JP2021065112A - 植物物質検出用流路チップおよび植物物質検出装置 - Google Patents
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Abstract
Description
項1. (A)植物試料注入部、及び
(C)前記植物試料注入部Aと連結しており、且つ植物物質検出プローブ固定化領域を有する流路、
を含む、流路チップ。
(B)植物試料排出部、及び
(C)前記植物試料注入部Aと前記植物試料排出部Bとを連結しており、且つ植物物質検出プローブ固定化領域を有する流路、
を含む、項1に記載の流路チップ。
(b)前記植物物質検出プローブ固定化領域上のシグナルを検出する工程、
を含む、植物物質検出方法。
(b)前記植物物質検出プローブ固定化領域上のシグナルを検出する工程、及び
(c)前記シグナルの値を指標として植物の状態を判定する工程、
を含む、植物の状態判定方法。
(b)前記植物物質検出プローブ固定化領域上のシグナルを検出する工程、
(c)前記シグナルの値を指標として植物の状態を判定する工程、及び
(d)前記判定の結果に基づいて、植物の栽培条件を調整する工程、
を含む、植物の栽培方法。
本発明は、その一態様において、(A)植物試料注入部、及び(C)前記植物試料注入部Aと連結しており、且つ植物物質検出プローブ固定化領域を有する流路、を含む、流路チップ(本明細書において、「本発明の流路チップ」と示すこともある。)に関する。以下、これについて説明する。
本発明は、その一態様において、本発明の流路チップを備える、装置(本明細書において、「本発明の装置」と示すこともある。)に関する。以下、これについて説明する。
本発明は、その一態様において、本発明の流路チップ、及び/又は本発明の装置を含む、キット(本明細書において、「本発明のキット」と示すこともある。)に関する。以下、これについて説明する。
本発明は、その一態様において、(a)本発明の流路チップの植物物質検出プローブ固定化領域に植物試料を接触させる工程、及び(b)前記植物物質検出プローブ固定化領域上のシグナルを検出する工程、を含む、方法(本明細書において、「本発明の方法」と示すこともある。)に関する。以下、これについて説明する。
<実施例1-1.DNAプローブの固相化>
液投入口2つとこれらを連結する流路(流路幅:1000μm、流路高さ:20μm)と流路上の液吸入口(シリンジポンプ連結部)とを備えるPDMS製プレート(DNAプローブ固相用PDMS製デバイス)を用いて、アミノ基導入スライドガラス(DNAマイクロアレイ用コートスライドグラスTYPE1高密度化アミノ基導入タイプ、MATSUNAMI)上にDNAプローブを固相化した。具体的には以下の様にして行った。
(1)DNAプローブ固相用PDMS製デバイスを、アミノ基導入スライドガラスの上に搭載し、15分間脱気した。搭載した状態を図7に示す。さらに、DNAプローブ固相用PDMS製デバイスの液吸入口にシリンジポンプのチューブ先端を固定化した。液の流路へ導入、通過は、液を投入口にピペットで導入し、吸入口からシリンジポンプにより液を吸引することにより行うことができる。
(2)10%グルタルアルデヒド溶液を流路へ導入し、室温で60分間インキュベーションした。
(3)水を流路へ導入(シリンジポンプ:3.0μl/min、20分間)し、流路を洗浄した。
(4)アミノ基修飾DNAプローブ(aminated probe DNA (Ami-DNA-miR399)
:[Am-C6]-TTTTTTTTTTTTTTTCAGGGCAACT(配列番号1))溶液(2μM)を流路へ導入(シリンジポンプ:1.5μl/min、10分間)し、4℃で一晩インキュベーションした。
(5)洗浄バッファー(0.5 x SSC、0.1% SDS)を流路へ導入(シリンジポンプ:3.0μl/min、20分間)して流路を洗浄し、水の流路への導入(シリンジポンプ:3.0 μl/min、20分間)により流路を洗浄した。
(6)DNAプローブ固相用PDMS製デバイスをスライドガラスから剥離し、ブロワーで余分な水分をとばした。この際、スライドガラス上の、DNAプローブを固相化したラインを、スライドガラスの裏からマーカーで印を付けた。
(7)液投入口と液吸引口とこれらを連結する2本の流路(流路幅:1000μm、流路高さ:20μm)とを備えるユニットを8つ備えるPDMS製プレート(検出用PDMS製デバイス)を、DNAプローブ固相化スライドガラスの上に搭載し、15分間脱気した。この際、剥離する前に付けておいた印を基準に、DNAプローブを固相化したラインと検出用PDMS製デバイスの流路とが直交するように搭載した。搭載した状態を図8に示す。さらに、検出用PDMS製デバイスの液吸引口にシリンジポンプのチューブ先端を固定化した。この状態を図9に示す。同様にして、流路数、ユニット数を変更した検出用PDMS製デバイスも作製した。
