CN107254477B - 一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，属于植物基因克隆技术领域。本发明的NSm基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。通过构建NSm基因的植物表达载体，转化农杆菌，通过和候选抗病基因共浸润本氏烟，观察本氏烟叶片是否产生过敏性坏死的性状，进而对候选抗病基因进行鉴定。该方法能迅速、高通量的进行抗病基因的鉴定，表明基于该基因开发的植物抗病基因筛选的方法具有十分重要的应用价值。

Description

一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法
技术领域
本发明属于植物基因克隆技术领域，具体涉及一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法。
背景技术
番茄斑萎病毒（Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV）已对烟草、番茄、辣椒、蔬菜等作物生产构成了巨大的威胁。现有的主栽作物品种均能被番茄斑萎病毒侵染，成为番茄斑萎病毒流行、爆发的潜在威胁。由于其传播介体——蓟马具有发育历期短、个体小易隐蔽、对杀虫剂极易产生抗药性等的特点，所以现有的防治措施难以取得理想的控制效果。利用抗病基因培育抗病作物品种是最经济、最有效的手段。
以往进行抗病候选基因鉴定和筛选主要利用转基因过表达结合基因沉默技术进行鉴定。通过分子标记锁定抗病基因连锁的scaffolds或基因区段，一般都会有多个候选基因，对多个候选基因分别进行转基因过表达需要耗费较大的人力物力。因此在进行转基因过表达前，对候选抗病基因进行进一步的快速准确筛选将极大的减少抗病候选基因鉴定和筛选的工作量，提高准确性。
在经典遗传学中，基因型控制的植物抗病性常常是由来源于植物的抗病基因 R (resistance)与相应的来源于病原物的无毒基因 Avr (avirulence)互作所决定的，即“基因对基因”学说。Avr基因的克隆和鉴定不仅有助于阐明抗病植株的抗病机制，而且基于Avr基因和R基因的对应关系，更有助于R基因的鉴定和筛选，更迅速的锁定R基因。因此在R基因克隆前，进行Avr基因的克隆和鉴定，并将含有Avr的表达载体和候选抗病基因一起共浸润来进行抗病基因鉴定，比起将全部候选抗病基因进行转基因过表达，并在转基因植株上来接种病毒来更方便、快捷，可以节约大量的人力、物力和财力。同时利用Avr基因和候选抗病基因一起共浸润进行抗病基因鉴定具有操作简便，能减少人为误差，重复性好，满足实现大规模检测的特点。
目前番茄中抗TSWV的基因SW-5b已被克隆，TSWV的NSm为其对应的Avr基因。辣椒中抗TSWV的基因Tsw最近也被已被克隆基因，其对应的Avr基因是TSWV的NSs基因。但是来源于野生烟草N. alata中抗性基因RTSW还未被克隆，其对应的TSWV Avr基因也未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，该方法能够快速地鉴定候选抗病基因，极大的减少了候选基因验证的难度和工作量，为快速分离、克隆抗病基因奠定了基础，对烟草抗病育种、抗病基因克隆具有显著的意义。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，包括如下步骤：
鉴定出番茄斑萎病毒基因组中激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因，该无毒基因是NSm基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示；
用所述番茄斑萎病毒基因组中的所述无毒基因构建含有所述无毒基因NSm的植物表达载体，并通过农杆菌注渗法将构建好的含有所述无毒基因NSm的植物表达载体导入根癌农杆菌菌株中，之后制得带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液；
构建含候选抗病基因的植物表达载体，并将候选抗病基因的植物表达载体导入根癌农杆菌菌株中，之后制得带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液；
将带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液和带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液一起注渗到本氏烟叶片脉间，并检测本氏烟叶片的过敏反应。
进一步，优选的是，若在本氏烟叶片上检测到所述过敏反应，则表明该候选抗病基因为该无毒基因的抗病基因。
进一步，优选的是，所述鉴定出番茄斑萎病毒基因组中激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因，具体包括：在所述番茄斑萎病毒基因组中搜索已注释的病毒功能基因，并从病毒的功能基因中验证出特异针对RTSW抗性位点的无毒基因。
进一步，优选的是，用所述番茄斑萎病毒基因组中的所述无毒基因构建含有所述无毒基因NSm的植物表达载体，并通过农杆菌注渗法将构建好的含有所述无毒基因NSm的植物表达载体导入根癌农杆菌菌株中，之后制得带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液，具体包括：
克隆所述无毒基因NSm全长序列，之后将该基因克隆于表达双元载体pK2GW7中，构建含有所述无毒基因NSm的植物表达载体；
通过农杆菌注渗法将含有所述无毒基因NSm的表达载体导入根癌农杆菌EHA105菌株中，之后将包含无毒基因NSm的农杆菌在根癌农杆菌培养基LB中，于28℃培养24小时，离心收集菌体，再用浸润缓冲液稀释成OD600＝0.5的菌体悬液，制得带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液。
进一步，优选的是，构建含候选抗病基因的植物表达载体，并将候选抗病基因的植物表达载体导入根癌农杆菌菌株中，之后制得带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液，具体包括：
克隆所述候选抗病基因全长序列，之后将其克隆于表达载体pHellsgate8中，构建含有所述候选抗病基因的植物表达载体；
