CN108611364A - 一种非转基因crispr突变体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于CRISPR‑Cas9技术的非转基因突变体的制备方法，具体的，包括构建方法和筛选方法。构建方法为将CRISPR‑Cas9及sgRNA预组装，定位在农杆菌的T‑DNA，通过农杆菌侵染目标植物及共培养，CRISPR‑Cas9及sgRNA的序列不需要整合到目标植物基因组里，就可实现目标植物的目的基因定点改变，使得到的目的基因定点改变的突变体材料，不需要经过有性生殖和后代分离群体筛选等过程，也不含有任何外源基因序列。本发明提供的高通量测序与高分辨率熔解曲线技术对得到的再生苗进行筛选，能够在转基因当代高效、快速地从再生苗中鉴定得到目的基因发生突变的突变体植株，即使是对突变体比例为混合群体1/100的低比例突变体筛选，本发明的筛选方法仍可保证优异的准确性和灵敏度。

Description

一种非转基因CRISPR突变体的制备方法
技术领域
本发明属于现代分子育种技术领域，涉及在不导入外源基因的前提下利用基因编辑技术构建及筛选作物突变体，具体为一种非转基因CRISPR突变体的制备方法。
背景技术
转基因技术为作物改良提供了强大的工具。然而，公众对转基因作物中的外源基因及其表达可能引起的食品安全和基因漂移问题存在担忧，制约了转基因技术的应用。近年来，CRISPR-Cas9技术介导的基因组编辑迅猛发展，其精准和高效性使以其为基础的定点突变在作物改良方面具有巨大的应用潜力，甚至有望替代传统的转基因技术。
目前植物中最广泛应用的CRISPR-Cas9技术依赖于Cas9核酸内切酶和sgRNA基因稳定整合到目标植物基因组中。对于单年生有性繁殖目标植物，稳定整合的外源基因(包括Cas9和sgRNA基因等)能够通过有性生殖和后代分离群体筛选实现与目标突变的分离，从而从基因组中清除出去，得到非转基因的突变子代。然而，有性生殖及后代群体筛选清除外源基因的方法不适用于通过无性繁殖的多年生植物。因为这些植物大多具有较长的童期，需要多年生长之后才能进行有性生殖；更重要的是，其基因组大多高度杂合，有性生殖将导致子代中重要优异性状的分离。因此，在依赖于无性繁殖的多年生杂交作物中，需要直接构建非转基因的CRISPR-Cas9突变体。
已有研究表明，进入原生质体的预组装的CRISPR-Cas9核糖核蛋白能够引起目的基因突变，不需要CRISPR-Cas9基因稳定整合至目标植物基因组中。目前，通过基因枪的方法已成功将CRISPR-Cas9核糖核蛋白导入小麦和玉米细胞中，产生非转基因的突变体。然而，原生质体和基因枪的方法仅适用于少部分作物，很多作物无法通过原生质体实现整株植株的再生。
大多数作物能够利用叶片、下胚轴、子叶、愈伤等外植体实现再生，通过农杆菌与外植体共培养已能够在很多多年生作物的细胞中实现农杆菌T-DNA基因的瞬时表达和蛋白合成。但是，将Cas9基因定位于农杆菌T-DNA区，能否成功在作物细胞中瞬时表达，并实现CRISPR-Cas9蛋白对目标作物基因的定点突变尚未见报道。
另一方面，CRISPR-Cas9技术对目标作物基因的定点突变是由目标植物在修复Cas9剪切DNA位点时随机自动发生的，可以在目标区段内引起不同类型的基因突变，可能是删除少数几个核苷酸，也有可能导致增加少数核苷酸或是替换原有的核苷酸，不同独立株系的突变植株的情况不同。而大多数的基因突变在小苗期无法直观确定其表型变化，即无法通过表型判断是否为突变体植株。且由于希望得到的是外源基因没有整合到基因组上的植株，这类植株通常对抗生素没有抗性，无法使用抗生素进行筛选，导致获得的再生苗中既包含突变体植株，也包含没有发生突变的野生型植株。因此需要采用特定的方法进行筛选鉴别，从较大样本中将突变体植株筛选出来。
发明内容
本发明提供一种基于CRISPR-Cas9技术的非转基因突变体的构建和筛选方法，使得到的目的基因定点改变的突变体材料，不需要经过有性生殖和后代分离群体筛选等过程，也不含有任何外源基因序列。
一种非转基因CRISPR-Cas9突变体植株制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1：将含有1个内含子的Cas9基因连入CRISPR基础载体，得到具有内含子的CRISPR-Cas9载体；
S2：根据目的基因，设计sgRNA靶定序列，并进一步连入启动子序列，合成具有启动子的sgRNA序列；
S3：将S2所得的具有启动子的sgRNA序列连入S1所得的具有内含子的CRISPR-Cas9载体，得到预组装Cas9突变载体；
S4：将S3得到的预组装Cas9突变载体转化农杆菌，将带有预组装Cas9突变载体的农杆菌侵染目标植物外植体，共培养；
S5：将S4共培养后的外植体转移至适合再生且不添加抗生素的培养基上，在适用于目标植物的、农杆菌介导的遗传转化条件下，诱导目标植物愈伤和芽再生，得到若干株独立株系的再生苗；
基于以上构建方法，由于预组装Cas9突变载体中CRISPR-Cas9及sgRNA定位在农杆菌的T-DNA，通过农杆菌侵染目标植物及共培养，CRISPR-Cas9及sgRNA的序列不需要整合到目标植物基因组里，就可实现目标植物的目的基因定点改变，即sgRNA引导CAS9到目标植物目的基因的靶定序列处，通过CAS9对该位置进行剪切，实现目的基因sgRNA靶定序列区域的序列被准确编辑，并且目标植物基因组中不一定含有外源基因序列。
然而，由于希望得到的是基因组中不含有任何外源基因序列的植株，这类植株通常对抗生素没有抗性，因此在遗传转化过程中不能够使用抗生素进行筛选，导致获得的再生苗中既包含突变体植株，也包含没有发生突变的野生型植株。因此需要对构建产物进一步筛选和鉴定，以从制备所得到的大量独立株系的再生苗中，进一步筛选出目的基因sgRNA靶定序列区域的序列被准确编辑的植株。
S6：将S5得到的独立株系的再生苗随机分成若干待测组，分别将各待测组中每株再生苗取等量叶片组织，混合，提取DNA，采用目的基因sgRNA靶定区域的特异性引物PCR扩增包含以sgRNA靶定位点为中心的上下游共80-120bp的区域，得到各待测组PCR产物样本；取野生型植株叶片组织，混合，提取DNA，并PCR扩增相同区域，得到野生组PCR产物样本，野生型植株叶片取样植株数无特殊限制；使用野生组PCR产物样本对各待测组PCR产物样本进行稀释，得到各待测组对应的稀释组PCR产物样本；
S7：分别高通量测序S6得到的各待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和各稀释组PCR产物样本，使用BWA软件默认参数将测序所得序列定位至PCR扩增区域的野生型序列上；分别统计待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和稀释组PCR产物样本每个位点处与野生型序列相同的核苷酸的比例，得到非变异核苷酸频率，变异核苷酸总频率则为1-非变异核苷酸频率；比较每个位点在待测组、其对应稀释组和野生组样本中的变异核苷酸总频率；若某一位点变异核苷酸总频率符合“待测组>>稀释组≥野生组”，则表明该位点存在突变；若某一待测组PCR产物样本存在符合“待测组>>稀释组≥野生组”规律的位点，则表明该待测组含有目的基因发生突变的突变体植株，则该待测组为突变组；
由于实际操作中，有些位点在高通量测序中错误率高，即表现为变异核苷酸频率高。这样的情况下，当待测组中所含独立株系再生苗超过40株时，采用现有的筛选方法，即仅对待测组测序，所得到的结果很可能是不含有突变体的待测组中也存在高频率的变异核苷酸，导致假阳性率高，筛选准确率非常不理想。本发明增加了稀释组这一设置，野生组和待测组中变异核苷酸频率都高的位点，稀释组其变异核苷酸频率不会下降；而只在突变体中存在的真实突变的变异核苷酸，因为在野生组中不存在，因此在稀释组中的频率就会大幅下降，以此去除本身测序错误率高的位点对真实突变位点的影响。
以上步骤可从各待测组中筛选到具有真实突变体植株的突变组，在此基础上，进一步对筛选出的突变组进行高分辨率熔解曲线分析，以得到具体的突变植株，分辨率熔解曲线分析方法如下：
S8：分别将S7筛选得到的突变组进一步分成若干待测亚组，分别将各待测亚组中每株再生苗取等量叶片组织，混合，提取DNA；取野生型植株叶片组织，混合，提取DNA，野生型植株叶片取样植株数无特殊限制；对待测亚组与野生组使用同样的sgRNA靶定位点附近区域特异性引物在同样条件下进行高分辨率熔解曲线PCR，若待测亚组与野生组曲线明显分离(两曲线在差异最大处的值统计检验P<0.001)，则该待测亚组为突变亚组；每组突变亚组的每个独立再生小苗分别与野生型小苗取等量叶片组织1:1混合，提取DNA，进行高分辨率熔解曲线PCR；若所得曲线与野生组有明显分离，则该独立再生小苗为目的基因发生突变的突变体植株；
