molekularbiologische Detektion, insbesondere PCR oder Hybridisierung, weiter aufgeschlossen.
III.D Anreicherung und Dispensierung über zwei miteinander verbunden Mikroliterpipetten.
Beim Entnehmen der Flüssigkeit aus dem Sammelgefäß sind relativ große Volumina zu handhaben (z. B. 5 ml), während nach dem Aufkonzentrieren ein möglichst kleines Volumen (z. B. 20 μl) gehandhabt werden soll. Dies ist eine sehr große Bandbreite (Faktor 250) zwischen den Volumina. Es ist sehr schwierig, für beide Bereiche eine hohe Genauigkeit sicherzustellen. Dies kann durch die im folgenden erläuterte Lösung erreicht werden, von der ein Ausführungsbeispiel in 11 dargestellt ist.
11 zeigt eine alternative Ausführung der Dosiereinheit 41. Durch Verwendung einer Mikroliterpipette 140 mit verlängerter Pipettenspitze 142 und zwei Saugeinheiten 144, 145 für verschieden Volumenbereiche ist sowohl das Waschen der Beads 16 als auch ein genaues Pipettieren in kleinen Volumina möglich. Auch hier werden die Beads 16 beim Spülen an der Innenseite der Pipettenspitze durch einen außen hinzugeschwenkten Magneten 44 zurückgehalten. Das hier beschriebene Pipettiersystem 146 kann problemlos in das Gesamtsystem integriert werden. Auch ein Betrieb mit der Hub-Schwenkeinheit 66 ist möglich.
IV. Beschreibung des Gesamtsystems:
Die zuvor beschriebenen Konzepte zur Anreicherung können mit weiteren Elementen zu einem Gesamtsystem verbunden werden. Das in den 7 und 8 naher dargestellte Gesamtsystem bildet eine Vorrichtung 70 zur automatischen Detektion von insbesondere biologischen Partikeln und weist als Komponenten eine Sammeleinrichtung 72, eine Transferiereinheit 74, die Dosiereinheit 41, den Magneten 44, eine Gruppe 76 von Reservoiren, eine Antriebseinheit 78, eine Aufschlusseinrichtung 80, eventuell mit Temperierungseinheit 82, eine Detektionseinheit 84 und eine Steuerungseinheit 86 auf.
Diese möglichen Komponenten werden im folgenden näher erläutert.
IV.A. Sammeleinrichtung:
Als Sammeleinrichtung 72 ist bevorzugt der Airsampler 30, insbesondere ein Airsampler 30 von der Firma SKC (siehe 3 sowie Patente US 5,902,385 und US 5,904,752 ) oder der Firma Bertin eingesetzt. Der Airsampler 30 transferiert Partikel 13, insbesondere Mikroorganismen (Bakterien, Viren) und Toxine, aus der Gasphase in die Sammelflüssigkeit 40.
IV.B. Transferiereinheit:
Die Transferiereinheit 74 weist bevorzugt die Hub-Schwenkeinheit 66 auf. Da der bevorzugte Airsampler 30 modular aufgebaut ist, und insbesondere aus wenigstens zwei Bauteilen besteht, kann der Düsenaufsatz 64 abgetrennt und der Sammelbehälter 36 zur Anreicherungsposition transferiert werden. Hier können die paramagnetischen Beads 16 mit einem der in Abschnitt 3 beschriebenen Verfahren aufgenommen und angereichert werden.
IV.C. Dosiereinheit:
Die Dosiereinheit 41 ist bevorzugt als Spritze 42 ausgebildet. Mit der Dosiereinheit 41 wird die Sammelflüssigkeit 40 aufgezogen. Als Dosiereinheit 41 können auch die in III.C. oder III.D beschriebenen Konstruktionen dienen.
IV.D. Trenneinrichtung – Magnet
Der Magnet 44 dient als Trenneinrichtung dazu, die paramagnetischen Beads 16 in oder an der Dosiereinheit 41 zu konzentrieren. Damit lassen sich die Beads 16 von der sie umgebenden Flüssigkeit separieren.
IV.E. Gruppe von Reservoiren:
Die Gruppe 76 hat mehrere Reservoire (Gefäße) 91–98 mit unterschiedlichen Flüssigkeiten, die zur Prozessierung der Partikel 13 benötigt werden. Außerdem ist eine Ruheposition 99 vorgesehen. Insbesondere sind folgende Flüssigkeitsreservoire vorgesehen:

• Lösung mit paramagnetischen Beads (erstes Reservoir 91)
• Äquilibrierungslösung (zweites Reservoir 92)
• erste Aufschlusslösung (drittes Reservoir 93)
• zweite Aufschlusslösung (viertes Reservoir 94)
• Sammelflüssigkeit, z. B. Wasser (fünftes Reservoir 95)
• Reinigungslösung (sechstes Reservoir 96)
• Konservierungslösung (siebtes Reservoir 97)
• Abfallgefäß (achtes Reservoir 98)

Die Reservoire 91–98 sind bevorzugt – zusammen mit der Ruheposition 99 sowie der Sammeleinrichtung 72 – auf einer Linie ausgerichtet. Dadurch lässt sich die Dosiereinheit 41 zwischen den Reservoiren 91–98, eventuell der Ruheposition 99 und der Sammeleinrichtung 72 linear mittels eines einfach aufgebauten Linearantriebes 100 bewegen.
Außerdem kann dann das Gesamtsystem einfach erweitert oder verkleinert werden (je nach Einsatzzweck).
IV.F. bis IV.I. Antriebseinheit:
Die Antriebseinheit 78 weist die im folgenden unter F) bis I) erläuterten Antriebe auf:

