CN111254148B

CN111254148B - 一种抗大豆花叶病毒基因GmST1、GmST1转基因大豆的培育方法与应用

Info

Publication number: CN111254148B
Application number: CN201811457732.8A
Authority: CN
Inventors: 韩英鹏; 井妍; 赵雪; 滕卫丽; 李文滨
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2038-11-30
Also published as: CN111254148A

Abstract

一种抗大豆花叶病毒基因GmST1、GmST1转基因大豆的培育方法与应用，属于大豆遗传育种技术领域。针对传统方法培育抗病品种存在的多倍体化，转化率低的问题，本发明提供了一种抗大豆花叶病毒转基因大豆的培育方法，包括如下步骤：将所述的抗大豆花叶病毒基因GmST1(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)构建到植物表达载体上，得到大豆GmST1基因重组载体；将上述重组载体导入农杆菌中，然后侵染大豆，培养后经鉴定获得转基因阳性植株。本发明可用于抗花叶病毒作物育种工作中。

Description

一种抗大豆花叶病毒基因GmST1、GmST1转基因大豆的培育方法与应用

技术领域

本发明属于大豆遗传育种技术领域，具体涉及一种抗大豆花叶病毒基因GmST1、GmST1转基因大豆的培育方法与应用。

背景技术

大豆(Glycine max)是我国乃至世界上重要的粮食、经济作物。大豆花叶病毒病由大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus，SMV)引起，是影响大豆产量和品质最严重的病毒性病害之一。在我国东北大豆主产区，N1和N3毒株为优势株系，其导致的大豆植株非正常生长可造成大豆大面积减产25％-60％,严重时甚至绝产。由于传统育种方法的局限性，因此利用分子手段筛选及鉴定有效的抗病基因，对抗病品种的选育便显得尤为重要，这为选育抗病品种提高了效率和准确性，加快了选育抗病品种的进程。由于大豆基因组庞大且大豆存在的多倍体化现象及低转化率等问题，迄今为止报道的具有功能明确的抗SMV基因相对较少。

发明内容

针对传统方法培育抗病品种存在的多倍体化，转化率低的问题，本发明提供了一种抗大豆花叶病毒基因GmST1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供了上述包含抗大豆花叶病毒基因GmST1的重组载体、重组菌或转基因植株。

本发明提供了一种抗大豆花叶病毒转基因大豆的培育方法，包括如下步骤：

1)将所述的抗大豆花叶病毒基因GmST1构建到植物表达载体上，得到大豆GmST1基因重组载体；

2)将上述重组载体转化大豆，培养后经鉴定获得转基因阳性植株。

进一步地限定，步骤1)所述GmST1基因通过PCR扩增获得，所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；扩增所用的DNA为大豆抗病品种的cDNA，所述抗病品种为东农93-046、铁豆52或铁豆54。

进一步地限定，步骤1)所述植物表达载体为pCAMBIA3301。

进一步地限定，步骤2)所述重组载体通过农杆菌介导法转入大豆，所述农杆菌为农杆菌EHA105；所述大豆的品种为东农50、垦农30、Peking、绥农10、绥农14、东农594、红丰11或L-28。

进一步地限定，步骤2)所述鉴定包括检测转基因植株是否同时转入目的基因GmST1与筛选标记基因、检测目的基因表达量以及转基因植株后代抗病表型鉴定。

更进一步地限定，所述检测筛选标记基因转入所用引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示；所述检测目的基因GmST1转入所用引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:7所示。

更进一步地限定，所述目的基因表达量的检测采用qRT-PCR方法，其中检测GmST1基因表达量所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；用于对照的基因为病毒外壳蛋白基因，检测病毒外壳蛋白基因表达量所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。

本发明所述的培育方法获得的转基因大豆可用于抗花叶病毒作物育种中。

有益效果

GmST1是本发明新发现的具有抗大豆花叶病毒病作用的基因，由转基因后代与野生型表型鉴定对比可看出，该基因对N1病毒株系有较好的抗性作用。本发明为实现抗SMV-N1株系转基因育种提供了理论依据与实践价值。