通过农杆菌注渗法将含有所述候选抗病基因的植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105 菌株中，之后将包含候选抗病基因的农杆菌在根癌农杆菌培养基LB中，于28℃培养24小时，离心收集菌体，再用浸润缓冲液稀释成OD600＝0.5的菌体悬液，制得带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液。
进一步，优选的是，将带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液和带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液一起注渗到本氏烟叶片脉间，具体包括：
将带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液和带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液按照体积比为1：1混合，并控制混合后菌体悬液的OD600＝0.5；
用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液9.5-10.5微升，从本氏烟的叶背注渗入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的本氏烟置于20-28℃及80％湿度的环境中，交替进行连续光照16小时及连续黑暗8小时，共观察72小时。
进一步，优选的是，检测本氏烟叶片的过敏反应，具体包括：
在本氏烟上以含有pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b的EHA105菌株作阳性对照，观察若本氏烟上产生混合后菌体悬液诱导的过敏反应，则表明该候选抗病基因为该无毒基因的抗病基因。
本发明无毒基因的克隆和鉴定方法包括如下步骤：
（1）分别扩增TSWV病毒基因组中的基因全长序列作为候选基因，并将候选基因克隆于表达双元载体pK2GW7中，构建含有所述候选无毒基因的表达载体；
（2）通过农杆菌注渗法分别将含有所述候选无毒基因的表达载体导入根癌农杆菌EHA105菌株中，构建系列的鉴别菌株。
（3）分别将鉴别菌株在根癌农杆菌培养基LB中，于28℃培养24小时，离心收集菌体，再用浸润缓冲液稀释成OD600＝0.5的菌体悬液；用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液9.5-10.5微升，从烟草植株的叶背注渗入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的烟草植株置于20-28℃及80％湿度的环境中，交替进行连续光照16小时及连续黑暗8小时，共观察72小时。
（4）观察若N. alata和Polalta上产生含无毒基因表达载体的鉴别菌株诱导的过敏反应，表明供试抗TSWV烟草植株对这个无毒候选基因发生了识别作用，即该候选基因为无毒基因。
本发明中激发烟草产生抗病反应的NSm为RTSW抗性位点对应的无毒基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示，为Genebank ID:JF960236.1的第101-1009个碱基所组成的基因，其氨基酸序列为Genebank ID:AEI70837.1；
本发明设计引物扩增NSm基因，通过Gateway 技术的LR 反应把NSm基因亚克隆到植物表达载体pK2GW7 中，构建含有所述NSm基因的表达载体pK2-35S-NSm；通过农杆菌注渗法将含有所述NSm基因的表达载体导入根癌农杆菌EHA105 菌株中，构建含有无毒基因NSm表达载体的菌株。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
采用本发明的利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，比起传统的将全部候选抗病基因进行转基因过表达，并在转基因植株上来接种病毒来更方便、快捷，可以节约大量的人力、物力和财力，单个候选基因鉴定节约4-5个月的时间。同时利用无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌和候选抗病基因一起共浸润本氏烟进行抗病基因鉴定具有操作简便，能减少人为误差，重复性好，满足实现大规模检测的特点。
附图说明
图1为4种烟草品种接种pK2-35S-NSm（图中标记为NSm）、pK2-35S-NSs（图中标记为NSs）、pK2-35S-Gn（图中标记为Gn）、pK2-35S-Gc（图中标记为Gc）、pK2-35S-N（图中标记为N）和pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b（图中标记为NSm+Sw-5b）HR 反应；
图中：A为N.alata(PI42334)，pK2-35S-NSm浸润区域表现过敏性坏死，阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b浸润区域表现表现过敏性坏死；B为Polalta，pK2-35S-NSm浸润区域表现过敏性坏死，阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b浸润区域表现表现过敏性坏死；B为N.tabacumCV. Hongda，仅阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b浸润区域表现表现过敏性坏死；D为N.tabacumCV. K326，仅阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b浸润区域表现表现过敏性坏死。
图2 本氏烟叶片上使用农杆菌浸润接种以下瞬时表达载体：pHellsgate8-N'au+pK2-35S-NSm，pHellsgate8-RTSWCG1+pK2-35S-NSm， pHellsgate8-RTSWCG2+pK2-35S-NSm和p2300-35S-Sw-5b+pK2-35S-NSm。接种后第3 天调查HR 反应。仅有p2300-35S-Sw-5b+pK2-35S-NSm有过敏性坏死斑出现。
图中A为pHellsgate8-N'au+pK2-35S-NSm共浸润，没有过敏性坏死斑出现 B为pHellsgate8-RTSWCG1+pK2-35S-NSm共浸润，没有过敏性坏死斑出现 C为pHellsgate8-RTSWCG2+pK2-35S-NSm共浸润，没有过敏性坏死斑出现，D为p2300-35S-Sw-5b+pK2-35S-NSm共浸润，有过敏性坏死斑出现。