(8)ブロッキング溶液(1 x ブロッキング溶液(DIG 洗浄およびブロックバッファーセット、ロシュ))を流路へ導入して、室温で60分間インキュベーションした。
(9)水を流路へ導入(シリンジポンプ:3.0μl/min、5分間)し、流路を洗浄した。
<実施例2-1.流路チップの作製>
(1)液投入口1つと液吸引口2つとこれらを連結する2本の流路(流路幅:500μm、流路高さ:20μm)とを備えるユニットを8つ備える検出用PDMS製プレート(PDMS製デバイス:模式図を図10に示す。)を、アミノ基導入スライドガラス(DNAマイクロアレイ用コートスライドグラスTYPE1高密度化アミノ基導入タイプ、MATSUNAMI)上に搭載し、15分間脱気した。さらに、PDMS製デバイスを送液装置のデバイス設置箇所に配置し、PDMS製デバイスの液吸入口に図11に示す送液装置の液注入口先端を固定化した。液の流路へ導入、通過は、送液装置の吸入口から送液装置のペリスタポンプにより液を吸引することにより行うことができる。
(2)10%グルタルアルデヒド溶液を各ユニットの片方の流路へ導入し、室温で60分間インキュベーションした。以後、(5)まではこちらの片側の流路へ液の導入を行う。
(3)水を流路へ導入(ポンプ:3.0μl/min、10〜15分間)し、流路を洗浄した。
(4)アミノ基修飾DNAプローブ(aminated probe DNA (Ami-DNA-miR399)
:[Am-C6]-TTTTTTTTTTTTTTTCAGGGCAACT(配列番号1))溶液(2μM)を流路へ導入(ポンプ:1.5μl/min、5分間)し、4℃で一晩インキュベーションした。
(5)水を流路へ導入(ポンプ:3.0μl/min、10〜15分間)して流路を洗浄し、或いは洗浄バッファー(0.5 x SSC、0.1% SDS)の流路へ導入(ポンプ:3.0 μl/min、10分間)と水の流路への導入(ポンプ:3.0 μl/min、10分間)により流路を洗浄した。
(6)ブロッキング溶液(1 x ブロッキング溶液(DIG 洗浄およびブロックバッファーセット、ロシュ))を各ユニットの両方の流路へ導入して、室温で60分間インキュベーションした。
(7)水を各ユニットの両方の流路へ導入(ポンプ:3.0μl/min、5分間)し、流路を洗浄した。
図12に示す検出原理に従って、シロイヌナズナ由来のmiR399(miR399b/c)を実施例1の流路チップを用いて検出した。具体的には以下の様にして行った。
(1)試料溶液(組成:miR399(UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUG(配列番号2))(0 nM(blank)又は1 nM)、biotinylated DNA probe(CTCCTTTGGCA-[biotin] (配列番号3))(0.4μM)、Streptavidin-Alexa(Streptavidin Alexa Flour 555 conjugate、サーモフィッシャー)(500 x)、緩衝液(1 x TE、1 x PBS))をチューブで調製し、室温で30分間インキュベーションした。
(2)10μlの試料溶液を流路チップの流路へ導入し、ハイブリダイゼーション(シリンジポンプ:〜0.5μl/min、30分間)した。
(3)洗浄バッファー(1 x 洗浄バッファー(DIG 洗浄およびブロックバッファーセット、ロシュ))で流路を洗浄(シリンジポンプ:1.5μl/min、10〜15分間)した。
(4)蛍光顕微鏡を使用して、流路チップの蛍光像を取得した(露光時間:4秒間)。
(5)蛍光像から蛍光量を定量した(画像解析ソフトウェアImage J、アメリカ国立衛生研究所)。
図12に示す検出原理に従って、シロイヌナズナ由来のmiR399(miR399a/b/c/d/e/f)を実施例1の流路チップを用いて検出した。具体的には以下の様にして行った。
(1)試料溶液(組成:miR399c(UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUG(配列番号2))、miR399a(UGCCAAAGGAGAUUUGCCCUG(配列番号7))、miR399b(CCUGCCAAAGGAGAGUUGCCC(配列番号8))、miR399d(UGCCAAAGGAGAUUUGCCCCG(配列番号9))、miR399e(UGCCAAAGGAGAUUUGCCUCG(配列番号10))、miR399f(UGCCAAAGGAGAUUUGCCCGG(配列番号11))、あるいはmiR156(UGACAGAAGAGAGUGAGCAC(配列番号4))(0 nM(blank)、0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、又は100 nM)、biotinylated DNA probe(CTCCTTTGGCA-[biotin] (配列番号4))(0.4μM)、Streptavidin-Alexa(Streptavidin Alexa Flour 555 conjugate、サーモフィッシャー)(500 x)、緩衝液(1 x TE、1 x PBS)、dithiothreitol(1 mM))をチューブで調製し、室温で30分間インキュベーションした。