F) einen Linearantrieb 100 mit Einheit 102 zur Aufnahme der Dosiereinheit 41 zur Ansteuerung aller Positionen (bevorzugt in nur einer Dimension, hier in X-Richtung);
G) eine erste Bewegungseinheit (erster Motor 104) zur Bewegung der Dosiereinheit 41 (bevorzugt zum Bewegen der Spritze 42) in Z-Richtung – erste Bewegung 112 –;
H) eine zweite Bewegungseinheit (zweiter Motor 106) zur Flüssigkeitsdosierung (bevorzugt zur Bewegung eines Spritzenkolbens 50) – zweite Bewegung 114 –; und
I) eine dritte Bewegungseinheit (dritter Motor 108) zum Annähern oder Entfernen des Magneten 44 (z. B. in Z-Richtung) – dritte Bewegung 116 –.

IV.J. Aufschlusseinrichtung:
Die Aufschlusseinrichtung 80 weist bevorzugt das oben genannte Ultraschallgerät 56, insbesondere in Form eines Ultraschallbads 110, für den mechanischen Aufschluss der Partikel, insbesondere Mikroorganismen, auf. Das Ultraschallbad 110 ist mit Flüssigkeit gefüllt, und die Dosierungseinheit 41 kann in diese Flüssigkeit eintauchen. In einer zweiten Funktion kann das Ultraschallbad 110, bei geringer Leistung, zur Resuspendierung der paramagnetischen Beads 16 verwendet werden.
IV.K. Aufschlusseinrichtung mit Temperierungseinheit und Temperierung der Reagenzien:
Die Aufschlusseinrichtung 86 weist in dem dargestellten Beispiel weiter eine erste Temperierungseinheit 82 auf, die gemeinsam oder separat mit dem Ultraschallbad 110 betrieben werden kann. Die Temperierungseinheit 82 dient zur Unterstützung biochemischer Verfahren zum Aufschluss der Partikel 13, insbesondere Mikroorganismen (z. B. enzymatischer Verdau). Auch thermische Aufschlussverfahren nahe des Siedepunkts sind mit der Temperierungseinheit möglich.
Für einen Betrieb des Gesamtsystems bei extremen Temperaturen ist eine Temperierung des Gesamtsystems vorgesehen. Insbesondere werden die Reagenzienreservoire 91–97, das Abfallgefäß 98 und der Sammelbehälter 36 temperiert. Dies ist z. B. durch eine in 8 beispielhaft als Heizspule angedeutete zweite Temperiereinheit 119 möglich.
IV.L. Detektionseinheit:
Die Detektionseinheit 84 ist am Ende der Prozesskette vorgesehen. Je nach Art der Probenaufbereitung können alle bekannten Analysemethoden in das Gesamtsystem integriert werden.
Nachfolgend werden die wichtigsten Methoden zum Nachweis und zur Analyse biologischer Moleküle genannt:

• PCR (Polymerase Chain Reaction),
• ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay),
• Hybridisierungsverfahren.

Eine genauere Beschreibung der Methoden findet sich in Abschnitt VI.
IV.M. Steuerungseinheit:
Die Steuerungseinheit 86 dient zur Steuerung und Überwachung des Gesamtsystems. Als Steuerungseinheit 86 ist beispielsweise ein Computer oder Datenverarbeitungsgerät vorgesehen, in dem die einzelnen Steuerungsschritte zur vollautomatischen Durchführung des Detektionsverfahrens in Form von Steuerungsbefehlen als Software gespeichert sind.
Gleichzeitig ist über die Steuerungseinheit 86 ein Datentransfer beispielsweise über das Internet (online) möglich. Der Datentransfer wird zum Abgleichen der Resultate über eine Datenbank oder zur Alarmgebung benutzt. Auch eine Steuerung des Gesamtsystems ist online möglich, so dass das System über größere Distanzen betrieben werden kann.
V. Extraktion und Aufbereitung:
In dem vorgestellten Gesamtsystem – Vorrichtung 70 – sollen je nach Detektionsmethode die angereicherten biologischen Partikel 13 aufbereitet und/oder aufgeschlossen werden. Eine Extraktion wäre für sämtliche molekularbiologischen Analysemethoden durchzuführen, um die Nukleinsäuren frei zugänglich zu machen. Eine Probe wird für die Vermessung verschiedener Parameter eingesetzt (anwendungsspezifisch). In dem Gesamtsystem können mehrere unterschiedliche Extraktionsmethoden gleichzeitig, hintereinander oder einzeln durchgeführt werden. Folgenden Extraktionsmethoden können in das Gesamtsystem integriert werden:

• chemische Aufschlussverfahren,
• mechanische Aufschlussverfahren und/oder
• biochemische Aufschlussverfahren.