图3 通过NPTII基因的PCR扩增检测p2300-35S-Sw-5b，pHellsgate8-N'au，pHellsgate8-RTSWCG1和pHellsgate8-RTSWCG2表达载体的阳性转基因植物。每一个点样孔代表一株转基因植株。其中标记为“+”的点样孔代表阳性对照pHellsgate8-RTSWCG1质粒，标记为“-”的点样孔代表阴性对照非转基因野生型烟草N.tabacumCV. K326, 标记为“M”的点样孔代表分子量标尺（DNA size marker），从下往上的条带分别代表为100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000和1500bp。标记为①为p2300-35S-Sw-5b转基因植株，标记为②为pHellsgate8-N'au转基因植株，标记为③为pHellsgate8-RTSWCG2转基因植株，标记为④为pHellsgate8-RTSWCG1转基因植株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明提供的一种利用番茄斑萎病毒NSm基因鉴定烟草抗性的方法，基于植物表达载体农杆菌注渗法，其发明构思是，利用无毒基因可引起依赖于寄主抗病基因的过敏反应这一特性，通过找出TSWV无毒基因，和候选抗病基因一起共浸润本氏烟，并观察本氏烟叶片是否产生过敏性坏死的性状，由此能够快速地鉴定出抗病基因。
本发明克隆了TSWV病毒的5个功能基因——NSs（为GenBank: JF960235.1的第89-1492个碱基所组成的基因，其氨基酸序列为Genebank ID: AEI70835.1）、NSm、Gn（为GenBank: JF960236.1的第3415- 4689个碱基所组成的基因，其氨基酸序列为GenebankID: AEI70838.1中1-425个氨基酸）、Gc（为GenBank: JF960236.1的第1282-3414个碱基所组成的基因，其氨基酸序列为Genebank ID: AEI70838.1中426-1136个氨基酸）和N（为GenBank: JF960235.1的第2043-2819个碱基所组成的基因，其氨基酸序列为Genebank ID:AEI70836.1），用这5个功能基因构建了一系列鉴别菌株pK2-35S-NSs、pK2-35S-NSm、pK2-35S-Gn、pK2-35S-Gc和pK2-35S-N，通过农杆菌介导瞬时表达的方法接种抗性寄主N. alata 和Polalta快速鉴定出无毒基因为NSm。
下面结合实例和附图对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。
如无特殊说明，下述各实施例使用的均为常规方法；如无特殊说明，所用的试验材料均为自常规生化试剂公司购买得到的。烟草材料为N. alata（PI42334）、Polalta、本氏烟（N. benthamiana）、N.tabacumCV. Hongda，N.tabacumCV. K326，Polalta×K326 BC6F1S和Polalta×K326 BC6F1R均来自云南省烟草农业科学研究院。TSWV病毒来自云南省烟草农业科学研究院。TSWV的cDNA通过常规方法提取病毒侵染的烟草叶片总RNA并利用试剂盒随机引物反转录方法获得。
Gateway LR clonase Enzyme Mix kit、pENTR/D-TOPO载体试剂盒购自Invitrogen公司，农杆菌EHA105购自Invitrogen公司。pK2GW7（购自FlandersInteruniversity Institute for Biotechnology，VIB）。质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒购自QIAGEN公司。Phusion High-Fidelity DNAPolymerase (M0530)试剂盒购自NEB公司。大肠杆菌(Escherichia coli) DH 5α、限制性内切酶、M-MuLV Reverse Transcriptase Kit反转录试剂盒、DNA size Marker、T4 DNA聚合酶及T4 DNA连接酶、卡拉霉素、壮观霉素均购自大连宝生物公司和Roche公司。RNA提取试剂盒Trizol购自Invitrogen公司，检测TSWV的ELISA试剂盒和试纸条购自Agdia公司。
实施例1 激发RTSW抗病位点产生过敏性反应的无毒基因确定
无毒基因鉴定通过TSWV病毒的5个功能基因（NSs、NSm、Gn、Gc和N）的克隆、表达载体构建及农杆菌瞬时浸润来实现。所有的载体构建过程中，均在正向引物的5’端加上CACC，扩增得到整个表达盒片段，这样片段的5’端与入门载体pENTR/D-TOPO的突出末端GTGG序列互补，在拓扑异构酶I的作用下使基因以正确的方向插入到pENTR/D-TOPO载体的两个attL重组位点之间，形成带有两个attL重组位点的入门克隆；提取构建正确的入门克隆质粒，按摩尔比1:1-3:1比例与目的载体pK2GW7混合，在LR Clonase Enzyme Mix的作用下，入门克隆载体的两个attL重组位点与pK2GW7的两个attR位点进行LR位点特异性重组反应，得到目的重组载体。
1、用TRIzoL Reagent（Invitrogen）从0.1g TSWV毒源叶片中提取总RNA。取-80℃保存的TSWV毒源叶片约0.1g，加入1ml 的TRIzoL 提取液在研钵中研磨，室温静置5min 后移入离心管，再加入0.2ml 氯仿，振荡混匀，离心15min（12000rpm），转移上清液至新管，加入0.5ml 异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min（12000rpm），弃上清，沉淀用75％乙醇1ml 清洗，4℃离心5min（7500rpm），弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解RNA。使用M-MuLV Reverse Transcriptase Kit（TaKaRa）进行cDNA的合成，取植物总RNA 约0.1μg-5μg，Random primer 50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl（5×reaction buffer 2μl，25mM MgCl2 4μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl），将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLVReverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。
