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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufkonzentrieren mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit, z.B. Wasser oder Abwasser, sowie eine Konzentrator-Einheit zur automatisierten Aufkonzentrierung mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur automatisierten online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz mittels molekulargenetischer Methoden in einer Probeflüssigkeit, z.B. Wasser oder Abwasser, und ein Online-Analysegerät zur Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz mittels molekulargenetischer Methoden in einer Probeflüssigkeit.
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Die Detektion biologischer Parameter spielt in der Prozessindustrie, beispielsweise bei der Überwachung und Reinigung von Industriewasser oder Klärwasser, in der Lebensmittelproduktion und im Pharma- und Lifescience-Bereich, beispielsweise bei der Überwachung von in Fermentoren durchgeführten biotechnologischen Prozessen, eine zunehmend wichtige Rolle. Zu detektierende bzw. zu überwachende Zielsubstanzen können beispielsweise Viren, Bakterien sowie Plasmid-assoziierte bakterielle Resistenzgene sein.
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Der Nachweis solcher biologischer Zielsubstanzen in Flüssigkeiten kann mit molekulargenetischen Methoden erfolgen, vorzugsweise mittels Amplifizierungstechniken wie PCR oder Real Time PCR. Hierzu werden Proben der zu analysierenden Flüssigkeit genommen und in spezialisierten Laboren, die über die notwendigen Gerätesysteme verfügen, analysiert. Zur automatisierten Probennahme aus Prozessen, z.B. aus Klärbecken, Fermentern, Produktionsgefäßen oder Leitungen, sind manuell handhabbare oder automatische Probennahmevorrichtungen und Probensammler bekannt. Die gesammelten Proben werden in der Regel zur weiteren Analyse in ein Labor transportiert, wo die Extraktion der Proben-Nukleinsäuren und der spezifische und gegebenenfalls quantitative Nachweis der biologischen Zielsubstanz manuell oder zumindest in Teilen automatisiert durchgeführt wird.
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Beispielsweise im Bereich der Wasser- und Abwasseranalyse sind Online-Analysegeräte bekannt, die eine Probennahme und eine quantitative Bestimmung eines, meist anorganischen, Analyten in der Probe vollständig automatisiert durchführen. Eine solche Online-Analyse kann kontinuierlich oder auch diskontinuierlich durchgeführt werden.
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Aus
US 2015/0224502 A1 ist ein Probensammel-Gerät für die Durchfluss-Probennahme in Gewässern bekannt. Das Gerät weist mehrere Durchfluss-Probenkartuschen auf, die dazu eingerichtet sind, Wasser aus dem zu überwachenden Gewässer aufzunehmen und gegebenenfalls Proben von Bestandteilen der Flüssigkeit oder von Feststoffen in einem Filter- oder Adsorptionsmedium zurückzuhalten, während das aufgenommene Wasser wieder aus den Kartuschen in das Gewässer zurückgeleitet wird. Die Proben können entweder für eine spätere Laboranalyse aufbewahrt werden oder direkt in dem Gerät analysiert werden. Hierzu können beispielsweise an dem Filter- oder Adsorptionsmedium adsorbierte biologische Substanzen als Lysat freigesetzt werden und einem Analysemodul zur weiteren Analyse, z.B. mittels qPCR, zur Verfügung gestellt werden.
Bei geringen Konzentrationen der Zielsubstanzen in der zu analysierenden Flüssigkeit stellt sich das Problem, bei der Probennahme einerseits eine für die anschließende Analyse ausreichende Menge der Zielsubstanz zur Verfügung zu stellen. Bei einer Durchfluss-Probennahme wie sie in
US 2015/0224502 A1 beschrieben ist, können auch in geringen Konzentrationen im Wasser vorliegende gelöste Substanzen oder Feststoffe durch Durchleiten eines entsprechend großen Wasservolumens im Filtermedium zurückgehalten werden. Dies ist jedoch nur praktikabel, wenn die zu analysierende Flüssigkeit nach der Probe wieder ohne Einschränkungen zurück in das Medium geleitet werden kann, wie dies z.B. bei der Gewässeranalyse der Fall ist. Bei der Überwachung von Prozessen, z.B. in der Wasseraufbereitung, der Lebensmittelindustrie oder im Pharmabereich ist eine Wiedereinleitung der entnommenen Flüssigkeit oft nicht möglich. Hier besteht Bedarf nach einem Verfahren zur effizienten Aufkonzentration von zu detektierenden Probenbestandteilen, das es ermöglicht, das aus dem Prozess für die Analyse zu entnehmende Flüssigkeitsvolumen gering zu halten.
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Ein weiterer Nachteil des in
US 2015/0224502 A1 beschriebenen Geräts besteht darin, dass die in dem Filter- oder Adsorptionsmedium zurückgehaltene Substanz durch Lyse und Elution aus dem Filter- oder Adsorptionsmedium in das Analysemodul geleitet wird. Hierbei ist zum einen zu erwarten, dass nur ein verhältnismäßig geringer Anteil der Zielsubstanz aus dem Filter- oder Adsorptionsmedium in das Analysemodul gelangt, zum anderen ist zum Ausspülen des Filters ein gewisses Mindestvolumen an Flüssigkeit erforderlich, so dass die in das Analysemodul gelangende Lösung ein verhältnismäßig großes Volumen bei einer entsprechend geringen Konzentration der Zielsubstanz aufweist.
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Die Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte automatisierte Online-Detektion einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit zu ermöglichen und ein verbessertes Verfahren bzw. eine verbesserte Vorrichtung zur automatisierten Online-Detektion einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit anzugeben. Insbesondere sollen das Verfahren und die Vorrichtung eine effiziente Aufkonzentrierung der Zielsubstanz und eine verlustarme Weiterleitung der Probeflüssigkeit mit der aufkonzentrierten Zielsubstanz in eine nachfolgende Detektionseinheit ermöglichen.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren zum Aufkonzentrieren mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit gemäß Anspruch 1, durch das Verfahren zur automatisierten online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit mittels eines Online-Analysegeräts gemäß Anspruch 14, durch die Konzentrator-Einheit zur automatisierten Durchführung einer Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit gemäß Anspruch 20 und durch das Online-Analysegerät zur Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit gemäß Anspruch 26. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
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Die Lösung basiert auf der Verwendung sogenannter Superabsorber, mit welchen jede wässrige Probeflüssigkeit bearbeitet werden kann, um die in der Probeflüssigkeit enthaltenen Biomoleküle aufzukonzentrieren.
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Superabsorber (Superabsorbent Polymers, SAP) werden Kunststoffe genannt, die in der Lage sind, ein Vielfaches ihres Eigengewichts an polaren Flüssigkeiten aufzusaugen. Dies sind vor allem Wasser bzw. wässrige Lösungen. Bei der Aufnahme der Flüssigkeit quillt der Superabsorber auf und bildet ein Hydrogel. Hydrogele können alle vernetzten Polymere bilden, die polar sind (z. B. Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidon, Amylopektin, Gelatine, Cellulose). Meist wird jedoch ein Copolymer aus Acrylsäure (Propensäure, H2C=CH-COOH) oder Natriumacrylat (Natriumsalz der Acrylsäure, H2C=CH-COONa) einerseits und Acrylamid andererseits verwendet, wobei das Verhältnis der beiden Monomere zueinander variieren kann. Zusätzlich wird ein so genannter Kernvernetzer (Core-Cross-Linker, CXL) der Monomerlösung zugesetzt, der die gebildeten langkettigen Polymermoleküle stellenweise untereinander durch chemische Brücken verbindet, auch als Vernetzen bezeichnet. Durch diese Brücken wird das Polymer wasserunlöslich. Dieses sogenannte Basispolymer wird eventuell einer sogenannten Oberflächen-Nachvernetzung, Surface-Cross-Linking (SXL) genannt, unterzogen. Dabei wird eine weitere Chemikalie auf die Oberfläche der Partikel aufgebracht, die durch Erwärmung ein zweites Netzwerk nur auf der äußeren Schicht des Korns knüpft. Diese Hülle stützt das aufgequollene Gel, um auch bei äußerer Belastung (Bewegung, Druck) zusammen zu halten.
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Das Produkt kommt beispielsweise herkömmlich als weißes Granulat mit Partikelgrößen von 100 - bis 1000 µm zum Einsatz. Es findet größtenteils in Babywindeln, Damenbinden, bei der Inkontinenzversorgung, in Verbandmaterial und in geringen Mengen auch in Kabelummantelungen für Tiefseeleitungen Verwendung. Weitere Anwendungsgebiete sind sogenannte Gelbetten, gelbildende Löschmittel in der Brandbekämpfung, als mechanischer Stabilisator für Schnittblumen in einer Vase oder als Zusatz für Pflanzenerde, um dauerhaft Wasser zu speichern. Hierbei kommt jedoch wegen der besseren Umweltverträglichkeit kalilaugeneutralisierte Acrylsäure zum Einsatz. In Form von kugelförmigen Partikeln ist die Verwendung von Superabsorbern unter Bezeichnungen wie „Wasserperlen“, „Aqua Beads“ oder „Water beads“ als Spielzeug bekannt. Hierbei handelt es sich um Superabsorber, welche in Form von Kugeln von variabler Größe (Submillimeter bis Zentimeter) kommerziell angeboten werden.