附图说明

图1GmST1基因PCR扩增结果，其中M为DL2000，1为GmST1基因PCR产物。

图2GmST1重组质粒的双酶切鉴定，其中M为DL2000，1为GmST1重组质粒经BglII和BstEII双酶切结果。

图3T2代转GmST1基因大豆植株接种SMV N1后叶片的变化。第一排两个叶片为未进行病毒接种的对照组(东农50)，第二排为过表达GmST1基因的转基因大豆T2代植株的叶片。

图4T2代转GmST1基因大豆植株的qRT-PCR检测，a为GmST1基因qRT-PCR检测结果，其中ck为东农50，1-9：转基因阳性植株；10-16：非转基因植株；b为SMV CP基因的qRT-PCR检测结果，其中ck为东农50，1-9：转基因植株；10-16：非转基因植株；纵坐标均为基因相对表达量(其中非转基因植株是指T2代未获得稳定遗传的植株)。

图5GmST1编码的蛋白产物的二级结构。

图6不同大豆基因型GmST1基因的SNP。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或可通过商业化试剂盒进行提取，下述实施例中所用的药品试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

所述DNA提取：SDS小量法提DNA

(1)取1片大豆三出叶片于1.5ml离心管中，加入液氮，充分研磨；

(2)向离心管中加入400μL EB，80μLSDS(质量分数10％)，上下颠倒充分混匀，65℃水浴30min，期间每10min颠倒一次；

(3)水浴后，加入100μL KAc(5M/L)，上下颠倒数次，冰浴30min；

(4)冰浴后，加入600μL或等体积氯仿异戊醇(24：1)，涡旋20s，充分混匀；

(5)4℃，12000rpm离心10分钟；

(6)取上清液于新的1.5ml离心管内，加入等体积氯仿异戊醇(24：1)，充分混匀；

(7)4℃，12000rpm离心10分钟；

(8)取上清液约400μL于新的1.5ml离心管内，加入等体积冷异丙醇，充分混匀，置于-20℃保存30min；

(9)4℃，12000rpm离心10分钟；

(10)弃上清液，加入1ml 70％乙醇溶液，4℃ 12000rpm离心2min；

(11)弃上清液，加入1ml 70％乙醇溶液，吹打、清洗2次，吸干乙醇。冷风吹干2h以上；

(12)加入50μLddH₂O室温下溶解2h，再加2μLRNA酶，并于37℃恒温处理1h；

(13)DNA于4℃短期保存，-20℃长期保存。

RNA提取：Trizol法提取植物总RNA

(1)向装有叶片的1.5ml的离心管中加入少许液氮，快速、充分研磨至粉末状；

(2)向管中加入1ml Trizol提取液，涡旋30s，震荡混匀，室温静止5min；

(3)向管中加入200μL氯仿，用力震荡，涡旋30s，充分转化，室温静止5min；

(4)4℃，12000rpm离心15min；

(5)吸取上清于新的1.5离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静止10min；

(6)4℃，12000rpm离心10min；

(7)弃上清，加1ml75％无水乙醇溶液，清洗沉淀；

(8)4℃，12000rpm离心5min；

(9)弃上清，等待充分干燥，加入20-30μL DEPC水溶解RNA；

(10)取3μL进行2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，剩余RNA于-80℃保存。

所用的LB培养基的配制方法为：配制每升培养基,在950ml去离子水中加入:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌21min。

所述YEP培养基配方为：配制每升培养基,在950ml去离子水中加入:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，摇动容器直至溶质溶解。用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌21min。

其他培养基配方为：

(1)GM萌发培养基：B5盐3.21g/L+蔗糖20g/L+琼脂粉7g/L，pH＝5.8，灭菌后，加1ml6-BA(1mg/mL)

(2)SCCM共培养培养基：B5盐0.321g/L+Mes 3.9g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉5g/L，pH＝5.4，灭菌后加入250μL/L As+25μL/L GA₃(0.01mg/mL)+1.67ml 6-BA(1mg/mL)以及过滤灭菌的1.0g/L L-Cys+0.248g/L Na₂S₂O₃+0.143g/L DTT。