TSWV病毒的5个功能基因——NSs、NSm、Gn、Gc和N分别采用如下引物对扩增合成的cDNA：
TSWV NSs F: 5’-caccatgtcttcaagtgtttatgagtcgat-3’;（SEQ ID No.2）
TSWV NSs R: 5’-ttattttgatcctgaagcatatgctt-3’;（SEQ ID No.3）
TSWV NSm F: 5’-caccatgttgactttttttggtaataag-3’；（SEQ ID No.4）
TSWV NSm R: 5’-ctatatctcatcaaaagataactgag-3’；（SEQ ID No.5）
TSWV N F:5’-caccatgtctaaggttaagctcactaag-3’;（SEQ ID No.6）
TSWV N R: 5’-ttaagcaagttctgcaagttttgtc-3’;（SEQ ID No.7）
TSWV Gn F:5’-caccatgagaattttaaaactactagaac-3’;（SEQ ID No.8）
TSWV Gn R :5’-ttagctagtccacttatgtttgttgtagt-3’;（SEQ ID No.9）
TSWV Gc F: 5’-caccatggaatggttccatctaatagtga-3’;（SEQ ID No.10）
TSWV Gc R:5’-tcagacaaggtgagagaaatccatag-3’;（SEQ ID No.11）
2、以合成的cDNA第一链为模板、用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(M0530)试剂盒的20μL体系进行扩增（5X Phusion HF缓冲液 4µl，10mM dNTPs 0.4 µl，10µM 上游引物 1µl，10µM 下游引物 1µl，模板DNA 1µl， Phusion DNA 聚合酶 0.2µl，加无菌水12.4µl至20µl）。扩增程序为98℃预变性30s；30个循环的98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；
3、pENTR-NSs、pENTR-NSm、pENTR-Gn、pENTR-Gc和pENTR-N入门载体的构建
将PCR扩增产物与pENTR/D-TOPO载体按照摩尔比1：1比例混合，即体系为pENTR/D-TOPO载体1μ1，Salt Solution 1μ1，PCR扩增产物 1-3μ1，无菌水补充至6μ1。室温下连接5min，将连接产物热激转化大肠杆菌DH5α后涂布在含有Kan(100mg/L)的平板上筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，提取质粒并测序，将测序正确的重组载体即为入门克隆载体，记作pENTR-NSs、pENTR-NSm、pENTR-Gn、pENTR-Gc和pENTR-N。
4、pK2-35S-NSs、pK2-35S-NSm、pK2-35S-Gn、pK2-35S-Gc和pK2-35S-N载体的构建
由于入门克隆载体pENTR-NSs、pENTR-NSm、pENTR-Gn、pENTR-Gc和pENTR-N为卡那霉素抗性，而目的载体pK2GW7为壮观霉素抗性，故可以直接利用质粒进行LR反应。参照Invitrogen 公司 Gateway LR Clonase Enzyme Mix 说明书，在0.5ml EP管中依次加入如下组分进行LR重组反应：入门克隆载体2μ1，pK2GW7目的载体 2μ1，TE buffer(pΗ 8.0)4 μ1，LR Clonase Enzyme Mix 2 μ1。短暂混匀后25℃孵育1小时，待反应完全后加入1 μl蛋白酶K于37℃、10分钟终止反应。取2 μl反应液热激转化大肠杆菌DH5α，菌液涂布在含有壮观霉素(100mg/l)的平板上筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，提取质粒并测序。测序结果表明目的序列已经插在了pK2GW7的attRl和attR2之间，表明得到的重组载体正确，记作pK2-35S-NSs、pK2-35S-NSm、pK2-35S-Gn、pK2-35S-Gc和pK2-35S-N。
5、农杆菌培养与接种方法：
用于阳性对照的载体p2300-35S-Sw-5b的农杆菌菌液在文献“Zhao W, Jiang L,Feng Z, Chen X, Huang Y, Xue F, Huang C, Liu Y, Li F, Liu Y et al.Plasmodesmata targeting and intercellular trafficking of Tomato spotted wilttospovirus movement protein NSm is independent of its function in HRinduction. J Gen Virol. 2016; 97:1990-7.”中公开过，公众可从云南省烟草农业科学研究院获得。
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体pK2-35S-NSs、pK2-35S-NSm、pK2-35S-Gn、pK2-35S-Gc和pK2-35S-N转入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105中，在加有50mg/L利福平和50mg/L壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用1mm的电击杯和200欧姆、2.5kV/0.2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5ml SOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃、200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留100μl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于LB抗生素（50mg/L利福平，50mg/L壮观霉素)固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆.