V.A. Chemische Aufschlussverfahren:
Der chemische Aufschluss kann über chaotrope Salze, insbesondere Guanidinium hydrochlorid oder Guanidiniumthiocyanat, erfolgen. Diese werden mit dem dargestellten System automatisch in die Dosiereinheit 41 (vorzugsweise Spritze 42) aufgenommen, um die an den Beads 16 haftenden Partikel 13 aufzuschließen.
V.B. Mechanische Aufschlussverfahren:
Sowohl der Aufschluss über Ultraschall als auch über Hitze ist sehr effektiv. Hierzu könnte in das Gesamtsystem das Ultraschallgerät 56, 110 und/oder ein Heizmodul – Temperierungseinheit 82 und/oder 119 – integriert werden. Auch eine Extraktion über Scherkräfte (Glasbeads oder Gewebehomogenisator) kann in dem Gesamtsystem verwirklicht werden. Für diese besondere Art des Aufschlusses werden die beladenen Beads 16 in einen speziellen Homogenisator überführt, und durch Reibungskräfte zwischen den Glasbeads oder der Homogenisatorwand kann ein effektiver Aufschluss erfolgen.
V.C. Biochemische Aufschlussverfahren
Eine sehr erfolgreiche Methode zum Aufschluss biologischer Partikel 13 ist die biochemische Extraktion. Bei der biochemischen Extraktion können Enzyme, insbesondere Proteasen und RNAsen, zum Einsatz kommen. Sehr häufig wird für den Zellaufschluss Proteinase K und für den Bakterienaufschluss Lysozym verwendet.
VI. Detektion:
Für die Detektion biologischer Partikel 13 sind eine Vielzahl von Detektionsmethoden etabliert worden. In dem vorgestellten Gesamtsystem – Vorrichtung 70 – kann je nach Bedarf eine oder mehrere der hier vorgestellten Methoden integriert werden. Entscheidend für den Analyt-Nachweis ist die Messung von definierten Panels entsprechend der Anwendungsgebiete. Auch kann das Gesamtsystem für noch völlig unbekannte Methoden umgerüstet werden.
Nachfolgend werden die Detektionsmethoden vorgestellt, die für eine Integration in das Gesamtsystem am wahrscheinlichsten sind:

• PCR bzw. Real time PCR,
• ELISA oder andere immunologische Methoden und/oder
• Hybridisierungsverfahren.

VI.A. PCR bzw. Real time PCR:
Die PCR-Methode (Polymerase Chain Reaktion) ist ein Verfahren, mit dem in einer Kettenreaktion kleinste Mengen eines DNA-Abschnitts vervielfältigt werden können (Amplifikation). Die PCR-Methode wird heute sehr oft eingesetzt, wenn anhand bestimmter DNA-Sequenzen Nachweise geführt werden sollen, so z. B.:

• in der Forensik oder beim Vaterschaftstest,
• in der Mikrobiologie zur Detektion von Mikroorganismen (Bakterien und Viren),
• in der medizinischen Diagnostik, wenn im Blut Viren-DNA oder -RNA nachzuweisen ist, oder
• in der Evolutionsbiologie, um Verwandtschaftsbeziehungen und Abstammungslinien zu verfolgen.

Um einen PCR-Nachweis führen zu können, müssen zwei kurze DNA-Stücke (Primer) vorhanden sein, die zu dem gesuchten DNA-Strang passen. Die von ihnen aus gestartete Kettenreaktion durchläuft bis zu 40 Zyklen, in denen die DNA-Menge jeweils verdoppelt wird. Durch die Verwendung spezieller fluoreszierender Probes (= Oligonukleotide) kann die Reaktion direkt beobachtet und quantitativ erfasst werden. Diese Sonderform der PCR wird als Real time PCR bezeichnet und dient einer sehr schnellen Detektion.
Eine weitere Sonderform der PCR ist die reverse Transkription. Dieses Verfahren wir sehr häufig für die Detektion von Viren verwendet. Da die meisten Viren RNA anstatt DNA als Erbgut besitzen, ist eine Übersetzung (reverse Transkription) der RNA in DNA zwingend notwendig. Nach der reversen Transkription kann dann die eigentliche Detektion über eine normale PCR oder Real time PCR erfolgen.
VI.B ELISA
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ist ein verbreitetes Verfahren, um spezifisch Proteine oder andere Makromoleküle (Antigene) nachweisen zu können. Dabei nutzt man die Mechanismen des Immunsystems: Wird eine Substanz vom Immunsystem als fremd erkannt, bildet es Antikörper, die an das fremde Molekül andocken und es so markieren. Diese so genannte Antikörper-Antigen-Interaktion wird für den ELISA-Test genutzt. Soll ein bestimmtes Protein nachgewiesen werden, müssen die dazu passenden Antikörper bekannt sein und zuvor mit verschiedenen gentechnischen oder zellbiologischen Verfahren hergestellt worden sein. Ist dann in einer Probe das gesuchte Protein vorhanden, bindet es an die auf einem Trägermedium immobilisierten Antikörper. Nach der Antigen-Antikörper-Interaktion wird eine von Enzymen gesteuerte Reaktion ausgelöst, die zu einem sichtbaren Signal (Farbreaktion, Fluoreszenz oder Chemolumineszenz) führt. ELISA-Tests sind heute in der medizinischen Diagnostik weit verbreitet. Sie werden aber auch in vielen anderen Bereichen genutzt, wenn spezielle Proteine oder biologische Toxine nachzuweisen sind. Im Falle einer Bakterien- oder Virendetektion wird die spezifischen Oberflächenproteine von dem Antikörper erkannt.
VI.C Hybridisierungsverfahren
Eine DNA-Doppelhelix kann man sich als einen „Reißverschluss” vorstellen (9). Die „Zähne” dieses Reißverschlusses sind die Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T). Die Information, die die DNA enthält, ist verschlüsselt in der Reihenfolge dieser vier Buchstaben entlang des „Reißverschlusses”.
Gegenüberliegende „Zähne” bilden dabei immer nur entweder AT- oder GC-Paare. Die Sequenz ACGCT etwa hat als komplementäres Gegenüber die Buchstabenfolge TGCGA. Durch Erhitzen wird der „Reißverschluss” geöffnet, so dass Einzelstränge vorliegen. Kurze, ebenfalls einzelsträngige DNA-Stücke, so genannte Sonden, können nun ihr passendes Gegenstück auf dem langen Einzelstrang finden. Beim Abkühlen binden diese Sonden an der passenden Stelle, man spricht dann von Hybridisierung. Man kann dies anhand von Markierungen (z. B. durch einen Fluoreszenzfarbstoff) sichtbar machen. Auf diese Weise kann herausgefunden werden, ob spezifische Sequenzen, die z. B. für bestimmte Gene stehen, in der untersuchten DNA vorhanden sind oder nicht. Sehr bekannte Hybridisierungsverfahren sind die in-situ-Hybridisierung, insbesondere Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), und Hybridisierung auf Microarrays.
VII. Beispiel für einen Ablaufplan des Gesamtsystems für eine Immundetektion (ELISA):
Im folgenden wird am Beispiel der ELISA-Methode ein Ablaufplan für die Druchführung eines Detektionsverfahrens zum Nachweis von Partikeln in einem Fluid – insbesondere Luft – näher erläutert. Anhand dieses Ablaufplanes und seiner Teilsequenzen kann der Fachmann leicht die Steuerungseinheit 86 entsprechend ausbilden, beispielsweise durch Programmierung.
Der dargestellte Ablaufplan für das Gesamtsystem beinhaltet mehrere Teilabschnitte (A–E, siehe unten), die für eine Immunodetektion (ELISA) benötigt werden. In diesen Teilabschitten werden Grundbefehle ausgeführt, mit deren Hilfe das Gesamtsystem die entsprechenden Positionen einnehmen kann.
Nachfolgend sind zunächst alle Grundbefehle und alle Positionen aufgeführt:
Grundbefehle

