KR102291738B1 - 컬럼 방식의 단일튜브 pcr용 핵산 분리를 위한 버퍼 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

컬럼 방식의 단일튜브 pcr용 핵산 분리를 위한 버퍼 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 분리용 버퍼 조성물, 이를 포함하는 멤브레인 필터가 장착된 핵산 분리용 키트 및 핵산 분리 방법에 대한 것으로, 상기 핵산 분리용 버퍼 조성물은 다양한 소재의 멤브레인 필터와 적합성이 우수하며, 다양한 샘플로부터 핵산을 우수하게 분리할 수 있고 특히, 이를 포함하는 핵산 분리용 키트는 컬럼 방식의 단일 튜브 PCR이 가능하며, 이를 활용한 핵산 분리 방법은 별도의 용출 과정 없이 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 바로 PCR에 적용할 수 있음을 확인한 바, 본 발명에 따른 핵산 분리용 조성물, 키트 및 분리 방법은 현장에서의 신속한 진단에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

컬럼 방식의 단일튜브 PCR용 핵산 분리를 위한 버퍼 조성물 및 이의 용도{Buffer composition for purification of nucleic acid with a column based one-tube PCR and use thereof}
본 발명은 핵산을 빠르고 쉽게 분리하기 위한 핵산 분리용 버퍼 조성물, 이를 포함하는 핵산 분리용 키트 및 핵산 분리 방법에 대한 것으로, 컬럼 방식의 단일튜브(one-tube) PCR이 가능한 기술적 특징을 보유한다.
일반적으로 각종 질병의 진단, 유전자 재조합 식물의 검사 등을 실시하기 위해서, 검사 목적에 맞는 조직, 혈액, 모근, 세포, 식물, 균주 등의 샘플에서 핵산을 정제하는 과정이 먼저 수행된다.
생물학적 물질에서 신속하고 빠르게 핵산을 분리하는 방법은 진단 프로세스에 있어서 무엇보다 중요한 바, 세포 용해 용액 내에 포함된 여러 종류의 물질들로부터 핵산만을 선택적으로 분리할 수 있는 효과적이고 재현성 있는 방법에 대한 다양한 연구가 이루어져 왔다.
통상적으로 사용되는 핵산 정제 방법은 채취된 샘플을 용해 버퍼(Lysis buffer)내에서 일정 시간 배양하여 세포벽 및 세포막 등을 파괴한 후 핵산을 노출시키도록 용해하는 전처리 과정을 실시하고, 상기 파괴된 불순물을 제거하는 단계를 포함한다.
보다 상세하게는 샘플을 용해 버퍼에 넣고 인큐베이팅하여 전처리한 후에 핵산이 바인딩되는 멤브레인(membrane)이 구비된 스핀 컬럼(spin column)에 투입한다. 전처리된 핵산 샘플이 투입된 컬럼은 원심 분리와 세척 과정을 번갈아 복수회 실시하여 스핀 컬럼 내부 멤브레인에 핵산을 바인딩시킨다. 상기 핵산이 바인딩된 멤브레인을 이용하여 건조 과정과 더불어 TE 버퍼(T ten E one buffer, TE buffer), 용출 버퍼(elution buffer) 및 물 등을 이용한, 멤브레인으로부터 핵산을 분리하는 과정을 수행하여 순수한 핵산을 분리한다.
따라서 기존의 컬럼을 이용한 핵산 분리 방법은 전처리과정, 원심 분리 과정, 세척 과정, 건조 과정 및 유전자 분리 과정을 거침에 따라 전처리 버퍼, 원심 분리 장치(Centrifuge), 건조 장치 및 분리 버퍼와 같은 다양한 장치와 마이크로 파이펫(micro pipette) 등의 도구가 필요하고, 샘플을 이동하면서 각 과정을 실시함에 따라 많은 시간과 인력을 필요로 한다. 이와 더불어 핵산의 멤브레인으로의 바인딩 또는 불순물 세척을 위한 복수회 세척 과정 또한 소요 시간의 증대에 기여하고 있다. 또한, 이를 통해 수득한 핵산을 PCR 반응에 활용하기 위해서는 아주 적은 양의 μl 단위의 핵산 샘플을 특정 도구(마이크로 파이펫)을 사용하여 얻어야 하기 때문에 연구실을 벗어난 장소에서 핵산 추출과 그 후의 PCR 반응을 수행하기에는 어려움이 따른다.
컬럼을 사용한 핵산 분리 방법은 사용자의 필요한 숙달 정도가 매우 낮아 유용성이 높은 바, 상기와 같은 문제점을 해결하여 활용할 수 있는 방안 마련이 매우 중요하다.
한편, 지난 20년 동안 인류는 중증호흡기증후군을 일으키는 SARS-CoV(Se-vere acute respiratory syndrome-Coronavirus(2002-2003))와 H1N1 신종인플루엔자(2009)와 같은 바이러스성 전염병을 경험했다. 최근 2012년과 2015년에는 중동호흡기증후군(Middle East respira-tory syndrome, MERS)을 일으키는 MERS 코로나바이러스(Coronavirus)가 사우디아라비아와 한국에서 지역적유행(epidemic)하였다.
더욱이 2019년 12월 31일에 WHO (World Health Organization)에 처음 보고된 신종 코로나 바이러스 19 (2019 novel Coronavirus, 2019-nCoV; COVID-19)가 발생하였다. 이러한 바이러스성 전염병은 전파 속도가 매우 빨라 이에 의한 환자가 지속적으로 빠르게 증가하고 있으며, 매우 치명적인 피해가 발생하고 있다.
따라서 현장에서의 빠른 진단이 무엇보다 중요하지만, 종래 컬럼을 이용한 핵산 분리 기술은 상기와 같은 문제점을 가지고 있으므로 현장에서의 활용도가 떨어지는 바, 이를 개선한 신속하고 쉬운 핵산 분리 기술의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 핵산을 분리하기 위한 신규한 핵산 분리용 버퍼 조성물과 이를 포함하는 멤브레인 필터가 장착된 컬럼 방식의 핵산 분리용 키트를 제조하고, 이를 이용하여 바로 PCR에 적용하는, 단일튜브(one-tube) PCR 또는 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 별도로 추출하여 PCR을 수행하였을 때 다양한 샘플로부터 핵산을 빠르고 정확하게 분리할 수 있음을 확인하여, 별도의 원심분리, 세척 과정 및 건조 과정 등이 필요하지 않은 핵산 분리 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 컬럼 방식의 단일 튜브 PCR에 적용 가능한 원스텝(one-step) 핵산 분리용 버퍼 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 원스텝(one-step) 핵산 분리용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 핵산의 증폭방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에탄올(Ethanol), SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), 염화나트륨(sodium chloride, NaCl), EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 Tris-HCl을 포함하는 원스텝(one-step) 핵산 분리용 버퍼 조성물을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물을 포함하며, 멤브레인 필터(membrane fliter)가 장착된 컬럼(Column)을 포함하는 원스텝(one-step) 핵산 분리용 키트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분리용 키트를 이용하여 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 분리된 핵산을 주형으로 PCR을 수행하는 단계;를 포함하는 핵산의 증폭방법을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물, 이를 포함하는 멤브레인 필터가 장착된 핵산 분리용 키트 및 핵산 분리 방법은 원스텝(one-step)으로 다양한 샘플로부터 핵산을 빠르고 정확하게 분리할 수 있고, 특히 별도의 용출 과정 없이 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 포함하는 컬럼에 PCR 반응 혼합물(PCR reaction mix)를 넣음으로써 바로 PCR에 적용할 수 있다. 기존의 컬럼을 이용한 핵산 분리 방법은 복잡한 과정을 통해 수행되고 이에 따라 다양한 장치와 도구가 필요한 바, 과도한 시간, 자본 및 인력이 필요하였다. 뿐만 아니라 분리된 핵산이 각 단계를 수행함에 따라 일부 손실 또는 오염될 우려도 있다. 반면 본 발명에 따른 핵산 분리용 조성물, 키트 및 분리 방법은 컬럼 방식 기반의 단일 튜브 PCR 방법에 적용할 수 있기 때문에 특별한 장치가 필요하지 않으며 쉽고 빠르게 핵산을 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 분리된 핵산의 손실 또는 오염의 우려가 적으며, 저렴한 가격으로 제공될 수 있다. 또한 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 컬럼으로부터 분리하여 별도의 튜브에 넣어 PCR 또는 RT-PCR도 수행할 수 있는 바, 다양한 PCR 방법에 적용할 수 있어 활용도가 높으므로 현장에서의 신속한 진단에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1 중 A는 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물 및 멤브레인 필터(membrane filter)가 장착된 주사기를 이용하여, 분리한 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 바로 적용하여 PCR(등온 PCR, 일반 PCR 또는 RT-PCR 포함)을 수행하는 과정을 나타낸 이미지이며, 도 1 중 B는 상기 핵산이 고정된 멤브레인을 컬럼에서 분리하여 용출 용액으로 핵산을 추출한 후 이를 이용하여 PCR(등온 PCR, 일반 PCR 또는 RT-PCR 포함)을 수행하는 과정을 나타낸 이미지이다.