筛选得到的阳性克隆和保存的p2300-35S-Sw-5b菌液分别在2mL LB抗生素（50mg/L利福平，50mg/L壮观霉素)和2mL LB抗生素（50mg/L利福平，50mg/L卡那霉素)培养基震荡培养活化，28℃、210r/min，30h。取150μL活化菌液至10mL LB 培养基[含10mmol/L吗啉乙磺酸(MES) (pH 5.6)，40μmol/L乙醚丁香酮（acetosyringone），50mg/L利福平]28℃、210 r/min，培养24h后，4700r/min，离心5min收集菌体。用浸润缓冲液(10 mmol/L MgCl2，10mmol/L MES，200μmol/L acetosyringone)悬浮调整至菌液OD600＝0.5。室温放置3h。
选取两种TSWV抗性烟草即含有RTSW抗性位点的烟草：N.alata（PI42334）、Polalta和两种TSWV感病烟草即不含RTSW抗性位点的烟草：N.tabacumCV. Hongda，N.tabacumCV.K326各5株，用2mL注射器浸润4周大小烟苗最大的2片叶片。每张叶片注射六孔，分别为pK2-35S-NSm、pK2-35S-NSs、pK2-35S-Gn、pK2-35S-Gc、pK2-35S-N和pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b（pK2-35S-NSm：p2300-35S-Sw-5b体积比1:1）。其中pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b为阳性对照，阳性对照在所有的烟草上都会产生过敏性坏死。烟苗接种后20-28℃的光照培养室中培养72h，调查观察过敏坏死（HR反应）。
结果（图1）表明：感病烟草N.tabacumCV. Hongda和N.tabacumCV. K326接种pK2-35S-NSm的农杆菌瞬时表达载体无HR反应，仅阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b有HR反应。而抗性烟草N. alata（PI42334）和Polalta除了阳性对照pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b外，接种pK2-35S-NSm的农杆菌也表现明显的HR反应，这说明N. alata（PI42334）和Polalta中抗病基因与TSWV互作的无毒基因为NSm。
实施例2 利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选和利用传统方法进行抗病基因筛选的比较
（1）利用无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌和候选抗病基因一起共浸润本氏烟进行抗病基因筛选
设计引物从N. alata （PI42334）中扩增候选基因，并构建候选基因的表达载体，转化农杆菌。分别和带有所述无毒基因NSm植物表达载体pK2-35S-NSm的农杆菌共浸润本氏烟，如有候选抗病基因能在叶片浸润区域诱导过敏性坏死，则表明该基因为抗病基因。
N'au瞬时表达载体pHellsgate8-N'au在专利“一种抗烟草花叶病毒的N′au 基因及其克隆方法和应用，申请人：刘勇，袁欣婕，黄昌军，李永平，于海芹，陈学军，肖炳光，申请号：201510768990.8， 申请公开号：CN 105274120 A”中公开过，公众可从云南省烟草农业科学研究院获得。特征是N'au是烟草中抗烟草花叶病毒（TMV）基因，其对应的无毒蛋白为TMV-CP。
步骤1：RTSW位点候选抗病基因（RTSWCG1和RTSWCG2）基因克隆：
以N. alata （PI42334）的DNA 为模板，用引物对：
RTSWCG1 F：5’-tgcatccaacgcgttgggagctcatcgcaaagaaggcccaactgattga-3’；（SEQ ID No.12）
RTSWCG1 R：5’-tctcattaaagcaggactctagagtagtaatgttacagtataaggagactg-3’；（SEQ ID No.13）
RTSWCG2 F：5’-tgcatccaacgcgttgggagctctaggttaagagaggatgagggatcta-3’；（SEQ ID No.14）
RTSWCG2 R：5’-tctcattaaagcaggactctagaggtggatcggtgatatcaaaagtga-3’；（SEQID No.15）
进行PCR 扩增。用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (M0530)试剂盒的20μL体系进行扩增（5X Phusion HF缓冲液 4µl，10mM dNTPs 0.4 µl，10µM 上游引物 1µl，10µM 下游引物 1µl，模板DNA 1µl， Phusion DNA 聚合酶 0.2µl，加无菌水12.4µl至20µl）。扩增程序为98℃预变性30s；30个循环的98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s；72℃后延伸5min，4℃保存；PCR产物经电泳检测为单一条带，纯化后备用；
2、用SacI +XbaI双酶切pHellsgate8空载体，切胶回收载体骨架，测定浓度。
3、采用One Step Cloning Kit ClonExpressTM II （Vazyme，中国南京）的重组反应体系：5X CE II Buffer 2ul，Exnase II 1ul，线性化克隆载体25-100ng，插入片段扩增产物 10-100ng，ddH2O to 10ul。室温下配置反应体系，37℃反应30min后，迅速转移到冰水中放置5min，直接转化。37℃环境下培养过夜，并利用步骤1中的候选基因的特异性引物进行PCR菌落筛选，得到阳性克隆。