– Spritze ↑; ↓
– Kolben ↑; ↓
– go to Pos →; ← (gehe zu)
– Magnet on ←; Magnet off →
– Hub. Schwenkeinheit ↔ ↑; Hub.-Schwenkeinheit ↓ ↔.
– Airsampler on/off (Airsampler 30 an/aus)
– Ultraschallbad on/off (d. h. an/aus)
– go to Pos. X (gehe zu Position X)
– [Detektionseinheit on/off]
– [Temperatur on/off]

Positionen (Pos.):
Die im folgenden wiedergegebenen Positionen können durch den Linearantrieb 100 angefahren werden:

– Pos. Hub.-Schwenkeinheit
– Pos. Ruheposition
– Pos. mag. Beads
– Pos. Äquilibrierung
– Pos. Aufschluss 1
– Pos. Aufschluss 2
– Pos. H₂O
– Pos. Reinigung
– Konservierungslösung
– Pos. Abfall
– Pos. Ultraschallbad
– Pos. Detektionseinheit

VII.A. Äquilibrieren des Systems:
Die folgenden Schritte werden zur Äquilibrierung durchgeführt. Dabei sind die durch die Steuerungseinheit 86 automatisch abgegebenen Befehle aufgeführt.

1) Gerät steht in Ruheposition; Spritze ist mit Konservierungslösung befüllt. Spritze in Pos. Ruheposition.
2) Entleeren der Konservierungslösung in den Abfall. Spritze ↑; go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓↑↓.
3) Spülen mit H₂O, 3 × 5 mL: Spritze ↑; go to Pos. H₂O←; Spritze ↓; Kolben ↑. Spritze ↑; go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓. Spritze ↑; go to Pos. H₂O←; Spritze ↓; Kolben ↑. Spritze ↑; go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓. Spritze ↑; go to Pos. H₂O←; Spritze ↓; Kolben ↑. Spritze ↑; go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓.
4) Spülen mit Äquilibrierungslösung, 3 × 5 mL: Spritze ↑; go to Pos. Äquilibrierungslösung ←; Spritze ↓; Kolben ↑. Spritze ↑; go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓. Spritze ↑; go to Pos. Äquilibrierungslösung ←; Spritze ↓; Kolben ↑. Spritze ↑; go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓. Spritze ↑; go to Pos. Äquilibrierungslösung ←; Spritze ↓; Kolben ↑. Spritze ↑; go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓.
5) Spritze geht zurück in Ruheposition: Spritze ↑; go to Pos. Ruheposition ←.

VII.B. Beladen des Airsamplers mit magnetischen Beads 1 × 5 ml.
Zum Beladen des Airsamplers 30 werden folgende Befehle durch die Steuereinrichtung gesteuert ausgeführt:
Spritze ↑; go to Pos. mag. Beads ←; Spritze ↓; Kolben ↑↓↑.
Hub.-Schwenkeinheit ↓↔↑
Spritze ↑; go to Pos. Hub.-Schwenkeinheit ←; Spritze ↓; Kolben ↓.
Spritze ↑; go to Pos. Ruheposition ←; Spritze ↓.
VII.C. ”Sampling” und Detektion mit ELISA
Zum Sampling und zur Detektion werden folgenden Schritte mit den jeweils angegebenen Befehlsfolgen durchgeführt:

1) Sampling starten Hub.-Schwenkeinheit ↓↔↑. Airsampler on.
2) Sampling beenden Airsampler off. Hub.-Schwenkeinheit ↓↔↑.
3) Magnet an die Spritze: Magnet on ←
4) Magnetische Beads mit der Spritze aus dem Airsampler ziehen 1 × 5 mL Spritze ↑; go to Pos. Hub.-Schwenkeinheit ←; Spritze ↓; Kolben ↓↑↓↑.
5) 4 mL (von den 1 × 5 mL) in den Abfall. Spritze ↑; go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓
6) Magnet weg von der Spritze. Magnet off →.
7) Aufnahme von 4 mL Äquilibrierungslösung. Spritze ↑; go to Pos. Äquilibrierungslösung ←; Spritze ↓; Kolben ↑.
8) Magnet an die Spritze. Magnet on ←.
9) Einspritzen von 3 mL Äquilibrierungslösung in den Airsampler Spritze ↑; go to Pos. Hub.-Schwenkeinheit ←; Spritze ↓; Kolben ↓.
10) Wiederaufnahme der 3 mL Äquilibrierungslösung in die Spritze. Spritze ↑; Spritze ↑; Kolben ↓↑↓↑.
11) erste Wiederholung von Schritt 5–10.
12) zweite Wiederholung von Schritt 5–10.
13) Reduktion des Volumens auf 10 μL. Spritze ↑; go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓.
14) Magnet weg von der Spritze. Magnet off →.
15) 10 μL Beads in die Detektionseinheit; Spritze ↓; Kolben ↓↑↓↑↓.
16) Spülen der Spritze mit H₂O. Routine VII.A.3): Spülen mit H₂O, 3 × 5 mL. Spritze ↑; go to Pos. Ruheposition ←; Spritze ↓.
17) Starten der Detektion (ELISA) in der Detektionseinheit. Detektionseinheit on.

VII.D. Reinigen
Zum Reinigen werden die folgenden Schritte mit den angegebenen Steuerungsbefehlen durchgeführt:

1) Spülen der Spritze mit H₂O, 3 × 5 mL. Routine VII.A.3): Spülen mit H₂O, 3 × 5 mL.
2) Reinigen mit Reinigungsmittel, 3 × 5 mL. Spritze ↑ go to Pos. Reinigung →; Spritze ↓; Kolben ↑. Spritze ↑ go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓. Spritze ↑ go to Pos. Reinigung →; Spritze ↓; Kolben ↑. Spritze ↑ go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓. Spritze ↑ go to Pos. Reinigung →; Spritze ↓; Kolben ↑. Spritze ↑ go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓.
3) Spülen der Spritze mit H₂O 6 × 5 mL. Routine VII.A.3): Spülen mit H₂O, 3 × 5 mL Routine VII.A.3): Spülen mit H₂O, 3 × 5 mL Spritze ↑; go to Pos. Ruheposition ←; Spritze ↓.

E) Konservieren

1) Spülen mit H₂O, 3 × 5 mL.
2) Spülen mit Konservierungslösung 3 × 5 mL. Spritze ↑ go to Pos. Konservierung →; Spritze ↓; Kolben ↑. Spritze ↑ go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓. Spritze ↑ go to Pos. Konservierung →; Spritze ↓; Kolben ↑. Spritze ↑ go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓. Spritze ↑ go to Pos. Konservierung →; Spritze ↓; Kolben ↑. Spritze ↑ go to Pos. Abfall →; Spritze ↓; Kolben ↓. Spritze ↑ go to Pos. Ruheposition ←; Spritze ↓.