도 2는 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하며, 용출과정이 제외된, 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 PCR에 바로 적용한 핵산 분리 방법에 있어서, SDS 및 EtOH의 최적 농도를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물과 상업적 멤브레인 필터(Commercial membrane filter)의 적합성에 있어서, 적합한 멤브레인 필터의 기공 크기를 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물과 실리카 멤브레인 필터(silica membrane filter)의 적합성을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물과 유리섬유 필터(glass microfiber filter)의 적합성을 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물 및 유리섬유 필터가 장착된 주사기를 이용하여 핵산을 분리한 후, 상기 유리섬유 필터의 gDNA 고정 여부를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물과 유리섬유 필터의 활용에 있어서, 상기 유리섬유 필터의 PCR 반응에 적합한 최적의 크기를 확인한 도이다.
도 8은 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하여 원스텝으로 분리한 핵산이 고정된 유리섬유 필터를 적용한 PCR에 있어서, gDNA 양에 따른 민감도를 확인한 도이다.
도 9는 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하여 원스텝으로 분리한 핵산이 고정된 유리섬유 필터를 적용한 PCR에 있어서, 핵산이 분리될 세포의 갯수에 따른 민감도를 확인한 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하여 원스텝으로 분리한 핵산이 고정된 유리섬유 필터를 적용한 PCR에 있어서, 박테리아 gDNA(bacteria genomic DNA) 분리 효율을 확인한 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하여 원스텝으로 분리한 핵산이 고정된 유리섬유 필터를 적용한 PCR에 있어서, pH에 따른 RNA 분리 효율을 확인한 도이다.
도 12는 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하며, 용출과정이 제외된, 핵산이 고정된 유리섬유 필터를 바로 적용한 PCR에 있어서, pH에 따른 PCR 반응을 확인한 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 에탄올(Ethanol), SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), 염화나트륨(sodium chloride, NaCl), EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 Tris-HCl을 포함하는 원스텝(one-step) 핵산 분리용 버퍼 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물은 원스텝(one-step)으로 핵산을 분리하며, 컬럼 방식의 단일튜브 PCR에 적용하여, 단일 튜브에서 핵산 분리부터 PCR 반응까지 진행하는 것에 기술적 특징이 있다. 본 발명은 이를 통하여 기존의 컬럼을 이용한 핵산 분리 방법이 갖는 다양한 용액이 필요한 복잡한 분리 방법, 추가 장비의 필요성 및 과도한 시간, 자원, 인력 낭비에 대한 문제점을 해결하는데 목적이 있다.
특히 gDNA 분리 방법에 있어서, 세포 용해 및 멤브레인 필터와 gDNA의 결합을 위해 다량의 염(NaCl 등) 및 EtOH이 필요한데, 상기 염 및 EtOH에 의해 PCR 결과가 영향을 받는 문제가 야기될 수 있다. 따라서 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하여 원스텝(one-step)으로 핵산을 분리한 후, 상기 분리한 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 이용하여 바로 PCR을 수행하는 경우, 용출 용액을 이용한 정밀한 분리 과정 및 별도의 세척 과정이 없기 때문에 멤브레인 필터에서 녹아나오는 상기 염과 EtOH이 PCR 결과에 미치는 영향을 최소화할 수 있는 조성이 매우 중요하다.
본 발명의 일실시예에서 본 발명의 조성물을 활용한 원스텝 DNA 분리에 있어서 상기 SDS 및 EtOH의 최적화 조건을 확인해 본 바, 50%(v/v) 이하의 EtOH 및 1%(w/v) 이하의 SDS가 포함된 조성물이 우수하게 핵산이 분리할 수 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명의 원스텝(one-step) 핵산 분리용 버퍼 조성물에 있어서, 상기 에탄올(Ethanol)은 10%(v/v) 내지 50%(v/v), 10%(v/v) 내지 40%(v/v), 10%(v/v) 내지 30%(v/v), 10%(v/v) 내지 20%(v/v), 20%(v/v) 내지 50%(v/v), 20%(v/v) 내지 40%(v/v), 20%(v/v) 내지 30%(v/v), 30%(v/v) 내지 50%(v/v), 30%(v/v) 내지 40%(v/v) 또는 40%(v/v) 내지 50%(v/v)로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 20%(v/v) 내지 50%(v/v)로 포함될 수 있다. 상기 에탄올이 50%(v/v)를 초과하는 농도로 포함될 경우, 일부 gDNA 분리는 이루어질 수 있으나, 버퍼를 상온에서 보관시 NaCl의 결정화가 발생하는 문제가 야기된다.
더불어 상기 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)는 0.1%(w/v) 내지 0.9%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.8%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.7%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.6%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.4%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.3%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.2%(w/v), 0.2%(w/v) 내지 0.9%(w/v), 0.2%(w/v) 내지 0.8%(w/v), 0.2%(w/v) 내지 0.7%(w/v), 0.2%(w/v) 내지 0.6%(w/v), 0.2%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.2%(w/v) 내지 0.4%(w/v), 0.2%(w/v) 내지 0.3%(w/v), 0.3%(w/v) 내지 0.9%(w/v), 0.3%(w/v) 내지 0.8%(w/v), 0.3%(w/v) 내지 0.7%(w/v), 0.3%(w/v) 내지 0.6%(w/v), 0.3%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.3%(w/v) 내지 0.4%(w/v), 0.4%(w/v) 내지 0.9%(w/v), 0.4%(w/v) 내지 0.8%(w/v), 0.4%(w/v) 내지 0.7%(w/v), 0.4%(w/v) 내지 0.6%(w/v), 0.4%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.5%(w/v) 내지 0.9%(w/v), 0.5%(w/v) 내지 0.8%(w/v), 0.5%(w/v) 내지 0.7%(w/v), 0.5%(w/v) 내지 0.6%(w/v), 0.6%(w/v) 내지 0.9%(w/v), 0.6%(w/v) 내지 0.8%(w/v), 0.6%(w/v) 내지 0.7%(w/v), 0.7%(w/v) 내지 0.9%(w/v), 0.7%(w/v) 내지 0.8%(w/v) 또는 0.8%(w/v) 내지 0.9%(w/v)로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v)로 포함될 수 있다.
상기 염화나트륨(sodium chloride, NaCl)은 0.1M 내지 1M, 0.1M 내지 0.9M, 0.1M 내지 0.8M, 0.1M 내지 0.7M, 0.1M 내지 0.6M, 0.1M 내지 0.5M, 0.1M 내지 0.4M, 0.1M 내지 0.3M, 0.1M 내지 0.2M, 0.2M 내지 1M, 0.2M 내지 0.9M, 0.2M 내지 0.8M, 0.2M 내지 0.7M, 0.2M 내지 0.6M, 0.2M 내지 0.5M, 0.2M 내지 0.4M, 0.2M 내지 0.3M, 0.3M 내지 1M, 0.3M 내지 0.9M, 0.3M 내지 0.8M, 0.3M 내지 0.7M, 0.3M 내지 0.6M, 0.3M 내지 0.5M, 0.3M 내지 0.4M, 0.4M 내지 1M, 0.4M 내지 0.9M, 0.4M 내지 0.8M, 0.4M 내지 0.7M, 0.4M 내지 0.6M, 0.4M 내지 0.5M, 0.5M 내지 1M, 0.5M 내지 0.9M, 0.5M 내지 0.8M, 0.5M 내지 0.7M, 0.5M 내지 0.6M, 0.6M 내지 1M, 0.6M 내지 0.9M, 0.6M 내지 0.8M, 0.6M 내지 0.7M, 0.7M 내지 1M, 0.7M 내지 0.9M, 0.7M 내지 0.8M, 0.8M 내지 1M, 0.8M 내지 0.9M 또는 0.9M 내지 1M로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 0.5M 내지 1M로 포함될 수 있다.