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Der hier beschriebenen Erfindung lag folgende unerwartete Beobachtung zu Grunde. Kommerziell verfügbare sog. Wasserperlen (kommerziell unter anderem unter den Bezeichnungen Aqua Beads, Water Beads, Wasserbeads, oder Gelperlen erhältlich) wurden einem Flüssigkeitsvolumen von 1 Liter zugegeben. Diese Wasserperlen sind aus einem Superabsorber-Material gebildet. Bei der Flüssigkeit handelte es sich um Oberflächenwasser, das einem Löschwasserteich mit Schwebstoffen entnommen worden war. Nach einer Inkubationszeit quollen die Kügelchen zu einem Vielfachen ihres ursprünglichen Volumens auf. Das Volumen des flüssigen Anteils des Gemisches aus der Flüssigkeit und den Wasserperlen reduzierte sich. Überraschenderweise zeigte sich, dass die Schwebstoffe der Flüssigkeit von den aufquellenden Kügelchen nicht aufgenommen wurden. Der flüssige Anteil des Gemisches einschließlich der Schwebstoffe (Volumen 400 ml) wurde in ein neues Gefäß überführt. Diesem flüssigen Anteil wurde eine Probe mit einem Volumen von 50 ml entnommen.
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Eine Vergleichsprobe mit einem Volumen von 50 ml wurde direkt aus der Flüssigkeit, d.h. dem erwähnten Oberflächenwasser, entnommen, ohne die Flüssigkeit zuvor nach dem beschriebenen Verfahren einzuengen. Beide Proben wurden bei 5000 x g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Sediment für eine Nukleinsäureextraktion eingesetzt. Die Nukleinsäureextraktion erfolgte mittels eines kommerziellen Kits (innuprep Stool DNA Mini Kit; IST Innuscreen GmbH). Die DNA von beiden Proben wurde dann mittels Real Time PCR auf die Menge an bakterielle Gesamtkeimzahl untersucht.
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Hierbei zeigte sich, dass in der unbehandelten Vergleichsprobe weniger Bakterien nachgewiesen wurden als in der mit dem Superabsorber eingeengten Probe. Dies bedeutet, dass die in der Flüssigkeit enthaltenen Bakterien nicht in die Wasserperlen aufgenommen wurde. Sie wurden aufkonzentriert und waren Bestandteil des verbliebenen flüssigen Anteils des Gemisches aus der Flüssigkeit und den Superabsorber-Kugeln. Diese Beobachtungen konnten nachfolgend auch für andere Biomoleküle (Viren oder eukaryotische Zellen) bestätigt werden: Nach Zugabe des Superabsorbers zu einem diese Biomoleküle enthaltenen Flüssigkeitsvolumen wurde das Volumen eingeengt und die Biomoleküle wurden in der verbleibenden Restflüssigkeit aufkonzentriert. Noch überraschender war, dass man mit dem beschriebenen Verfahren auch Proteine sowie freie genomische DNA, die sich in geringen Konzentrationen in einer wässrigen Lösung befinden, aufkonzentrieren kann.
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Auf der Basis dieser Beobachtung konnte die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe gelöst werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zum Aufkonzentrieren mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit umfasst:
- - Dosieren und Transportieren eines ersten initialen Volumens der Probeflüssigkeit über eine Flüssigkeitszuleitung in eine erste Konzentratorkammer einer Konzentrator-Einheit; und
- - Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit durch Reduzieren des ersten initialen Volumens der Probeflüssigkeit in der Konzentrator-Einheit und damit verbundenem Aufkonzentrieren von in dem ersten Volumen der Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen mittels einer ersten Menge eines Superabsorbers, wobei das Reduzieren und das damit verbundene Aufkonzentrieren durch Inkubieren eines aus dem ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mit der ersten Menge des Superabsorbers gebildeten Gemisches erfolgt.
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Die nach dem Inkubieren mit dem Superabsorber erhaltene, in ihrem Volumen reduzierte Probeflüssigkeit mit entsprechend erhöhter Konzentration der darin enthaltenen Biomoleküle bzw. der darin enthaltenen mindestens einen biologischen Zielsubstanz wird hier und im Folgenden auch kurz als „aufkonzentrierte Probeflüssigkeit“ bezeichnet.
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Indem das initiale Volumen der Probeflüssigkeit nach Inkubation mit dem Superabsorber-Material auf ein beliebig einstellbares Volumen reduziert wird, was mit dem Anstieg der Konzentration der biologischen Zielsubstanz im verbleibenden Volumen der Probeflüssigkeit einhergeht, kann ein, gegenüber dem im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, bei dem Biomoleküle nach Bindung an ein Filtermedium durch Ausspülen des Filtermediums freigesetzt werden, vergleichsweise hoher Anteil der aus dem ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit gewonnenen Biomoleküle in einem geringen Flüssigkeitsvolumen aufkonzentriert werden. Somit bewirkt das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur eine effiziente Aufkonzentrierung der zu bestimmenden Zielsubstanz in der Probeflüssigkeit, sondern ermöglicht es, auch bei einer niedrigen Konzentration der Zielsubstanz in der zu untersuchenden Probeflüssigkeit das für die anschließende Analyse bestimmte, z.B. aus einem Prozess zu entnehmende Volumen vergleichsweise gering zu wählen. Damit ist das Verfahren universell zur Überwachung von Flüssigkeiten in einer Vielzahl verschiedenartiger industrieller Prozesse geeignet, unabhängig davon, ob das in die Prozesseinheit transportierte Volumen der Probeflüssigkeit nach dem Anreichern verworfen und ggfs. entsorgt werden muss, oder ob es zurück in den Prozess gegeben werden kann.
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Die Zielsubstanz kann beispielsweise ein Biomolekül sein. Das Biomolekül kann ausgewählt sein aus der Gruppe gebildet aus: eukaryotischen Zellen, Bestandteilen von eukaryotischen Zellen, prokaryotischen Zellen, Bestandteilen prokaryotischer Zellen, subzellulären Vesikeln, Bakteriophagen, Viren oder Virusbestandteilen, Toxinen, Antikörpern, Nukleinsäuren und Proteinen.
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Als Probeflüssigkeit kommen beispielsweise jegliche wässrige Lösungen in Frage, z.B. Wasser- und Abwasserproben, Fermentationsflüssigkeiten, Flüssigkeiten aus lebensmitteltechnischen, chemischen, pharmazeutischen oder biochemischen Produktionsprozessen.
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Der Superabsorber kann einen Kunststoff umfassen, der Wassermoleküle unter Bildung eines Hydrogels aufnimmt. Der Superabsorber kann beispielsweise eines der oben genannten Materialien sein. Vorteilhaft nimmt der Kunststoff zwar Wasser oder andere polare Lösungsmittel-Moleküle, aber keine Biomoleküle, insbesondere nicht die Zielsubstanz, auf. Dies ist beispielsweise bei den oben genannten Materialien und bei den unter den Bezeichnungen „Wasserperlen“, „Aqua Beads“ oder „Water beads“ kommerziell erhältlichen Superabsorber-Kugeln der Fall. Der Superabsorber kann beispielsweise in Form von Partikeln, z.B. als Pulver, als Granulat oder in Form geometrischer Körper, insbesondere Kugeln, eingesetzt werden. Ein geeigneter Durchmesser der Partikel, insbesondere der Kugeln liegt bei 100 bis 5000 µm.
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Das Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit kann das Dosieren des ersten initialen Volumens der Probeflüssigkeit zu der in der ersten Konzentratorkammer vorgelegten ersten Menge des Superabsorbers oder das Dosieren der ersten Menge des Superabsorbers zu dem in der ersten Konzentratorkammer vorgelegten ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit umfassen.
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Das Inkubieren des aus dem ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mit der ersten Menge des Superabsorbers gebildeten Gemisches kann über eine vorgegebene, insbesondere wählbare, Zeitspanne ausgeführt werden. Generell ist die innerhalb einer Zeitspanne erreichbare Konzentrationserhöhung einer Zielsubstanz in der Probeflüssigkeit abhängig von der Art des Superabsorbers, von der Partikelgröße des Superabsorbers, von der Größe der zugegebenen ersten Menge des Superabsorbers, von der beim Inkubieren herrschenden Temperatur und von der Länge der gewählten Zeitspanne für die Inkubation. Die Zeitspanne, während der die Inkubation ausgeführt wird, kann mittels einer Steuerelektronik überwacht werden. In einer alternativen Ausgestaltung ist es auch möglich, das Volumen des flüssigen Anteils zu überwachen, und das Inkubieren zu beenden, wenn ein gewünschtes, vorgegebenes Zielvolumen erreicht ist.
