CN107400674B - 一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，属于植物保护技术领域。所述NSm基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。NSm是激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因。采用农杆菌瞬时表达系统，在烟草叶片中瞬时表达NSm基因，通过检测供试烟草是否表现过敏反应判断供试烟草是否含有RTSW抗性位点。本发明能够快速、准确地鉴定出烟草对番茄斑萎病毒病的抗性，可应用于烟草抗病育种、抗病基因定位和克隆。

Description

一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，进一步属于烟草病毒病抗性鉴定技术领域，具体涉及一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法。
背景技术
番茄斑萎病毒属（Orthotospovirus）病毒是寄主范围最广、发生最为严重的一类植物病毒，其代表种番茄斑萎病毒（Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV）已对云南烟区的烟叶生产构成了较大的威胁。最近几年从云南各地(州、市)县采集样品检测结果看，云南全省烟草上TSWV均有分布并有扩大和加重的趋势。而更让人忧虑的是目前云南省的烤烟主栽品种均不抗TSWV，田间调查发现现有的主栽烤烟品种K326、红花大金元、云烟87等均能被TSWV侵染，成为TSWV流行、爆发的潜在因素。TSWV常用的防治手段主要依赖防治传毒介体蓟马，但由于蓟马具有发育历期短、个体小易隐蔽、对杀虫剂极易产生抗药性等的特点，所以现有的防治措施难以取得理想的控制效果，因而，选育抗TSWV的烤烟品种是最经济、最有效的手段。
野生烟草资源含有丰富的抗性基因。研究表明花烟草(Nicotiana alata)对TSWV具有很好的抗性。接种TSWV仅在接种叶表现过敏性坏死症状，在系统叶中检测不到病毒的存在。经过一系列的常规杂交和回交转育，研究人员已将该抗性基因从花烟草抗性转育至烤烟品种中，育成抗病育种中间材料Polalta。N. alata和Polalta对TSWV的抗性是由显性的单基因（命名为RTSW）位点控制。
在经典遗传学中，基因型控制的植物抗病性常常是由来源于植物的抗病基因R (resistance)与相应的来源于病原物的无毒基因Avr (avirulence)互作所决定的，即“基因对基因”学说。Avr基因的克隆和鉴定不仅有助于阐明抗病植株的抗病机制，而且由于Avr基因和R基因的对应关系，更有助于抗病基因的克隆，更迅速的锁定R基因的类型。因为单独表达Avr基因即能在抗性植株上引起过敏性反应，比起接种病毒更方便、快捷，鉴定结果更准确。因此Avr基因在抗病育种的应用将加速抗性品种的鉴定和选育。现有的结果表明番茄Sw-5b基因是典型的R基因，TSWV的NSm为其对应的Avr基因。辣椒Tsw基因也具备R基因的特点，其对应的Avr基因是TSWV的NSs基因。但是来源于野生烟草N. alata中抗性基因RTSW对应的TSWV Avr基因还未见报道。
以往鉴定烟草抗病性方法主要是在待试植株直接接种TSWV，经过一段时间进行观察，如果未产生相应的病害症状，系统叶片中没有TSWV病毒存在则说明供试作物为抗病。反之，则说明该供试作物为感病。这种方法的缺点是其需要花费的时间较长。根据苗龄大小和环境温度、湿度不同，从TSWV接种群体到群体全体感病植株发病需要15天至30天。而且TSWV侵染后7-10天会造成植物整株坏死，因此需要进行连续的发病症状观察和多次病毒检测以保证检测准确性。另外TSWV病毒粒子在常温条件下稳定性较差，因此为了保持病毒的侵染活性需要在-80℃条件下保存毒源，并在冰浴环境下研磨毒源，接种过程中需要保持接种缓冲液温度在10℃左右。TSWV病毒接种烟苗后，为保证接种效率需要，需要在22-25℃的人工气候室中培养15天至30天，对环境要求较为严苛。使用TSWV毒源接种感病品种要求操作精细和熟练，稍有操作不当就容易出现感病品种不能100%发病的现象，导致抗性分离群体的抗性鉴定不能满足遗传分析的要求。因此急需一种更方便、快捷、准确的鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，该方法不仅能够快速地鉴定出烟草材料的抗病性，而且能提供烟草作物抗病基因的相关信息，为快速分离、克隆抗病基因奠定了基础，对烟草抗病育种、抗病基因克隆具有显著的意义。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，包括如下步骤：
鉴定出番茄斑萎病毒基因组中激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因，该无毒基因是NSm基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示；