S9：取S8筛选得到的突变体植株的叶片组织，提取DNA，使用任意两对或两对以上定位于T-DNA插入片段的引物进行PCR扩增，以避免出现假阴性结果；并同时使用前述S3中预组装的PDS-Cas9突变载体DNA作为阳性对照。若阳性对照可扩增得到PCR产物，而突变体DNA两对或两对以上引物均无法得到扩增产物，则表明该突变体植株中很可能不含有外源基因序列，即CRISPR-Cas9及sgRNA的序列未整合到目标植物基因组中，将该植株作为非转基因突变体候选植株；
S10：将S9得到的非转基因突变体候选植株无性繁殖，对无性繁殖植株进行CRISPR-Cas9载体T-DNA区抗性基因的抗性筛选，若植株不具有抗性，则表明该植株基因组中不含有外源基因序列，为非转基因CRISPR-Cas9突变体植株；
S11：将S10鉴定得到的非转基因CRISPR-Cas9突变体植株转移至适宜的生根培养基，继续培养，得到非转基因CRISPR-Cas9突变体完整植株。
进一步的，S6中所述各待测组的植株数为50-100株。
进一步的，所述S7中先分别统计待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和稀释组PCR产物样本在Cas9剪切位点，即sgRNA靶定位点3’端3-8个核苷酸区域，及其上下游共14-20bp区域内的位点的变异核苷酸总频率，如该区域内所有位点的变异核苷酸总频率均不符合“待测组>>稀释组≥野生组”，则进一步统计整个PCR扩增共80-120bp区域。
具体的，S7中分别高通量测序S6得到的各待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和各稀释组PCR产物样本，用BWA软件默认参数将待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本、稀释组PCR产物样本测序所得的原始clean reads，定位在PCR扩增区域的野生型序列上。由于通常突变位点就在Cas9剪切位点，即sgRNA靶定位点3’端3-8个核苷酸区域，上下游比较短的区域内，因此，可先统计并比较待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和稀释组PCR产物样本在Cas9剪切位点上下游较短区域，具体的，sgRNA靶定位点3’端3-8个核苷酸及其上下游共14-20bp区域内每个位点的变异核苷酸总频率，如果该区域内某一位点变异核苷酸总频率符合“待测组>>稀释组≥野生组”，则为存在突变体。如果该区域内所有位点的变异核苷酸总频率均不符合“待测组>>稀释组≥野生组”，为了避免可能在离剪切位点较远的区域存在突变，则进一步统计整个PCR扩增区域即sgRNA靶定区域上下游共80-120bp区域。
进一步的，所述目标植物为烟草，所述目的基因为烟草PDS基因。
进一步的，S1所述含有1个内含子的Cas9基因为以5’端-SpeI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-SpeI酶切位点-含1个内含子的Cas9基因序列-ApaI酶切位点-ApaI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，直接基因合成含有1个完整内含子的Cas9基因(SEQID NO.1)；所述CRISPR基础载体为pK7WGF2::hCas9(Addgene质粒号#46965)；使用限制性内切酶SpeI和ApaI双酶切将含有1个内含子的Cas9基因连入载体；使用内含子区域特异性引物In-F(5’-TGACGCACAATCCCACTATC-3’)(SEQ ID NO.2)和In-R(5’-ATCCACCTTAGCCATCTCATTAC-3’)(SEQ ID NO.3)进行PCR扩增并测序，验证得到连接正确的具有内含子的CRISPR-Cas9载体。
进一步的，S2所述目的基因为烟草PDS基因，根据已知的烟草PDS基因第四个外显子的序列，设计sgRNA靶定序列：5’-GCTGCATGGAAAGATGATGA-3’(SEQ ID NO.15)，进而以5’端-XbaI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-XbaI酶切位点-拟南芥U6-26基因启动子-PDSsgRNA靶定序列-sgRNA骨架序列-KpnI酶切位点-KpnI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成具有启动子的U6-sgRNA序列(SEQ ID NO.4)。
进一步的，所述S3中，使用限制性内切酶XbaI和KpnI双酶切将S2所得的具有启动子的U6-sgRNA序列连入S1所得的具有内含子的CRISPR-Cas9载体T-DNA，使用U6-sgRNA区域特异性引物sg-F(5’-CCCTGGGAATCTGAAAGAAGAG-3’)(SEQ ID NO.5)和sg-R(5’-TAATTCGCGGTACCAAGTTCA-3’)(SEQ ID NO.6)进行PCR扩增并测序，验证得到连接正确的预组装PDS-Cas9突变载体。
进一步的，所述S4中，使用冻融法将预组装PDS-Cas9突变载体转化至农杆菌EHA105感受态细胞中，使用引物In-F和In-R进行农杆菌菌落PCR并测序，将得到阳性克隆菌侵染烟草外植体，所述侵染时间为20min。侵染转移至含100μM AS的MS固体培养基上(培养基中不添加任何抗生素)黑暗25℃培养三天。
将共培养后的烟草叶片转移至含2.0mg/L BAP、150mg/L特美汀的MS固体培养基上(培养基中不添加任何抗生素)。16h光照/8h黑暗、25℃培养4周，得到若干株独立株系的再生苗。
进一步的，S6中所述目的基因sgRNA靶定区域的特异性引物为烟草PDS基因第四个外显子PDS sgRNA靶定区域的特异性引物PDS-F(5’-CTGAAGCAGTCACCAAGA-3’)(SEQ IDNO.7)和PDS-R(5’-AGTACGCATTCTTGAGGAGTC-3’)(SEQ ID NO.8)，待测组PCR产物样本和野生组PCR产物样本使用所述烟草PDS基因第四个外显子PDS sgRNA靶定区域的特异性引物，进行50μl普通PCR扩增；所述稀释组PCR产物样本为测定待测组PCR产物样本和野生组PCR产物样本的DNA浓度后，使用大于5倍于待测组PCR产物样本DNA量的野生组PCR产物样本DNA稀释待测组PCR产物样本得到。
S7中分别高通量测序S6得到的各待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和各稀释组PCR产物样本，用BWA软件默认参数将待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本、稀释组PCR产物样本测序所得的原始clean reads，定位在PCR扩增区域的野生型序列，即已知烟草PDS基因序列上(NCBI Genbank序列号：NW_015814914.1)上；由于通常突变位点就在Cas9剪切位点，即sgRNA靶定位点(SEQ ID NO.15)3’端3-8个核苷酸区域，上下游比较短的区域内，因此，可先统计并比较待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和稀释组PCR产物样本在Cas9剪切位点上下游较短区域，具体的，sgRNA靶定位点3’端3-8个核苷酸及其上下游共16bp区域内每个位点的变异核苷酸总频率，如果该区域内某一位点变异核苷酸总频率符合“待测组>>稀释组≥野生组”，则为存在突变体。如果该区域内所有位点的变异核苷酸总频率均不符合“待测组>>稀释组≥野生组”，为了避免可能在离剪切位点较远的区域存在突变，则进一步统计整个PCR扩增区域即包含烟草PDS sgRNA靶定位点为中心的上下游共80-120bp区域。
进一步的，S9中，所述三对定位于T-DNA插入片段的引物为特异于T-DNA插入序列的引物1F(5’-AGGTGGCGAAGTCATCTGC-3’)(SEQ ID NO.9)和1R
(5’-TGTCGTTTCCCGCCTTCAG-3’)(SEQ ID NO.10)、特异于Cas9基因的引物2F
(5’-GCCTGTTTGGTAATCTTATCGC-3’)(SEQ ID NO.11)和2R
(5’-TCTTTCCACTCTGCTTGTCTCG-3’)(SEQ ID NO.12)、特异于卡那霉素抗性基因的引物3F(5’-ACTGGGCACAACAGACAATC-3’)(SEQ ID NO.13)和3R
