CN110904130A

CN110904130A - 一种抗菌核病基因GmGST1、转GmGST1基因植株的构建与应用

Info

Publication number: CN110904130A
Application number: CN201911309610.9A
Authority: CN
Inventors: 赵雪; 张倩; 宋伟; 姜海鹏; 韩英鹏; 李文滨
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-12-18
Also published as: CN110904130B

Abstract

一种抗菌核病基因GmGST1、转GmGST1基因植株的构建与应用，属于植物基因工程技术领域。为了解决目前在抗大豆菌核病方面可利用的基因资源稀少的问题，本发明提供了一种抗菌核病基因GmGST1，序列如SEQ ID No.1所示，本发明在过量表达抗病基因GmGST1得到转基因大豆植株基础上，通过后代表型鉴定，确定了GmGST1能够参与到抗大豆菌核病反应中，可显著提高受体大豆种质中茎中可溶性色素水平和其对核盘菌的抗性，为大豆抗菌核病分子设计育种提供有效的分子标记和基因资源。

Description

一种抗菌核病基因GmGST1、转GmGST1基因植株的构建与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种抗菌核病基因GmGST1、转GmGST1基因植株的构建与应用。

背景技术

大豆菌核病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)引起的真菌性病害，是一种危害严重的世界性病害，直接影响大豆的品质及产量，病情严重时发病率高达50％～90％，甚至绝产。由于传统育种方法的局限性，利用分子手段筛选及鉴定有效的抗病基因，对抗病品种的选育便显得尤为重要，然而目前抗病品种培育的基因资源稀少，制约了新品种选育的效率以及准确性。

在抗大豆菌核病基因研究方面，仅限于草酸氧化酶基因Germin、草酸脱羧酶及呼吸爆发氧化酶基因的应用，其他类型基因尚无相关报道，而大豆抗菌核病机制复杂，存在大量位点及关键基因有待挖掘与利用。

发明内容

为了解决目前在抗大豆菌核病方面可利用的基因资源稀少的问题，本发明提供了一种抗菌核病基因GmGST1，所述GmGST1的cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了扩增上述抗菌核病基因GmGST1的引物，引物序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了上述抗菌核病基因GmGST1的重组载体。

本发明还提供了上述抗菌核病基因GmGST1的重组菌。

本发明还提供了一种抗菌核病的转基因植株的构建方法，步骤如下：

(1)构建过表达上述的GmGST1基因的重组载体；

(2)将步骤(1)构建的重组载体转入农杆菌中，获得带有GmGST1基因的重组菌；

(3)将步骤(2)获得重组菌转入植物，获得抗大豆菌核病的转基因植株。

进一步地限定，步骤(1)所述的重组载体构建所用的中间载体为pCambia3301。

进一步地限定，步骤(2)所述的农杆菌为农杆菌EHA105。

进一步地限定，步骤(3)所述植物为大豆，优选为大豆合丰25或Maple Arrow。

本发明还提供了上述抗菌核病基因GmGST1在抗菌核病作物育种中的应用。

有益效果

本发明在过量表达抗病基因GmGST1得到转基因大豆植株基础上，通过后代表型鉴定，确定了GmGST1能够参与到抗大豆菌核病反应中。可显著提高受体大豆种质中茎中可溶性色素水平和其对核盘菌的抗性，为大豆抗菌核病分子设计育种提供有效的分子标记和基因资源。

附图说明

图1.大豆叶片总RNA的提取；

图2.GmGST1基因的克隆，其中M：DL2000，1：PCR产物；

图3.重组载体pCambia3301-GmGST1双酶切鉴定结果，其中M：DL2000，1：双酶切产物；

图4.转化农杆菌菌液PCR鉴定，其中M：DL2000，1，2：PCR产物；

图5.转基因大豆的PCR检测，其中M：DL2000，1：阳性对照，2：Maple Arrow的阴性对照，3：水，4-18：Maple Arrow的PCR产物1-15，19-24：合丰25的PCR产物1-6；25：阳性对照，26：合丰25阴性对照，27-31：合丰25的PCR产物7-11；