用所述番茄斑萎病毒基因组中的所述无毒基因构建系列的鉴别菌株；
将带有所述无毒基因NSm的农杆菌悬液注渗到烟草应试寄主叶片脉间，并检测所述烟草应试寄主的过敏反应。
进一步，优选的是，若在所述应试寄主上检测到所述过敏反应，则表明所述应试寄主对所述无毒基因发生了识别作用，提示所述寄主具有针对该无毒基因的抗病基因。
进一步，优选的是，所述鉴定出番茄斑萎病毒基因组中激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因，具体包括：在所述番茄斑萎病毒基因组中搜索已注释的病毒功能基因，并从病毒的功能基因中验证出特异针对RTSW抗性位点的无毒基因。
进一步，优选的是，用所述番茄斑萎病毒基因组中的所述无毒基因构建系列的鉴别菌株，具体包括：
克隆所述无毒基因NSm全长序列作为候选基因，并将所述候选基因克隆于表达双元载体pK2GW7中，构建含有所述无毒基因NSm的表达载体；
通过农杆菌注渗法分别将含有所述无毒基因NSm的表达载体导入根癌农杆菌EHA105 菌株中，构建所述系列的鉴别菌株。
进一步，优选的是，将带有所述无毒基因NSm的农杆菌悬液注渗到烟草应试寄主叶片脉间，具体包括：
将包含无毒基因NSm的农杆菌在根癌农杆菌培养基LB中，于28℃培养24小时，离心收集菌体，再用浸润缓冲液稀释成OD600＝0.5的菌体悬液；
用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液9.5-10.5微升，从烟草植株的叶背注渗入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的烟草植株置于20-28℃及80％湿度的环境中，交替进行连续光照16小时及连续黑暗8小时，共观察72小时。
进一步，优选的是，检测所述应试寄主的过敏反应，具体包括：
在所述烟草寄主上以含有pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b的EHA105菌株作阳性对照，以含有pK2-35S-NSs的EHA105菌株为阴性对照，观察若所述烟草应试寄主上产生含无毒基因NSm表达载体的鉴别菌株诱导的过敏反应，则确认所述烟草应试寄主相对所述无毒基因NSm的抗病品种。
本发明无毒基因的克隆和鉴定方法包括如下步骤：
（1）分别扩增TSWV病毒基因组中的基因全长序列作为候选基因，并将候选基因克隆于表达双元载体pK2GW7中，构建含有所述候选无毒基因的表达载体；
（2）通过农杆菌注渗法分别将含有所述候选无毒基因的表达载体导入根癌农杆菌EHA105菌株中，构建系列的鉴别菌株。
（3）将至少带有所述无毒基因的农杆菌悬液注渗到抗TSWV烟草供试寄主叶片脉间，具体包括：分别将鉴别菌株在根癌农杆菌培养基LB中，于28℃培养24小时，离心收集菌体，再用浸润缓冲液稀释成OD600＝0.5的菌体悬液；用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液9.5-10.5微升，从烟草植株的叶背注渗入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的烟草植株置于20-28℃及80％湿度的环境中，交替进行连续光照16小时及连续黑暗8小时，共观察72小时。
（4）观察若N. alata和Polalta上产生含无毒基因表达载体的鉴别菌株诱导的过敏反应，表明供试抗TSWV烟草植株对这个无毒候选基因发生了识别作用，即该候选基因为无毒基因。
利用无毒基因NSm的超表达载体进行烟草抗性鉴定的方法，是这样实现的，包括以下步骤：
（1）通过农杆菌注渗法分别将含有所述无毒基因的表达载体pK2-35S-NSm导入根癌农杆菌EHA105菌株中，构建系列的鉴别菌株。
（2）将带有所述无毒基因的农杆菌悬液注渗到供试烟草叶片脉间，具体包括：分别将鉴别菌株接种至LB培养基中，于28℃培养24 小时，离心收集菌体，再用浸润缓冲液稀释成OD600＝0.5的菌悬液；用无菌的去掉针头的注射器，将菌悬液9.5-10.5微升，从供试烟草的叶背注渗入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的烟草寄主置于20-28℃及80％湿度的环境中，交替进行连续光照16 小时及连续黑暗8小时，共观察72小时。
（3）检测供试寄主的过敏反应，具体包括：以pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b作阳性对照，以含有pK2-35S-NSs的EHA105菌株作阴性对照，若供试烟草在pK2-35S-NSm注渗位点产生过敏反应，则确认供试烟草为含有RTSW抗性位点的抗TSWV烟草。
本发明中激发烟草产生抗病反应的NSm为RTSW抗性位点对应的无毒基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示，为Genebank ID:JF960236.1的第101-1009个碱基所组成的基因，其氨基酸序列为Genebank ID:AEI70837.1；