(2)10μlの試料溶液を流路チップの流路へ導入し、ハイブリダイゼーション(ポンプ:〜0.5μl/min、30分間)した。
(3)洗浄バッファー(1 x 洗浄バッファー(DIG 洗浄およびブロックバッファーセット、ロシュ))で流路を洗浄(ポンプ:1.5μl/min、10〜15分間)した。
(4)蛍光顕微鏡を使用して、流路チップの蛍光像を取得した(露光時間:4秒間)。
(5)蛍光像から蛍光量を定量した(画像解析ソフトウェアImage J、アメリカ国立衛生研究所)。
複数の標的分子として人工合成のmiR399(配列番号2)とmiRNA156(UGACAGAAGAGAGUGAGCAC)(配列番号4)を用い、一標的分子のみを含む試料および複数の標的分子を含む試料において、標的分子をそれぞれ個別に、特異的に検出することを試みた。
トマト地上部をペッスルで破砕した後、遠心(13000 rpm、4℃、10分間)した。上清を抽出液として使用した。続いて、抽出液の一部をフィルタ(ナノセップ:MWCO30K)にかけて粗精製した溶液を用意した。続いて、試料溶液(組成:フィルタリングなし抽出液、又は、フィルタで粗精製した抽出液、miR399(0 nM(blank)、0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、又は100 nM)、biotinylated DNA probe(0.4μM)、Streptavidin-Alexa(1/500 x)、緩衝液(1 x TE、1 x PBS)、dithiothreitol(100 mM))をチューブで調製した。この試料溶液を用いて実施例3と同様にして検出を行った。
トマト地上部をペッスルで破砕した後、遠心(13000 rpm、4℃、10分間)した。上清を抽出液として使用した。続いて、抽出液の一部にmiR399を0 nM(blank)、0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、又は100 nMとなる様に加えた。続いて、それらの試料をフィルタ(ナノセップ:MWCO30K)にかけて粗精製溶液を用意した。続いて、それぞれの粗精製溶液について、試料溶液(粗精製溶液、biotinylated DNA probe(0.4μM)、Streptavidin-Alexa(1/500 x)、緩衝液(1 x TE、1 x PBS)、dithiothreitol(100 mM))をチューブで調製した。この試料溶液を用いて実施例3と同様にして検出を行った。
トマト地上部をペッスルで破砕して抽出液を得た。続いて、試料溶液(組成:トマト抽出液、miR399(0 nM(blank)又は10 nM)、biotinylated DNA probe(CTCCTTTGGCA-[biotin] (配列番号3))(0.4μM)、Streptavidin-Alexa(Streptavidin Alexa Flour 555 conjugate、サーモフィッシャー)(1/500 x)、緩衝液(1 x TE、1 x PBS)、dithiothreitol(100 mM))を調整した。続いて、それらの試料溶液を対象に、図12に示す検出原理に従って、実施例2の流路チップおよび図11に示す送液装置を用いてmiR399を検出した。具体的には以下の様にして行った。
(1)送液装置のフィルター押さえ下部にフィルターを配置した。フィルターは、通道性を良くなるようにすべく事前に針で穴を開けた。続いて、実施例2の流路チップを送液装置のチップフォルダーにセットした。
(2)各10μlの試料溶液を送液装置の挿入口に導入した。続いて、送液操作により、送液装置から流路チップに試料溶液を導入し、ハイブリダイゼーション(ペリスタポンプ:〜0.4μl/min、30分間)した。
(3)送液操作により、洗浄バッファー(1 x 洗浄バッファー(DIG 洗浄およびブロックバッファーセット、ロシュ))で流路を洗浄(ペリスタポンプ:1.3μl/min、15分間)した。
(4)流路チップを送液装置から外し、蛍光顕微鏡を使用して、流路チップの蛍光像を取得した(露光時間:4秒間)。
(5)蛍光像から蛍光量を定量した(画像解析ソフトウェアImage J、アメリカ国立衛生研究所)。
緩衝液、シロイヌナズナ葉抽出液(At、タンパク量0.2 mg/ml)とトマト葉抽出液(SI、タンパク量0.2 mg/ml)の三つの背景で、合成miRNA399を検出した。具体的には、実施例6と同様にして行った。