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Die Konzentratorkammer und das darin enthaltene Gemisch können während des Inkubierens mittels einer Temperiervorrichtung der Konzentrator-Einheit temperiert werden. Die Temperiervorrichtung kann eine Heiz- und/oder Kühlvorrichtung sein, die automatisiert mittels einer Steuerelektronik zur Steuerung und/oder Regelung einer Temperatur des in der Konzentratorkammer vorliegenden Gemisches betrieben werden kann.
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Das Verfahren kann weiter den folgenden Schritt umfassen: nach dem Inkubieren Entnehmen mindestens eines Teils der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit aus der ersten Konzentratorkammer. Die entnommene Flüssigkeit kann direkt einer Detektionseinheit eines Analysegeräts zugeleitet werden. Alternativ kann, wie im Folgenden beschrieben, die aufkonzentrierte Probeflüssigkeit zunächst einem Sammelgefäß zugeführt werden. Dies erlaubt es, die Zielsubstanz in mehreren, z.B. einem Prozess oder einem Gewässer als Proben entnommenen, initialen Flüssigkeitsvolumina mittels des beschriebenen Verfahrens aufzukonzentrieren und für die weitere Detektion zusammenzuführen. Die zusammengeführten aufkonzentrierten Proben können optional erneut mittels des beschriebenen Verfahrens weiter aufkonzentriert werden. Dieses Vorgehen ist besonders vorteilhaft, wenn die Konzentration der Zielsubstanz in der ursprünglichen, unbehandelten Probeflüssigkeit besonders niedrig ist. Das Vorgehen wird im Folgenden genauer beschrieben.
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Die aus der Konzentrator-Kammer entnommene in einer ersten Stufe aufkonzentrierte Probeflüssigkeit kann zunächst in ein Sammelgefäß transportiert werden. Anschließend können Reste der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und die erste Menge des Superabsorbers aus der Konzentratorkammer entfernt werden, z.B. durch Spülen der Konzentratorkammer mit einem Spülfluid, z.B. einer Spülflüssigkeit oder einem Spülgas.
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Weiter kann das Verfahren folgende Schritte umfassen:
- - Dosieren und Transportieren eines zweiten initialen Volumens der Probeflüssigkeit über eine Flüssigkeitszuleitung in die erste Konzentratorkammer der Konzentrator-Einheit; und
- - Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit durch Reduzieren des zweiten initialen Volumens der Probeflüssigkeit in der Konzentrator-Einheit und damit verbundenem Aufkonzentrieren von in dem zweiten initialen Volumen der Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen mittels einer zweiten Menge des Superabsorbers, wobei das Reduzieren und das damit verbundene Aufkonzentrieren durch Inkubieren eines aus dem zweiten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mit der zweiten Menge des Superabsorbers gebildeten Gemisches erfolgt, und
- - Transportieren mindestens eines Teils der durch Reduzieren des zweiten initialen Volumens der Probeflüssigkeit erhaltenen aufkonzentrierten Probeflüssigkeit aus der ersten Konzentratorkammer in das Sammelgefäß.
Auf diese Weise können mehrere Chargen aufkonzentrierter Probeflüssigkeit erzeugt und im Sammelgefäß zusammengegeben werden. Dies ermöglicht es, eine sehr große Volumenmenge an Probe aufzukonzentrieren.
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Mindestens ein Teil der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit aus dem Sammelgefäß kann zur weiteren Aufkonzentrierung der Zielsubstanz mittels einer dritten Menge des Superabsorbers in die erste Konzentratorkammer oder in eine zweite, von der ersten Konzentratorkammer verschiedene, Konzentratorkammer dosiert und transportiert werden. Diese weitere Aufkonzentrierung erfolgt in ganz analoger Weise wie für die erste Aufkonzentrierung beschrieben, nämlich durch Erzeugen eines Gemisches aus der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und der dritten Menge des Superabsorbers und Inkubieren des Gemisches, wodurch sich das Volumen der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit erneut reduziert und die enthaltenen Biomoleküle, einschließlich die Zielsubstanz, weiter aufkonzentriert werden. Die so erhaltene weiter aufkonzentrierte Probeflüssigkeit kann in gleicher Weise erneut aufkonzentriert oder zur weiteren Analyse direkt einer Detektionseinheit eines Analysegeräts zugeleitet werden. Auf diese Weise kann die Sensitivität des Verfahrens weiter erhöht werden.
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Das Verfahren kann in all seinen voranstehend beschriebenen Varianten vorteilhafterweise vollständig automatisiert durch eine Steuerelektronik durchgeführt werden. Die Konzentrator-Einheit kann zu diesem Zweck Mittel zum Transport von Flüssigkeiten und zum Transport des Superabsorbers innerhalb der Konzentrator-Einheit aufweisen, die z.B. Pumpen und/oder Ventile umfassen können.
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Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur automatisierten online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit mittels eines Online-Analysegeräts. Dieses Verfahren umfasst:
- - Erzeugen von aufkonzentrierter Probeflüssigkeit aus mindestens einem ersten initialen Volumen der Probeflüssigkeit mittels des voranstehend beschriebenen Verfahrens zum Aufkonzentrieren mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit,
- - Transportieren mindestens eines Teils der erzeugten aufkonzentrierten Probeflüssigkeit aus der Konzentrator-Einheit in eine Detektionseinheit des Online-Analysegeräts, und
- - Qualitative oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und/oder in der Probeflüssigkeit, d.h. der ursprünglichen Probeflüssigkeit vor Aufkonzentrierung, mittels der Detektionseinheit und einer Steuerelektronik des Online-Analysegeräts.
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Die qualitative oder quantitative Bestimmung kann mittels molekulargenetischer Methoden erfolgen.
In einer solchen vorteilhaften Ausgestaltung umfasst das Verfahren weiter die folgenden Schritte:
- - Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen, insbesondere der mindestens einen biologischen Zielsubstanz, und Erzeugen einer die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Lösung,
- - Amplifizieren mindestens einer in der Lösung enthaltenen Ziel-Nukleinsäure, und
- - Erfassen eines Messsignals, das eine von dem Fortschritt der Amplifizierung und/oder von einer Anzahl von Kopien der Ziel-Nukleinsäure abhängige Messgröße repräsentiert, wobei die Steuerelektronik des Analysegeräts anhand des erfassten Messsignals die qualitative oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und/oder in der Probeflüssigkeit vor Aufkonzentrierung durchführt. Die zu amplifizierende Ziel-Nukleinsäure kann entweder die zu detektierende Zielsubstanz oder eine Nukleinsäure der zu detektierenden Zielsubstanz sein.
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In einer vorteilhaften Ausgestaltung wird das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen und das Erzeugen der die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Lösung in einer ersten Mikrofluidikeinheit der Detektionseinheit durchgeführt. Die Lösung wird in eine mit der ersten Mikrofluidikeinheit fluidisch verbindbare zweite Mikrofluidikeinheit transportiert, und das Amplifizieren und das Erfassen des Messsignals wird in der zweiten Mikrofluidikeinheit durchgeführt. Die erste und die zweite Mikrofluidikeinheit können in zwei voneinander getrennten Kartuschen oder in einer gemeinsamen Kartusche untergebracht sein.
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Das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen und das Erzeugen der die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Lösung kann mindestens folgende Schritte umfassen:
- - Versetzen der flüssigen Probe mit einem oder mehreren Lysereagenzien, um Nukleinsäuren der Biomoleküle freizusetzen,
- - Binden der freigesetzten Nukleinsäuren an ein Nukleinsäure bindendes Material; und
- - Waschen der gebundenen Nukleinsäuren mit einer Waschlösung, und
- - Ablösen der Nukleinsäuren von dem Nukleinsäure bindenden Material durch Eluieren.
Das hierbei erhaltene Eluat bildet in dieser Ausgestaltung die erwähnte, die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassende Lösung.
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In einer alternativen Ausgestaltung kann das Freisetzen und/oder Isolieren von Nukleinsäuren aus den in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen und das Erzeugen der die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassenden Lösung folgende Schritte umfassen:
- - thermisches Behandeln der in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomoleküle in einer Pufferlösung, beispielsweise in einer phosphatgepufferten Salzlösung, in Wasser, in einem Tris-Puffer oder in einem Puffer, der eine geringe Konzentration an einem Detergenz enthält. In diesem Fall bildet die Pufferlösung mit den durch die thermische Behandlung freigesetzten Nukleinsäuren die zuvor erwähnte, die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassende Lösung.
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Die thermische Freisetzung kann eine Dispergierung der Probe in der gepufferten Lösung und eine Inkubation umfassen. Diese Verfahrensvariante eignet sich beispielsweise für Anwendungen, in denen die zu bestimmende Zielsubstanz eine Nukleinsäure ist, die bereits frei in der zu analysierenden Flüssigkeit vorliegt. Bei dieser alternativen Verfahrensausgestaltung kann also eine klassische Lyse unterbleiben. Es ist auch möglich, das Verfahren anzuwenden, wenn die Zielsubstanz als Biomolekül ein Bakterium oder ein Virus ist. In diesem Fall können die in der Probe enthaltenene Biomoleküle thermisch/chemisch zerstört und die enthaltene Nukleinsäure freigesetzt werden.