Abschluss des jeweiligen Samplings ist die Übergabe der Beads bzw. des Lysats in oder auf eine entsprechende Detektionseinheit 84. Insbesondere kann dies durch Injektion auf eine mikrofluidische Disk erfolgen.
Eine weitere Möglichkeit besteht im Aufbringen der Beads 16 auf eine Membran, bevorzugt auf einen mikromechanischen Filter (nicht dargestellt), dessen Oberfläche dann als Detektionsplattform genutzt werden kann. Die Detektion auf der Oberfläche eines mikromechanischen Filters wurde bereits in der deutschen Patentanmeldung 10 2006 026 559.5 sowie der 10 2007 021 387.7 ausführlich beschrieben. Ein verfeinertes Verfahren ist weiter Gegenstand einer parallel zu dieser Anmeldung am gleichen Tag eingereichten deutschen Patentanmeldung mit dem Titel „Optischer Partikelfilter sowie Detektionsverfahren”, bei der die Firma EADS Deutschland GmbH ebenfalls Anmelderin ist. Es wird für weitere Einzelheiten ausdrücklich auf die vorgenannten weiteren Patentanmeldungen verwiesen.
VIII. Weitere Alternativen und Anwendungen
VIII.A Anreicherung von Partikeln aus Flüssigkeiten
Durch geringfügige Modifikationen des hier vorgestellten Gesamtsystems ist auch eine Anreicherung von biologischen Partikeln aus Flüssigkeiten möglich. Hierzu wird, wie in 10 dargestellt, der Airsampler 30 durch eine Filtrationseinheit 120 ersetzt, die einen hohen Flüssigkeitsdurchsatz erlaubt.
Gezeigt ist die Konstruktion einer Flusszelle 122, die von zwei Membranen 124, 126 begrenzt wird. Die Porengröße der Membranen 124, 126 sollte so gewählt werden, dass die Partikel 13, insbesondere Mikroorganismen, passieren können, die paramagnetischen Partikel 16 jedoch zurückgehalten werden. Zwischen den Membranen 124, 126 befinden sich die paramagnetischen Beads 16, an die die Partikel 13 effektiv binden.
Um eine homogene Verteilung der paramagnetischen Beads 16 zu gewährleisten, befindet sich in der Flusszelle 122 ein Rührer 128 (Rotor), der mittels des Durchflusses 134 angetrieben wird.
Eine automatische Entnahme der Beads 16 erfolgt durch einen Verschluss in der Flusszelle 122, insbesondere durch ein Septum 130, das mit einer Injektionsnadel 132 durchstochen werden kann.
VIII.B. Verwendung alternativer Beads
Auch eine Verwendung nicht paramagnetischer Beads ist in dem Gesamtsystem denkbar. Eine Anreicherung der Beads nach dem „Air-Sampling” könnte anstatt mittels eines magnetischen Feldes über eine poröse Membran, bevorzugt einen mikromechanischen Filter, erfolgen. Dieser Filter würde die Beads zurückhalten, aber Flüssigkeiten passieren lassen. Demzufolge könnten sämtliche Wasch- und Detektionslösungen, die für eine Immunodetektion (ELISA) notwendig sind, über diesen mikromechanischen Filter gepumpt werden.
Beispiele für mikromechanische Filter sowie damit durchführbare Detektionsverfahren und für solche Filter aufweisende Detektionsvorrichtungen finden sich in der deutschen Patentanmeldung 10 2006 026 559.9 , der deutschen Patentanmeldung 10 2007 021 387.7 , sowie den beiden parallel zu der vorliegenden Patentanmeldung eingereichten deutschen Patentanmeldungen mit der Firma EADS Deutschland GmbH als (Mit-)Anmelderin mit den Titeln „Optischer Partikelfilter sowie Detektionsverfahren” und „Partikelfilter sowie Herstellverfahren hierfür”. Es wird für weitere Einzelheiten auf diese Patentanmeldungen verwiesen.
VIII.C. Verwendung von Beads mit Nukleinsäuren oder von Glasmilch
Eine weitere Möglichkeit zum Sampling von Mikroorganismen besteht in dem Einsatz von nukleinsäuregekoppelten Beads in dem Gesamtsystem. Hierzu werden die Mikroorganismen aus der Luft angereichert und aufgeschlossen (Extraktionsmethoden siehe oben). Nach der Extraktion werden die mit Nukleinsäuren beschichteten Beads zu dem Lysat gegeben und das Erbgut der Mikroorganismen kann mit der Nukleinsäure auf den Beads hybridisieren. Auch eine unspezifische Bindung der extrahierten DNA an Glasmilch (Silica-Matrix) ist möglich. Hierzu wird nach der Zelllyse eine entsprechende Menge Glasmilch zu dem Lysat gegeben und die freigesetzte DNA kann unspezifisch an die Silica-Partikel binden.
VIII.D. Abtrennung des Antikörper-Antigen-Komplexes von den Beads
Bei bestimmten Detektionsmethoden (z. B. ELISA) besteht die Notwendigkeit, den Antikörper-Antigen-Komplex gemäß 1 von den Beads abzutrennen. Folgenden Abspaltungsmöglichkeiten können mit dem Gesamtsystem durchgeführt werden:

• Chemische Abspaltung durch Zerstörung der Biotin-Streptavidin Bindung
• Chemiche Abspaltung durch Verwendung von Sulfo-NHS-SS-Biotin
• Thermische Abspaltung durch Denaturierung im Bereich des Siedepunkts
• Biochemische Abspaltung durch Verwendung geeigneter Proteasen (z. B. Papain)
• Physikalische Abspaltung durch Lichteinwirkung. Voraussetzung hierfür ist die Verwendung eines lichtsensitiven Biotin-Linkers, der bei Licht bestimmter Wellenlänge zerfällt.

Eine anschließende Detektion könnte dann über die klassischen molekularbiologischen Methoden (PCR oder Hybridisierung, siehe oben) erfolgen.
VIII.E. Integration anderer Airsampler
In dem hier vorgestellten Gesamtsystem wurde der Airsampler der Firma SKC integriert. Der flexible und modulare Aufbau des Gesamtsystems lässt jedoch auch die Integration anderer Airsamplertypen zu (siehe Publikation Hogan et al. 2005). Folgende Airsamplertypen wären für eine Integration in das Gesamtsystem gleichfalls geeignet:

• AGI-30 (all-glas-impinger)
• Frit bubbler oder
• Coriolis Air Sampler (Firma Bertin).

VIII.F Automatisches Reinigen/Desinfizieren
Ein vollautomatisches Reinigungs- und Desinfizierprogramm kann in dem Gesamtsystem etabliert werden. Sämtliche denkbaren Reinigungs- und Desinfizierungslösungen können in dem robusten System Verwendung finden. Bevorzugterweise können folgende Lösungen zum Einsatz kommen:

• Säuren,
• Laugen,
• Detergentien und/oder
• Alkohole.