4、PCR筛选得到阳性克隆pHellsgate8-RTSWCG1和pHellsgate8-RTSWCG2，构建完成后，电脉冲法将上述构建好的候选基因的表达载体转入农杆菌EHA105中。在本氏烟叶片上使用农杆菌浸润接种以下瞬时表达载体：p2300-35S-Sw-5b+pK2-35S-NSm（p2300-35S-Sw-5b：pK2-35S-NSm体积比1：1），pHellsgate8-N'au+pK2-35S-NSm（pHellsgate8-N'au：pK2-35S-NSm体积比1：1），pHellsgate8-RTSWCG1+pK2-35S-NSm（pHellsgate8-RTSWCG1：pK2-35S-NSm体积比1：1）和pHellsgate8-RTSWCG2+pK2-35S-NSm（pHellsgate8-RTSWCG2：pK2-35S-NSm体积比1：1）。每株接种2片最大叶片。接种后第3天调查HR反应。（图2）结果可知仅有p2300-35S-Sw-5b+pK2-35S-NSm产生了过敏性反应，pHellsgate8-N'au+pK2-35S-NSm，pHellsgate8-RTSWCG1+pK2-35S-NSm和pHellsgate8-RTSWCG2+pK2-35S-NSm都没有过敏性反应，表明RTSWCG1和RTSWCG1都不是抗病基因。
（2）利用传统转基因方法进行抗病基因鉴定
为了进一步验证利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的准确性和比较利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选和利用传统方法进行抗病基因筛选的优势，我们利用传统方法将植物表达载体p2300-35S-Sw-5b、pHellsgate8-N'au、pHellsgate8-RTSWCG1和pHellsgate8-RTSWCG2的农杆菌转化烟草Nicotiana tabacum cv. K326。
步骤1植物表达载体的农杆菌转化烟草
挑取携带有质粒p2300-35S-Sw-5b、pHellsgate8-N'au、pHellsgate8-RTSWCG1和pHellsgate8-RTSWCG2 的农杆菌单菌落接种于50ml 的LB 培养基中。pHellsgate8-N'au、pHellsgate8-RTSWCG1和pHellsgate8-RTSWCG2在含50mg/L利福平、50mg/L壮观霉素的LB中培养，p2300-35S-Sw-5b在含50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的LB中培养，180rpm，28℃培养24h，待菌液OD600 至1.0 左右，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。再用10ml 左右的MS液体培养基悬浮，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。重复以上操作2～3次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD600值为0.5。
制备烟草(Nicotiana tabacum cv. K326)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无菌烟草的叶片切成小片叶盘，在制备好的农杆菌菌液中浸染15-20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1（MS+NAA 0.21μg/ml+BAP 0.02μg/ml）上黑暗共培养2 天，将外植体转移至含卡那霉素(50μg/ml)的芽诱导培养基MS4（MS+NAA 0.53μg/ml+BAP0.5μg/ml）上进行芽的诱导，约15天继代一次（共3-4次）。待有芽生成后，转入含卡那霉素(50ug/ml) 的MS 培养基上进行根的诱导（约需25-30天左右）。
步骤2目的基因在转基因烟草中的插入情况及表达水平的检测
为了确认通过卡那霉素筛选的转基因烟草株系确实含有导入的目的基因的DNA片段，用PCR 方法对筛选到的转基因烟草作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组：称取植物叶片100mg左右置于1.5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900μl预热到65℃的2×CTAB 缓冲液（Tris-HCl pH7.5 100mM, EDTA 20mM, NaCl 1.4M，CTAB2%），65℃度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500 uL 氯仿－异戊醇混合液（体积比24：1）摇匀，4℃离心10min（7500rpm）后转移上清至1.5ml EP管；再次加入500μl 氯仿－异戊醇混合液（24 ：1）摇匀，4℃离心10min（7500rpm）；取出上清置于新的EP 管中，加入1/10体积3MpH5.2 醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4℃离心20min（12000rpm）；弃上清，用75％乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase 的TE 缓冲液溶解并降解RNA，获得的基因组DNA 样品。以转烟草抗性苗基因组作为模板，以pHellsgate8-RTSWCG1质粒为阳性对照（图3中用“+”标记），以非转基因野生型烟草N.tabacumCV. K326为阴性对照（图3中用“-”标记），用表达载体都含有的NPTII基因的上下游引物 NPtII F：5’-ggtggagaggctattcggctatga-3’（SEQ ID No.16）和NPtII R：5’-cgctcagaagaactcgtcaagaagg-3’（SEQ ID No.17）进行PCR 扩增检测目的基因是否插入烟草基因组。扩增产物大小和预期推测(754 bp)一致，说明目的基因均已插入这些转基因株系的基因组，野生型烟草N.tabacumCV. K326基因组PCR 产物未出现目标条带（图3）。
步骤3 p2300-35S-Sw-5b、pHellsgate8-N'au、pHellsgate8-RTSWCG1和pHellsgate8-RTSWCG2转基因阳性株各得到16、12、15、25株，分别接种TSWV。接种后的第9、16、23、30天调查记录症状，并采样进行ELISA检测。具体步骤如下：
接种缓冲液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸缓冲液，121℃灭菌20分钟；在接种前半个小时内，每100mL磷酸缓冲液加入0.2g亚硫酸钠、10uL beta-巯基乙醇，配成TSWV接种缓冲液，放置冰上，备用；