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Die, beispielsweise in der zweiten Mikrofluidikeinheit durchgeführte, Amplifikation kann beispielsweise mittels herkömmlicher PCR-basierter Verfahren durchgeführt werden. Die qualitative oder quantitative Bestimmung der Zielsubstanz kann, in ebenfalls herkömmlicher Weise, durchgeführt werden, indem mittels eines Sensors zu einem bestimmten Zeitpunkt oder zu mehreren Zeitpunkten jeweils mindestens ein Messwert einer Messgröße erfasst wird, die mit der zum jeweiligen Zeitpunkt vorliegenden Anzahl der durch die Amplifikation erzeugten Kopien einer Zielnukleinsäure korreliert. Aus dem erhaltenen Messwert oder Messwertverlauf als Funktion der Zeit lässt sich das Vorliegen der Zielnukleinsäure und damit der biologischen Zielsubstanz in der Probeflüssigkeit qualitativ detektieren oder ein quantitativer Wert, z.B. eine Konzentration, der biologischen Zielsubstanz in der ursprünglichen Probeflüssigkeit oder in der Probeflüssigkeit nach Aufkonzentrieren mittels des weiter oben beschriebenen Verfahrens ermitteln und von der Steuerelektronik als Messergebnis ausgeben.
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Alle Schritte des hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens zur Online-Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit in allen angegebenen Ausgestaltungen können mittels der Steuerelektronik des Online-Analysegeräts automatisiert durchgeführt werden. Hierzu kann sie beispielsweise einen Flüssigkeitstransport (Probeflüssigkeit und/oder Reagenzien) oder Feststofftransport (Superabsorber-Material) durch Betätigung steuerbarer Ventile und/oder Pumpen bewirken und die Inkubationsdauer und -Temperatur beim Aufkonzentrieren und/oder bei der Freisetzung von Nukleinsäuren mittels eines vorgegebenen Ablaufprogramms steuern und/oder regeln.
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Die Erfindung umfasst auch eine Konzentrator-Einheit zur automatisierten Durchführung einer Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit, insbesondere nach dem weiter oben beschriebenen Verfahren, umfassend:
- - eine erste Konzentratorkammer;
- - mindestens eine in die erste Konzentratorkammer mündende Flüssigkeitszuleitung; und
- - mindestens eine in die erste Konzentratorkammer mündende Flüssigkeitsableitung,
wobei die Konzentrator-Einheit dazu eingerichtet ist, eine erste Menge eines Superabsorbers zu einem über die Flüssigkeitszuleitung in die erste Konzentratorkammer eingeleiteten initialen Flüssigkeitsvolumen der Probeflüssigkeit zuzugeben, oder dazu eingerichtet ist, das initiale Flüssigkeitsvolumen zu der ersten Menge des Superabsorbers zuzugeben.
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In einer möglichen Ausgestaltung kann die erste Menge des Superabsorbers in der ersten Konzentratorkammer vorgelegt sein. Die Konzentratorkammer kann in dieser Ausgestaltung als austauschbare Kartusche ausgestaltet sein. Bei Verwendung dieser Ausgestaltung kann für die Aufkonzentrierung der Zielsubstanz in jeder neuen Charge der Probeflüssigkeit die austauschbare Kartusche mit dem Superabsorber gegen eine neue Kartusche ausgewechselt werden.
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In einer alternativen Ausgestaltung kann die Konzentrator-Einheit mindestens ein Reservoir aufweisen oder mit einem Reservoir verbunden sein, in dem Superabsorber, insbesondere in Form von Partikeln, enthalten ist. Vorzugsweise wird als Superabsorber eines der weiter oben genannte Materialien, insbesondere in Kugelform, eingesetzt. Als sehr vorteilhaft haben sich kommerziell erhältliche Superabsorber-Kugeln mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 1 mm erwiesen, die auch kommerziell unter der Bezeichnung „Wasser-Beads“, „Aqua Beads“, „Water Beads“ oder „Gelkügelchen“ erhältlich sind. Superabsorber-Kugeln in dieser Größenordnung lassen sich in der Konzentratorkammer sehr gut dispergieren.
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Das Reservoir kann beispielsweise über eine mit einem, insbesondere mittels einer Steuerelektronik steuerbaren, Ventil verschließbare Superabsorber-Zuleitung mit der ersten Konzentratorkammer verbunden sein, derart, dass bei geöffnetem Ventil mindestens ein Teil des in dem Reservoir enthaltenen Superabsorbers als erste Menge des Superabsorbers in die erste Konzentratorkammer gelangt. Der Transport von Superabsorber kann mittels der Schwerkraft bewirkt werden. Es ist aber auch möglich, dass die Konzentrator-Einheit Mittel zum Transport des beispielweise in Partikeln vorliegenden Superabsorbers aufweist, z.B. eine Pumpe und/oder Mittel zum Erzeugen eines Gasstroms, der die Superabsorber-Partikel transportiert. Zum Dosieren und zum Transport des Superabsorbers kann eine zum automatischen Betrieb der Konzentrator-Einheit ausgestaltete Steuerelektronik dienen, die dazu eingerichtet ist, die erwähnten Mittel und/oder das erwähnte Ventil zu betätigen, um die erste Menge Superabsorber abzumessen und in die Konzentratorkammer zu transportieren. Diese Steuerelektronik kann entsprechend im Zusammenspiel mit Pumpen und/oder Ventilen dazu eingerichtet sein, das initiale Volumen der Probenflüssigkeit in die Konzentratorkammer zu dosieren.
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Die Konzentrator-Einrichtung kann Mittel zum Bewegen, insbesondere Rühren, der in der Reaktionskammer enthaltenen Flüssigkeit aufweisen. Die Mittel können z.B. einen Rührer, eine Zuleitung für ein Inertgas in die Reaktionskammer und eine Ableitung für das Inertgas umfassen, die so angeordnet sind, dass das Inertgas durch die in der Reaktionskammer enthaltene Flüssigkeit hindurchströmt, oder einen Antrieb zum Bewegen der Reaktionskammer aufweisen.
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Die Konzentrator-Einheit kann weiter eine Temperiervorrichtung aufweisen, die dazu ausgestaltet ist, die erste Konzentratorkammer zu temperieren. Die Temperiervorrichtung kann beispielsweise Heiz- und/oder Kühlelemente aufweisen, die mittels der Steuerelektronik betreibbar sind, um eine Temperatur einer in der Konzentratorkammer aufgenommenen Flüssigkeit zu steuern und/oder zu regeln.
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Die Flüssigkeitsableitung zur Ableitung mindestens eines Teils des in der ersten Konzentratorkammer vorliegenden Flüssigkeitsvolumens der Probeflüssigkeit kann fluidisch mit einem Sammelgefäß verbindbar sein.
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In einer weiteren Ausgestaltung kann das Sammelgefäß eine Sammelgefäßableitung aufweisen, die fluidisch mit der ersten Konzentratorkammer verbindbar ist. Auf diese Weise kann im Sammelgefäß vorliegende, bereits in einer ersten Stufe aufkonzentrierte Probeflüssigkeit erneut in die erste Konzentratorkammer geleitet werden, um in einer zweiten Stufe weiter aufkonzentriert zu werden, indem erneut Superabsorber zur aufkonzentrierten Probeflüssigkeit in der ersten Konzentratorkammer geleitet und das Gemisch inkubiert wird.
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In einer alternativen Ausgestaltung kann die Konzentrator-Einheit eine zusätzliche zweite Konzentratorkammer umfassen, wobei die Flüssigkeitsableitung der ersten Konzentratorkammer diese, insbesondere über ein Sammelgefäß, mit der zweiten Konzentratorkammer verbindet; und eine in die zweite Konzentratorkammer mündende weitere Flüssigkeitsableitung,
wobei die Konzentrator-Einheit dazu eingerichtet ist, eine zweite Menge des Superabsorbers zu einem in die zweite Konzentratorkammer eingeleiteten Volumen der in der ersten Konzentratorkammer aufkonzentrierten Probenflüssigkeit zuzugeben oder das Flüssigkeitsvolumen zu der zweiten Menge des Superabsorbers zuzugeben.
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Die Erfindung umfasst auch ein Online-Analysegerät zur Detektion mindestens einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit, insbesondere nach dem weiter oben beschriebenen Verfahren. Das Analysegerät umfasst: eine Steuerelektronik;
eine Konzentrator-Einheit nach einer der voranstehend beschriebenen Ausgestaltungen, wobei die Konzentrator-Einheit einen Flüssigkeitsausgang für in der Konzentrator-Einheit aus der Probeflüssigkeit erzeugte aufkonzentrierte Probeflüssigkeit aufweist; und
eine mit dem Flüssigkeitsausgang der Konzentrator-Einheit fluidisch verbindbare Detektionseinheit; und mindestens eine von der Steuerelektronik steuerbare Transporteinrichtung, z.B. eine Pumpe, die dazu eingerichtet ist, aufkonzentrierte Probeflüssigkeit vom Flüssigkeitsausgang der Konzentrator-Einheit in die Detektionseinheit zu transportieren,
wobei die Steuerelektronik dazu eingerichtet ist, mittels der Detektionseinheit die Zielsubstanz in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit und/oder in der Probeflüssigkeit vor Aufkonzentrierung qualitativ oder quantitativ basierend auf einem molekulargenetischen Verfahren zu bestimmen.