LCCM不加琼脂粉、L-Cys、Na₂S₂O₃及DTT。

(3)SIM-恢复培养基：B5盐3.21g/L+Mes 0.59g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L，pH＝5.6，灭菌后，加1.67ml 6-BA(1mg/mL)和2mL头孢(250mg/mL)。

(4)SIM+筛选培养基：B5盐3.21g/L+Mes 0.59g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L，pH＝5.6，灭菌后，加1.67ml 6-BA(1mg/mL)+2ml头孢(250mg/mL)+1ml PPT(5mg/mL)。

(5)SEM伸长培养基：Ms 4.43g/L+Mes 0.59g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L，灭菌后，加入1ml ZR(1mg/mL)+100μL IAA(1mg/mL)+1ml Asp(50mg/mL)+0.5mlGA3(1mg/mL)+1ml头孢(250mg/mL)。

(6)RM生根培养基：B5盐1.605g/L+Mes 0.59g/L+蔗糖20g/L+琼脂粉7g/L，pH＝5.6，灭菌后加入1ml IBA(1mg/1mL)。

名词缩写：

ZR：玉米素；DTT：二硫苏糖醇；Str：链霉素；Kan卡那霉素；Rif：利福平；PPT：草铵膦。

所述培养基中添加的抗生素含量均为终浓度。

此外，大豆花叶病毒N1株系(简称SMV-N1株系)：公众可以从东北农业大学获得；该株系记载在：滕卫丽.大豆抗花叶病遗传,细胞超微结构分析及基因定位.博士学位论文.东北农业大学.2006.感病叶片的表型为：叶脉间失绿，系统花叶。大豆品种东农93-046(抗病品种)，东农50(感病品种)：公众可以从东北农业大学获得；上述品种记载在：滕卫丽.大豆抗花叶病遗传,细胞超微结构分析及基因定位.博士学位论文.东北农业大学.2006。

其他大豆品种，包括：铁豆52、铁豆54、垦农30、Peking、绥农10、绥农14、东农594、红丰11及L-28：其中，铁豆52、铁豆54记载在：铁豆系列大豆新品种_傅连舜。垦农30记载在：高蛋白大豆新品种垦农30特征特性及高产栽培技术_阚洪亮。Peking记载在：不同抗性大豆品种对大豆孢囊线虫发育的影响_王会艳。绥农10记载在：优良大豆种质绥农10号的利用及效果分析_付春旭。绥农14记载在：大豆品种绥农14号快速推广的原因分析_王贵江。东农594记载在：多环境_多遗传背景下不同发育时期大豆籽粒重的QTL分析_韩英鹏。红丰11记载在：大豆新品种_红丰11号_勇建康。L-28记载在：Zhao X,Han Y,Li Y,et al.Loci andcandidate gene identification for resistance to Sclerotinia sclerotiorum insoybean(Glycine max L.Merr.)via association and linkage maps[J].Plant Journalfor Cell&Molecular Biology,2015,82(2):245-255.

上述品种公众均可以从东北农业大学获得。pCAMBIA3301表达载体：公众可以从东北农业大学获得。农杆菌菌株EHA105：公众可以从东北农业大学获得，也可通过商业化途径购买获得。

实施例1.抗大豆花叶病毒基因GmST1的获得。

本发明所述的抗大豆花叶病毒基因GmST1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因可通过如下方法获得：

1)以大豆品种东农93-046为材料，待长出第一组三出复叶时，取材，提取总RNA并反转录合成cDNA第一链。

2)根据Phytozome上GmST1(Glyma.13G191400)基因序列，利用Primer 5软件设计基因克隆引物(引物1)，其核苷酸序列如下:

引物1-S:5’-GAAGATCTATGGCTCCAACAAATGTCAC-3’(SEQ ID NO：2)；

引物1-A:5’-CTTGGTTACCTTAAAATGACAAGCCTGAC-3’(SEQ ID NO：3)。

以cDNA为模板进行RT-PCR反应，反应体系如下，反应程序：94℃ 5min；38个循环：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min；72℃ 7min，4℃保存。反应后取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收纯化目的片段。RT-PCR反应体系如下：