상기 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)는 1mM 내지 100 mM으로 포함될 수 있으며, 상기 Tris-HCl은 1mM 내지 50 mM으로 포함될 수 있다.
본 발명의 원스텝(one-step) 핵산 분리용 버퍼 조성물은 바람직한 구체예로써 20%(v/v) 내지 50%(v/v) 에탄올(Ethanol), 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v) SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), 0.5M 내지 1M 염화나트륨(sodium chloride, NaCl), 1mM 내지 100 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 1mM 내지 50mM Tris-HCl를 포함할 수 있다.
또한, 바람직하게는 상기 버퍼 조성물은 버퍼 조성물 100 중량부에 대하여, 20%(v/v) 내지 50%(v/v) 에탄올(Ethanol) 1 내지 5 중량부, 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v) SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 1 내지 5 중량부, 0.5M 내지 1M 염화나트륨(sodium chloride, NaCl) 2.5 내지 10 중량부, 1mM 내지 100 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 1 내지 5 중량부 및 1mM 내지 50mM Tris-HCl 1 내지 5 중량부가 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 버퍼 조성물은 버퍼 조성물 100 중량부에 대하여, 20%(v/v) 내지 50%(v/v) 에탄올(Ethanol) 2.5 중량부, 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v) SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 2.5 중량부, 0.5M 내지 1M 염화나트륨(sodium chloride, NaCl) 5 중량부, 1mM 내지 100 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 2.5 중량부 및 1mM 내지 50mM Tris-HCl 2.5 중량부가 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 보다 바람직한 구체예로써 50%(v/v) 에탄올(Ethanol), 0.25%(w/v) SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), 0.25M 염화나트륨(sodium chloride, NaCl), 12.5mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 25mM Tris-HCl를 포함하는 수용액을 제조하였다.
본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하여 gDNA를 분리하는 경우, 상기 Tris-HCl은 pH 8인 것이 바람직하다.
더불어 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하여 총 RNA(total RNA)를 분리하는 경우, pH 4 내지 7에서 수행하는 것이 바람직함을 확인하였다.
따라서 본 발명에 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하여 총 RNA를 분리하는 경우, 상기 Tris-HCl의 pH는 pH 4 내지 7인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 원스텝(one-step) 핵산 분리용 버퍼 조성물을 포함하며, 멤브레인 필터(membrane fliter)가 장착된 컬럼(Column)을 포함하는 원스텝(one-step) 핵산 분리용 키트를 제공한다.
더불어 본 발명의 원스텝(one-step) 핵산 분리용 키트는 컬럼 상부에 압력을 가하여 멤브레인 필터로 용액을 여과한 후, 여과액을 하부에서 제거할 수 있는 형태로, 보다 바람직하게는 주사기 형태일 수 있다. 상기 키트가 주사기 형태로 제조될 경우 원심분리기 등 별도의 도구가 필요하지 않아 휴대용으로 현장에서 바로 검출이 가능한 장점을 가진다.
상기 멤브레인 필터는 폴리비닐리덴 플루오라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF), 나일론 필터(nyron filter), 셀룰로오스 니트레이트 필터(celluose nitrate filter), 종이 필터(paper filter), 유리섬유 필터(glassfiber filter) 및 실리카 필터(silica filter)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 하기 실시예에서 본 발명의 원스텝(one-step) 핵산 분리용 버퍼 조성물과 상기 각 멤브레인 필터와의 적합성이 우수한 것을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서 확인한 바에 따르면, 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물과 PVDF 소재의 상업적 멤브레인 필터를 이용한 DNA 분리에 있어서, 기공 크기 0.1μm 필터가 가장 높은 DNA 분리 효율을 보인 것을 확인하였다.
한편, PVDF 멤브레인, 실리카 멤브레인 및 유리섬유 멤브레인 필터와 같은 음전하 멤브레인 필터(negative charged membrane filter)는 음전하의 gDNA를 포착(capture)하기 위해 양전하(positive charge)의 중간 매개로 다량의 염(salt)을 필요로 한다(0.1~1M NaCl). 따라서 별도의 정제없이 gDNA가 포착된 유리섬유 필터에 PCR 반응 혼합물을 첨가한 후 PCR을 수행하면, 상기 유리섬유 필터로부터 녹아나온 NaCl로 인하여 PCR 반응의 저해가 야기될 수 있는 바, 본 발명의 또다른 실시예에서 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물과의 활용에 있어서 유리섬유 필터의 최적의 크기를 확인하였다. 그 결과 총 볼륨 50ul 당 유리섬유 필터는 2x2mm2 크기 이하가 최적임을 확인하였다(0.25M NaCl 기준).
상기 핵산은 DNA(deoxyribonucleic acid), RNA(Ribonucleic acid) 및 PNA(pentose nucleic acid)를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분리용 키트를 이용하여 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 분리 방법을 통해 분리된 핵산을 주형으로 PCR을 수행하는 단계;를 포함하는 핵산의 증폭방법을 제공한다.
보다 상세하게는 상기 방법은 샘플을 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼에 침지하여 용해하는 단계; 상온에서 상기 샘플이 용해된 용액을 인큐베이션(incubation)하는 단계; 상기 샘플이 용해된 용액을 멤브레인 필터(membrane fliter)가 장착된 컬럼에 옮기는 단계; 및 상기 컬럼에 압력을 가하여 필터에 핵산을 고정하고 여과액은 제거하는 단계;로 수행되거나, 샘플을 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼에 침지하여 용해하는 단계; 상온에서 상기 샘플이 용해된 용액을 인큐베이션(incubation)하는 단계; 상기 샘플이 용해된 용액을 멤브레인 필터(membrane fliter)가 장착된 컬럼에 옮기는 단계; 상기 컬럼에 압력을 가하여 필터에 핵산을 고정하고 여과액은 제거하는 단계; 상기 핵산이 고정된 컬럼에 용출 용액을 넣고 멤브레인 필터를 통과시키는 단계; 및 상기 용출 용액을 수득하는 단계;로 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산의 증폭방법에 있어서, 주형이 되는 핵산은 핵산이 고정된 필터를 직접적으로 이용하거나, 용출 용액에 포함된 형태로 이용될 수 있다.
이때 상기 핵산이 고정된 필터를 직접적으로 이용하는 경우, 도 1 중 A 및 B와 같이, 핵산이 고정된 필터가 장착된 컬럼 자체에 PCR 반응 혼합물을 바로 첨가하여 PCR을 수행하거나, 핵산이 고정된 필터를 분리하여 이를 별도의 튜브에 옮긴 후 PCR 반응 혼합물과 반응시켜 PCR을 수행할 수 있다. 이때 핵산이 고정된 필터는 적절한 크기로 자를 수 있다.
이때 상기 PCR 반응은 분리된 핵산을 확인하기 위한 방법으로, 이외 분리된 핵산을 확인할 수 있는 방법이라면 당 분야에 공지된 어떤 방법이든지 적용 가능하다. 바람직하게는 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 및 등온증폭(isothermal amplification) PCR일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용출 용액은 당 분야에 공지된 용출 용액(elution buffer)라면 제한없이 사용 가능하다. 바람직하게는 증류수, TE 버퍼(T ten E one buffer, TE buffer) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 당 분야에 공지된 용출 용액은 TE 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA)) 또는 용출 버퍼(10mM Tris-HCl, pH 7.5~8.5)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 핵산 분리 방법에 있어서, 상기 인큐베이션(incubation)은 세포를 용해(lysis)시키는 과정으로 2분 내지 10분동안 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 5분동안 수행될 수 있다.
상기 인큐베이션은 샘플을 1 내지 5 ml의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼에 침지하여 흔들어주며 혼합한 후, 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 샘플은 생물학적 또는 비생물학적 샘플인 것을 특징으로 한다.