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Das Online-Analysegerät kann weiter eine Probenpumpe aufweisen, wobei die Steuerelektronik dazu eingerichtet ist, die Probenpumpe zum Transport eines vorgegebenen Volumens der Probenflüssigkeit in die Konzentrator-Einheit zu steuern. Die Probenzuleitung kann fluidisch mit einer Probenvorlage oder unmittelbar mit einem Gewässer oder einer Leitung in einer Prozessanlage, einem Fermenter oder einem sonstigen Prozessbehälter verbindbar sein.
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Die Detektionseinheit kann die folgenden Komponenten aufweisen:
- - eine mit einem Flüssigkeitsausgang für aufkonzentrierte Probenflüssigkeit der Konzentrator-Einheit fluidisch verbindbare erste Mikrofluidikeinheit, die dazu eingerichtet ist, aus in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomolekülen, insbesondere der mindestens einen biologischen Zielsubstanz, Nukleinsäuren freizusetzen und/oder zu isolieren,
- - eine mit der ersten Mikrofluidikeinheit verbundene zweite Mikrofluidikeinheit, die dazu eingerichtet ist, ein die freigesetzten und/oder isolierten Nukleinsäuren umfassendes Eluat aufzunehmen und eine Ziel-Nukleinsäure zu amplifizieren; und
- - einen, insbesondere optischen, Sensor, der dazu eingerichtet ist, ein von dem Fortschritt einer in der zweiten Mikrofluidikeinheit durchgeführten Amplifizierung und/oder von einer Anzahl von Kopien der Ziel-Nukleinsäure in der zweiten Mikrofluidikeinheit abhängiges Messsignal zu erzeugen und an die Steuerelektronik auszugeben; und
wobei die Steuerelektronik dazu eingerichtet ist, anhand des von dem Sensor ausgegebenen Messsignals die biologische Zielsubstanz in der Flüssigkeit qualitativ und/oder quantitativ zu bestimmen.
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Der Flüssigkeitsausgang der Konzentrator-Einheit kann mit der zuvor erwähnten ersten Konzentratorkammer und/oder mit einer ggfs. vorhandenen zweiten Konzentratorkammer und/oder mit einem ebenfalls optional vorhandenen Sammelgefäß fluidisch verbindbar sein. In verschiedenen Ausgestaltungs- oder Betriebsalternativen des Online-Analysegerät kann somit aufkonzentrierte Probeflüssigkeit direkt aus der ersten oder der optional vorhandenen zweiten Konzentratorkammer oder über das optional vorhandene Sammelgefäß in die Detektionseinheit transportiert werden.
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Die erste und die zweite Mikrofluidikeinheit können zusammen in einer, insbesondere austauschbaren, Kartusche angeordnet sein. Alternativ kann die erste Mikrofluidikeinheit in einer ersten Kartusche angeordnet und die zweite Mikrofluidikeinheit in einer zweiten, von der ersten Kartusche verschiedenen Kartusche angeordnet sein, wobei die erste und die zweite Kartusche fluidisch miteinander verbindbar sind, um Flüssigkeit aus der ersten Kartusche in die zweite zu transportieren. Die erste und die zweite Kartusche können austauschbar ausgestaltet sein.
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Die erste Mikrofluidikeinheit kann dazu eingerichtet sein, die aufkonzentrierte Probe mit den enthaltenen Biomolekülen aufzunehmen und mit einem oder mehreren Lysereagenzien zu versetzen, um Nukleinsäure der in der Probe enthaltenen Biomoleküle freizusetzen, anschließend die freigesetzten Nukleinsäuren ggf. unter Zugabe eines die Bindung der Nukleinsäure an ein Nukleinsäure-bindendes Material verstärkenden/vermittelnden Komponente zu binden und die an diesem Material gebundenen Nukleinsäuren ein- oder mehrmals mit einer Waschlösung zu waschen. Die Steuerelektronik kann dazu eingerichtet sein, einen Transport der Partikel und optional der Reagenzien durch die erste Mikrofluidikeinheit zu steuern.
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Die erste Mikrofluidikeinheit kann weiter dazu eingerichtet sein, die Nukleinsäuren vom Nukleinsäurebindenden Material durch Eluieren abzulösen und das Eluat über eine die erste Mikrofluidikeinheit mit der zweiten Mikrofluidikeinheit verbindende Fluidleitung in die zweite Mikrofluidikeinheit zu transportieren. Die Steuerelektronik kann dazu eingerichtet sein, das Eluieren und den Transport des Eluats zu steuern.
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In einer alternativen Ausgestaltung kann die erste Mikrofluidikeinheit dazu eingerichtet sein, die aufkonzentrierte Probe mit den enthaltenen Biomolekülen aufzunehmen und die Biomoleküle in einer Pufferlösung, beispielsweise in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS-Puffer), Wasser oder einem Tris-Puffer, oder optional einem Puffer, der ein Detergenz enthält, thermisch/chemisch freizusetzen, wobei die Steuerelektronik dazu eingerichtet ist, die thermische Freisetzung der Biomoleküle zu steuern und die Pufferlösung mit den darin gelösten Biomolekülen bzw. Nukleinsäuren in die zweite Mikrofluidikeinheit zur nachfolgenden Amplifikation zu transportieren. Diese Ausgestaltung ist beispielsweise zur Verwendung in einer Anwendung geeignet, bei der die zu detektierende biologische Zielsubstanz eine in der Flüssigkeit frei vorliegende Nukleinsäure ist.
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Die erste Mikrofluidikeinheit kann die zur Freisetzung und/oder Isolierung der Nukleinsäure benötigten Reaktionskomponenten in fester Form, beispielsweise in Form von durch Lyophilisierung gewonnenen Pellets, oder in durch Mikroventile verschlossenen Reagenzienkammern oder in durch Folien verschlossenen Reagenzienpacks enthalten, die durch Kraft- oder Wärmeeinwirkung automatisiert, insbesondere mittels der Steuerelektronik, geöffnet werden können.
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In der zweiten Mikrofluidikeinheit können Reagenzien für die Amplifikation in entsprechender Weise vorgehalten sein. Sie kann weiter ein oder mehrere Detektionskammern enthalten, in denen die Amplifikation einer Ziel-Nukleinsäure oder auch parallel mehrerer verschiedener Ziel-Nukleinsäuren durchgeführt werden können. Die zweite Mikrofluidikeinheit kann eine Temperiereinreichtung für die Detektionskammern umfassen. Die Temperiereinrichtung kann zum Beispiel durch die Steuerelektronik steuerbare thermoelektrische Elemente aufweisen.
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Die hier und voranstehend im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Konzentrator-einheit beschriebene Steuerelektronik kann eine elektronische Datenverarbeitungseinrichtung mit mindestens einem Prozessor und einem Speicher aufweisen, in dem ein oder mehrere Betriebsprogramme hinterlegt sind, die mittels des Prozessors ausführbar sind, um das Analysegerät automatisch zu steuern und um aus den Messsignalen des Sensors qualitative oder quantitative Analyseergebnisse zu ermitteln. Die Betriebsprogramme können so ausgestaltet sein, dass die Steuerelektronik das Analysegerät zur Durchführung des weiter oben beschriebenen Verfahrens steuert. Die Steuerelektronik kann außerdem ein Benutzerinterface aufweisen, z.B. einen Touch-Screen oder ein anderes Anzeige-Display in Kombination mit einer Eingabetastatur. Die Steuerelektronik kann dazu eingerichtet sein, drahtlos per Funk oder über eine Datenleitung mit einer anderen Datenverarbeitungseinrichtung, z.B. einem Computer, einer Prozesssteuerung, einem, insbesondere tragbaren, Anzeige- oder Bediengerät zur Kommunikation verbunden zu werden.
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Die automatische Steuerung der in der Konzentrator-Einheit durchgeführten Aufkonzentrierung kann mittels derselben Steuerelektronik durchgeführt werden, die auch der Steuerung der übrigen Komponenten des Analysegeräts dient. Die Konzentrator-Einheit kann alternativ auch eine eigene Steuerelektronik aufweisen, die dazu eingerichtet ist, die Aufkonzentrierung der Probeflüssigkeit in der beschriebenen Weise automatisiert auszuführen. Die Steuerelektronik der Konzentrator-Einheit ist in dieser Ausgestaltung vorteilhafterweise mit der Steuerelektronik des Analysegeräts, die die übrigen Komponenten des Analysegeräts steuert, nämlich insbesondere die Detektionseinheit, zur Kommunikation verbunden.