3)按照TIANGEN公司的PGM-T克隆试剂盒的步骤，将上述得到的胶回收产物与克隆载体进行连接，获得带有目的基因的克隆质粒pGM-T-GmST1，转化Top10大肠感受态细胞，挑取单克隆并进行PCR及测序验证。最终得到目的片段大小为1035bp的GmST1基因，如图1所示。

实施例2.抗大豆花叶病毒转基因大豆的培育方法。

1)将实施例1获得的抗大豆花叶病毒基因GmST1构建到植物表达载体上，得到大豆GmST1基因重组载体。

2)将上述重组载体导入农杆菌中，然后侵染大豆，培养后经鉴定获得转基因阳性植株。

具体方法如下：

1)大豆GmST1基因重组载体的构建：

将带有目的基因的pGM-T-GmST1克隆质粒和pCAMBIA3301载体质粒分别用BglII和BstEII进行双酶切，所述酶切体系及方法参照限制酶切酶产品说明书进行，将酶切后的基因目的片段和pCAMBIA3301载体片段进行胶回收。用T₄连接酶连接两个胶回收产物，连接产物转化Top10感受态细胞，挑取单斑，进行菌液PCR鉴定。鉴定为阳性的菌株提质粒并进行双酶切，能够获得1035bp大小的目的片段以及载体片段，如图2所示，表明已成功构建pCAMBIA3301-GmST1重组载体。

2)采用根癌农杆菌介导法转化大豆子叶节，将pCAMBIA3301-GmST1成功转入农杆菌EHA105中，所述将pCAMBIA3301-GmST1转入EHA105的方法采用本实验保存的质粒，冻融法转化农杆菌的方法，该方法可参考：王涛.大豆miRNA172及靶基因参与开花诱导和逆境响应的功能分析.博士学位论文.东北农业大学.2016中所述农杆菌转化方法进行。并以感病大豆品种东农50为受体进行遗传转化，共转化得到完整的外植体400个，具体方法如下：

(1)菌液制备：取制备好的菌液在YEP固体平板(50mg/mL Str，50mg/mL Kan，25mg/mLRif)上划线28℃培养，挑取单菌落接种于YEP液体培养基(50mg/mL Str，50mg/mL Kan，25mg/mL Rif)中，28℃ 200rpm震荡培养1-2天，取1-2ml菌液接种于50ml新鲜的YEP液体培养基中震荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，将菌液放在4000rpm的离心机中离心10min，富集菌体后再用等量的液体CCM培养基重悬。

(2)种子灭菌：选取饱满、无菌斑的东农50种子于培养皿中，采用氯气灭菌法，将种子放入通风厨的干燥器内，在干燥器的三角瓶中倒入96ml次氯酸钠，再快速加入6ml浓盐酸后迅速盖紧封盖。灭菌16h后置于超净工作台内吹走残留的氯气，约30min左右，密封待用。

(3)种子萌发：将灭菌后的种子种脐向下种于萌发培养基中，每瓶种10粒，在23℃、16h光照/8h黑暗条件下萌发5-6天。

(4)子叶节的制备：选取无菌、萌发充分的植株，去掉种皮，于子叶下端5mm处将下胚轴切掉，沿下胚轴中线将两片子夜切开，去除真叶，得到子叶节外植体。用实验刀在子叶与胚轴交接处直径约3mm的范围内划3-5刀。

(5)侵染与共培养：将制备好的外植体放入侵染液中28℃ 120rpm恒温震荡培养30min，倒掉侵染液，用无菌纸将外植体表面的侵染液吸干，倒置平铺在共培养培养基上并进行3天暗培养。

(6)丛生芽的诱导及筛选：将暗培养后的子叶节外植体装入无菌的培养瓶中，用灭菌蒸馏水清洗3遍，用无菌纸将子叶节表面的液体吸干，以与培养基表面45度角斜插在恢复培养基中进行芽诱导。在诱导7-10天后，将丛生芽转移至含有5mg/L PPT的筛选培养基中，筛选7-10天。