本发明设计引物扩增NSm基因，通过Gateway 技术的LR 反应把NSm基因亚克隆到植物表达载体pK2GW7 中，构建含有所述NSm基因的表达载体pK2-35S-NSm；通过农杆菌注渗法将含有所述NSm基因的表达载体导入根癌农杆菌EHA105 菌株中，构建所述鉴别菌株。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
采用本发明的对烟草供试寄主抗病品种进行鉴定的方法，不仅能够快速地鉴定出烟草材料的抗病性，而且能提供烟草作物抗病基因的相关信息，为快速分离、克隆抗病基因奠定了基础，对烟草抗病育种、抗病基因克隆具有显著的意义。本发明单独表达Avr基因即能抗性植株上引起过敏性反应，比起接种病毒更方便、快捷，因此Avr基因在抗病育种的应用将加速抗性品种的鉴定和选育。
附图说明
图1为4种烟草品种接种pK2-35S-NSm（图中标记为NSm）、pK2-35S-NSs（图中标记为NSs）、pK2-35S-Gn（图中标记为Gn）、pK2-35S-Gc（图中标记为Gc）、pK2-35S-N（图中标记为N）和pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b（图中标记为NSm+Sw-5b）HR 反应；
图中：A为N.alata(PI42334)，pK2-35S-NSm浸润区域表现过敏性坏死，阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b浸润区域表现表现过敏性坏死；B为Polalta，pK2-35S-NSm浸润区域表现过敏性坏死，阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b浸润区域表现表现过敏性坏死；C为N.tabacunCV. Hongda，仅阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b浸润区域表现表现过敏性坏死；D为N.tabacunCV. K326，仅阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b浸润区域表现表现过敏性坏死。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明提供的一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法基于植物表达载体农杆菌注渗法，其发明构思是，利用无毒基因可引起依赖于寄主抗病基因的过敏反应这一特性，通过找出TSWV无毒基因，检验出寄主植物抗病基因RTSW的存在，由此能够快速地鉴定出烟草作物抗病品种。
本发明克隆了TSWV病毒的5个功能基因——NSs（为GenBank: JF960235.1的第89-1492个碱基所组成的基因，其氨基酸序列为Genebank ID: AEI70835.1）、NSm、Gn（为GenBank: JF960236.1的第3415- 4689个碱基所组成的基因，其氨基酸序列为GenebankID: AEI70838.1中1-425个氨基酸）、Gc（为GenBank: JF960236.1的第1282-3414个碱基所组成的基因，其氨基酸序列为Genebank ID: AEI70838.1中426-1136个氨基酸）和N（为GenBank: JF960235.1的第2043-2819个碱基所组成的基因，其氨基酸序列为Genebank ID:AEI70836.1），用这5个功能基因构建了一系列鉴别菌株pK2-35S-NSs、pK2-35S-NSm、pK2-35S-Gn、pK2-35S-Gc和pK2-35S-N，通过农杆菌介导瞬时表达的方法接种抗性寄主N. alata和Polalta快速鉴定出无毒基因为NSm。
培养含有NSm基因的表达载体pK2-35S-NSm、阴性对照pK2-35S-NSs和阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b的农杆菌，用无针头注射器分别将pK2-35S-NSm，pK2-35S-NSs和pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b农杆菌悬液注渗到寄主叶片脉间，检测过敏反应。若pK2-35S-NSm和阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b能引起过敏反应，而阴性对照pK2-35S-NSs不能引起过敏反应，就表明应试寄主植物对这个无毒基因发生了识别作用，提示该寄主植物具有针对该无毒基因的抗病基因RTSW。
下面结合实例和附图对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。