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Das Analysegerät kann somit Online-Bestimmungen biologischer Zielsubstanzen in einer Flüssigkeit durchführen, ohne dass es einer manuellen Probennahme- oder Vorbereitung oder den Transport von Proben in ein Labor erfordert. Das Analysegerät kann insbesondere vollständig automatisch Probennahme- und Detektions-Zyklen ausführen, die z.B. von der Steuerelektronik ereignisgesteuert oder in vorgegebenen Zeitabständen ausgeführt werden können.
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Die Erfindung wird im Folgenden anhand der in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispiele beschrieben. Dabei bezeichnen gleiche Bezugszeichen gleiche Komponenten der in den Figuren gezeigten Bauteile. Es zeigen:
- 1 eine schematische Darstellung eine Online-Analysegeräts zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung einer biologischen Zielsubstanz in einer Flüssigkeit;
- 2 ein erstes Ausführungsbeispiel einer Konzentrator-Einheit des in 1 dargestellten Online-Analysegeräts nach einem ersten Ausführungsbeispiel; und
- 3 ein zweites Ausführungsbeispiel einer Konzentrator-Einheit für ein Online-Analysegerät.
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In 1 ist schematisch ein Ausführungsbeispiel für ein Online-Analysegerät 1 zur Detektion einer biologischen Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit dargestellt. Das Analysegerät 1 weist im vorliegenden Beispiel ein Gehäuse 2 auf, in dem alle Komponenten des Geräts untergebracht sind. Diese Komponenten umfassen im Einzelnen eine Konzentrator-Einheit 3, eine Detektionseinheit 4 und eine Steuerelektronik 5. Die Konzentrator-Einheit 3 ermöglicht die Detektion auch in sehr geringer Konzentration in einer Probeflüssigkeit enthaltener Biomoleküle, da sie dazu eingerichtet ist, biologische Zielmoleküle in einem Volumen einer zu analysierenden Probeflüssigkeit aufzukonzentrieren und die aufkonzentrierte Probeflüssigkeit zur Detektion und ggfs. vorbereitenden Schritten wie Extraktion und/oder Isolierung von Nukleinsäuren an die Detektionseinheit 4 weiterzugeben.
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Die Konzentrator-Einheit 3 ist fluidisch über eine Probenzuleitung 6 mit einer Probenvorlage 7 oder mit einem Prozessbehälter, z.B. einer Rohrleitung oder einem Reaktor oder einem Fermenter, verbunden, in der bzw. dem die zu analysierende Flüssigkeit enthalten ist. Zum Transport und zur Dosierung der Flüssigkeit aus der Probenvorlage 7 in eine in der Konzentrator-Einheit 3 enthaltenen ersten Konzentratorkammer 8 dient eine Pumpe 9, die von der Steuerelektronik 5 gemäß einem in der Steuerelektronik 5 hinterlegten und von dieser ausgeführten Betriebsprogramm steuerbar ist. Die erste Konzentratorkammer 8 ist auch fluidisch mit Reservoiren 10, 11 verbindbar. In den Reservoiren 10, 11 sind Substanzen enthalten, die der Anreicherung von in der Flüssigkeit enthaltenen Biomolekülen dienen. Jedes Reservoir 10, 11 ist im vorliegenden Beispiel über eine Fluidleitung fluidisch mit der Konzentratorkammer in der Konzentrator-Einheit 3 verbunden. Zum Transport der in den Reservoiren enthaltenen Substanzen durch die Fluidleitungen dient jeweils eine Pumpe 12, 13. Es ist auch möglich, dass die Reservoire 10, 11 direkt in die Konzentrator-Einheit 3 integriert sind. Der Transport der Substanzen kann selbstverständlich mit anderen dem Fachmann bekannten Mitteln bewerkstelligt werden, z.B. pneumatisch oder durch Ausnutzung der Schwerkraft bzw. eines, beispielsweise hydrostatischen, Drucks.
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Die Konzentrator-Einheit 3 kann optional eine Temperiereinheit aufweisen (nicht in 1 dargestellt), die der Einstellung einer bestimmten Temperatur in der Konzentratorkammer 8 dient. Die Temperiereinheit kann eine Widerstandsheizung, eine Kühlung und/oder thermoelektrische Elemente zum wahlweisen Heizen oder Kühlen umfassen. Sie kann mit der Steuerelektronik 5 verbunden sein, wobei die Steuerelektronik 5 dazu eingerichtet ist, die Temperatur in der Konzentratorkammer 8 zu steuern oder zu regeln.
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Die Konzentrator-Einheit 3 kann außerdem eine Vorrichtung 14 zum Bewegen oder Rühren einer in der Reaktionskammer 8 enthaltenen Flüssigkeit bzw. Flüssigkeitsmischung aufweisen. Die Vorrichtung 14 umfasst im vorliegenden Beispiel einen Antrieb zum Bewegen, z.B. Rütteln, der Reaktionskammer 8. Die Vorrichtung 14, insbesondere der Antrieb, kann von der Steuerelektronik 5 gesteuert werden.
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Die Konzentratorkammer 8 ist fluidisch über die Fluidleitung 15 wahlweise mittels eines von der Steuereinheit 5 betätigbaren Ventils 16 mit der Detektionseinheit 4 oder mit einem Flüssigkeitsauslass 17 verbindbar.
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Die Detektionseinheit 4 weist im vorliegenden Beispiel eine Analysekartusche auf, in der zwei miteinander über die Fluidleitung 18 fluidisch verbundene Mikrofluidikeinheiten, nämlich eine erste Mikrofluidikeinheit 19 und eine zweite Mikrofluidikeinheit 20, integriert sind. In einer anderen Ausgestaltung können die Mikrofluidikeinheiten auch in getrennten Kartuschen untergebracht sein. Die Analysekartusche ist im vorliegenden Beispiel auswechselbar.
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Die erste Mikrofluidikeinheit 19 ist dazu eingerichtet, eine die aufkonzentrierten Biomoleküle aus der Reaktionskammer enthaltende Probe aufzunehmen und für eine nachfolgende Amplifikation und Detektion in der zweiten Mikrofluidikeinheit 20 vorzubereiten. Dies kann mittels an sich bekannter Extraktions- und Isolationsverfahren erfolgen. Hierzu umfasst die erste Mikrofluidikeinheit 19 Reagenzien und optional eine Temperiereinheit zur Inkubation von in der Mikrofluidikeinheit 19 hergestellten Reaktionsmischungen. Zur Steuerung eines Transports der Probe durch die erste Mikrofluidikeinheit 19 und zur Durchführung der Extraktion und/oder Isolation von Nukleinsäuren umfasst die Detektionseinheit 4 geeignete, dem Fachmann bekannte Mittel, die von der Steuerelektronik 5 steuerbar sind. Die zweite Mikrofluidikeinheit 20 umfasst Mittel zur Amplifikation, d.h. Reagenzien und Temperierelemente, z.B. thermoelektrische Elemente, sowie Mittel zum Transport und zur Aliquotierung von Fluiden innerhalb der zweiten Mikrofluidikeinheit 20. Zur Detektion eines Fortschritts der Amplifikation in an sich bekannter Weise, z.B. mittels eines Real Time PCR-basierten Verfahrens, weist die Detektionseinheit einen Sensor 21 auf, der beispielsweise FluoreszenzMessungen in der zweiten Mikrofluidikeinheit 20 durchführen kann und Messsignale an die Steuerelektronik 5 ausgeben kann. Die Steuerelektronik 5 ist dazu eingerichtet, anhand der Messignale ein qualitatives oder quantitatives Analyseergebnis zu ermitteln.
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Die Steuerelektronik 5 kann eine zentrale Recheneinheit, z.B. eine CPU mit Prozessor und Speicher und darin gespeicherten Betriebsprogrammen sein. Sie kann auch auf mehrere Recheneinheiten innerhalb des Analysegeräts aufgeteilt sein, z.B. können die Konzentrator-Einheit 3 und die Detektionseinheit 4 jeweils eine eigene Vorort-Elektronik aufweisen, die mit einer übergeordneten Elektronik zur Kommunikation verbunden sind, wobei die übergeordnete Elektronik und die Vorort-Elektroniken zusammen die Steuerelektronik 5 bilden.
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In 2 ist schematisch ein erstes Ausführungsbeispiel einer Konzentrator-Einheit 3 des in 1 dargestellten Online-Analysegeräts 1 im Detail dargestellt. Der in 2 dargestellte Aufbau der Konzentrator-Einheit 3 ist lediglich ein mögliches Ausführungsbeispiel. Der Fachmann kann eine Vielzahl von Varianten auffinden, ohne vom Erfindungsgedanken abzuweichen.