(5’-ACCGTAAAGCACGAGGAA-3’)(SEQ ID NO.14)。
进一步的，S10中，无性繁殖非转基因突变体候选植株，待无性繁殖小苗生长2周，取其地上部转移至含100mg/L卡那霉素的MS培养基中生长，若小苗不具有抗性，死亡，则表明植株中不含有外源基因，为非转基因CRISPR-Cas9突变体植株，即外源基因没有整合到烟草的基因组上的，且PDS sgRNA靶定区域被准确编辑的烟草植株，将其转移至适宜的生根培养基，继续培养，得到非转基因CRISPR-Cas9突变体完整植株。
前述非转基因CRISPR-Cas9突变体植株制备方法在目的基因定点突变的非转基因CRISPR突变体构建中的应用，进一步的，在有性生殖后会产生性状分离的或童期长的多年生杂交作物的非转基因CRISPR突变体构建中的应用。
由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比，有益效果在于：
1、本发明应用农杆菌瞬时侵染技术，可在转基因当代直接得到不含有任何外源基因序列的、目的基因定点改变的CRISPR-Cas9突变体植株，不需要进行耗时费事地进行有性繁殖以及子代植株中外源基因与突变基因的分离鉴定，特别适用于有性生殖后会产生性状分离的或童期长的多年生杂交作物的非转基因CRISPR突变体构建中的应用。
2、本发明筛选方法中增加了稀释组这一设置，对于野生组和待测组中变异核苷酸频率都高的位点，稀释组其变异核苷酸频率不会下降；而只在突变体中存在的真实突变的变异核苷酸，因为在野生组中不存在，因此在稀释组中的频率就会大幅下降，以此去除本身测序错误率高的位点对真实突变位点的影响。
3、本发明应用高通量测序与高分辨率熔解曲线技术对得到的再生苗进行筛选，能够在转基因当代高效、快速地从再生苗中鉴定得到目的基因发生突变的突变体植株，即使是对突变体比例小于混合群体1/100的低比例突变体筛选中，本发明的筛选方法仍可保证优异的准确性和灵敏度。
4、本发明在转基因植株再生过程中不使用任何抗生素进行筛选，对于对抗生素敏感的、转基因难度较大的植物材料，相对更容易获得再生植株。
附图说明
图1为实施例1中PDS sgRNA靶定序列设计示意图。
4th外显子：烟草PDS基因第四个外显子。
图2为实施例1中Cas9载体T-DNA插入区域示意图。
in：Cas9基因所含内含子；Primer set 1-3：用于检测非转基因烟草突变体的3对引物1F&1R、2F&2R、3F&3R；LB、RB：T-DNA插入左边界、右边界。
图3为实施例4高通量测序检测再生植株在Cas9剪切位点附近的突变。
横坐标为Cas9剪切位点上下游的核苷酸序列及其对应位点；纵坐标为该位点处变异核苷酸总频率。三角、方框和圆点分别代表待测组、对应稀释组及野生组样本的值。待测组1、2、3、20组分别对应实施例4表4中的待测组1、2、3、20样本。
图4为实施例5高分辨率熔解曲线筛选烟草突变体。
待测亚组1-6组分别对应实施例5表6中的待测亚组1-6样本，WT为野生组样本。
图5为实施例6烟草pds基因突变体的抗性筛选。
烟草pds基因突变体pds-7(左)和pds-9(右)的无性繁殖小苗转移至含100mg/L卡那霉素的MS培养基中生长0天(A)、20天(B)、35天(C)。突变体pds-7在含卡那霉素的MS培养基中培养后死亡，说明其不含有外源基因，为鉴定需要的非转基因突变体。
图6为实施例7高通量测序检测低比例突变体群体中Cas9剪切位点附近的突变。
横坐标为Cas9剪切位点上下游的核苷酸位点；纵坐标为该位点处变异核苷酸总频率。三角、方框和圆点分别代表低比例突变体待测组、对应稀释组及野生组样本的值。1/100待测组1与1/100待测组4分别对应实施例7表9中的1/100待测组1、4样本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明若无特别说明，原来均可市购获得，方法为本领域的常规方法。
实施例1.Cas9突变载体的构建
1.以5’端-SpeI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-SpeI酶切位点-含1个内含子的Cas9基因序列-ApaI酶切位点-ApaI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，直接基因合成含有1个完整内含子的Cas9基因(SEQ ID NO.1)。使用限制性内切酶SpeI和ApaI双酶切37℃过夜将CRISPR基础载体pK7WGF2::hCas9(Addgene质粒号#46965)线性化，利用Infusion方法，将含有内含子的Cas9基因连入载体，得到内含子Cas9载体。使用内含子区域特异性引物In-F(5’-TGACGCACAATCCCACTATC-3’)(SEQ ID NO.2)和In-R(5’-ATCCACCTTAGCCATCTCATTAC-3’)(SEQ ID NO.3)进行20μl普通PCR扩增并测序，验证载体连接是否正确。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：94℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环。
2.根据已知的烟草PDS基因第四个外显子的序列，设计PDS sgRNA靶定序列(5’-GCTGCATGGAAAGATGATGA-3’)(SEQ ID NO.15，图1)，以5’端-XbaI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-XbaI酶切位点-拟南芥U6-26基因启动子-PDS sgRNA靶定序列-sgRNA骨架序列-KpnI酶切位点-KpnI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，直接合成U6-sgRNA序列(SEQ ID NO.4)。使用限制性内切酶XbaI和KpnI双酶切37℃过夜将内含子Cas9载体线性化，利用Infusion方法，将U6-sgRNA序列连入内含子Cas9载体，得到PDS-Cas9突变载体。载体T-DNA插入区域示意图如图2。使用sgRNA区域特异性引物sg-F(5’-CCCTGGGAATCTGAAAGAAGAG-3’)(SEQ ID NO.5)和sg-R(5’-TAATTCGCGGTACCAAGTTCA-3’)(SEQ ID NO.6)进行20μl普通PCR扩增并测序，验证载体连接是否正确。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：94℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环。
3.以上各步Infusion反应的反应体系见表2，反应温度为37℃，反应时间30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。
表1 20μl普通PCR扩增反应体系
ddH2O Up to 20μl
引物1 1μl(0.4μM)
引物2 1μl(0.4μM)
DNA模板 1μl(0.1ng–5ng)
Premix Taq(TaKaRa TaqTM Version 2.0plus dye) 10μl
表2 Infusion反应体系
ddH2O Up to 20μl
5×CE II Buffer 4μl
线性化克隆载体 50-200ng
插入片段扩增产物 20-200ng
ExnaseTM II酶 2μl
实施例2.农杆菌的转化
使用冻融法将PDS-Cas9突变载体转化至农杆菌EHA105感受态细胞中。具体步骤如下：50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA0.1-1μg(5-10μl)，冰浴30min；放入液氮中5min(或1min)，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；取出离心管，立即置于冰上冰浴2min，之后加入900μl不含任何抗生素的LB，28℃、220rpm振荡培养3-5h；取出菌液，3000转离心3min，之后去掉850μl的上清液，留下100μl上清液用枪吸打悬浮菌块沉淀，然后均匀涂布在含100mg/L大观霉素的LB平板。2天左右菌落可见。挑取单菌落，接种于5ml含100mg/L大观霉素的LB液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养过夜。使用引物In-F和In-R进行农杆菌菌落PCR(20μl普通PCR扩增)及测序，验证载体转化是否正确。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：94℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环。将菌落PCR检测确认的阳性克隆菌液于-80℃保存备用。