待检烟苗接种：取TSWV毒源1-2g，放于研钵中，加入5-10mL步骤（1）获得的TSWV接种缓冲液和2-3g 200-400目金刚砂，冰上充分研磨至混合均匀，得到TSWV毒源汁液；
接种前洗净双手或者戴一次性乳胶手套操作；
接种时，首先将粒径为200-400目金刚砂按照每片叶0.1-0.2g的用量均匀的撒至本氏烟幼苗的叶表面，之后取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接种烟苗叶片，另一只手从待接种烟苗叶片的叶基到叶尖的方向轻轻地、均匀地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量为每片叶50-100ul；
涂擦后用清水冲洗接种过的叶片，接着将植株于温度22-25℃、湿度为60-80%条件下暗培养一天，之后将植株移至温度22-25℃、光周期是昼/夜为14h/10h、湿度为80%条件下继续培养；
发病率统计：从接种后第9天开始，每7天取烟草新鲜嫩叶并利用双抗体夹心ELISA法检测TSWV，并计算烟苗番茄斑萎病毒的发病率a，共调查4次。根据ELISA结果区分待检植株的抗感性，调查方法为：第一次采集全部叶片检测，其后每次检测前一次呈现阴性的植株。呈现阳性的植株直接登记为感病。即第二次采集第一次检测呈现阴性的样品，第三次检测第二次呈现阴性的样品，第四次检测第三次呈现阴性的样品。为了减少人为操作的误差，每个样品的ELISA检测设计三次技术重复。
双抗体夹心ELISA法步骤如下：
1.用AS-0105 IgG包被板，用CB缓冲液稀释1000倍，每孔加入200μl，37℃反应2-4h，洗板。
2.加入磨好的样品200μl，用1×PBST+2%PVP磨样，4℃过夜，洗板。
3.加鼠单抗，用ECI稀释3000 倍，37℃、2到4h，洗板。
4.加入用ECI稀释的羊抗鼠-AP，37℃、2h，洗板。
5.加入PNPP底物，室温，1 h后测OD值。
将四次的阳性株数加和即为总的发病株数。发病率a=（该品种感病植株数量/该品种总植株数量）×100%。结果见表1。
表1 利用传统方法进行抗性鉴定
Figure 699063DEST_PATH_IMAGE001
*dpi（days post inoculation）, 即表示接种后的天数。9 dpi、16 dpi、23、dpi、30 dpi分别表示的是接种后第9、16、23、30天。
从以上结果可知，通过和候选抗病基因共浸润本氏烟，观察本氏烟叶片是否产生过敏性坏死的性状，进而对候选抗病基因进行鉴定和传统方法鉴定的结果吻合，结果准确。该方法仅用3天即能明确鉴定结果并且可同时进行多个候选基因鉴定，而传统方法需要3-4个月进行转基因，并需要一个月左右明确鉴定结果，且每个候选基因都需单独进行转基因后才能进行鉴定，耗时耗力。利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法能迅速、高通量的进行抗病基因的鉴定，表明基于该基因开发的植物抗病基因筛选的方法具有十分重要的应用价值。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID No.1
ttagtttcac ttgctaaaca taacggtaat gttgaagtct caaaaccatg gtcttcttct 120
gatgaaaagc ttgctttaac caaagctatg gatacatcca aaggaaagat actgttgaac 180
acagagggaa catcttcctt tggaacatat gaatctgatt ctatcacaga atcagagggt 240
tatgatcttt ctgcgagaat gatagtagat acaaaccacc atatctcaaa ctggaaaaat 300
gatctttttg tcggcaacgg gaagcaaaac gctaataagg tcatcaagat ctgtccaact 360
tgggacagca gaaaacaata catgatgatt tccaggattg tgatatgggt ctgccccact 420
ataccaaacc ctacagggaa acttgtggtt gctctggtcg atcccaacat gccatctgaa 480
aagcaaatca ttctgaaggg tcaggggaca ataactgatc ctatctgttt tgttttttat 540
ctgaactggt ctattccgaa aatgaataac actccagaaa actgctgtca gctgcacttg 600
atgtgcagtc aagaatacaa gaagggggtt tcttttggta gtgtcatgta ttcttggaca 660
aaggagtttt gtgattcacc cagagctgat aaagacaaaa gttgcatggt catacctcta 720
aacagggcta ttagagctag atctcaagca ttcattgagg cttgcaagct gataattcct 780
aaaggaaaca gtgagaagca gattaaaaaa cagcttaaag aactgagctc aaatcttgag 840
agatcagttg aagaagagga ggaaggggtt tatgataatg ttgctcagtt atcttttgat 900
gagatatag 909
SEQ ID No.2
caccatgtct tcaagtgttt atgagtcgat 30
SEQ ID No.3
ttattttgat cctgaagcat atgctt 26
SEQ ID No.4
caccatgttg actttttttg gtaataag 28
SEQ ID No.5
ctatatctca tcaaaagata actgag 26
SEQ ID No.6
caccatgtct aaggttaagc tcactaag 28
SEQ ID No.7
ttaagcaagt tctgcaagtt ttgtc 25
SEQ ID No.8
caccatgaga attttaaaac tactagaac 29
SEQ ID No.9
ttagctagtc cacttatgtt tgttgtagt 29
SEQ ID No.10
caccatggaa tggttccatc taatagtga 29
SEQ ID No.11
tcagacaagg tgagagaaat ccatag 26