Dazu werden alle Komponenten des Airsamplers 30 automatisch gereinigt, indem die Lösungen zugefügt werden. Anschließend ist ein Spülschritt möglich. Durchgeführt wird dies durch ein Fluidiksystem, das die Reagenzien zur Verfügung stellt, auf- bzw. einbringt und anschließend wieder aufnimmt.
Neben der Reinigung des Airsamplers und des gesamten fluidischen Systems durch die oben genannten Flüssigkeiten, wird das System durch UV-Bestrahlung desinfiziert. Hierzu sind über dem System mehrere UV-Röhren angebracht, die das Gesamtsystem in einem relativ kurzen Zeitraum sterilisieren.
VIII.G Anwendungen des Gesamtsystems
Dem Gesamtsystem eröffnen sich mannigfaltige Anwendungen. Folgende Anwendungsmöglichkeiten sind denkbar:

• medizinische Anwendungen in der Diagnostik, insbesondere eine schnelle Detektion von infektionskrankheits-Erregern aus Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Speichel, Tränenflüssigkeit und Urin;
• militärische Anwendungen, insbesondere Integration des Gesamtsystems in militärische Fahrzeuge, Schiffe, U-Boote und Fluggeräte;
• Anwendung als ein mobiles System in allen militärischen und zivilen Bereichen;
• Anwendung im Bereich „Homeland Security”, insbesondere zur Abwehr terroristischer Anschläge mit Biowaffen;
• Detektion von Sprengstoffen, insbesondere zur Abwehr terroristischer Anschläge;
• Detektion diverser Betäubungsmitteln und Drogen, insbesondere im Einsatz bei Polizei, Bundespolizei und Bahnpolizei;
• zivile Anwendungen, insbesondere bei der Lebensmittelüberwachung, Trinkwasserüberwachung und in der Baubiologie (Raumluft-Überwachung);
• Anwendungen in der Luft- und Raumfahrt, insbesondere bei der Kontrolle des Bordwassers und der Kabinenluft sowie in Verbindung mit Weltraummissionen insbesondere zum Aufspüren extraterrestrischen Lebens.

Bezugszeichenliste

10: Antikörper
11: Mittelachse
12: Antigene
13: Partikel (insbesondere Mikroorganismus)
14: Oberfläche
15: Tangente
16: Bead
18: Biotin
20: Streptadivin
22: F_C-Domain
24: Phagenprotein
26: Bakterium
30: Airsampler
32: Einlass
34: Auslass
36: Sammelbehälter
38: Tangentialdüsen
39: Luftstrom
40: Sammelflüssigkeit (Anreicherungsflüssigkeit)
41: Dosiereinheit
42: Spritze
43: Dosiervolumen
44: Magnet
45: Auslasskanal
46: Außenwand
48: Innenwand
50: (hohler) Spritzenkolben
52: Magnetkolben
54: Kolbenboden
56: Ultraschallgerät
58: Stabmagnet
60: Membran
62: weiteres Gefäß
64: Düsenaufsatz
66: Hub-Schwenkeinheit
70: Vorrichtung (Gesamtsystem)
72: Sammeleinrichtung
74: Transferiereinheit
76: Gruppe von Reservoiren
78: Antriebseinheit
80: Aufschlusseinrichtung
82: Temperiereinheit
84: Detektionseinheit
86: Steuerungseinheit
91: erstes Reservoir (Beads; Lösung mit paramagnetischen Beads)
92: zweites Reservoir (Äquilibrierungslösung)
93: drittes Reservoir (erste Aufschlusslösung)
94: viertes Reservoir (zweite Aufschlusslösung)
95: fünftes Reservoir (Sammelflüssigkeit, zum Beispiel Wasser, H₂O)
96: sechstes Reservoir (Reinigungslösung)
97: siebtes Reservoir (Konservierungslösung)
98: Abfallgefäß
99: Ruheposition
100: Linearantrieb
102: Einheit zur Aufnahme der Dosiereinheit
104: erster Motor
106: zweiter Motor
108: dritter Motor
110: Ultraschallbad
112, Z1: erste Bewegung (Spritze in Z-Richtung)
114, Z2: zweite Bewegung (Spritzenkolben in Z-Richtung)
116, Z3: dritte Bewegung (Magnet in Z-Richtung)
118: Rückstrom zur Pumpe
120: Filtrationseinheit
122: Flusszelle
124: Membran
126: Membran
128: Rührer
130: Septum (Verschluss)
132: Injektionsnadel
134: Durchfluss
140: Mikroliterpipette
142: Pipettenspitze
144: erste Saugeinheit
145: zweite Saugeinheit
146: Pipettiersystem