緩衝液、トマト葉抽出液(Si、タンパク量0.2 mg/ml)とトマト葉抽出液(SI、タンパク量0.5 mg/ml)の三つの背景で、合成miRNA399を検出した。具体的には、実施例6と同様にして行った。
発芽後6日間栄養リッチな条件で寒天培地上でトマト芽生えを栽培し、その後、再び栄養リッチな通常条件あるいはリン欠乏条件の寒天培地にそれぞれ移し替えて7日間栽培した。通常条件あるいはリン欠乏条件で栽培したトマトの地上部(生重量100 mg程度)を凍結破砕し、粉末を遠心限外ろ過デバイス(ナノセップK30、ポール)にアプライし、遠心(14000g、5min、室温)、フロースルーを回収し、粗精製すり潰し液試料とした。
ガラス温室で、カボチャを水耕栽培にて栄養リッチな条件で一月程度通常の育成を行い、その後、栄養リッチ条件から再び栄養リッチな通常条件あるいはリン欠乏条件に置換して14日間栽培した。そして、それぞれの栽培区で育成したカボチャの葉を採取し植物試料とした。
<実施例13-1.コーティング/キャプチャー抗体の固相化>
(1)実施例1-1と同様にして、DNAプローブ/キャプチャー抗体固相用PDMS製デバイス(図7)を、アミノ基導入スライドガラスの上に搭載し、15分間脱気した後、DNAプローブ/キャプチャー抗体固相用PDMS製デバイスを用意した。
(2)10%グルタルアルデヒド溶液を流路へ導入し、室温で60分間インキュベーションした。
(3)水を流路へ導入(シリンジポンプ:3.0μl/min、15分間)し、流路を洗浄した。
(4)炭酸・重炭酸バッファー(pH9.6)(ELISA complete kit、Bioreba)で1000倍希釈のキャプチャー抗体(Cucumber mosaic virus(CMV)検出抗体、ELISA complete kit、Bioreba)を流路へ導入(20μl、シリンジポンプ:1.5μl/min、10分間)した。
(5)30℃で4時間インキュベーションした。この際、乾燥・蒸発防止のため、PDMS破片でウェルに蓋をした。
(6)洗浄バッファー(ELISA complete kit、Bioreba)で流路を洗浄(シリンジポンプ:3.0μl/min、15分間)した。
(7)DNAプローブ/キャプチャー抗体固相用PDMS製デバイスをスライドガラスから剥離し、ブロワーで余分な水分をとばした。この際、スライドガラス上の、キャプチャー抗体を固相化したラインを、マーカーで印を付けた。続いて、検出用PDMS製デバイスを抗体固相化スライドガラスの上に搭載し、脱気(15分間)した。
(8)ブロッキング液(0.1 M lysine/1 x PBSバッファー背景)を流路へ導入し、室温で30分間インキュベーションした。
(9)洗浄バッファーで流路を洗浄(シリンジポンプ:1.5μl/min、10分間)した。
(10)ブロッキング液(1% BSA/1x PBSバッファー)を流路へ導入(シリンジポンプ:1.5μl/min、10分間)して、室温で60分間インキュベーションした。
(11)洗浄バッファーで流路を洗浄(シリンジポンプ:1.5μl/min、10分間)した。
<実施例14-1.試料溶液の調製>
(1)未感染タバコ葉又はCMV感染タバコ葉の葉片(1 cm四方未満)を凍結破砕し、抽出バッファー(ELISA complete kit、Bioreba)中で、ホモジナイズした。この際、葉片破砕物:抽出バッファー=1:20(w/v)とした。
(2)上清の総タンパク質濃度を測定(ブラッドフォード法)し、0.5 mg/mlに抽出バッファーで調整した。得られた溶液を、通道性を良くなるようにすべく事前に針で穴を開けた遠心限外ろ過デバイス(ナノセップK30、ポール)に全量アプライし、遠心(14000g、5min、室温)、フロースルーを回収し、試料溶液(抗原)とした。
(4)実施例13の流路チップのウェルから洗浄バッファーを除いて、20μlの試料溶液をウェルにアプライし、流路へ試料溶液を導入(シリンジポンプ:0.5μl/min、30分間)した。
(5)4℃で一晩インキュベーションした。この際、乾燥防止のため、PDMSの切れ端でウェルに蓋をした。
(6)洗浄バッファーで流路を洗浄(シリンジポンプ:1.5μl/min、15分間)した。
(7)コンジュゲートバッファー(ELISA complete kit、Bioreba)で1000倍希釈のAP標識抗体を流路へ導入(20μl、シリンジポンプ:1.5μl/min、10分間)した。
(8)30℃で5時間インキュベーションした。この際、乾燥防止のため、PDMSの切れ端でウェルに蓋をした。
(9)洗浄バッファーで流路を洗浄(シリンジポンプ:1.5μl/min、15分間)した。
(10)洗浄バッファーを除き、15μlのAP基質溶液(1mM AttoPhos、プロメガ)を流路に導入(シリンジポンプ:5.0μl/min、3分間)した。
(11)蛍光顕微鏡を使用して、流路チップの蛍光像を取得した(露光時間:0.4秒間)。