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Die Konzentrator-Einheit 3 weist eine Konzentratorkammer 8 mit verschiedenen Einlässen und Auslässen auf. Die Zuleitung 23 ist mit einem als Reservoir 10 dienenden Vorratsbehälter verbunden, der einen Superabsorber 24, z.B in Form von Kugeln aus dem Superabsorber-Material, enthält. Über die Zuleitung 23 erfolgt die Zugabe des Superabsorbers 24 in die Konzentratorkammer 8. Eine erste Öffnung 25 dient der Zuleitung der Probeflüssigkeit. Über sie erfolgt die Eingabe eines bestimmten initialen Volumens der zu Probeflüssigkeit in die Konzentratorkammer 8. Eine zweite Öffnung 26 ist mit der Fluidleitung verbunden, die die Reaktionskammer (1) mit einem Probenauslass sowie der Detektionseinheit verbindet. Die zweite Öffnung 26 kann einen Durchmesser aufweisen, der geringer ist als der Durchmesser der Superabsorber-Kugeln, so dass lediglich der flüssige Anteil des Gemisches aus Probeflüssigkeit und Adsorber aus der Konzentratorkammer 8 über die zweite Öffnung 26 in Richtung der Detektionseinheit 4 ableitbar ist. Optional kann die zweite Öffnung 26 auch einen Größenselektor, z.B. ein Gitter oder einen Filter aufweisen, der die Superabsorber-Kugeln in der Konzentratorkammer 8 zurückhält.
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Der in der Konzentratorkammer 8 enthaltene Superabsorber und Reste der Probeflüssigkeit können durch eine als Ableitung dienende dritte Öffnung 27 aus der Konzentratorkammer 8 entfernt werden, die im vorliegenden Beispiel gegenüber der Öffnung 25, über die Probeflüssigkeit in die Konzentratorkammer 8 einleitbar ist. Zum vollständigen Entfernen des Superabsorbers 24 und der Reste der Probeflüssigkeit kann eine Spülflüssigkeit oder ein Spülgas durch die Konzentratorkammer 8 geleitet werden. Im vorliegenden Beispiel kann die Spülflüssigkeit entweder die Probenflüssigkeit sein, die aus der Probenvorlage 7 durch die Konzentratorkammer 8 geleitet wird. Alternativ kann die Spülflüssigkeit eine in dem Reservoir 11 bevorratete Flüssigkeit sein. In letzterem Fall ist das Reservoir 11 fluidisch mit der ersten Öffnung 25 verbunden. Optional sind in den jeweiligen Zuleitungen Ventile angeordnet, die von der Steuerelektronik 5 betätigbar sind.
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Die Steuerelektronik 5 kann ein Betriebsprogramm umfassen, das sie zur Durchführung des folgenden Verfahrens ausführen kann:
- 1) Einleiten eines ersten initialen Probeflüssigkeitsvolumens aus der Probevorlage 7 in die Konzentratorkammer 8,
- 2) Zugeben einer ersten Menge des Superabsorbers 24 aus dem Reservoir 10 in die Konzentratorkammer 8 zu dem ersten initialen Probeflüssigkeitsvolumen,
- 3) Inkubieren des Gemisches aus dem Superabsorber 24 und der Probeflüssigkeit während einer von der Steuerelektronik 5 gemessenen Zeitspanne, dabei reduziert sich das Volumen des flüssigen Anteils des Gemisches unter Aufkonzentrierung von Biomolekülen, insbesondere einer zu bestimmenden biologischen Zielsubstanz in dem flüssigen Anteil,
- 4) Nach Ablauf der Zeitspanne für die Inkubation Ableiten des flüssigen Anteils.
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Wie weiter oben bereits beschrieben, nimmt der Superabsorber polare Lösungsmittel, im vorliegenden Ausführungsbeispiel z.B. Wasser aus der Probeflüssigkeit unter Bildung eines Gels auf. Biomoleküle, insbesondere die zu bestimmende biologische Zielsubstanz, werden dagegen vom Superabsorber nicht aufgenommen. Während der Inkubation verringert sich somit das Volumen des flüssigen Anteils des Gemisches aus Superabsorber und Probeflüssigkeit, dabei wird die Zielsubstanz in der Flüssigkeit aufkonzentriert. Die Inkubationszeit kann so gewählt werden, dass sichergestellt ist, dass die nach dem Inkubieren vorliegende Konzentration der Zielsubstanz in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit über einem Schwellenwert, z.B über einer durch die Detektionseinheit vorgegebenen Nachweisgrenze, liegt. Die Zeitdauer bis zur gewünschten Volumenreduktion bzw. zur gewünschten Aufkonzentrierung hängt von den folgenden Faktoren ab: Art des Superabsorbers, Partikelgröße der Superabsorberpartikel, zugesetzte Menge des Superabsorbers, Temperatur während des Inkubierens. Eine für eine bestimmte Art von Probeflüssigkeit geeignete Menge von Superabsorber und Inkubationszeit kann mittels Vorversuchen ermittelt und in der Steuerelektronik hinterlegt werden.
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Die Steuereinheit 5 kann dazu ausgestaltet sein, mittels der zuvor erwähnten Temperiereinrichtung die Temperatur der in der Konzentratorkammer 8 enthaltenen Flüssigkeit bzw. des Gemischs aus Probenflüssigkeit und Superabsorber auf einen konstanten Wert einzustellen oder zu regeln. All diese Schritte können automatisiert mittels der Steuereinheit 5 durchgeführt werden. Der flüssige Anteil ist eine aufkonzentrierte Probeflüssigkeit, d.h. Probeflüssigkeit, die aufgrund der Volumenreduktion durch Aufnahme von Wasser durch den Superabsorber die biologische Zielsubstanz in einer erhöhten Konzentration enthält. Die aufkonzentrierte Probeflüssigkeit kann in einer möglichen Ausgestaltung gemäß dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel direkt in die Detektionseinheit 4 transportiert werden. Mit dem hier beschriebenen Verfahren und der hier beschriebenen Konzentrator-Einheit 3 zur Durchführung dieses Verfahrens wird es möglich, eine großvolumige Wasserprobe auf ein sehr viel kleineres Probenvolumen zu reduzieren und korrespondierend dazu eine große Konzentrationssteigerung an Biomolekülen zu erreichen. Dies erleichtert und/oder beschleunigt eine nachfolgende Detektion mit molekulargenetischen Verfahren. Ist die Konzentration der Biomoleküle in der Probeflüssigkeit ursprünglich sehr gering, kann das hier beschriebene Verfahren sogar eine molekulargenetische Detektion der Zielsubstanz überhaupt erst ermöglichen.
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Ein weiterer Vorteil ergibt sich daraus, dass es mit dem erfindungsgemäßen Ansatz möglich ist, völlig unselektiv sowohl Bakterien, Viren, als auch freie Nukleinsäuren aufzukonzentrieren. Entsprechend ist es auch in sehr einfacher Weise möglich, mit dem Verfahren mehrere verschiedene biologische Zielsubstanzen zunächst aufzukonzentrieren, zu extrahieren und nachfolgend mittels eines PCR-basierten Verfahrens zu bestimmen.
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Die Öffnung 26 der Konzentrator-Einheit 3 ist fluidisch mit der Fluidleitung 15 des Analysegeräts 1 verbunden, die über das Ventil 16 einerseits mit der Detektionseinheit 4 und andererseits mit dem Flüssigkeitsauslass 17 verbindbar ist. Die Detektion der Zielsubstanz wird im folgenden näher beschrieben: Über die Fluidleitung 15 wird mittels der Steuerelektronik 5 die aufkonzentrierte Probeflüssigkeit durch die Fluidikleitung 15 in die erste Mikrofluidikeinheit 19 transportiert. Hierzu kann eine weitere Pumpe dienen, die von der Steuerelektronik 5 gesteuert wird. Auch das Ventil 16 wird durch die Steuerelektronik 5 betätigt. In der ersten Mikrofluidikeinheit 19 erfolgt eine automatisierte Nukleinsäureextraktion und/oder -isolierung, in der der ersten Mikrofluidikeinheit 19 nachgeschalteten zweiten Mikrofluidikeinheit 20 erfolgt eine automatisierte Amplifizierung und Detektion mittels PCR bzw. Real Time PCR. Für das vorliegend beschriebene Verfahren geeignete Mikrofluidikeinheiten zur automatisierten Nukleinsäureextraktion, Amplifizierung und Detektion sind im Stand der Technik grundsätzlich bekannt. Vorteilhaft ist für die vorliegende Anmeldung eine Zentrifugalplattform, wie sie beispielsweise in
WO 2013/045631 A1 und
EP 2 621 632 A1 beschrieben ist, es ist aber auch die Verwendung anderer Mikrofluidik-Plattformen oder Lab-on-Chip-Systeme möglich, die einen Flüssigkeits- und Reagenzientransport mittels Kapillarkräften, Pumpen oder Pneumatik statt mit Zentrifugalkraft vorsehen.
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Die Extraktion und/oder Isolierung der Nukleinsäuren in der ersten Mikrofluidikeinheit 19 erfolgt mittels bekannter Reagenzien und Verfahren, wie es bereits einleitend beschrieben wurde. Wenn es sich bei der biologischen Zielsubstanz nicht um bereits in der aus der Probenvorlage entnommenen Flüssigkeit frei vorliegende Nukleinsäuren handelt, werden die in der aufkonzentrierten Probeflüssigkeit enthaltenen Biomoleküle lysiert. Die freien Nukleinsäuren werden an ein Nukleinsäuren bindendes Material, z.B. in Partikelform, gebunden. Das Nukleinsäuren bindende Material mit den daran gebundenen Nukleinsäuren wird nachfolgend in bekannter Weise gewaschen und die Nukleinsäuren final von dem Material gelöst. Das die gelösten Nukleinsäuren enthaltende Eluat wird, wiederum gesteuert durch die Steuerelektronik 5, in die zweite Mikrofluidikeinheit 20 transportiert.