상기 생물학적 샘플은 DNA 및 RNA를 포함하는 샘플로, 비강 흡인물(nasal aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 객담(sputum), 눈물(tears), 침(saliva), 세포(cell), 세포 분리물(cell extract), 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 소변(urine), 정액(semen), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더불어 상기 비생물학적 샘플은 화학적으로 합성된 PNA을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물, 이를 포함하는 멤브레인 필터가 장착된 핵산 분리용 키트 및 핵산 분리 방법은 원스텝(one-step)으로 다양한 샘플로부터 핵산을 우수하게 분리할 수 있고, 특히 별도의 용출 과정 없이 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 바로 PCR에 적용할 수 있는 기술적 특징이 있다.
이는 기존의 컬럼을 이용한 핵산 분리 방법이 보유한 과도한 시간, 자본 및 인력의 필요, 분리된 핵산의 손실 또는 오염 발생 위험성 등의 문제점을 우수하게 개선한 것으로, 핵산을 빠르게 분리하여 현장에서의 신속한 진단에 활용하고자 한다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 핵산 분리용 버퍼 조성물 제조
본 발명자들은 핵산 분리를 위한 버퍼 조성물의 바람직한 실시예로서, 버퍼 조성물 100ml을 기준으로 2.5ml의 50%(v/v) 에탄올(Ethanol), 2.5ml의 0.25%(w/v) SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), 5ml의 0.25 M 염화나트륨(sodium chloride, NaCl), 2.5ml의 12.5 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 2.5ml의 25 mM Tris-HCl를 포함하는 수용액을 제조하였다.
한편, 기존 핵산 분리 방법은 전처리과정, 원심 분리 과정, 세척 과정, 건조 과정 및 유전자 분리 과정의 복잡한 과정을 통해 수행된다. 이를 위하여 용해 버퍼(lysis buffer), 결합 버퍼(binding buffer), 세척용 버퍼, 용출 버퍼(elution buffer) 등이 각 단계별로 필요하며 원심분리기와 같은 특별한 장치도 필요하여 과도한 시간, 자본 및 인력이 소요된다. 뿐만 아니라 분리된 핵산이 각 단계를 수행함에 따라 일부 손실 또는 오염될 우려도 있다. 더불어 추가적으로 분리된 핵산을 이용하여 PCR을 수행하려면 분리된 DNA를 마이크로 파이펫 (micro pipette)과 파이펫 팁 (pipette tips) 등을 사용하여 1~5μl 정도의 아주 소량을 채취해야 하는데, 이는 상기 도구가 구비되어 있지 않은 현장에서 수행하기에는 어려움이 따른다. 반면, 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물은 모든 구성요소가 하나로 혼합된 조성물로, 원스텝(onestep)으로 핵산 분리가 가능하여 신속하게 분리할 수 있을 뿐만 아니라 분리된 핵산의 손실 또는 오염의 우려가 적고, 이에 있어 추가로 필요한 장비가 없으므로 현장에서 보다 쉽고 빠르게 실시간 검출이 가능하다.
실시예 2. 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용한 핵산 분리 방법
2-1. 용출과정이 제외된 핵산 분리 방법
본 발명의 핵산 분리 방법에 있어서, 핵산이 고정된 필터를 별도의 용출 과정 없이 바로 PCR에 적용하여 결과를 바로 확인할 수 있다.
먼저 면봉을 이용하여 샘플을 채취하고, 상기 실시예 1에서 제조한 2ml의 핵산 분리용 버퍼 조성물에 침지하고 흔들어 혼합한 후 이를 상온에서 5분간 인큐베이션(incubation)하여 세포를 용해(lysis)시켰다.
인큐베이션 종료 후, 상기 용액을 멤브레인 필터가 장착된 주사기에 옮긴 후, 천천히 압력을 가해 용액을 멤브레인 필터로 통과시켜 핵산을 고정하고 여과액을 제거하였다. 그런 후 상기 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 이용하여 PCR을 수행하였다.
보다 상세하게는 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 포함하는 주사기에 PCR 반응 혼합물(25μl의 2X i-TaqTM PCR mix, 1μl의 10pmol/μl 정방향 프라이머(forward primer), 1μl의 10pmol/μl 역방향 프라이머, 23μl의 증류수(distilled water)으로, 총 볼륨 50μl)을 첨가하였다. 그런 후 PCR 반응시켰으며, 이때 하기와 같은 PCR 조건 하에 수행하였다: 초기 변성(initial denaturation):94℃, 2분, 30회(cycle) (변성(denaturation): 94℃, 20초; 결합(annealing): 55℃, 10초; 신장(extension): 72℃, 30초; 최종 신장(final extension): 72℃, 5분).
2-2. 용출 과정이 포함된 핵산 분리 방법
더불어 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 용출 용액을 이용하여 용출한 후, 이를 PCR에 적용할 수 있다.
멤브레인 필터에 핵산을 고정하기 전까지 단계는 상기 2-1의 방법과 동일하게 수행하였다. 여과액이 제거된 주사기에 증류수를 넣고 멤브레인 필터를 통과시킨 후 이를 수득하였다. 이때 증류수를 넣기 전 선택적으로 불순물을 거르기 위하여 100% EtOH로 한번 세척할 수 있다. 최종적으로 수득한 용액으로부터 DNA 또는 RNA의 포함 여부를 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 확인하였다.
실시예 3. 원스텝(one-step) 핵산 분리용 버퍼 조성물의 최적 조건 확인
gDNA 분리에 있어 세포 용해 및 멤브레인 필터에 gDNA가 결합하기 위해서는 다량의 염을 필요로 하며, EtOH도 함유되어야 한다. 따라서 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하여 원스텝(one-step)으로 핵산을 분리한 후, 상기 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 이용하여 바로 PCR을 수행하는 경우, 상기 염과 EtOH의 영향을 최소화할 수 있는 조성이 매우 중요하다.
이를 확인하기 위하여, 구성요소인 SDS(0.5% 또는 1%), Nacl(0.5M 또는 1M), 또는 EtOH(50% 또는 70%)를 각각 포함한 핵산 분리용 버퍼 조성물의 DNA 분리 효율을 확인하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이때 각 실험군에 맞춰 상기 실시예 2-1 또는 2-2의 방법과 동일하게 수행하였으며, 멤브레인 필터로는 유리섬유 필터 (glass microfiber filters, GF/C, Whatman co)를 사용하였고, 293T세포(SV40 대형 T 항원의 돌연변이를 발현하는 HEK 293 세포주에서 파생된 인간 세포주)를 1.75×109로 동일하게 사용하였다. 분리한 샘플 5μl와 다이(dye) 1μl를 혼합하여 0.8% 아가로오스 겔(Agarose gel)에 로딩(loading)한 후, GelDoc(전기영동 이미징 시스템)을 이용하여 결과를 확인하였다.
도 2에 있어, 1번 라인은 100bp 래더(ladder)이고, 2번 라인은 음성 대조군(핵산을 넣지 않고 PCR을 수행한 후 이를 로딩)이며, 3번 라인은 5μl의 GAPDH에 대한 프라이머 (forward primer: TGCACCACCAACTGCTTAGC, reverse primer: CGCATGGACTGTGGTCATGAG) 만 로딩한 결과이고, 4번 라인은 양성 대조군(positive control (상업적 gDNA 분리 키트(gDNA extraction using AccuPrep®Genomic DNA Extraction Kit (K-3032) of Bioneer)를 이용하여 분리된 gDNA(1μg)를 PCR함)이며, 5번 라인은 상기 실시예 2-1와 같이, 샘플과 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼가 혼합된 혼합물을 멤브레인 필터에 여과하고, 이를 로딩한 결과이고(AB(attach and bind) elution이라 기재), 6번 라인은 상기 실시예 2-2와 같이, 상기 5번 라인에 있어서 혼합물이 여과된 멤브레인 필터를 증류수로 용출한 후, 상기 증류수를 로딩한 결과이며(AB(attach and bind)라 기재)(상기 5번 라인 및 6번 라인은 멤브레인 필터의 gDNA 결합 여부를 확인하기 위한 실험군), 7번 라인은 2ml의 상기 실시예 1의 버퍼 조성물을 적용하여 상기 실시예 2-1과 같이 수행하여 수득한 것을 로딩한 결과이며(ST(standard concentration)라 기재), 8번 라인은 2ml의 고농도 SDS(1%, HS(High SDS)로 기재)를 적용한 결과이고, 9번 라인은 2ml의 중농도 SDS(0.5%, MS(Medium SDS)로 기재)를 적용한 결과이며, 10번 라인은 2ml의 고농도 NaCl(1M, HN(High NaCl)으로 기재)를 적용한 결과이고, 11번 라인은 2ml의 중농도 NaCl(0.5M, MN(Medium NaCl)으로 기재)를 적용한 결과이며, 12번 라인은 2ml의 고농도 EtOH(70%, HE(High EtOH)로 기재)를 적용한 결과이고, 13번 라인은 2ml의 중농도 EtOH(50%, ME(Medium EtOH)로 기재)를 적용한 결과이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 멤브레인 필터의 gDNA의 결합 여부를 확인한 결과, 5번 라인 대비 6번 라인의 발광이 뚜렷한 바, 멤브레인 필터에 핵산이 잘 결합되어 있으며(5번 라인 참고), 증류수를 이용해 이로부터 핵산을 우수하게 분리할 수 있음(6번 라인 참고)을 확인할 수 있었다.