实施例3.烟草的瞬时侵染
1.农杆菌准备：取实施例2中-80℃保存的农杆菌，在含100mg/L大观霉素的LB平板上划线，28℃培养2天。挑取单菌落接种于含有相同浓度抗生素的5ml LB液体培养基中，200rpm 28℃振荡培养16h。取5ml菌液加入新的50ml LB培养基中，200rpm 28℃再振荡培养6-8h左右使OD600值为0.6-0.8。4℃条件下5000rpm离心15min，菌体沉淀用50ml重悬液(MS+100μM AS)180rpm 28℃振荡1h后待用。
2.农杆菌侵染及共培养：取烟草无菌苗的健壮叶片，剪成约0.5cm2大小，浸入待用的农杆菌重悬液中侵染20min。结束后用滤纸吸去多余的重悬液，转移至含100μM AS的MS固体培养基上(培养基中不添加任何抗生素)黑暗25℃培养三天。
3.愈伤和芽再生：将共培养后的烟草叶片转移至含2.0mg/L BAP、150mg/L特美汀的MS固体培养基上(培养基中不添加任何抗生素)。16h光照/8h黑暗、25℃培养4周，得到独立株系的再生苗(表3)。
表3无抗生素筛选获得的烟草独立株系再生苗
实施例4.高通量测序筛选烟草突变体
1.突变体测序样本准备：取实施例3制备得到的独立株系的再生苗，以47株烟草独立株系的再生苗为1组，共取24组(表4)。其中15组，每组分别包含至少1株烟草PDS基因突变的白色再生苗；另外9组全部由正常绿色再生苗组成，即不含有PDS基因突变植株。对于每组待测样本，取每株再生苗的等量叶片组织混合，提取DNA，使用烟草PDS基因第四个外显子PDS sgRNA靶定区域的特异性引物PDS-F(5’-CTGAAGCAGTCACCAAGA-3’)(SEQ ID NO.7)和PDS-R(5’-AGTACGCATTCTTGAGGAGTC-3’)(SEQ ID NO.8)进行50μl普通PCR扩增，得到各待测组PCR产物样本。
表4高通量测序样本分组情况
分组 所含白色烟草株系 所含绿色烟草独立株系数 烟草株系总数
待测组1 pds-1 46 47
待测组2 pds-2 46 47
待测组3 pds-3 46 47
待测组4 pds-4 46 47
待测组5 pds-5 46 47
待测组6 pds-6 46 47
待测组7 pds-7、pds-8 45 47
待测组8 pds-9、pds-10 45 47
待测组9 pds-11、pds-12 45 47
待测组10 pds-13、pds-14 45 47
待测组11 pds-15、pds-16、pds-17 44 47
待测组12 pds-18、pds-19、pds-20 44 47
待测组13 pds-21、pds-22、pds-23 44 47
待测组14 pds-24、pds-25、pds-26 44 47
待测组15 pds-27、pds-28、pds-29 44 47
待测组16 无 47 47
待测组17 无 47 47
待测组18 无 47 47
待测组19 无 47 47
待测组20 无 47 47
待测组21 无 47 47
待测组22 无 47 47
待测组23 无 47 47
待测组24 无 47 47
野生组 无 1 1
取烟草野生型无菌苗叶片(表4)，提取DNA，使用引物PDS-F(SEQ ID NO.7)、PDS-R(SEQ ID NO.8)进行50μl普通PCR扩增，得到野生组PCR产物样本。使用Nanodrop荧光分光光度计分别测定待测组和野生组PCR产物样本的DNA浓度，使用6倍于待测组样本DNA量的野生组样本DNA稀释待测组样本，得到稀释组PCR产物样本，即稀释组样本中突变体DNA浓度为待测组样本中的1/7。50μl普通PCR扩增反应体系见表5，PCR反应条件为：94℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环。
表5 50μl普通PCR扩增反应体系
ddH2O Up to 50μl
引物1 1μl(0.4μM)
引物2 1μl(0.4μM)
DNA模板 1μl(0.1ng–10ng)
Premix Taq(TaKaRa TaqTM Version 2.0plus dye) 25μl
烟草叶片DNA提取使用TIANGEN DNAsecure Plant Kit，具体步骤为：①取100mg新鲜的烟草叶片，加入液氮充分研磨，把组织粉末用液氮冷却的黄枪头转入1.5ml的离心管中，加入400μl的缓冲液LP1和6μl RNase A(10mg/ml)，漩涡振荡1min，室温放置10min。②加入130μl的缓冲液LP2，漩涡振荡1min使其充分混匀。③12,000rpm离心5min，将上清液移至新的离心管中。④向离心管中加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即15s振荡混匀。⑤将上一步得到的溶液加入到吸附柱CB3中，12,000rpm离心30s，倒掉废液。⑥向吸附柱中加入600μl的漂洗液PW，12,000rpm离心30s，倒掉废液。⑦同上重复一次。⑧12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置5min。⑨将吸附柱转入到一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL的洗脱缓冲液TE，室温放置3min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
2.高通量测序及分析：分别高通量各测序待测组、野生组和各相应稀释组样本，使用BWA软件默认参数将测序所得序列定位至PCR扩增区域的已知烟草PDS基因序列(NCBIGenbank序列号：NW_015814914.1)上。选取Cas9剪切位点，即sgRNA靶定位点(SEQ IDNO.15)3’端3-8个核苷酸区域，及其上下游共16bp序列，统计其每个位点处所测得的全部核苷酸中，与野生型序列相同的核苷酸的比例，即为该位点的非变异核苷酸频率；变异核苷酸总频率则为1-非变异核苷酸频率。比较该16bp序列每个位点在每个待测组、其对应稀释组及野生组样本中的变异核苷酸总频率。若16bp序列所有位点的变异核苷酸总频率均不符合“待测组>>稀释组≥野生组”，则进一步统计比较整个PCR扩增区域全部位点在待测组、其对应稀释组及野生组样本中的变异核苷酸总频率。
24组烟草再生苗样本的分析结果表明，所有15组含有突变再生苗的待测组样本，均在16bp序列中存在变异核苷酸总频率符合“待测组>>稀释组≥野生组”的位点(如图3B-图3D)；而所有9组不含有突变再生苗的待测组样本，其整个PCR扩增区域内所有位点的变异核苷酸总频率均不符合“待测组>>稀释组≥野生组”(如图3A)。
因此，根据待测组、其对应稀释组及野生组样本中Cas9剪切位点上下游位点处变异核苷酸总频率是否符合“待测组>>稀释组≥野生组”的规律，可以判断待测组样本是否为突变组样本；若存在符合“待测组>>稀释组≥野生组”规律的位点，则表明该待测组含有目的基因发生突变的突变体植株，为突变组样本。
实施例5.高分辨率熔解曲线筛选烟草突变体
1.突变体样本准备：以7株烟草独立再生苗为1个待测亚组，共取15个亚组，每亚组分别包含至少1株烟草PDS基因突变的白色再生苗(表6)。每个亚组取每株再生苗的等量叶片组织混合，提取DNA，使用PDS-F、PDS-R引物对进行PCR扩增，得到待测亚组PCR产物样本。
表6高分辨率熔解曲线分析样本分组情况
分组 所含白色烟草株系 所含绿色烟草独立株系数 烟草株系总数
待测亚组1 pds-1 6 7
待测亚组2 pds-2 6 7
待测亚组3 pds-3 6 7
待测亚组4 pds-4 6 7
待测亚组5 pds-5 6 7
待测亚组6 pds-6 6 7
待测亚组7 pds-7、pds-8 5 7
待测亚组8 pds-9、pds-10 5 7
待测亚组9 pds-11、pds-12 5 7
待测亚组10 pds-13、pds-14 5 7
待测亚组11 pds-15、pds-16、pds-17 4 7
待测亚组12 pds-18、pds-19、pds-20 4 7
待测亚组13 pds-21、pds-22、pds-23 4 7