Claims

Vorrichtung (70) zur automatischen Detektion von Partikeln (13) mit einer Einrichtung zum Verbinden der Partikel (13) mit selektiv an die Partikel anbindbaren Trennpartikelkörpern, einer Trenneinrichtung zum Extrahieren der Trennpartikelkörpern (16) mit angebundenen Partikeln (13) aus einer Sammelflüssigkeit (40) und einer Detektionseinheit (84) zum Erfassen einer Anzahl und/oder Konzentration der derart getrennten Partikel (13), dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Dosiereinheit (41), die automatisch gesteuert mit vorbestimmten Volumen befüllbar ist und die zum Befüllen einer Sammeleinrichtung (72) mit Sammelflüssigkeit (40) ausgebildet ist, aufweist, dass die Einrichtung zum Verbinden der Partikel (13) mit den Trennpartikelkörpern die Sammeleinrichtung (72) zum Sammeln der Partikel (13) aus einem zu untersuchenden Partikel-Fluidgemisch (39, 134) ist, die durch das Partikel-Fluidgemisch durchströmbar ist und automatisch mit einer mit den Trennpartikeln (16) versetzten Sammelflüssigkeit (40) befüllbar ist, wobei die Dosiereinheit (41) die Trenneinrichtung aufweist, welche derart automatisch schaltbar ausgebildet ist, dass Trennpartikelkörper (16) wahlweise in der Dosiereinheit festgehalten werden oder mit dem dosierten Volumen ausgeschieden werden.
Vorrichtung (70) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (70) zur automatischen Detektion von biologischen Partikeln wie Mikroorganismen ausgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosiereinheit (41) eine Spritze (42) oder Pipette aufweist.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosiereinheit (41) mittels einer Antriebseinheit (78) zwischen der Sammeleinrichtung (72) und der Detektionseinheit (84) automatisch gesteuert bewegbar ist.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Gruppe (76) von Reservoiren für unterschiedliche Mittel zur Durchführung unterschiedlicher Schritte des Detektionsvorganges.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Gruppe (76) von Reservoiren eine Einrichtung zum Entsorgen von Abfällen, insbesondere ein Abfallgefäß (98), zugeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 4 und nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosiereinheit (41) mittels der Antriebseinheit (78) wählbar zu unterschiedlichen Reservoiren (91–99) der Gruppe (76) von Reservoiren bewegbar ist, um Mittel aufzunehmen oder abzugeben.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Gruppe (76) von Reservoiren, insbesondere inklusive Entsorgs- und Abfällenreservoiren (98), temperierbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Sammelbehälter (36) automatisch befüllbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Dosiereinheit (41) mittels der Antriebseinheit (78) zur automatischen Befüllung des Sammelbehälters (36) antreibbar ist.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch wenigstens einen steuerbaren Motor (104, 106, 108) zum Antreiben einer Dosiereinheit (41) zur dosierten Aufnahme und Abgabe von Flüssigkeiten.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trenneinrichtung zum Zusammenwirken mit paramagnetischen Beads (16) als Trennpartikelkörper einen automatisch gesteuert schalt- oder bewegbaren Magneten (44) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Magnet (44) an einer Wandung einer Dosierkammer (43) der Dosiereinheit (41) und/oder an einem Kolbenboden (54) eines Kolbens (50, 52) der Dosiereinheit (41) angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Magnet (44) ein Permanentmagnet ist, der durch einen automatisch gesteuerten Motor wahlweise in eine erste Position zum Festhalten der Beads (16) und in eine zweite Position zum Loslassen der Beads (16) bewegbar ist.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trenneinrichtung einen mikromechanischen Filter mit Poren aufweist, deren Durchmesser größer als der Durchmesser der Partikel (13), aber kleiner als der Durchmesser der einzusetzenden Trennpartikelkörper (16) ist.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sammeleinrichtung (72) eine insbesondere durch einen Airsampler (30) gebildete Gassammeleinrichtung zum Überführen der Partikel (13) aus einem mit den Partikeln beladenen Gas in eine Sammelflüssigkeit (40) aufweist, wobei die Sammelflüssigkeit (40) mit den Trennpartikelkörpern (16) beladen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Gassammeleinrichtung (30) wenigstens eine in die mit den Trennpartikelkörpern (16) beladene Sammelflüssigkeit (40) eintauchende Düse (38) aufweist, durch die das mit Partikeln (13) beladene Gas (39) in die Sammelflüssigkeit (40) diese aufwirbelnd einleitbar ist.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sammeleinrichtung (72) einen separaten Sammelbehälter (36) zur Aufnahme der mit Trennpartikelkörpern (16) beladenen Sammelflüssigkeit hat, der mittels einer Transferiereinheit (74) automatisch zwischen einer Sammelposition, in der das Partikel-Fludigemisch (39) durch die Sammelflüssigkeit (40) leitbar ist, und einer Be-/Entladeposition zwecks Aufnahme der Sammelflüssigkeit (40) und/oder Entnahme von Proben bewegbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Transferiereinheit (74) eine Hub-Schwenkeinheit (66) zum Anheben und Senken und zum Verschwenken zwischen den wählbaren Positionen für den Sammelbehälter (36) aufweist.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sammeleinrichtung (72) eine Filtriereinheit (120) mit einer mittels Membranen (124, 126) abgetrennten, die Trennpartikelkörper (16) beinhaltende Flusszelle (122) aufweist, durch die ein Partikel-Flüssigkeitsgemisch (134) leitbar ist, wobei die Membranen (124, 126) durchlässig für die Partikel (13) und undurchlässig für die Trennpartikelkörper (16) sind.
Verfahren zum automatischen Detektieren Partikeln in einem Partikel-Fluidgemisch, durchführbar mit einer Vorrichtung (70) nach einem der voranstehenden Ansprüche, mit: – einem Sammel- und Reaktionsschritt, in dem die biologischen Partikel (13) in einer Sammelflüssigkeit (40) gesammelt werden, die mit sich an bestimmte zu detektierende Partikel (13) anbindende Trennpartikelkörpern (16) beladen ist, so dass sich die Trennpartikelkörper simultan zum Sammeln der Partikel an die Partikel (13) anbinden, – einem Extraktions- und Anreicherungsschritt in einer Dosiereinheit, die dosiert mit der mit den Partikeltrennkörpern und den daran gebundenen zu detektierenden Partikeln (13) beladenen Sammelflüssigkeit (40) und mit flüssigen Mitteln zum Extrahieren und Anreichern der Partikeltrennkörper (16) befüllt wird, in dem die Trennpartikelkörper (16) mit den daran angebundenen zu detektierenden Partikeln (13) von der Sammelflüssigkeit (40) getrennt und in einem wesentlich kleinerem Volumen angereichert werden, wobei in der Dosiereinheit (41) die Partikeltrennkörper (16) mittels Schalten einer Trenneinrichtung (44) festgehalten werden, während Flüssigkeit aus der Dosiereinheit (41) abgegeben wird, und – einem Detektionsschritt zum Erfassen der Anzahl und/oder der Konzentration der separierten Partikel (13).
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Verfahren zum automatischen Detektieren von biologischen Partikeln ist.