더불어 EtOH는 50% 이하였을 때만 용출 과정없이 바로 멤브레인 필터를 적용한 PCR이 수행될 수 있었다(13번 라인 참고). 또한 SDS의 경우, 1% SDS를 포함하는 경우에는 PCR이 수행되지 않음을 확인하였다(8번 라인 참고).
따라서 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하며, 용출과정이 제외된, 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 바로 적용한 핵산 분리 방법에 있어서, 상기 SDS는 1% 이하로 포함되는 것이 바람직하며, 상기 EtOH는 50% 이하로 포함되는 것이 바람직함을 확인하였다.
실시예 4. 멤브레인 필터에 따른 핵산 분리 효율 확인
4-1. 상업적 멤브레인 필터(Commercial membrane filter)
다양한 기공 크기(pore size)를 갖는 PVDF 소재의 상업적 멤브레인 필터 중 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물에 적합한 필터를 확인하였다.
이에 있어, 0.1μm PVDF 필터, 0.22μm PVDF 필터, 0.45μm PVDF 필터 또는 종이 필터(paper filter(3M paper filter))가 장착된 주사기 및 본 발명의 핵산 분리용 버퍼(GB(gDNA extraction buffer))를 이용하였다. HEK 293T 세포(1.0×106)을 5ml의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼를 이용하여 용해하였고, 상기 실시예 2 중 2-1.과 동일한 방법으로 게놈 DNA(genomic DNA, gDNA)를 분리하고 각각의 분리 효율을 확인하여 도 3에 나타내었다. 각 실험군의 조건에 따라 수득한 샘플 5μl와 다이 1μl을 혼합하였으며, 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)을 이용하여 100v에서 30분간 로딩하였다.
도 3에 있어, 1번 라인은 1kb 래더(ladder)이고, 2번 라인은 gDNA 대조군(상업적 gDNA 분리 키트(gDNA extraction using AccuPrep®Genomic DNA Extraction Kit (K-3032) of Bioneer)를 이용하여 분리된 gDNA(1μg)를 PCR함)이며, 3번(기공 크기 0.1μm 필터), 5번(기공 크기 0.22μm 필터), 7번(기공 크기 0.45μm) 및 9번 라인(paper filter)은 100μl의 상기 실시예 2에 따라 분리된 gDNA(10μg) + 300μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼를 각 멤브레인 필터에 여과시킨 실험군(여과 후, 멤브레인에 결합되지 않은, 핵산 분리용 버퍼에 남은 gDNA의 양을 확인하기 위한 실험군)이고, 4번(기공 크기 0.1μm 필터), 6번(기공 크기 0.22μm 필터), 8번(기공 크기 0.45μm) 및 10번 라인(paper filter)은 상기 실시예 2 중 2-2의 방법에 있어서 최종 단계에서 400 μl의 H2O로 용출하여 핵산을 수득한 실험군이다. 이때 4번, 6번, 8번 및 10번 라인에 있어서 불순물을 거르기 위하여 멤브레인 필터를 400μl의 100% EtOH로 한번 세척하였다.
도 3에서 확인한 바와 같이, 4번 라인에서 뚜렷한 밴드를 확인할 수 있었다. 따라서 다양한 기공 크기를 가진 PVDF 소재의 상업적 멤브레인 필터에 있어서, 기공 크기 0.1μm 필터가 가장 높은 DNA 분리 효율을 보임을 확인하였다. 반면, 기공 크기 0.45μm 필터의 경우, gDNA가 멤브레인 필터에 결합되지 않아, 여과된 용액에서 상당량의 gDNA를 확인할 수 있었다. 그러므로 PVDF 소재의 필터에 있어서, 기공 크기 0.1μm의 필터가 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물과 가장 적합한 것을 확인하였다.
4-2. 실리카 멤브레인 필터(silica membrane filter)
실리카 멤브레인 필터와 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물과의 적합성 또한 평가하였다.
이에 있어, 실리카 필터가 장착된 주사를 이용하여 실시예 2 중 2-1.과 동일한 방법으로 293T 세포로부터 게놈 DNA(genomic DNA, gDNA)를 분리하고 각각의 분리 효율을 확인하여 도 4에 나타내었다. 이때 용출 용액의 양에 따라 용출되는 핵산의 양을 확인하였다(실리카 필터 일루션 1 부터 5 (silica filter elution 1 부터 5)로 기재).
도 4에 있어, 1번 라인은 1kb 래더(ladder)이고, 2번 라인은 양성대조군(상업적 gDNA 분리 키트(gDNA extraction using AccuPrep®Genomic DNA Extraction Kit (K-3032) of Bioneer)를 이용하여 분리된 gDNA(1μg)와 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 400μl를 혼합한 후, 0.1μM PVDF 멤브레인 필터에 여과한 후, 상기 멤브레인 필터를 200μl 증류수로 용출시킨 실험군)이며, 3번 라인은 상기 2번 라인의 한번 용출된 멤브레인 필터를 다시 200μl 증류수를 사용하여 용출시킨 실험군이고(용출 후 gDNA 잔량이 없음을 확인하기 위한 실험군), 4번 라인은 1μg gDNA를 함유한 본 발명의 핵산 분리용 버퍼를 실리카 멤브레인 필터로 여과시킨 후 이를 이용한 실험군이며(실리카 멤브레인 필터에 gDNA가 결합되었는지 확인하기 위한 실험군), 5번 라인은 상기 실리카 멤브레인 필터를 50μl 증류수로 용출한 실험군이고, 6번 라인은 상기 실리카 멤브레인 필터를 50μl 증류수로 2회 반복 용출한 실험군이며, 7번 라인은 상기 실리카 멤브레인 필터를 50μl 증류수로 3회 반복 용출한 실험군이고, 8번 라인은 상기 실리카 멤브레인 필터를 50μl 증류수로 4회 반복 용출한 실험군이며, 9번 라인은 상기 실리카 멤브레인 필터를 50μl 증류수로 5회 반복 용출한 실험군이다.
따라서 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물과 실리카 멤브레인 필터를 이용한 경우도 gDNA 분리 효율이 우수한 것을 확인하였다. 특히 5번 내지 9번 라인에서 뚜렷한 밴드를 확인할 수 있었으며, 이를 참고로 한 바, 용출 용액의 볼륨은 100 내지 200μl 정도가 적정함을 확인하였다.
4-3. 유리섬유 필터(glass microfiber filter)
1) 적합성 확인
유리섬유 필터와 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물과의 적합성 또한 평가하였다.
이에 있어, 유리섬유 필터가 장착된 주사기를 이용하여 상기 실시예 2 중 2-1.과 동일한 방법으로 293T 세포로부터 게놈 DNA(genomic DNA, gDNA)를 분리하고 각각의 분리 효율을 확인하여 도 5에 나타내었다.