待测亚组14 pds-24、pds-25、pds-26 4 7
待测亚组15 pds-27、pds-28、pds-29 4 7
2.高分辨率熔解曲线分析：对全部待测亚组PCR产物样本及实施例4中的野生组PCR产物样本，使用仪器CFX96TM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad,USA)，进行10μl高分辨率熔解曲线反应。反应体系见表7，第1步PCR反应条件为：95℃5min变性之后，95℃10s，60℃30s，72℃1min，重复50个循环；第2步高分辨率熔解曲线反应条件：95℃30s，60℃1min，之后自65℃升温至95℃的范围内，每增加0.2℃时生成熔解曲线。熔解曲线使用Precision Melt Analysis软件(Bio-Rad,USA)分析。
结果表明，全部15个含有突变再生苗的待测亚组PCR产物样本的熔解曲线均与野生组PCR产物样本的熔解曲线存在明显分离(两曲线在差异最大处的值统计检验P<0.001，如图4)。因此，根据PCR产物样本的熔解曲线是否与野生组的存在明显分离，可判断待测亚组样本是否为突变亚组样本；若熔解曲线分离明显，则表明该待测亚组含有目的基因发生突变的突变体植株，为突变亚组样本。
进一步取突变亚组样本中的每株独立再生苗的叶片组织，与野生型烟草植株的等量叶片组织混合，提取DNA，进行相同条件的PCR反应及高分辨率熔解曲线反应，熔解曲线存在明显分离的样本中，所取再生苗为突变体再生苗。
表7 10μl高分辨率熔解曲线反应体系
ddH2O Up to 10μl
引物1(2μM) 0.5μl
引物2(2μM) 0.5μl
DNA模板 1μl(50ng)
Precision Melt Supermix(Bio-Rad,USA) 5μl
实施例6.非转基因烟草突变体的鉴定
对所获得的29株烟草PDS基因突变的白色再生苗，取叶片提取DNA，使用特异于T-DNA插入序列的引物1F(5’-AGGTGGCGAAGTCATCTGC-3’)(SEQ ID NO.9)和1R
(5’-TGTCGTTTCCCGCCTTCAG-3’)(SEQ ID NO.10)、特异于Cas9基因的引物2F
(5’-GCCTGTTTGGTAATCTTATCGC-3’)(SEQ ID NO.11)和2R
(5’-TCTTTCCACTCTGCTTGTCTCG-3’)(SEQ ID NO.12)、特异于卡那霉素抗性基因的引物3F(5’-ACTGGGCACAACAGACAATC-3’)(SEQ ID NO.13)和3R
(5’-ACCGTAAAGCACGAGGAA-3’)(SEQ ID NO.14)进行20μl普通PCR扩增，并同时使用前述预组装的PDS-Cas9突变载体DNA作为阳性对照。PCR反应体系见表1，PCR反应条件为：94℃30s，55℃30s，72℃1min，重复30个循环。若阳性对照可扩增得到PCR产物，而突变体再生苗DNA三对引物均无法得到扩增产物的植株可能为非转基因的突变体植株。
无性繁殖可能为非转基因突变体的再生苗，待无性繁殖小苗生长2周左右，取其中一株的地上部转移至含100mg/L卡那霉素的MS培养基中生长1个月左右(图5)。若小苗不具有抗性，死亡，则表明植株中不含有外源基因，为非转基因突变体，即如图5中的突变体植株pds-7在含卡那霉素的MS培养基中培养后死亡，说明其不含有外源基因，为鉴定需要的非转基因突变体。取鉴定得到的非转基因突变体的其他无性繁殖小苗移至适宜的生根培养基生根培养，获得所需的非转基因突变体完整植株。
结果表明，所有突变体植株中非转基因的比例约为17.2％(表8)。
表8非转基因突变株系的比例
实施例7.高通量测序筛选低比例烟草突变体
1.突变体测序样本准备：取实施例3制备得到的独立株系的再生苗，以100株烟草独立株系的再生苗为1组，共取5组(表9)。其中3组，每组分别包含1株烟草PDS基因突变的白色再生苗；另外2组全部由正常绿色再生苗组成，即不含有PDS基因突变植株。对于每组待测样本，采用与实施例4中的相同方法，取每株再生苗的等量叶片组织混合，提取DNA，使用烟草PDS基因第四个外显子PDS sgRNA靶定区域的特异性引物PDS-F(SEQ ID NO.7)和PDS-R(SEQ ID NO.8)进行50μl普通PCR扩增，得到待测组PCR产物样本。使用Nanodrop荧光分光光度计测定待测组PCR产物样本的DNA浓度，使用6倍于待测组样本DNA量的实施例4中的野生组样本DNA稀释待测组样本，得到稀释组PCR产物样本，即稀释组样本中突变体DNA浓度为待测组样本中的1/7。
表9高通量测序1/100待测组样本分组情况
分组 所含白色烟草株系 所含绿色烟草独立株系数 烟草株系总数
1/100待测组1 pds-1 99 100
1/100待测组2 pds-2 99 100
1/100待测组3 pds-3 99 100
1/100待测组4 无 100 100
1/100待测组5 无 100 100
2.高通量测序及分析：采用与实施例4中的相同方法，分别高通量测序待测组和稀释组样本，并分析比较Cas9剪切位点上下游序列每个位点在每个待测组、其对应稀释组及实施例4中的野生组样本中的变异核苷酸总频率。结果表明，所有3组突变体比例为1/100的烟草待测组样本均在16bp序列中存在变异核苷酸总频率符合“待测组>>稀释组≥野生组”的位点(如图6B)，即根据本发明的筛选方法，可确定为突变组样本；而所有2组不含有突变再生苗的待测组样本，其整个PCR扩增区域内所有位点的变异核苷酸总频率均不符合“待测组>>稀释组≥野生组”，(如图6A)，即根据本发明的筛选方法，可确定其不含有突变体植株。因此，本发明的筛选方法能够从群体量为100个体的混合群体中，灵敏准确地鉴定出其是否至少含有1个突变体，即筛选分辨率可达1/100。
本发明应用农杆菌瞬时侵染技术，可在转基因当代直接得到不含有任何外源基因序列的、目的基因定点改变的CRISPR-Cas9突变体植株，不需要进行耗时费事地进行有性繁殖以及子代植株中外源基因与突变基因的分离鉴定，特别适用于有性生殖后会产生性状分离的或童期长的多年生杂交作物的非转基因CRISPR突变体构建中的应用。
本发明筛选方法中增加了稀释组这一设置，对于野生组和待测组中变异核苷酸频率都高的位点，稀释组其变异核苷酸频率不会下降；而只在突变体中存在的真实突变的变异核苷酸，因为在野生组中不存在，因此在稀释组中的频率就会大幅下降，以此去除本身测序错误率高的位点对真实突变位点的影响。
本发明应用高通量测序与高分辨率熔解曲线技术对得到的再生苗进行筛选，能够在转基因当代高效、快速地从再生苗中鉴定得到目的基因发生突变的突变体植株，即使是对突变体比例小于混合群体1/100的低比例突变体筛选中，本发明的筛选方法仍可保证优异的准确性和灵敏度。
本发明在转基因植株再生过程中不使用任何抗生素进行筛选，对于对抗生素敏感的、转基因难度较大的植物材料，相对更容易获得再生植株。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种非转基因CRISPR突变体的制备方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4670
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctgcaggcg gccgcactag tgcccgggca tggacaagaa gtactccatt gggctcgata 60
tcggcacaaa cagcgtcggc tgggccgtcg taagtttctg cttctacctt tgatatatat 120
ataataatta tcattaatta gtagtaatat aatatttcaa atattttttt caaaataaaa 180
gaatgtagta tatagcaatt gcttttctgt agtttataag tgtgtatatt ttaatttata 240
acttttctaa tatatgacca aaatttgttg atgtgcagat tacggacgag tacaaggtgc 300
cgagcaaaaa attcaaagtt ctgggcaata ccgatcgcca cagcataaag aagaacctca 360
ttggcgccct cctgttcgac tccggggaga cggccgaagc cacgcggctc aaaagaacag 420
cacggcgcag atatacccgc agaaagaatc ggatctgcta cctgcaggag atctttagta 480