SEQ ID No.12
tgcatccaac gcgttgggag ctcatcgcaa agaaggccca actgattga 49
SEQ ID No.13
tctcattaaa gcaggactct agagtagtaa tgttacagta taaggagact g 51
SEQ ID No.14
tgcatccaac gcgttgggag ctctaggtta agagaggatg agggatcta 49
SEQ ID No.15
tctcattaaa gcaggactct agaggtggat cggtgatatc aaaagtga 48
SEQ ID No.16
ggtggagagg ctattcggct atga 24
SEQ ID No.17
cgctcagaag aactcgtcaa gaagg 25

Claims (6)

1.一种利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，其特征在于，包括如下步骤：
鉴定出番茄斑萎病毒基因组中激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因，该无毒基因是NSm基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示；
用所述番茄斑萎病毒基因组中的所述无毒基因构建含有所述无毒基因NSm的植物表达载体，并通过农杆菌注渗法将构建好的含有所述无毒基因NSm的植物表达载体导入根癌农杆菌菌株中，之后制得带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液；
构建含候选抗病基因的植物表达载体，并将候选抗病基因的植物表达载体导入根癌农杆菌菌株中，之后制得带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液；
将带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液和带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液一起注渗到本氏烟叶片脉间，并检测本氏烟叶片的过敏反应；若在本氏烟叶片上检测到所述过敏反应，则表明该候选抗病基因为该无毒基因的抗病基因。
2.根据权利要求1所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，其特征在于，所述鉴定出番茄斑萎病毒基因组中激发含有抗性位点RTSW的烟草产生抗病反应的无毒基因，具体包括：在所述番茄斑萎病毒基因组中搜索已注释的病毒功能基因，并从病毒的功能基因中验证出特异针对RTSW抗性位点的无毒基因。
3.根据权利要求1或2所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，其特征在于，用所述番茄斑萎病毒基因组中的所述无毒基因构建含有所述无毒基因NSm的植物表达载体，并通过农杆菌注渗法将构建好的含有所述无毒基因NSm的植物表达载体导入根癌农杆菌菌株中，之后制得带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液，具体包括：
克隆所述无毒基因NSm全长序列，之后将该基因克隆于表达双元载体pK2GW7中，构建含有所述无毒基因NSm的植物表达载体；
通过农杆菌注渗法将含有所述无毒基因NSm的表达载体导入根癌农杆菌EHA105 菌株中，之后将包含无毒基因NSm的农杆菌在根癌农杆菌培养基LB中，于28℃培养24小时，离心收集菌体，再用浸润缓冲液稀释成OD600＝0.5的菌体悬液，制得带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液。
4.根据权利要求1或2所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，其特征在于，构建含候选抗病基因的植物表达载体，并将候选抗病基因的植物表达载体导入根癌农杆菌菌株中，之后制得带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液，具体包括：
克隆所述候选抗病基因全长序列，之后将其克隆于表达载体pHellsgate8中，构建含有所述候选抗病基因的植物表达载体；
通过农杆菌注渗法将含有所述候选抗病基因的植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105菌株中，之后将包含候选抗病基因的农杆菌在根癌农杆菌培养基LB中，于28℃培养24小时，离心收集菌体，再用浸润缓冲液稀释成OD600＝0.5的菌体悬液，制得带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液。
5.根据权利要求1或2所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，其特征在于，将带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液和带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液一起注渗到本氏烟叶片脉间，具体包括：
将带有所述无毒基因NSm植物表达载体的农杆菌悬液和带有候选抗病基因植物表达载体的农杆菌悬液按照体积比为1：1混合，并控制混合后菌体悬液的OD600＝0.5；
用无菌的去掉针头的注射器，将菌体悬液9.5-10.5微升，从本氏烟的叶背注渗入叶脉间，形成一个可见的浸润斑；将接种后的本氏烟置于20-28℃及80％湿度的环境中，交替进行连续光照16小时及连续黑暗8小时，共观察72小时。
6.根据权利要求5所述的利用番茄斑萎病毒NSm基因进行抗病基因筛选的方法，其特征在于，检测本氏烟叶片的过敏反应，具体包括：
在本氏烟上以含有pK2-35S-NSm+p2300-35S-Sw-5b的EHA105菌株作阳性对照，观察若本氏烟上产生混合后菌体悬液诱导的过敏反应，则表明该候选抗病基因为该无毒基因的抗病基因。
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登录号：JF960236;Hu,Z.Z.等;《GENBANK》;20111005;第1页 *

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