如无特殊说明，下述各实施例使用的均为常规方法；如无特殊说明，所用的试验材料均为自常规生化试剂公司购买得到的。烟草材料为N. alata（PI42334）、Polalta、本氏烟（N. benthamiana）、N.tabacunCV. Hongda，N.tabacunCV. K326，Polalta×K326 BC6F1S和Polalta×K326 BC6F1R均来自云南省烟草农业科学研究院。TSWV病毒来自云南省烟草农业科学研究院。TSWV的cDNA通过常规方法提取病毒侵染的烟草叶片总RNA并利用试剂盒随机引物反转录方法获得。
Gateway LR clonase Enzyme Mix kit、pENTR/D-TOPO载体试剂盒购自Invitrogen公司，农杆菌EHA105购自Invitrogen公司。pK2GW7（购自FlandersInteruniversity Institute for Biotechnology，VIB）。质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒购自QIAGEN公司。Phusion High-Fidelity DNAPolymerase (M0530)试剂盒购自NEB公司。大肠杆菌(Escherichia coli) DH 5α、限制性内切酶、M-MuLV Reverse Transcriptase Kit反转录试剂盒、DNA Marker、T4 DNA聚合酶及T4DNA连接酶、卡拉霉素、壮观霉素均购自大连宝生物公司和Roche公司。RNA提取试剂盒Trizol购自Invitrogen公司，检测TSWV的ELISA试剂盒和试纸条购自Agdia公司。
实施例1 激发RTSW抗病位点产生过敏性反应的无毒基因确定
无毒基因鉴定通过TSWV病毒的5个功能基因（NSs、NSm、Gn、Gc和N）的克隆、表达载体构建及农杆菌瞬时浸润来实现。所有的载体构建过程中，均在正向引物的5’端加上CACC，扩增得到整个表达盒片段，这样片段的5’端与入门载体pENTR/D-TOPO的突出末端GTGG序列互补，在拓扑异构酶I的作用下使基因以正确的方向插入到pENTR/D-TOPO载体的两个attL重组位点之间，形成带有两个attL重组位点的入门克隆；提取构建正确的入门克隆质粒，按摩尔比1:1-3:1比例与目的载体pK2GW7混合，在LR Clonase Enzyme Mix的作用下，入门克隆载体的两个attL重组位点与pK2GW7的两个attR位点进行LR位点特异性重组反应，得到目的重组载体。
1、用TRIzoL Reagent（Invitrogen）从0.1g TSWV毒源叶片中提取总RNA。取-80℃保存的TSWV毒源叶片约0.1g，加入1ml 的TRIzoL 提取液在研钵中研磨，室温静置5min 后移入离心管，再加入0.2ml 氯仿，振荡混匀，离心15min（12000rpm），转移上清液至新管，加入0.5ml 异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min（12000rpm），弃上清，沉淀用75％乙醇1ml 清洗，4℃离心5min（7500rpm），弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA。使用M-MuLV Reverse Transcriptase Kit（TaKaRa）进行cDNA的合成，取植物总RNA 约0.1μg-5μg，Random primer 50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl（5×reaction buffer 2μl，25mM MgCl2 4μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLVReverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。
TSWV病毒的5个功能基因——NSs、NSm、Gn、Gc和N分别采用如下引物对扩增合成的cDNA：
TSWV NSs F: 5’-caccatgtcttcaagtgtttatgagtcgat-3’;（SEQ ID No.2）
TSWV NSs R: 5’-ttattttgatcctgaagcatatgctt-3’;（SEQ ID No.3）
TSWV NSm F: 5’-caccatgttgactttttttggtaataag-3’；（SEQ ID No.4）
TSWV NSm R: 5’-ctatatctcatcaaaagataactgag-3’；（SEQ ID No.5）
TSWV N F:5’-caccatgtctaaggttaagctcactaag-3’;（SEQ ID No.6）
TSWV N R: 5’-ttaagcaagttctgcaagttttgtc-3’;（SEQ ID No.7）
TSWV Gn F:5’-caccatgagaattttaaaactactagaac-3’;（SEQ ID No.8）
TSWV Gn R :5’-ttagctagtccacttatgtttgttgtagt-3’;（SEQ ID No.9）
TSWV Gc F: 5’-caccatggaatggttccatctaatagtga-3’;（SEQ ID No.10）