atgagatggc taaggtggat gactctttct tccataggct ggaggagtcc tttttggtgg 540
aggaggataa aaagcacgag cgccacccaa tctttggcaa tatcgtggac gaggtggcgt 600
accatgaaaa gtacccaacc atatatcatc tgaggaagaa gcttgtagac agtactgata 660
aggctgactt gcggttgatc tatctcgcgc tggcgcatat gatcaaattt cggggacact 720
tcctcatcga gggggacctg aacccagaca acagcgatgt cgacaaactc tttatccaac 780
tggttcagac ttacaatcag cttttcgaag agaacccgat caacgcatcc ggagttgacg 840
ccaaagcaat cctgagcgct aggctgtcca aatcccggcg gctcgaaaac ctcatcgcac 900
agctccctgg ggagaagaag aacggcctgt ttggtaatct tatcgccctg tcactcgggc 960
tgacccccaa ctttaaatct aacttcgacc tggccgaaga tgccaagctt caactgagca 1020
aagacaccta cgatgatgat ctcgacaatc tgctggccca gatcggcgac cagtacgcag 1080
accttttttt ggcggcaaag aacctgtcag acgccattct gctgagtgat attctgcgag 1140
tgaacacgga gatcaccaaa gctccgctga gcgctagtat gatcaagcgc tatgatgagc 1200
accaccaaga cttgactttg ctgaaggccc ttgtcagaca gcaactgcct gagaagtaca 1260
aggaaatttt cttcgatcag tctaaaaatg gctacgccgg atacattgac ggcggagcaa 1320
gccaggagga attttacaaa tttattaagc ccatcttgga aaaaatggac ggcaccgagg 1380
agctgctggt aaagcttaac agagaagatc tgttgcgcaa acagcgcact ttcgacaatg 1440
gaagcatccc ccaccagatt cacctgggcg aactgcacgc tatcctcagg cggcaagagg 1500
atttctaccc ctttttgaaa gataacaggg aaaagattga gaaaatcctc acatttcgga 1560
taccctacta tgtaggcccc ctcgcccggg gaaattccag attcgcgtgg atgactcgca 1620
aatcagaaga gaccatcact ccctggaact tcgaggaagt cgtggataag ggggcctctg 1680
cccagtcctt catcgaaagg atgactaact ttgataaaaa tctgcctaac gaaaaggtgc 1740
ttcctaaaca ctctctgctg tacgagtact tcacagttta taacgagctc accaaggtca 1800
aatacgtcac agaagggatg agaaagccag cattcctgtc tggagagcag aagaaagcta 1860
tcgtggacct cctcttcaag acgaaccgga aagttaccgt gaaacagctc aaagaagact 1920
atttcaaaaa gattgaatgt ttcgactctg ttgaaatcag cggagtggag gatcgcttca 1980
acgcatccct gggaacgtat cacgatctcc tgaaaatcat taaagacaag gacttcctgg 2040
acaatgagga gaacgaggac attcttgagg acattgtcct cacccttacg ttgtttgaag 2100
atagggagat gattgaagaa cgcttgaaaa cttacgctca tctcttcgac gacaaagtca 2160
tgaaacagct caagaggcgc cgatatacag gatgggggcg gctgtcaaga aaactgatca 2220
atgggatccg agacaagcag agtggaaaga caatcctgga ttttcttaag tccgatggat 2280
ttgccaaccg gaacttcatg cagttgatcc atgatgactc tctcaccttt aaggaggaca 2340
tccagaaagc acaagtttct ggccaggggg acagtcttca cgagcacatc gctaatcttg 2400
caggtagccc agctatcaaa aagggaatac tgcagaccgt taaggtcgtg gatgaactcg 2460
tcaaagtaat gggaaggcat aagcccgaga atatcgttat cgagatggcc cgagagaacc 2520
aaactaccca gaagggacag aagaacagta gggaaaggat gaagaggatt gaagagggta 2580
taaaagaact ggggtcccaa atccttaagg aacacccagt tgaaaacacc cagcttcaga 2640
atgagaagct ctacctgtac tacctgcaga acggcaggga catgtacgtg gatcaggaac 2700
tggacatcaa tcggctctcc gactacgacg tggatcatat cgtgccccag tcttttctca 2760
aagatgattc tattgataat aaagtgttga caagatccga taaaaataga gggaagagtg 2820
ataacgtccc ctcagaagaa gttgtcaaga aaatgaaaaa ttattggcgg cagctgctga 2880
acgccaaact gatcacacaa cggaagttcg ataatctgac taaggctgaa cgaggtggcc 2940
tgtctgagtt ggataaagcc ggcttcatca aaaggcagct tgttgagaca cgccagatca 3000
ccaagcacgt ggcccaaatt ctcgattcac gcatgaacac caagtacgat gaaaatgaca 3060
aactgattcg agaggtgaaa gttattactc tgaagtctaa gctggtctca gatttcagaa 3120
aggactttca gttttataag gtgagagaga tcaacaatta ccaccatgcg catgatgcct 3180
acctgaatgc agtggtaggc actgcactta tcaaaaaata tcccaagctt gaatctgaat 3240
ttgtttacgg agactataaa gtgtacgatg ttaggaaaat gatcgcaaag tctgagcagg 3300
aaataggcaa ggccaccgct aagtacttct tttacagcaa tattatgaat tttttcaaga 3360
ccgagattac actggccaat ggagagattc ggaagcgacc acttatcgaa acaaacggag 3420
aaacaggaga aatcgtgtgg gacaagggta gggatttcgc gacagtccgg aaggtcctgt 3480
ccatgccgca ggtgaacatc gttaaaaaga ccgaagtaca gaccggaggc ttctccaagg 3540
aaagtatcct cccgaaaagg aacagcgaca agctgatcgc acgcaaaaaa gattgggacc 3600