图6.抗病品种Maple Arrow T₁代转GmGST1基因大豆植株的qRT-PCR检测；

图7.感病品种合丰25T₁代转GmGST1基因大豆植株的qRT-PCR检测；

图8.野生型大豆植株与T1代转基因大豆植株接种大豆菌核病后3天后叶片的变化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药品试剂，YEP固体平板、MS0培养基等，如无特殊说明，均为常规试剂，或自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中所涉及的植物品种：加拿大引进的世界公认的耐菌核病品种MapleArrow，感病品种合丰25。病原菌：采自黑龙江省大庆大豆菌核病发病地块，可从东北农业大学获得，记载于赵雪等2014年发表的题为“大豆种质对菌核病的耐病性评价及资源筛选”的文献中(安徽农业科学,2014，v.42，No.449(16):5014-5017)。

名词缩写解释如下：Str：链霉素；Kan：卡那霉素；Rif：利福平；PPT：草铵膦

本发明从大豆抗病品种Maple Arrow中克隆出了GmGST1基因，利用农杆菌介导的大豆遗传转化，荧光定量PCR鉴定及表型鉴定的方法，最终得到T1代转基因过表达大豆植株，并对后代进行分子验证和接菌鉴定，证明了GmGST1基因能够参与到抗大豆菌核病的抗性反应中，所获得的转GmGST1基因的大豆可用于抗大豆菌核病育种工作。下面举例描述本发明。

实施例1.抗菌核病基因GmGST1的获得。

1)以大豆抗菌核病品种Maple Arrow为材料，待长出第一组三出复叶时，取材，提取总RNA，结果如图1所示，并反转录合成cDNA第一链。

2)根据Phytozome上GmGST1基因序列，利用Primer 5软件设计基因克隆引物，

引物1-S:5’-AGATCTATGGCCGTTACCTTCTCAAAT-3’,序列如SEQ ID NO.2所示；

引物1-a:5’-GGTTACCTTAGATTTTGTTGAATGCAAC-3’，序列如SEQ ID NO.3所示。

以cDNA为模板PCR反应，反应体系如下:

反应程序：94℃ 5min；37个循环：94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 40s；72℃ 10min，4℃保存。反应后取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收纯化目的片段。

3)按照TIANGEN公司的PGM-T克隆试剂盒的步骤，将上述得到的胶回收产物与克隆载体进行连接，获得pGM-GmGST1，并转化Top10大肠感受态细胞，挑取单克隆并进行PCR及测序验证，PCR所用引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，测序结果如SEQ ID NO.1所示。最终得到目的片段大小为668bp的GmGST1基因，PCR扩增产物结果如图2所示。

实施例2.抗菌核病转基因大豆植株的构建。

(1)构建过表达GmGST1基因重组载体，具体步骤如下：

将质粒pCambia3301和质粒实施例1制备的pGM-GmGST1分别用BstEII和BglII双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测后回收纯化pCambia3301载体骨架及GmGST1基因酶切片段，将两个片段连接、转化，对挑取的单斑进行BstEII和BglII双酶切进行鉴定，获得携带有GmGST1基因重组载体pCambia3301-GmGST1，酶切鉴定结果如图3所示。

(2)将步骤(1)构建的重组载体导入农杆菌中，获得带有GmGST1基因的重组菌，具体步骤如下：

将步骤(1)获得的pCambia3301-GmGST1表达载体转入农杆菌EHA105，并进行菌液PCR验证，PCR所用引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，最终得到目的片段为668bp的阳性菌株，结果如图4所示，获得已成功转入pCambia3301-GmGST1载体的农杆菌EHA105。

(3)将步骤(2)获得携带有重组载体的农杆菌转入大豆，获得转基因大豆植株，具体步骤如下：

1)菌液制备：取步骤(2)成功转入pCambia3301-GmGST1载体的农杆菌EHA105的菌液分别在YEP固体平板(50mg/mL Str，50mg/mL Kan，25mg/mL Rif)上划线28℃培养，挑取单菌落接种于YEP液体培养基(50mg/mL Str，50mg/mL Kan，25mg/mL Rif)中，28℃ 200rpm震荡培养1-2天，取1-2ml菌液接种于50ml新鲜的YEP液体培养基中震荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。

2)种子灭菌：选取饱满、品种为Maple Arrow的无菌斑种子于培养皿中，采用氯气灭菌法，将种子放入通风厨的干燥器内，在干燥器的三角瓶中倒入96ml次氯酸钠，再快速加入6ml浓盐酸后迅速盖紧封盖。灭菌16h后置于超净工作台内吹走残留的氯气，大约30min左右，密封待用。