(7)丛生芽的伸长与生根：取经筛选后的丛生芽，去掉大芽并用解剖刀刮掉丛生芽的黑头，再将其插入到伸长培养基中。待伸长20-30天左右，将长出2组三出叶的大豆苗从丛生芽处切下，转移至生根培养基中，待15天左右，将苗转移至土壤中。

将上述400个共转化外植体所伸长出的大豆苗移栽至土壤中，在其长到第5-6轮三出复叶时，选取一片三出叶，用毛刷进行PPT的涂抹，PPT浓度为125mg/L，4-7天内观察叶片是否变黄。将PPT涂抹后叶片未变黄的植株视为潜在阳性植株，共获得T0代ppt阳性植株96个。

目的基因GmST1与筛选标记基因检测：提取经转化GmST1基因的T1代大豆植株的DNA，用筛选标记基因Bar基因引物(引物2)和GmST1基因特异性引物(引物3)进行PCR鉴定，目的片段分别为433bp和534bp，将同时扩增出两种目的片段的植株鉴定为阳性，最终检测出16个为转GmST1基因大豆植株用于进一步筛选。

所述引物2核苷酸序列为：

Bar-433-S:5’-TGCACCATCGTCAACCACTACATC-3’(SEQ ID NO：4)；

Bar-433-A:5’-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3’(SEQ ID NO：5)。

所述引物3核苷酸序列为：

ST1-S:5’-AATGTTGGGTTATTGGAAGG-3’(SEQ ID NO：6)；

ST1-A:5’-ATGTATAATTGCGGGACTCTAA-3’(SEQ ID NO：7)。

转基因植株后代抗病表型鉴定：收取T1代中鉴定为转基因植株的大豆并播种，于T2代植株对生真叶完全展开时进行SMV N1病毒接种实验，具体方法为：配制0.01mol/L的磷酸氢二钠与磷酸二氢钠的磷酸缓冲液(pH＝7.0)(10mL/g病毒叶)，将其加入已放病毒叶和少量金刚砂的研钵内，研磨成匀浆状即可。将材料种在灭菌后的土壤里，待对生真叶充分展开后，用毛刷蘸取接种液并沿真叶叶脉摩擦接种，接种后立即用清水冲洗叶片表面致残渣去除。一周后进行第二次接种。最终结果发现：对照大豆(东农50)叶片叶脉明显褪绿，呈现典型的感病花叶症状，转GmST1基因的植株叶脉轻微褪绿，但无明显感病症状，二次加强接种后转GmST1基因的植株能恢复正常生长，产生新叶并且叶片较少出现花叶现象，而对照植株呈现系统花叶，说明转GmST1基因对感大豆花叶病毒病品种东农50产生了一定的抗病性，结果如图3所示。

目的基因表达量检测：根据GmST1基因以及病毒外壳蛋白基因的序列分别设计定量引物:(引物4-5)，检测GmST1基因表达量所用引物(引物4)的核苷酸序列为：

qGmST1-S:5'-TCCCCTTTCTCGGATTCATT-3'(SEQ ID NO:8)；

qGmST1-A:5'-TGCCAATCAGTACTAGAGATCG-3'(SEQ ID NO:9)。

检测病毒外壳蛋白基因SMV-CP(GenBank登录号:U25673.1)表达量所用引物(引物5)的核苷酸序列为：

SMV-CP-S:5'-AGGATCCAAAGAAGAGCACC-3'(SEQ ID NO:10)；

SMV-CP-A:5'-GCCTTTCAGTATTTTCGGAGT-3'(SEQ ID NO:11)。

利用qRT-PCR的方法对T2代植株进行检测，所述qRT-PCR方法参照王涛.大豆miRNA172及靶基因参与开花诱导和逆境响应的功能分析.博士学位论文.东北农业大学.2016中所述方法进行。

结果检测到转GmST1基因的大豆叶片中GmST1基因的相对表达量高于对照品种(东农50)，同时检测到了转GmST1基因的大豆叶片中存在的病毒外壳蛋白基因相对表达量低于对照品种，结果如图4所示。说明了转GmST1基因对感大豆花叶病毒病品种东农50产生了一定的抗病性。以超过对照2.5倍的相对表达量为基准，统计出转GmST1基因大豆植株为9株。