ccaagaaata cggcggattc gattctccta cagtcgctta cagtgtactg gttgtggcca 3660
aagtggagaa agggaagtct aaaaaactca aaagcgtcaa ggaactgctg ggcatcacaa 3720
tcatggagcg atcaagcttc gaaaaaaacc ccatcgactt tctcgaggcg aaaggatata 3780
aagaggtcaa aaaagacctc atcattaagc ttcccaagta ctctctcttt gagcttgaaa 3840
acggccggaa acgaatgctc gctagtgcgg gcgagctgca gaaaggtaac gagctggcac 3900
tgccctctaa atacgttaat ttcttgtatc tggccagcca ctatgaaaag ctcaaagggt 3960
ctcccgaaga taatgagcag aagcagctgt tcgtggaaca acacaaacac taccttgatg 4020
agatcatcga gcaaataagc gaattctcca aaagagtgat cctcgccgac gctaacctcg 4080
ataaggtgct ttctgcttac aataagcaca gggataagcc catcagggag caggcagaaa 4140
acattatcca cttgtttact ctgaccaact tgggcgcgcc tgcagccttc aagtacttcg 4200
acaccaccat agacagaaag cggtacacct ctacaaagga ggtcctggac gccacactga 4260
ttcatcagtc aattacgggg ctctatgaaa caagaatcga cctctctcag ctcggtggag 4320
acagcagggc tgaccccaag aagaagagga aggtgtgaag ggtgggcgcg ccgacccagc 4380
tttcttgtac aaagtggtga tatcccgcgg ccatgctaga gtccgcaaaa atcaccagtc 4440
tctctctaca aatctatctc tctctatttt tctccagaat aatgtgtgag tagttcccag 4500
ataagggaat tagggttctt atagggtttc gctcatgtgt tgagcatata agaaaccctt 4560
agtatgtatt tgtatttgta aaatacttct atcaataaaa tttctaattc ctaaaaccaa 4620
aatccagtga cctgcaggca tgcgacgtcg ggccctctag aggatccccg 4670
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgacgcacaa tcccactatc 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atccacctta gccatctcat tac 23
<210> 4
<211> 605
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcgacgtcg ggccctctag atgcagtaag cttcgttgaa caacggaaac tcgacttgcc 60
ttccgcacaa tacatcattt cttcttagct ttttttcttc ttcttcgttc atacagtttt 120
tttttgttta tcagcttaca ttttcttgaa ccgtagcttt cgttttcttc tttttaactt 180
tccattcgga gtttttgtat cttgtttcat agtttgtccc aggattagaa tgattaggca 240
tcgaaccttc aagaatttga ttgaataaaa catcttcatt cttaagatat gaagataatc 300
ttcaaaaggc ccctgggaat ctgaaagaag agaagcaggc ccatttatat gggaaagaac 360
aatagtattt cttatatagg cccatttaag ttgaaaacaa tcttcaaaag tcccacatcg 420
cttagataag aaaacgaagc tgagtttata tacagctaga gtcgaagtag tgattgctgc 480
atggaaagat gatgagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta 540
tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttttttga acttggtacc gcgaattatc 600
gatca 605
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccctgggaat ctgaaagaag ag 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taattcgcgg taccaagttc a 21
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgaagcagt caccaaga 18
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agtacgcatt cttgaggagt c 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggtggcgaa gtcatctgc 19
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgtcgtttcc cgccttcag 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcctgtttgg taatcttatc gc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctttccact ctgcttgtct cg 22
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actgggcaca acagacaatc 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
accgtaaagc acgaggaa 18
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctgcatgga aagatgatga 20

Claims (12)

1.一种非转基因CRISPR-Cas9突变体植株制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1：将含有1个内含子的Cas9基因连入CRISPR基础载体，得到具有内含子的CRISPR-Cas9载体；
S2：根据目的基因，设计sgRNA靶定序列，并进一步连入启动子序列，合成具有启动子的sgRNA序列；
S3：将S2所得的具有启动子的sgRNA序列连入S1所得的具有内含子的CRISPR-Cas9载体，得到预组装Cas9突变载体；
S4：将S3得到的预组装Cas9突变载体转化农杆菌，将带有预组装Cas9突变载体的农杆菌侵染目标植物外植体，共培养；
S5：将S4共培养后的外植体转移至适合再生且不添加抗生素的培养基上，在适用于目标植物的、农杆菌介导的遗传转化条件下，诱导目标植物愈伤和芽再生，得到若干株独立株系的再生苗；
S6：将S5得到再生苗随机分成若干待测组，分别将各待测组中每株再生苗取等量叶片组织，混合，提取DNA，采用目的基因sgRNA靶定区域的特异性引物PCR扩增包含以sgRNA靶定位点为中心上下游共80-120bp的区域，得到各待测组PCR产物样本；取野生型植株叶片组织，混合，提取DNA，并PCR扩增相同区域，得到野生组PCR产物样本；使用野生组PCR产物样本对各待测组PCR产物样本进行稀释，得到各待测组对应的稀释组PCR产物样本；