TSWV Gc R:5’-tcagacaaggtgagagaaatccatag-3’;（SEQ ID No.11）
2、以合成的cDNA第一链为模板、用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(M0530)试剂盒的20μL体系进行扩增（5X Phusion HF缓冲液 4µl，10mM dNTPs 0.4 µl，10µM 上游引物 1µl，10µM 下游引物 1µl，模板DNA 1µl， Phusion DNA 聚合酶 0.2µl，加无菌水12.4µl至20µl）。扩增程序为98℃预变性30s；30个循环的98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；
3、pENTR-NSs、pENTR-NSm、pENTR-Gn、pENTR-Gc和pENTR-N入门载体的构建
将PCR扩增产物与pENTR/D-TOPO载体按照摩尔比1：1比例混合，即体系为pENTR/D-TOPO载体1μ1，Salt Solution 1μ1，PCR扩增产物 1-3μ1，无菌水补充至6μ1。室温下连接5min，将连接产物热激转化大肠杆菌DH5α后涂布在含有Kan(100mg/L)的平板上筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，提取质粒并测序，将测序正确的重组载体即为入门克隆载体，记作pENTR-NSs、pENTR-NSm、pENTR-Gn、pENTR-Gc和pENTR-N。
4、pK2-35S-NSs、pK2-35S-NSm、pK2-35S-Gn、pK2-35S-Gc和pK2-35S-N载体的构建
由于入门克隆载体pENTR-NSs、pENTR-NSm、pENTR-Gn、pENTR-Gc和pENTR-N为卡那霉素抗性，而目的载体pK2GW7为壮观霉素抗性，故可以直接利用质粒进行LR反应。参照Invitrogen 公司 Gateway LR Clonase Enzyme Mix 说明书，在0.5ml EP管中依次加入如下组分进行LR重组反应：入门克隆载体2μ1，pK2GW7目的载体 2μ1，TE buffer(pΗ 8.0)4 μ1，LR Clonase Enzyme Mix 2 μ1。短暂混匀后25℃孵育1小时，待反应完全后加入1 μl蛋白酶K于37℃、10分钟终止反应。取2 μl反应液热激转化大肠杆菌DH5α，菌液涂布在含有壮观霉素(100mg/l)的平板上筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，提取质粒并测序。测序结果表明目的序列已经插在了pK2GW7的attRl和attR2之间，表明得到的重组载体正确，记作pK2-35S-NSs、pK2-35S-NSm、pK2-35S-Gn、pK2-35S-Gc和pK2-35S-N。
5、农杆菌培养与接种方法：
用于阳性对照的载体p2300-35S-Sw-5b的农杆菌菌液在文献“Zhao W, Jiang L,Feng Z, Chen X, Huang Y, Xue F, Huang C, Liu Y, Li F, Liu Y et al.Plasmodesmata targeting and intercellular trafficking of Tomato spotted wilttospovirus movement protein NSm is independent of its function in HRinduction. J Gen Virol. 2016; 97:1990-7.”中公开过，公众可从云南省烟草农业科学研究院获得。
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK2-35S-NSs、pK2-35S-NSm、pK2-35S-Gn、pK2-35S-Gc和pK2-35S-N转入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105中，在加有50mg/L利福平和50mg/L壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用1mm的电击杯和200欧姆、2.5kV/0.2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5ml SOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃、200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留100μl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于LB抗生素（50mg/L利福平，50mg/L壮观霉素)固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆.