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In der zweiten Mikrofluidikeinheit 20 werden bestimmte Volumina des Eluats in eine oder mehrere Detektionskammern transportiert und Amplifizierungsreagenzien zugesetzt. In den Detektionskammern erfolgt dann eine Amplifizierung, deren Fortschritt mittels Fluoreszenzmessungen mit dem Sensor 21 überwacht wird. Der Sensor 21 gibt Messsignale an die Steuerelektronik 5 aus. Diese ermittelt aus den Messsignalen entweder einen qualitativen Wert, der angibt, ob die bestimmte biologische Zielsubstanz in der aus der Probevorlage 7 entnommenen Flüssigkeit enthalten ist. Alternativ oder zusätzlich kann die Steuerelektronik 5 aus den Messsignalen auch einen quantitativen Wert ermitteln, der eine Konzentration der biologischen Zielsubstanz in der Flüssigkeit repräsentiert. In einer vorteilhaften Ausgestaltung können in mehreren Detektionskammern jeweils unterschiedliche Ziel-Nukleinsäuren amplifiziert und so parallel mehrere unterschiedliche biologische Zielsubstanzen in der Flüssigkeit qualitativ oder quantitativ bestimmt werden.
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Vor oder nach dem Transfer der aufkonzentrierten Flüssigkeit aus der Konzentrator-Einheit 3 in die Detektionseinheit 4 oder nach erfolgter Detektion wird die in der Konzentrator-Einheit 3 verbliebene Flüssigkeit aus der Prozesseinheit 3 durch den Flüssigkeitsauslass 17 abgeführt. Die Konzentrator-Einheit 3 kann ausreichend mit einem Spülmedium, beispielsweise mit aus der Probevorlage 7 angesaugter Flüssigkeit, gespült werden und der Prozess kann jetzt für eine weitere Messung wiederholt werden. Die Mlkrofluidikeinheiten 19, 20 in der Detektionseinheit können für die weitere Messung durch neue Mikrofluidikeinheiten 19, 20 ersetzt werden. Alle hier beschriebenen Schritte können durch die Steuerelektronik 5 automatisiert durchgeführt werden.
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In 3 ist schematisch ein alternatives Ausführungbeispiel für eine Konzentrator-Einheit 33 dargestellt, die anstelle der in 2 dargestellten Konzentrator-Einheit 3 im Analysegerät der 1 eingesetzt werden kann. Die Konzentrator-Einheit 33 ist dazu eingerichtet, eine Probeflüssigkeit in mehreren Stufen aufzukonzentrieren und erlaubt somit die Aufkonzentrierung selbst von Zielsubstanzen, die nur mit einer äußerst geringen Konzentration in der ursprünglichen Probeflüssigkeit vorliegen. Die Konzentrator-Einheit 33 weist eine erste Konzentratorkammer 8 auf, die einen Einlass 25 für Probeflüssigkeit, eine Zuleitung 23 für Superabsorber, z.B. in Form von Kugeln mit einem Durchmesser von der Größenordnung von 1 mm, und zwei Ableitungen 26, 27 aufweist. Die Zuleitung 23 für den Superabsorber kann mit einem Reservoir 10 verbunden sein, in dem ein Vorrat von Superabsorber enthalten ist. Die erste Ableitung 26 aus der Konzentratorkammer 8 führt zu einem Sammelgefäß 28, die zweite Ableitung 27 dient als Ableitung für verbrauchte Flüssigkeit und verbrauchten Superabsorber und kann beispielsweise mit einem Abfall-Sammelbehälter verbunden sein.
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Das Sammelgefäß 28 ist über eine Flüssigkeitsableitung 29 mit einer zweiten Konzentratorkammer 30 fluidisch verbindbar. Die zweite Konzentratorkammer 30 kann identisch ausgestaltet sein wie die erste Konzentratorkammer 8. Sie weist im vorliegenden Beispiel eine weitere Zuleitung 31 für Superabsorber auf, die fluidisch mit demselben Reservoir 10 des Analysegeräts verbindbar ist wie die Zuleitung 23 zur ersten Konzentratorkammer 8. Die zweite Konzentratorkammer weist eine erste Ableitung 15 auf, die mit der Detektoreinheit 4 des Analysegeräts fluidisch verbindbar ist, um der Detektoreinheit aufkonzentrierte Probeflüssigkeit für den qualitativen und/oder quantitativen Nachweis der biologischen Zielsubstanz zuzuleiten. Die Konzentratorkammer 8 weist eine zweite Ableitung 32 zur Ableitung von verbrauchter Flüssigkeit und/oder verbrauchtem Superabsorber auf.
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Eine mehrstufige Aufkonzentrierung einer Zielsubstanz in einer Probeflüssigkeit kann mittels der Konzentrator-Einheit 33, insbesondere automatisiert mittels einer Steuerelektronik, z.B. der Steuerelektronik 5 des Analysegeräts, in folgender Weise erfolgen: In einer ersten Stufe kann in die erste Konzentratorkammer 8 ein erstes initales Volumen der zu analysierenden Probeflüssigkeit eingeleitet werden. Nach Zugabe einer ersten Menge des Superabsorbers kann das so gebildete Gemisch über einen vorgegebenen Zeitraum oder bis zum Erreichen eines bestimmten Endvolumens des flüssigen Anteils inkubiert werden. Mindestens ein Teil des nach dem Inkbieren verbliebenen flüssigen Anteils kann anschließend über die erste Ableitung 26 aus der Konzentratorkammer 8 in das Sammelgefäß 28 geleitet werden. Restflüssigkeit und verbrauchter Superabsorber können über die Ableitung 27 aus der Konzentrator-Kammer abgeleitet werden.
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In gleicher Weise können ein oder mehrere weitere initiale Volumina der Probeflüssigkeit in der ersten Konzentratorkammer 8 reduziert werden, um die Zielsubstanz in diesen weiteren Volumina aufzukonzentrieren. Nach der jeweiligen Inkubation, wird entsprechend mindestens ein Teil des jeweils verbliebenen flüssigen Anteils in das Sammelgefäß 28 überführt.
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Die gesammelte, bereits in einer ersten Stufe aufkonzentrierte, Probeflüssigkeit kann mittels der zweiten Konzentratorkammer 30 in einer zweiten Stufe weiter aufkonzentriert werden. Hierzu kann mindestens ein Teil der in dem Sammelgefäß 28 enthaltenen aufkonzentrierten Probeflüssigkeit über die Ableitung 29 des Sammelgefäßes 28 in die zweite Konzentratorkammer 30 eingeleitet werden. Über die Zuleitung 31 für Superabsorber wird eine zweite Menge Superabsorber in die zweite Konzentratorkammer 30 eingeleitet. Das so gebildete Gemisch wird über einen vorgegebenen Zeitraum und/oder bis zum Erreichen eines gewünschten Volumens des flüssigen Anteils in der zweiten Konzentratorkammer 30 inkubiert. Mindestens ein Teil des flüssigen Anteils kann dann über die Flüssigkeitsleitung 15 der Detektoreinheit 4 des Analysegeräts zugeführt werden. Nicht benötigte Flüssigkeit und/oder der verbrauchte Superabsorber kann über die Ableitung 32 aus der zweiten Konzentratorkammer 30 abgeleitet werden.
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Alle Schritte des hier beschriebenen Verfahrens können von einer Steuerelektronik, z.B. der Steuerelektronik 5 des Analysegeräts 1 vollständig automatisiert durchgeführt werden. Hierzu weist die Konzentrator-Einheit geeignete Mittel zum Transport von Flüssigkeit und Superabsorber-Partikeln durch die Fluidleitungen in die verschiedenen Kammern, insbesondere Pumpen und Ventile auf (nicht in 3 eingezeichnet), die die Steuerelektronik zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens zum Aufkonzentrieren der Zielsubstanz in der Probeflüssigkeit betätigt.
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Das erfindungsgemäße Analysegerät und Verfahren löst damit durch die Verknüpfung verfügbarer Gerätesysteme für die Detektion in idealer Weise die Aufgabenstellung und ermöglicht die Durchführung einer online-Flüssigkeits-Analytik biologischer Targets, die besonders vorteilhaft für die Überwachung von Wasser bzw. Abwasser in Netzwerken, Kläranlagen oder Aufbereitungsanlagen sowie von Gewässern erscheint. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es erstmals ohne manuelle Intervention beginnend mit einer großvolumigen Probe bis hin zur Detektion ein molekulargenetisches Monitoring von biologischen Targets in praktikabler und wirtschaftlicher Weise umzusetzen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 2015/0224502 A1 [0005, 0006]
- WO 2013/045631 A1 [0076]
- EP 2621632 A1 [0076]