3)种子萌发：将灭菌后的种子种脐向下种于MS0培养基中，每瓶种10粒，共瓶，在23℃、16h光照/8h黑暗条件下萌发5-6天。

4)茎尖外植体的制备：种子萌发至子叶即将冲破种皮时，用镊子和解剖刀去掉种皮，将两半子叶中的一半切掉，用解剖刀轻轻刮掉子叶和生长点之间的腋芽，并在子叶节处轻轻划3-5道伤口，剩余的部分作为外植体用于侵染。

5)侵染、共培养和移栽：将制备好的外植体放入侵染液中进行抽真空处理，抽真空条件为0.6pa，10min。真空侵染后的外植体用灭菌蒸馏水清洗三次，用无菌纸将外植体表面的侵染液吸干，插入MS0培养基中共培养3天，观察复活情况。

(6)使用PPT对转基因植株进行筛选，叶片未变黄植株即为转基因抗菌核病植株。

成功返青的外植体移栽至土壤中，在其长到第5-6轮三出复叶时，选取一片三出叶，用毛刷进行PPT的涂抹，PPT浓度为125mg/L，4-7天内观察叶片是否变黄。将PPT涂抹后叶片未变黄的植株视为T0代潜在阳性植株。本实施例共获得T0代阳性植株22株。

实施例3.抗菌核病转基因大豆植株的构建。

重复实施例2，与实施例2不同之处在于，本实施例步骤(3)中2)所用种子为大豆品种合丰25。本实施例共获得T0代阳性植株16株。

为了对抗菌核病基因GmGST1在抗菌核病上的效果进行验证，以实施例2和实施例3制备的转基因植株为例，进行如下实验。

1.过表达植株的PCR检测

为了鉴定收获的阳性植株为成功转入基因GmGST1，将收获的T0代进行播种，生长出的植株为T1代，待T1代植株第一组三出复叶完全展开时取植株叶片提取DNA，并用Bar基因引物，所述引物序列：引物2-S：5’-CAATCCCACTATCCTTCGC-3’如SEQ ID NO.4所示，所述引物序列：引物2-A：5’-CCACGTCATGCCAGTTCC-3’如SEQ ID NO.5所示，PCR检测共鉴定3次，都检测得到大小为599bp的目的片段的植株鉴定为阳性，结果如图5所示，最终得到阳性植株抗病品种Maple Arrow和感病品种合丰25分别为15个和11个。

2.过表达植株的qRT-PCR检测

根据GmGST1基因序列设计定量引物，引物3-S:CCGTTACCTTCTCAAATCTCC序列如SEQID NO：6所示，引物3-A:TGATGTCGTCCTTTGTGAACT序列如SEQ ID NO：7所示，利用qRT-PCR的方法分别对抗病品种Maple Arrow和感病品种合丰25的T1代植株进行检测，内参基因选取大豆管家基因GmActin 4，引物4-S:GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA序列如SEQ ID NO：8所示，引物4-A:GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT序列如SEQ ID NO：9所示。

依照TIANGEN公司的荧光定量SYBR Green试剂盒的反应体系设置。

PCR扩增体系：

使用罗氏LightCycler 480定量仪器，PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 10s，60℃30s，72℃ 30s，40个循环；95℃ 1min，65℃ 30s，97℃ 30s。反应结束后分析融解曲线，计算每个样本3次重复数据的表达量。

结果检测到转GmGST1基因的大豆叶片中GmGST1基因的相对表达量高于对照品种，说明了转GmGST1基因对大豆菌核病产生了一定的抗病性。以超过对照2.5倍的相对表达量为基准，统计出抗病品种Maple Arrow T1代转GmGST1基因大豆植株为8株结果如图6所示，感病品种合丰25T1代转GmGST1基因大豆植株为6株结果如图7所示。

3.过表达植株的菌核病抗性鉴定

当T1代植株处于R3期时，对转基因植株叶片进行接种实验，将培养4天的核盘菌，在其生长的固体培养基上取1cm直径琼脂块，接种于叶片上，结果如图8所示，野生型MapleArrow大豆叶片初期叶面产生暗绿色水渍状斑纹，后扩展为不规则状病斑，；转GmGST1基因的Maple Arrow植株大豆叶片初期叶面产生不明显的水渍状病斑，后期病斑变为深褐色，过表达GmGST1基因的Maple Arrow叶片病斑面积明显小于同时期的合丰25野生型对照植株。