筛选得到的阳性克隆和保存的p2300-35S-Sw-5b菌液分别在2mL LB抗生素（50mg/L利福平，50mg/L壮观霉素)和2mL LB抗生素（50mg/L利福平，50mg/L卡那霉素)培养基震荡培养活化，28℃、210r/min，30h。取150μL活化菌液至10mL LB 培养基[含10mmol/L吗啉乙磺酸(MES) (pH 5.6)，40μmol/L乙醚丁香酮（acetosyringone），50mg/L利福平]28℃、210 r/min，培养24h后，4700r/min，离心5min收集菌体。用浸润缓冲液(10 mmol/L MgCl2，10mmol/L MES，200μmol/L acetosyringone)悬浮调整至菌液OD600＝0.5。室温放置3h。
选取两种TSWV抗性烟草即含有RTSW抗性位点的烟草：N.alata（PI42334）、Polalta和两种TSWV感病烟草即不含RTSW抗性位点的烟草：N.tabacunCV. Hongda，N.tabacunCV.K326各5株，用2mL注射器浸润4周大小烟苗最大的2片叶片。每张叶片注射六孔，分别为pK2-35S-NSm、pK2-35S-NSs、pK2-35S-Gn、pK2-35S-Gc、pK2-35S-N和pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b（pK2-35S-NSm：p2300-35S-Sw-5b体积比1:1）。其中pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b为阳性对照，阳性对照在所有的烟草上都会产生过敏性坏死。烟苗接种后20-28℃的光照培养室中培养72h，调查观察过敏坏死（HR反应）。
结果（图1）表明：感病烟草N.tabacunCV. Hongda和N.tabacunCV. K326接种pK2-35S-NSm的农杆菌瞬时表达载体无HR反应，仅阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b有HR反应。而抗性烟草N. alata（PI42334）和Polalta除了阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b外，接种pK2-35S-NSm的农杆菌也表现明显的HR反应，这说明N. alata（PI42334）和Polalta中抗病基因与TSWV互作的无毒基因为NSm。
实施例2 利用传统方法进行抗性鉴定和利用表达载体pK2-35S-NSm的农杆菌瞬时浸润进行烟草抗性鉴定的比较
Polalta×K326 BC6F1S为Polalta×K326 BC5F1抗性鉴定为感病的单株（即rtsw/rtsw基因型）和K326杂交后留种得到的群体，应该为全部感病。
Polalta×K326 BC6F1R为Polalta×K326 BC5F1抗性鉴定为抗病，自交留种至Polalta×K326 BC5F3确定抗性纯和的单株（即RTSW/RTSW基因型）和K326杂交后留种得到的群体，应该为全部抗病。
1.利用传统方法进行抗性鉴定
取N. alata（PI42334）、Polalta、本氏烟（N. benthamiana）和N.tabacunCV. K326各5株，Polalta×K326 BC6F1S和Polalta×K326 BC6F1R各栽15株（盆栽），4～5片叶时，分别接种TSWV。接种后的第9、16、23、30天调查记录症状，并采样进行Elisa检测。具体步骤如下：
步骤（1），接种缓冲液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸缓冲液，121℃灭菌20分钟；在接种前半个小时内，每100 mL磷酸缓冲液加入0.2 g亚硫酸钠，10 uL beta-巯基乙醇，配成TSWV接种缓冲液，放置冰上，备用；
步骤（2），待检烟苗接种：取TSWV毒源1-2g，放于研钵中，加入5-10mL步骤（1）获得的TSWV接种缓冲液和2-3g 200-400目金刚砂，冰上充分研磨至混合均匀，得到TSWV毒源汁液；
接种前洗净双手或者戴一次性乳胶手套操作；
接种时，首先将粒径为200-400目金刚砂按照每片叶0.1-0.2g的用量均匀的撒至本氏烟幼苗的叶表面，之后取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种烟苗叶片，另一只手从待接种烟苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量为每片叶50-100ul；
涂擦后用清水冲洗接种过的叶片，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为80%条件下继续培养；
步骤（3）发病率统计：从接种后第9天开始，每7天取烟草新鲜嫩叶并利用双抗体夹心ELISA法检测TSWV，并计算烟苗番茄斑萎病毒的发病率a，共调查4次。根据ELISA结果区分待检植株的抗感性，调查方法为：第一次采集全部叶片检测，其后每次检测前一次呈现阴性的植株。呈现阳性的植株直接登记为感病。即第二次采集第一次检测呈现阴性的样品，第三次检测第二次呈现阴性的样品，第四次检测第三次呈现阴性的样品。为了减少人为操作的误差，每个样品的ELISA检测设计三次技术重复。