도 5에 있어, 1번 라인은 1kb 래더(ladder)이고, 2번 라인은 음성 대조군으로, gDNA없이 200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물만 넣은 실험군이며, 3번 및 4번 라인은 1μg gDNA를 함유한 본 발명의 핵산 분리용 버퍼를 유리섬유 필터로 여과시킨 후 50μl의 증류수로 용출한, 같은 조건으로 2회 반복한 실험군이며, 5번 라인은 상기 유리섬유 필터를 100μl의 증류수로 용출한 실험군이고, 6번 라인은 상기 유리섬유 필터를 200μl의 증류수로 용출한 실험군이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 유리섬유 필터를 사용한 실험군인 1번 라인 내지 4번 라인이 뚜렷한 밴드를 보이므로, gDNA가 분리되었음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물과 유리섬유 필터를 이용한 경우도 gDNA 분리 효율이 우수한 것을 확인하였다.
더불어 유리섬유 필터의 gDNA 고정 여부를 육안으로 확인하여 도 6에 나타내었다. 이를 위하여, 유리 섬유 필터에 EtBr(Ethidium bromide)을 처리한 후, UV하에서 발광을 확인하여 유리섬유 필터의 gDNA 고정 여부를 확인하여 도 6에 나타내었다.
도 6에 있어, 1번 및 4번은 대조군으로, gDNA없이 200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물만 넣은 실험군이며, 2번 및 3번은 같은 조건으로 반복 수행한 실험군으로, PCR을 수행하지 않은 실험군이고, 5번 및 6번은 같은 조건으로 반복 수행한 실험군으로, PCR을 수행한 실험군이다.
gDNA가 결합된 유리섬유 멤브레인 필터를 용출 과정 없이 UV 상으로 확인한 도 6의 결과, 2번 및 3번 라인에서 뚜렷한 밴드 발광을 확인할 수 있으므로 유리 섬유 멤브레인 필터에 gDNA가 잘 결합되어 있음을 확인하였다. 더불어 유리섬유 멤브레인 필터를 이용한, 용출 과정을 제외하고 바로 PCR하는 경우에 있어서, 유리섬유 멤브레인 필터의 gDNA 잔량을 확인한 결과, PCR을 하기 전보다 약간 감소되는 것을 확인하였다. 이는 PCR 과정 중 일부 gDNA가 PCR 반응 혼합물에 녹아들었음을 나타내는 것으로 판단되었다.
따라서 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물과 유리섬유 멤브레인 필터를 이용한 경우도 gDNA 결합과 분리 효율이 우수한 것을 확인하였다.
2) 최적의 크기 확인
한편 PVDF 멤브레인, 실리카 멤브레인 및 유리섬유 멤브레인 필터와 같은 음전하 멤브레인 필터(negative charged membrane filter)는 음전하의 gDNA를 포착(capture)하기 위해 양전하(positive charge)의 중간 매개로 다량의 염(salt)을 필요로 한다(0.1~1M NaCl). 따라서 핵산을 포함하고 있는 유리섬유 필터는 gDNA 결합 매개체인 다량의 Na+를 함유하고 있기 때문에 별도의 정제없이 PCR을 수행하면 PCR 반응의 저해를 야기할 수 있다. 이를 방지하기 위한 가장 효율적인 방법은 PCR 볼륨(volume)에 비해 유리섬유 필터를 가능한 한 작게 만들어서 Na+에 의한 영향을 최소화하는 것이다. 하지만 너무 작게 만들면 유리섬유 멤브레인 필터가 장착된 컬럼 형태의 핵산 분리용 키트를 제작하기 어렵다는 유의점이 있다. 그러므로 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물과의 활용에 있어서 유리섬유 필터의 최적의 크기를 확인하였다.
상기 실시예 2 중 2-1.과 동일한 방법으로 293T 세포로부터 게놈 DNA(genomic DNA, gDNA)를 분리하고 각각의 분리 효율을 확인하여 도 7에 나타내었다.
이때 PCR 생성물의 확인을 위해 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)을 사용하였고 100v에서 30분간 로딩하였다. 더불어 PCR은 총 50μl의 볼륨으로 수행하였고 샘플 5μl와 다이(Dye) 1μl을 혼합하여 로딩하였다.
도 7에 있어, 1번 라인은 100bp 래더 (2μl의 래더 + 3μl의 H2O)이고, 2번 라인은 음성대조군으로 gDNA없이 200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물만 넣은 실험군이며, 3번 라인은 5μl의 GAPDH에 대한 프라이머 (정방향 프라이머: TGCACCACCAACTGCTTAGC, 역방향 프라이머: CGCATGGACTGTGGTCATGAG) 만 로딩한 실험군이고, 4번 라인은 양성 대조군(상업적 gDNA 분리 키트(gDNA extraction using AccuPrep®Genomic DNA Extraction Kit (K-3032) of Bioneer)를 이용하여 분리된 gDNA(1μg)를 PCR함)이고, 5번 라인 은 1μg gDNA를 함유한 본 발명의 핵산 분리용 버퍼를 유리섬유 필터로 여과시킨 후, 상기 여과된 버퍼를 PCR한 실험군이며(6번 라인의 대조군), 6번 라인은 1μg gDNA를 함유한 400μl의 본 발명의 핵산 분리용 버퍼를 유리섬유 필터로 여과시키고, 이를 1/8크기(4×4mm2)로 자른 후 PCR 반응을 수행한 실험군이고, 7번 라인은 1μg gDNA를 함유한 400μl의 본 발명의 핵산 분리용 버퍼를 유리섬유 필터로 여과시키고, 상기 여과된 버퍼를 PCR한 실험군이며(8번 라인의 대조군), 8번 라인은 1μg gDNA를 함유한 400μl의 본 발명의 핵산 분리용 버퍼를 유리섬유 필터로 여과시키고, 이를 1/16크기(2×2mm2)로 자른 후 PCR 반응을 수행한 실험군이다.
도 7과 같이, 총 볼륨 50μl PCR 반응 기준으로, 8번 라인에서 뚜렷한 밴드가 관찰되는 바 2x2mm2 크기에서(1/16) 성공적으로 PCR이 수행되었음을 확인하였다. 반면 6번 라인과 같이, 4x4mm2 크기(1/8)에서는 PCR이 수행되지 않았음을 확인하였다. 따라서 총 볼륨 50ul 당 유리섬유 필터는 2x2mm2 크기 이하가 최적임을 확인하였다(0.25M NaCl 기준).
실시예 5. 원스텝(one-step) 핵산 분리 방법의 핵산 분리 효율 확인
5-1. gDNA 양에 따른 민감도(sensitivity) 확인
본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하며, 용출과정이 제외된, 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 바로 PCR에 적용하는 핵산 분리 방법에 있어서, 소량의 gDNA도 PCR로 검출할 수 있는지 확인하였다. 유리섬유 필터를 이용하는 경우, gDNA 양(μg (microgram)부터 pg (picogram) 단위)에 따른 민감도를 검증하여야 한다.
이를 위해 상업적 gDNA 분리 키트(gDNA extraction using AccuPrep®Genomic DNA Extraction Kit (K-3032) of Bioneer)를 이용하여 293T세포로부터 DNA를 추출하였다. 추출된 총 120μg의 gDNA를 400μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물과 혼합한 후, 이의 1/10인 40μl를 360μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물과 혼합하고, 상기 혼합된 용액의 1/10을 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물과 다시 희석하는, 연속적 희석(serial dilution)을 7회 수행한 후, 각각을 유리섬유 필터를 통해 여과하였다. 그 후, 상기 필터를 2×2mm2로 자르고 이를 PCR 반응 혼합물에 넣어 PCR 증폭 여부를 확인하였다.
이때 0.1% 아가로스 겔(agarose gel)을 사용하였고 100v에서 30분간 로딩하였다. 더불어 PCR은 총 50μl의 볼륨으로 수행하였고 샘플 5μl와 다이(Dye) 1μl을 혼합하여 로딩하였다.