(12)蛍光像から蛍光量を定量した(画像解析ソフトウェアImage J、アメリカ国立衛生研究所)。
(13)蛍光像から蛍光量を定量した(画像解析ソフトウェアImage J、アメリカ国立衛生研究所)。
2 流路C
3 流路チップ中の、フィルターからなる植物試料精製部
4 流路チップ
5 装置中の、フィルターからなる植物試料精製部
Claims (17)
- (A)植物試料注入部、及び
(C)前記植物試料注入部Aと連結しており、且つ植物物質検出プローブ固定化領域を有する流路、
を含む、流路チップ。 - (A)植物試料注入部、
(B)植物試料排出部、及び
(C)前記植物試料注入部Aと前記植物試料排出部Bとを連結しており、且つ植物物質検出プローブ固定化領域を有する流路、
を含む、請求項1に記載の流路チップ。 - 前記植物物質が、核酸、タンパク質、ペプチド、糖鎖、細菌、ウイルス、及び低分子化合物からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1又は2に記載の流路チップ。
- 前記植物物質が環境応答遺伝子群、器官/組織/細胞の発生成長関連遺伝子群、ストレス応答遺伝子群等に直接コードされる生育状態の指標となる生体内分子群、環境応答遺伝子群、器官/組織/細胞の発生成長関連遺伝子群、ストレス応答遺伝子群等に間接的に生成される生育状態の指標となる生体内分子群、miR399、miR395、miR172、miR156等のmiRNA、siRNA、その他のnon-coding RNA、mRNA、 FTタンパク質、FTホモログタンパク質(TSFタンパク質、Hd3aタンパク質、RFT1タンパク質、ZCN8タンパク質等やAFTタンパク質等)、HY5タンパク質、CLAVATA3/ESR-relatedペプチド、C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDEペプチド、CEP DOWNSTREAMタンパク質等の植物の維管束である篩管や道管を介して全身へ移行するシグナル分子群及び、篩管や道管といった植物の維管束を介して感染するウィルスに由来するRNA及びタンパク質群からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項1〜3のいずれかに記載の流路チップ。
- 前記植物物質が1〜4000種の植物物質である、請求項1〜4のいずれかに記載の流路チップ。
- 前記植物物質がRNAである、請求項1〜5のいずれかに記載の流路チップ。
- さらに、フィルターからなる植物試料精製部を含む、請求項6に記載の流路チップ。
- 植物の状態判定用である、請求項1〜7のいずれかに記載の流路チップ。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の流路チップを備える、植物試料注入装置。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の流路チップを備える、植物物質検出装置。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の流路チップを備える、植物の状態判定装置。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の流路チップ、及び/又は請求項9に記載の植物試料注入装置を含む、植物物質検出キット。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の流路チップ、及び/又は請求項10に記載の植物物質検出装置を含む、植物物質検出キット。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の流路チップ、及び/又は請求項11に記載の植物状態判定装置を含む、植物の状態判定キット。
- (a)請求項1〜8のいずれかに記載の流路チップの植物物質検出プローブ固定化領域に植物試料を接触させる工程、及び
(b)前記植物物質検出プローブ固定化領域上のシグナルを検出する工程、
を含む、植物物質検出方法。 - (a)請求項1〜8のいずれかに記載の流路チップの植物物質検出プローブ固定化領域に植物試料を接触させる工程、
(b)前記植物物質検出プローブ固定化領域上のシグナルを検出する工程、及び
(c)前記シグナルの値を指標として植物の状態を判定する工程、
を含む、植物の状態判定方法。 - (a)請求項1〜8のいずれかに記載の流路チップの植物物質検出プローブ固定化領域に植物試料を接触させる工程、
(b)前記植物物質検出プローブ固定化領域上のシグナルを検出する工程、
(c)前記シグナルの値を指標として植物の状態を判定する工程、及び
(d)前記判定の結果に基づいて、植物の栽培条件を調整する工程、
を含む、植物の栽培方法。
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