双抗体夹心ELISA法步骤如下：
1.用AS-0105 IgG包被板，用CB缓冲液稀释1000倍，每孔加入200μl，37℃反应2-4h，洗板。
2.加入磨好的样品200μl，用1×PBST+2%PVP磨样，4℃过夜，洗板。
3.加鼠单抗，用ECI稀释3000 倍，37℃、2到4h，洗板。
4.加入用ECI稀释的羊抗鼠-AP，37℃、2h，洗板。
5.加入PNPP底物，室温，1 h后测OD值。
将四次的阳性株数加和即为总的发病株数。发病率a=（该品种感病植株数量/该品种总植株数量）×100%。结果见表1。
表1 利用传统方法进行抗性鉴定
Figure DEST_PATH_IMAGE002
*dpi（days post inoculation）, 即表示接种后的天数。9 dpi、16 dpi、23、dpi、30 dpi分别表示的是接种后第9、16、23、30天。
2．利用表达载体pK2-35S-NSm的农杆菌瞬时浸润进行烟草抗性鉴定
取N. alata（PI42334）、Polalta、本氏烟（N. benthamiana）和K326各5株，Polalta×K326 BC6F1S和Polalta×K326 BC6F1R各栽15株（盆栽），4～5片叶时，选取完全展开的顶部叶片，在同一张叶片上选取三个位置分别接种pK2-35S-NSm、pK2-35S-NSs、pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b。接种后的第72小时调查记录症状。具体步骤如下：
将pK2-35S-NSm、pK2-35S-NSs和p2300-35S-Sw-5b农杆菌菌液分别在2mL LB培养基震荡培养活化（28℃、210r/min，30h）。其中pK2-35S-NSm和pK2-35S-NSs的LB含有抗生素（50mg/L利福平，50mg/L壮观霉素)，p2300-35S-Sw-5b的LB含有抗生素（50mg/L利福平，50mg/L卡那霉素)。取150μL活化菌液至10mL LB 培养基[含10mmol/L吗啉乙磺酸(MES) (pH5.6)，40μmol/L乙醚丁香酮（acetosyringone），50mg/L利福平]28℃、210 r/min，培养24h后，4700r/min，离心5min收集菌体。用浸润缓冲液(10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，200μmol/L acetosyringone)悬浮调整至菌液OD600＝0.5。室温放置3h。
用2 mL注射器浸润4周大小烟苗最大的2片叶片，从叶背注渗入叶脉间，形成一个可见的浸润斑。每张叶片注射三孔，分别为pK2-35S-NSm、pK2-35S-NSs和pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b。其中pK2-35S-NSs作为阴性对照，pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b为阳性对照，阳性对照在所有的烟草上都会产生过敏性坏死。烟苗接种后20～28 ℃的光照培养室中培养72h，调查观察过敏坏死（HR反应）。结果见表2
表2 利用表达载体pK2-35S-NSm的农杆菌瞬时浸润进行烟草抗性鉴定结果统计
Figure DEST_PATH_IMAGE004
从表1和表2的比较可知，利用利用表达载体pK2-35S-NSm的农杆菌瞬时浸润进行烟草抗性鉴定比传统病毒接种方法进行抗性鉴定更方便、快捷。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID No.1
ttagtttcac ttgctaaaca taacggtaat gttgaagtct caaaaccatg gtcttcttct 120
gatgaaaagc ttgctttaac caaagctatg gatacatcca aaggaaagat actgttgaac 180
acagagggaa catcttcctt tggaacatat gaatctgatt ctatcacaga atcagagggt 240
tatgatcttt ctgcgagaat gatagtagat acaaaccacc atatctcaaa ctggaaaaat 300
gatctttttg tcggcaacgg gaagcaaaac gctaataagg tcatcaagat ctgtccaact 360
tgggacagca gaaaacaata catgatgatt tccaggattg tgatatgggt ctgccccact 420
ataccaaacc ctacagggaa acttgtggtt gctctggtcg atcccaacat gccatctgaa 480
aagcaaatca ttctgaaggg tcaggggaca ataactgatc ctatctgttt tgttttttat 540
ctgaactggt ctattccgaa aatgaataac actccagaaa actgctgtca gctgcacttg 600
atgtgcagtc aagaatacaa gaagggggtt tcttttggta gtgtcatgta ttcttggaca 660