도 8에 있어, 1번 라인은 100bp 래더이고, 2번 라인은 음성대조군으로, gDNA없이 200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물만 넣은 실험군이며, 3번 라인은 5μl의 GAPDH에 대한 프라이머(정방향 프라이머: TGCACCACCAACTGCTTAGC, 역방향 프라이머: CGCATGGACTGTGGTCATGAG)만 로딩한 실험군이고, 4번 라인은 양성 대조군(상업적 gDNA 분리 키트(gDNA extraction using AccuPrep®Genomic DNA Extraction Kit (K-3032) of Bioneer)를 이용하여 분리된 gDNA(1μg)를 PCR함)이며, 5번 라인은 120μg gDNA를 유리섬유 필터에 고정시킨 후, 이를 2×2mm2 크기로 자른 후 PCR 반응 혼합물에 넣어 PCR 증폭 여부를 확인한 실험군이고, 6번 라인은 12μg gDNA의 PCR 결과이며, 7번 라인은 1.2μg gDNA의 PCR 결과이고, 8번 라인은 120ng gDNA의 PCR 결과이며, 9번 라인은 12ng gDNA의 PCR 결과이고, 10번 라인은 1.2ng gDNA의 PCR 결과이며, 11번 라인은 120pg gDNA의 PCR 결과이고, 12번 라인은 12pg DNA의 PCR 결과이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 12번 라인(12pg의 gDNA)에서도 뚜렷한 밴드를 확인할 수 있는 바, 적은 양의 gDNA에도 PCR 증폭이 우수하게 이루어지는 것을 확인하였다.
5-2. 세포 수에 따른 민감도(sensitivity) 확인
본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하며, 용출과정이 제외된, 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 바로 PCR에 적용하는 핵산 분리 방법에 있어서, 적은 개수의 세포에서 얻어진 gDNA 양에 따른 민감도를 검증하여야 한다. 이를 위하여, 유리섬유 필터를 이용하는 경우 10만개의 세포로부터 100 단위의 gDNA 양에 따른 민감도를 확인하였다.
이를 위해 10만개의 293T 세포를 400μl의 물에 용해시키고 그 중 200μl를 채취하여 새로운 튜브에 옮긴 후, 200μl 물을 첨가하여 혼합하는 방식으로 1/2씩 연속 희석하였다(희석 후에 각 튜브의 볼륨은 200μl임). 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물(GB, gDNA extraction buffer)을 이용해 세포를 용해시키고, 유리섬유 필터를 통해 용출한 후 2×2mm2 크기로 자른 유리섬유 필터를 PCR 반응 혼합물에 넣어 PCR 증폭 여부를 확인하였다.
이때 0.1% 아가로스 겔(agarose gel)을 사용하였고 100v에서 30분간 로딩하였다. 더불어 PCR은 총 50μl의 볼륨으로 수행하였고 샘플 5μl와 다이(Dye) 1μl을 혼합하여 로딩하였다.
도 9에 있어, 1번 라인은 100bp 래더(2μl의 래더 + 3μl의 H2O)이고, 2번 라인은 GAPDH에 대한 프라이머(정방향 프라이머: TGCACCACCAACTGCTTAGC, 역방향 프라이머: CGCATGGACTGTGGTCATGAG)만 로딩한 실험군이며, 3번 라인은 양성 대조군(상업적 gDNA 분리 키트(gDNA extraction using AccuPrep®Genomic DNA Extraction Kit (K-3032) of Bioneer)를 이용하여 분리된 gDNA(1μg)를 PCR함)이고, 4번 라인은 음성 대조군(gDNA없이 200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물만 넣은 실험군, AB-control)이며, 5번 라인은 양성 대조군(1μg의 qDNA와 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물 200μl, AB+control)이고, 6번 라인은 100,000개 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이며, 7번 라인은 50,000개 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이고, 8번 라인은 25,000개 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이며, 9번 라인은 12,500개 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이고, 10번 라인은 6,250개 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이며, 11번 라인은 3,125개 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이고 12번 라인은 1,563개 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이며, 13번 라인은 781개 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 781개의 적은 세포 개수에도 불구하고, gDNA에서 성공적으로 PCR 증폭이 수행되는 것을 확인하였다(13번 라인 참고).
5-3. 박테리아 gDNA(bacteria gDNA) 분리 효율 확인
본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하며, 용출과정이 제외된, 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 바로 PCR에 적용하는 핵산 분리 방법에 있어서, 유리섬유 필터를 이용하는 경우, 세포벽(cell wall)을 가지고 있는 박테리아 gDNA도 분리할 수 있는지 확인하였다.
이를 위해 109개의 E.coli(대장균) 세포와 400μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼를 혼합하여 용해시킨 후, 그 중 200μl를 채취하여 새로운 튜브에 옮기고 200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼를 첨가하여 혼합하는 방식으로 1/2씩 연속 희석하였다(희석 후에 각 튜브의 볼륨은 200μl임). 이를 유리섬유 필터를 통해 용출한 후 2×22 크기로 자른 유리섬유 필터를 PCR 반응 혼합물에 넣어 PCR 증폭 여부를 확인하였다.
박테리아 gDNA에서 증폭하기 위하여 사용한 프라이머는 uidA 유전자에 대한 프라이머이며 정방향 프라이머(uidA Up): TATGGAATTTCGCCGATTTT, 역방향 프라이머(uidA Down): TGTTTGCCTCCCTGCTGCGG)를 사용하였다. 더불어 사용한 PCR 반응 혼합물과 PCR 조건은 상기 실시예에 기재한 바와 같다.
이때 0.1% 아가로스 겔(agarose gel)을 사용하였고 100v에서 30분간 로딩하였다. 더불어 PCR은 총 50μl의 볼륨으로 수행하였고 샘플 5μl와 다이(Dye) 1μl을 혼합하여 로딩하였다.
도 10에 있어, 1번 라인은 100bp 래더이고, 2번 라인은 음성 대조군(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물)이며, 3번 라인은 5μl의 E.coli 유전자에 대한 프라이머만 로딩한 실험군이며, 4번 라인은 양성 대조군(상업적 gDNA 분리 키트(gDNA extraction using AccuPrep®Genomic DNA Extraction Kit (K-3032) of Bioneer)를 이용하여 분리된 gDNA(1μg)를 PCR함)이고, 5번 라인은 1.75×109 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이며, 6번 라인은 1.75×108 개의 E.coli 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이고, 7번 라인은 1.75×107개의 E.coli 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이며, 8번 라인은 1.75×106 개의 E.coli 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이고, 9번 라인은 1.75×105 개의 E.coli 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이며, 10번 라인은 1.75×104 개의 E.coli 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이고, 11번 라인은1.75×103 개의 E.coli 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이며, 12번 라인은 1.75×102 개의 E.coli 세포(200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물) 실험군이다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 175개 정도의 적은 개수의 박테리아 gDNA에서도 성공적으로 PCR 증폭이 수행된 것을 확인하였다(12번 라인 참고).
5-4. pH에 따른 RNA 분리 효율 확인
본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하며, 용출 과정 없이 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 이용한 핵산 분리 방법에 있어서, 세포의 pH에 따른 총 RAN 분리 효율을 확인하였다.
세포로부터 총 RNA를 분리하기 위해서는 DNA와는 다른 pH의 변화가 필요한 바, 다양한 pH 변화하에 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물과 유리섬유 필터를 이용하여, 총 RNA를 분리하고 필터에 고정한 후 용출하여 총 RNA 분리 여부를 확인하였다. 이때 세포는 293T 세포로, 1×106으로 동일하게 사용하였다.
상기 세포를 2ml의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물(GB, gDNA extraction buffer) 2ml과 혼합하고 5분간 인큐베이션하여 용해시켰다. 그 후, 유리섬유 필터를 통해 용출하여 유리섬유 필터에 총 RNA를 고정시키고, 증류수로 용출하여 총 RNA 추출 여부를 확인하였다. pH에 따른 총 RNA 추출 효율을 분석하기 위하여 pH4 내지 pH8의 25mM Tris-HCl을 사용하였다.
이때 1% 아가로스 겔(agarose gel)을 사용하였고 100v에서 30분간 로딩하였다. 더불어 PCR은 총 50μl의 볼륨으로 수행하였고 샘플 5μl와 다이(Dye) 1μl을 혼합하여 로딩하였다.
도 11에 있어, 1번 라인은 100bp 래더(2μl의 래더 + 3μl의 H2O)이고, 2번 라인은 양성 대조군(상업적 총 RNA 분리 키트(total RNA extraction using AccuPrep®Universal RNA Extraction Kit of Bioneer)를 이용하여 분리된 총 RNA(1μg))이고, 3번 라인은 또 다른 대조군으로, 상기 2번 라인과 같이 상업적 총 RNA 분리 키트를 이용해 수득한 총 RNA (1μg)를 2ml의 pH8의 25mM Tris-HCl이 포함된 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물로 용해시킨 실험군이며, 4번 라인 내지 8번 라인은 세포를 각각 pH 4 내지 8의 25mM Tris-HCl이 포함된 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물로 용해한 실험군이다.