合丰25对照大豆叶片初期产生较大的暗绿色水渍状斑纹，后期病斑扩展速度加快，最后几乎布满整个叶片；转GmGST1基因的合丰25植株大豆叶片初期叶面产生暗绿色水渍状病斑，后期病斑变为深褐色，外部有黄色晕圈，最后叶片变黄，湿度大时产生少量白色菌丝，随后病斑扩展停止，过表达GmGST1基因的合丰25植株叶片病斑面积明显小于同时期的合丰25野生型对照植株，说明过表达GmGST1基因可提高耐病大豆品种和感病大豆品种对大豆菌核病的抗性。

4.GmGST1基因过表达植株色素含量分析

获取T1代过表达植株叶柄，于16h/8h光暗交替、25℃恒温培养条件下，用40mM草酸溶液浸泡叶柄48h，使叶柄中色素充分溶于，在518nm下测得色素的吸光值，然后经通过独立样品T检验，以Maple Arrow为受体的4个GmGST1过表达植株叶柄色素平均吸光值为0.35，野生型Maple Arrow平均吸光值为0.15，以合丰25为受体的3个GmGST1过表达植株叶柄色素平均吸光值为0.035，野生型合丰25平均吸光值为0.015，无论抗病品种或感病品种为受体的GmGST1过表达大豆植株，叶柄在草酸胁迫下的色素水平均显著高于野生型大豆色素水平，转基因叶片对核盘菌的抗性增强与此相对应。

本发明通过转基因后代表型鉴定，确定了大豆GmGST1基因具有提高大豆对菌核病抗性的作用，并且该基因可提高大豆植株中色素的水平，本发明为实现抗大豆菌核病转基因育种提供优异基因资源，以加速菌核病的抗病育种进程和提高育种效率，研究成果具有重要的理论意义与实践价值。

核苷酸序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种抗菌核病基因GmGST1、转GmGST1基因植株的构建与应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 675

<212> DNA

<213> GmGST1 cDNA

<400> 1

atggccgtta ccttctcaaa tctccacaca gaatcaggtc tcaagtccct cgacgacttc 60

ctctctggga aggtctacgt ttctggggat cagttcacaa aggacgacat caaagtgtat 120

ggtgctgttt tggagaagcc aggtgactct tttcccaatg ctgccaagtg gtacgaggtt 180

gtctcatctc agcttgctgc aagcttcccc ggcaatgctc aaggggtgag attcagtggc 240

aaagcttctg ctccagcgga ggctgctcct gcgaaaccgg atgcttctgc tgctgaagat 300

gatgatgacc ttgatctctt tggcgatgag actgaggaag acaaaaaggc agcagaggaa 360

agggaggctg ctaagaagtc taccaagaag aaagagagtg gcaaatcttc tgttctgctt 420

gacgttaagc cttgggatga tgaaacagac atgaagaagc tggaagaggc tgttcgcagt 480

gttgagatgc ctggtctatt gtggggagca tccaaactgg ttcctgttgg ttatgggatc 540

aagaagttgc agatcatgtt aactattgtc gatgaccttg tatctgtgga cacccttgtt 600

gaggagactc tcacagttga gcccatcaat gagtatgtcc aaagctgtga cattgttgca 660

ttcaacaaaa tctaa 675

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物1-S

<400> 2

agatctatgg ccgttacctt ctcaaat 27

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物1-a

<400> 3

ggttacctta gattttgttg aatgcaac 28

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物2-S

<400> 4

caatcccact atccttcgc 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物2-A

<400> 5

ccacgtcatg ccagttcc 18

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物3-S

<400> 6

ccgttacctt ctcaaatctc c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物3-A

<400> 7

tgatgtcgtc ctttgtgaac t 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物4-S

<400> 8

gtttcaagct cttgctcgta atca 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物4-A

<400> 9

gtgtcagcca tactgtcccc attt 24

Claims

1.一种抗菌核病基因GmGST1，其特征在于，所述GmGST1的cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.扩增权利要求1所述的抗菌核病基因GmGST1的引物，其特征在于，引物序列如SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示。

3.含有权利要求1所述的抗菌核病基因GmGST1的重组载体。

4.含有权利要求1所述的抗菌核病基因GmGST1的重组菌。

5.一种抗菌核病的转基因植株的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(1)构建过表达权利要求1所述的GmGST1基因的重组载体；

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的重组载体构建所用的中间载体为pCambia3301。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述的农杆菌为农杆菌EHA105。

8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述植物为大豆。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述大豆，品种为合丰25或MapleArrow。

10.权利要求1所述的抗菌核病基因GmGST1在抗菌核病作物育种中的应用。