aaggagtttt gtgattcacc cagagctgat aaagacaaaa gttgcatggt catacctcta 720
aacagggcta ttagagctag atctcaagca ttcattgagg cttgcaagct gataattcct 780
aaaggaaaca gtgagaagca gattaaaaaa cagcttaaag aactgagctc aaatcttgag 840
agatcagttg aagaagagga ggaaggggtt tatgataatg ttgctcagtt atcttttgat 900
gagatatag 909
SEQ ID No.2
caccatgtct tcaagtgttt atgagtcgat 30
SEQ ID No.3
ttattttgat cctgaagcat atgctt 26
SEQ ID No.4
caccatgttg actttttttg gtaataag 28
SEQ ID No.5
ctatatctca tcaaaagata actgag 26
SEQ ID No.6
caccatgtct aaggttaagc tcactaag 28
SEQ ID No.7
ttaagcaagt tctgcaagtt ttgtc 25
SEQ ID No.8
caccatgaga attttaaaac tactagaac 29
SEQ ID No.9
ttagctagtc cacttatgtt tgttgtagt 29
SEQ ID No.10
caccatggaa tggttccatc taatagtga 29
SEQ ID No.11
tcagacaagg tgagagaaat ccatag 26

Claims (6)

1.一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
鉴定出番茄斑萎病毒基因组中激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因，该无毒基因是NSm基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示；
用所述番茄斑萎病毒基因组中的所述无毒基因构建系列的鉴别菌株；
将带有所述无毒基因NSm的农杆菌悬液注渗到烟草应试寄主叶片脉间，并检测所述烟草应试寄主的过敏反应。
2.根据权利要求1所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，其特征在于，若在所述应试寄主上检测到所述过敏反应，则表明所述应试寄主对所述无毒基因发生了识别作用，提示所述寄主具有针对该无毒基因的抗病基因。
3.根据权利要求1所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，其特征在于，所述鉴定出番茄斑萎病毒基因组中激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因，具体包括：在所述番茄斑萎病毒基因组中搜索已注释的病毒功能基因，并从病毒的功能基因中验证出特异针对RTSW抗性位点的无毒基因。
4.根据权利要求1或2所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，其特征在于，用所述番茄斑萎病毒基因组中的所述无毒基因构建系列的鉴别菌株，具体包括：
克隆所述无毒基因NSm全长序列作为候选基因，并将所述候选基因克隆于表达双元载体pK2GW7中，构建含有所述无毒基因NSm的表达载体；
通过农杆菌注渗法分别将含有所述无毒基因NSm的表达载体导入根癌农杆菌EHA105菌株中，构建所述系列的鉴别菌株。
5.根据权利要求4所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，其特征在于，将带有所述无毒基因NSm的农杆菌悬液注渗到烟草应试寄主叶片脉间，具体包括：
将包含无毒基因NSm的农杆菌在根癌农杆菌培养基LB中，于28℃培养24小时，离心收集菌体，再用浸润缓冲液稀释成OD600＝0.5的菌体悬液；
用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液9.5-10.5微升，从烟草植株的叶背注渗入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的烟草植株置于20-28℃及80％湿度的环境中，交替进行连续光照16小时及连续黑暗8小时，共观察72小时。
6.根据权利要求5所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，其特征在于，检测所述应试寄主的过敏反应，具体包括：
在所述烟草寄主上以含有pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b的EHA105菌株作阳性对照，以含有pK2-35S-NSs的EHA105菌株为阴性对照，观察若所述烟草应试寄主上产生含无毒基因NSm表达载体的鉴别菌株诱导的过敏反应，则确认所述烟草应试寄主相对所述无毒基因NSm的抗病品种。
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