도 11에 나타낸 바와 같이, gDNA에 적합한 pH인 pH 8에서는 총 RNA 분리가 잘 이루어지지 않았으나, pH 7 이하에서는 총 RNA가 잘 분리된 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물과 유리섬유 필터를 이용하며, 용출 과정 없이 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 이용한 총 RNA 분리 방법에 있어서, pH 4 내지 7에서 수행하는 것이 바람직함을 확인하였다.
5-5. pH에 따른 RNA 분리 후 PCR 효율 확인
본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물과 유리섬유 필터를 이용하여, 세포로부터 총 RNA를 분리하고 멤브레인 필터에 고정한 후 총 RNA가 고정된 멤브레인을 PCR 튜브에 넣어서 바로 PCR 반응이 가능한지 확인하였다.
DNA와 달리 RNA를 분리하기 위해서는 DNA와는 다른 pH의 buffer 조성의 변화가 필요한 바, pH에 따른 total RNA 추출 후 PCR 반응에 주는 영향을 분석하기 위하여 pH4~pH8의 25mM Tris-HCl을 사용하였다. 다양한 pH 변화하에 이를 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물 2ml을 이용해 1×106 개의 293T 세포를 5분간 인큐베이션하여 용해시켰다. 유리섬유 필터를 통해 용출하여 유리섬유 필터에 total RNA를 고정시키고, 2×2mm2 크기로 잘라 PCR 반응 혼합물에 넣어 PCR 증폭 여부를 확인하였다.
이때 1% 아가로스 겔(agarose gel)을 사용하였고 100v에서 30분간 로딩하였다. 더불어 PCR은 총 50μl의 볼륨으로 수행하였고 샘플 5μl와 다이(Dye) 1μl을 혼합하여 로딩하였다.
도 12에 있어, 1번 라인은 100bp 래더(2μl의 래더 + 3μl의 H2O)이고, 2번 라인은 음성대조군으로, 200μl의 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물만 넣은 실험군이며, 3번 라인은 5μl의 GAPDH에 대한 프라이머 (정방향 프라이머: TGCACCACCAACTGCTTAGC, 역방향 프라이머: CGCATGGACTGTGGTCATGAG) 만 로딩한 결과이고, 4번 라인은 양성 대조군(상업적 총 RNA 분리 키트(total RNA extraction using AccuPrep®Universal RNA Extraction Kit of Bioneer)를 이용하여 분리된 총 RNA(1μg))이며, 5번 라인은 상기 4번 라인과 같이 상업적 총 RNA 분리 키트를 이용해 수득한 총 RNA (1μg)를 2ml의 pH8의 25mM Tris-HCl이 포함된 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물로 용해시킨 실험군이며, 6번 라인은 양성 대조군(상업적 gDNA 분리 키트(gDNA extraction using AccuPrep®Genomic DNA Extraction Kit (K-3032) of Bioneer)를 이용하여 분리된 gDNA(1μg)를 PCR함)이고, 7번 라인은 상기 6번 라인과 같이 상업적 gDNA 분리 키트를 이용해 수득한 gDNA(1μg)를 2ml의 pH8의 25mM Tris-HCl이 포함된 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물로 용해시킨 실험군이며, 8번 라인 내지 12번 라인은 세포를 각각 pH 4 내지 8의 25mM Tris-HCl이 포함된 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물을 이용하여 용해한 실험군이다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 세포를 pH4 내지 7의 25mM Tris-HCl이 포함된, 본 발명의 핵산 분리용 버퍼 조성물로 용해한 후, 이를 유리섬유 필터로 여과시키고, 바로 PCR 튜브에 넣은 PCR을 수행하더라도 성공적으로 수행됨을 확인하였다.
종합적으로 본 발명에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물 및 이를 포함하는 멤브레인 필터가 장착된 핵산 분리용 키트는 단일튜브(one-tube)로 PCR 반응까지 수행할 수 있으며 원스텝(one-step)으로 다양한 샘플로부터 핵산을 분리할 수 있고, 상기 핵산 분리용 버퍼 조성물은 다양한 소재의 멤브레인 필터와 적합성이 우수함을 확인하였다. 더불어 이를 적용한 핵산 분리 방법에 있어서, 별도의 용출 과정 없이 핵산이 고정된 멤브레인 필터를 바로 PCR에 적용할 수 있음을 확인한 바, 본 발명에 따른 핵산 분리용 조성물, 키트 및 분리 방법은 현장에서의 신속한 진단에 유용하게 활용될 수 있다.

Claims (16)

  1. 20%(v/v) 내지 50%(v/v) 에탄올(Ethanol), 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v) SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), 0.5M 내지 1M 염화나트륨(sodium chloride, NaCl), 1mM 내지 100 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 1mM 내지 50mM Tris-HCl을 포함하는 원스텝(one-step) 핵산 분리용 버퍼 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 따른 핵산 분리용 버퍼 조성물을 포함하며, 멤브레인 필터(membrane fliter)가 장착된 컬럼(Column)을 포함하는 원스텝(one-step) 핵산 분리용 키트.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 멤브레인 필터는 폴리비닐리덴 플루오라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF), 나일론 필터(nyron filter), 셀룰로오스 니트레이트 필터(celluose nitrate filter), 종이 필터(paper filter), 유리섬유 필터(glassfiber filter) 및 실리카 필터(silica filter)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 핵산 분리용 키트.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 키트는 주사기 형태인 것을 특징으로 하는, 핵산 분리용 키트.
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA, RNA 및 PNA를 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 핵산 분리용 키트.
  7. 20%(v/v) 내지 50%(v/v) 에탄올(Ethanol), 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v) SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), 0.5M 내지 1M 염화나트륨(sodium chloride, NaCl), 1mM 내지 100 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 1mM 내지 50mM Tris-HCl을 포함하는 원스텝(one-step) 핵산 분리용 버퍼 조성물을 포함하며, 멤브레인 필터(membrane fliter)가 장착된 컬럼(Column)을 포함하는 원스텝(one-step) 핵산 분리용 키트를 이용하여 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법:
    샘플을 상기 원스텝(one-step) 핵산 분리용 버퍼 조성물에 침지하여 용해하는 단계;
    상온에서 상기 샘플이 용해된 용액을 인큐베이션(incubation)하는 단계;
    상기 샘플이 용해된 용액을 멤브레인 필터(membrane fliter)가 장착된 컬럼에 옮기는 단계; 및
    상기 컬럼에 압력을 가하여 필터에 핵산을 고정하고 여과액은 제거하는 단계.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법:
    샘플을 상기 원스텝(one-step) 핵산 분리용 버퍼 조성물에 침지하여 용해하는 단계;
    상온에서 상기 샘플이 용해된 용액을 인큐베이션(incubation)하는 단계;
    상기 샘플이 용해된 용액을 멤브레인 필터(membrane fliter)가 장착된 컬럼에 옮기는 단계;
    상기 컬럼에 압력을 가하여 필터에 핵산을 고정하고 여과액은 제거하는 단계;
    상기 핵산이 고정된 컬럼에 용출 용액을 넣고 멤브레인 필터를 통과시키는 단계; 및
    상기 용출 용액을 수득하는 단계.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 용출 용액은 증류수, TE 버퍼(T ten E one buffer, TE buffer) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 인큐베이션(incubation)은 2분 내지 10분동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법.
  12. 제 7항에 있어서,
    상기 샘플은 생물학적 또는 비생물학적 샘플인 것을 특징으로 하는, 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 비강 흡인물(nasal aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 객담(sputum), 눈물(tears), 침(saliva), 세포(cell), 세포 분리물(cell extract), 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 소변(urine), 정액(semen), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 비생물학적 샘플은 화학적으로 합성된 PNA를 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플로부터 핵산을 분리하는 방법.
  15. 제 7항에 따른 방법으로 분리된 핵산을 주형으로 PCR을 수행하는 단계;를 포함하는 핵산의 증폭방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 PCR은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 및 등온증폭(isothermal amplification) PCR로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 핵산의 증폭방법.
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