S7：分别高通量测序S6得到的各待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和各稀释组PCR产物样本，使用BWA软件默认参数将测序所得序列定位至PCR扩增区域的野生型序列上；分别统计待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和稀释组PCR产物样本每个位点处与野生型序列相同的核苷酸的比例，得到非变异核苷酸频率，变异核苷酸总频率则为1-非变异核苷酸频率；比较每个位点在待测组PCR产物样本、其对应稀释组PCR产物样本和野生组PCR产物样本中的变异核苷酸总频率；若某一位点变异核苷酸总频率符合“待测组>>稀释组≥野生组”，则表明该位点存在突变，若某一待测组PCR产物样本存在突变位点，则表明该待测组含有目的基因发生突变的突变体植株，则该待测组为突变组；
S8：分别将S7筛选得到的突变组进一步分成若干待测亚组，分别将各待测亚组中每株再生苗取等量叶片组织，混合，提取DNA；取野生型植株叶片组织，混合，提取DNA；对待测亚组与野生组使用同样的sgRNA靶定位点附近区域特异性引物在同样条件下进行高分辨率熔解曲线PCR，若待测亚组所得曲线与野生组明显分离，则为该待测亚组为突变亚组，所述明显分离为待测亚组所得曲线与野生组曲线在差异最大处的值统计检验P<0.001；每组突变亚组的每个独立再生小苗分别与野生型小苗取等量叶片组织1:1混合，提取DNA，进行高分辨率熔解曲线PCR；若所得曲线与野生组有明显分离，则该独立再生小苗为目的基因发生突变的突变体植株；
S9：取S8筛选得到的突变体植株的叶片组织，提取DNA，使用任意两对或两对以上定位于T-DNA插入片段的引物进行PCR扩增，以避免出现假阴性结果；并同时使用S3中预组装的PDS-Cas9突变载体DNA作为阳性对照。若阳性对照可扩增得到PCR产物，而突变体DNA两对或两对以上引物均无法得到扩增产物，则表明该突变体植株中很可能不含有外源基因序列，将该植株作为非转基因突变体候选植株；
S10：将S9得到的非转基因突变体候选植株取样进行无性繁殖，对无性繁殖植株进行CRISPR-Cas9载体T-DNA区抗性基因的抗性筛选，若植株不具有抗性，则表明不含有外源基因序列，为非转基因CRISPR-Cas9突变体植株；
S11：将S10鉴定得到的非转基因CRISPR-Cas9突变体植株转移至适宜的生根培养基，继续培养，得到非转基因CRISPR-Cas9突变体完整植株。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S6中所述各待测组植株数为50-100株。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S7中先分别统计待测组PCR产物样本、野生组PCR产物样本和稀释组PCR产物样本在Cas9剪切位点及其上下游共14-20bp区域内的位点的变异核苷酸总频率，所述Cas9剪切位点为sgRNA靶定位点3’端3-8个核苷酸区域；如该区域内所有位点的变异核苷酸总频率均不符合“待测组>>稀释组≥野生组”，则进一步统计整个PCR扩增共80-120bp区域。
4.根据权利要求1至3任一条所述的制备方法，其特征在于，所述目标植物为烟草，所述目的基因为烟草PDS基因。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S1所述含有1个内含子的Cas9基因为以5’端-SpeI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-SpeI酶切位点-含1个内含子的Cas9基因序列-ApaI酶切位点-ApaI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，直接基因合成含有1个完整内含子的Cas9基因(SEQ ID NO.1)；所述CRISPR基础载体为pK7WGF2::hCas9(Addgene质粒号#46965)；使用限制性内切酶SpeI和ApaI双酶切将含有1个内含子的Cas9基因连入载体；使用内含子区域特异性引物In-F：5’-TGACGCACAATCCCACTATC-3’(SEQ IDNO.2)和In-R：5’-ATCCACCTTAGCCATCTCATTAC-3’(SEQ ID NO.3)进行PCR扩增并测序，验证得到连接正确的具有内含子的CRISPR-Cas9载体。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述S2中，根据已知的烟草PDS基因第四个外显子的序列，设计PDS sgRNA靶定序列(5’-GCTGCATGGAAAGATGATGA-3’)(SEQ IDNO.15)，进而以5’端-XbaI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-XbaI酶切位点-拟南芥U6-26基因启动子-PDS sgRNA靶定序列-sgRNA骨架序列-KpnI酶切位点-KpnI酶切位点5’端15个碱基的载体序列-3’端的顺序，合成具有启动子的U6-sgRNA序列(SEQ ID NO.4)。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述S3中，使用限制性内切酶XbaI和KpnI双酶切将S2所得的具有启动子的U6-sgRNA序列连入S1所得的具有内含子的CRISPR-Cas9载体T-DNA，使用U6-sgRNA区域特异性引物sg-F：
5’-CCCTGGGAATCTGAAAGAAGAG-3’(SEQ ID NO.5)和sg-R：
5’-TAATTCGCGGTACCAAGTTCA-3’(SEQ ID NO.6)进行PCR扩增并测序，验证得到连接正确的预组装PDS-Cas9突变载体。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述S4中，使用冻融法将预组装PDS-Cas9突变载体转化至农杆菌EHA105感受态细胞中，使用引物In-F(SEQ ID NO.2)和In-R(SEQ ID NO.3)进行农杆菌菌落PCR并测序，将得到阳性克隆菌侵染烟草外植体，所述侵染时间为20min。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S6中所述待测组PCR产物样本和野生组PCR产物样本使用烟草PDS基因第四个外显子PDS sgRNA靶定区域的特异性引物PDS-F：
5’-CTGAAGCAGTCACCAAGA-3’(SEQ ID NO.7)和PDS-R：
5’-AGTACGCATTCTTGAGGAGTC-3’(SEQ ID NO.8)进行50μl普通PCR扩增；所述稀释组PCR产物样本为测定待测组PCR产物样本和野生组PCR产物样本的DNA浓度后，使用大于5倍于待测组PCR产物样本DNA量的野生组PCR产物样本DNA稀释待测组PCR产物样本得到。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S9中，所述三对定位于T-DNA插入片段的引物为特异于T-DNA插入序列的引物1F：5’-AGGTGGCGAAGTCATCTGC-3’(SEQ ID NO.9)和1R：5’-TGTCGTTTCCCGCCTTCAG-3’(SEQ ID NO.10)、特异于Cas9基因的引物2F：5’-GCCTGTTTGGTAATCTTATCGC-3’(SEQ ID NO.11)和2R：
5’-TCTTTCCACTCTGCTTGTCTCG-3’(SEQ ID NO.12)、特异于卡那霉素抗性基因的引物3F：5’-ACTGGGCACAACAGACAATC-3’(SEQ ID NO.13)和3R：
5’-ACCGTAAAGCACGAGGAA-3’(SEQ ID NO.14)。
11.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S10中，无性繁殖非转基因突变体候选植株，待无性繁殖小苗生长2周，取其地上部转移至含100mg/L卡那霉素的MS培养基中生长，若小苗不具有抗性，死亡，则表明植株中不含有外源基因，为非转基因CRISPR-Cas9突变体植株。
12.权利要求1至11任一项所述一种非转基因CRISPR-Cas9突变体植株制备方法在目的基因定点突变的非转基因CRISPR突变体构建中的应用，进一步的，在有性生殖后会产生性状分离的或童期长的多年生杂交作物的非转基因CRISPR突变体构建中的应用。
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