本发明对获得的GmST1进行了生物信息学分析：

1.基因结构分析

利用ProtParam软件预测GmST1亲水性/疏水性，结果显示总平均亲水性达0.015。通过在线软件TMHMM预测蛋白质的跨膜螺旋区并分析候选基因GmST1编码的蛋白的氨基酸理化性质，结果显示在其编码的蛋白质中，主要存在的4种结构分别为α螺旋结构(40.7％)、片层结构(13.08％)、β转角结构(6.69％)以及无规则卷曲结构(39.53％)。如图5所示。在Phytozome上选取候选基因GmST1上游2000bp作为启动子的分析区域，通过TSSP预测其转录起始位点，并利用TATA-box进一步地确定启动子的正确性，在PlantCARE分析软件上分析启动子的顺式作用元件。结果显示在GmST1基因启动子区域查找到多种功能不同的调控元件，这其中包括了逆境相关反应元件和病程相关反应元件等，为进一步验证GmST1基因参与大豆抗病反应提供了理论依据。

2.GmST1的单倍型分析：

选取不同抗、感大豆品种(东农93-046、铁豆52、铁豆54；恳农30、Peking、绥农10、绥农14、东农594、红丰11及L-28)进行基因组DNA提取，分别PCR扩增出GmST1基因目的条带(所用引物及程序参考实施例1所述)并进行胶回收纯化，并将纯化后产物送公司测序，将测序结果与参考基因组Williams 82的基因序列进行比对。测序结果显示，在基因功能域中找到了5个SNP位点，其中，有一个碱基的突变与抗感性明显相关，即在感病品种绥农10、绥农14、Peking、恳农30、东农594、L-28以及红丰11的对应碱基均为与Williams 82一致的碱基C，而在抗病品种东农93-046、铁豆52以及铁豆54中该位置碱基变化为T，结果如图6所示。

本发明通过生物信息学以及转基因后代表型鉴定，确定了大豆GmST1基因对对N1病毒株系有较好的抗性作用，为实现抗SMV-N1株系转基因育种提供了理论依据与实践价值，所获得的转GmST1基因的大豆可用于抗花叶病毒作物育种中。

核苷酸序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种抗大豆花叶病毒基因GmST1、GmST1转基因大豆的培育方法与应用

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1035

<212> DNA

<213> 抗大豆花叶病毒基因GmST1

<400> 1

atggctccaa caaatgtcac atgcttcaga gaagaaaatg aatccgagaa aggggaggaa 60

ataacaatag aagaagacaa gctaagtcaa gaatgtaagg agttgatact ctctcttcct 120

agggagagag gttggagaac acgttatata tatctatttc aaggattttg gtgccagcca 180

ttggaaatcc aagcaataat cacttttcag aagcacttcc aagctaaaga cagtgatgtt 240

attgtggcca caattccaaa atcaggtacc acttggctga aagctctcac ctttgccatt 300

gtcaatcgcc atactcatag tatcactaca tcaatgtcat cacatccttt gcttacttct 360

aatcctcatg aacttgtgcc tttcatagaa tacaccgttt atggtaatgc ccctagccat 420

gttccaaacc tatccaacat gactgagcca agactttttg gtacacatat tccattccat 480

gcattggcca agtcaatcaa ggagttcaat agtagaataa tttatatatg taggaaccca 540

cttgacactt ttgtgtctac ttggattttc ctcaacaaaa ttaagccaga acatttacct 600

gaatttgaac taggggaagc ttttgaaaag tattgcaaag gaataatagg gtttggtcca 660

acttgggacc aaatgttggg ttattggaag gagagtatag ctaggcctag taaggttttg 720

ttcttgaagt acgaggatct taaaaaagat gtcaattttc atgtgaaaag aatagcggag 780

ttcttaggat ggcctttcac ttcggaggaa gaaggtgatg ggactattga gagcataatc 840

aagctatgca gcttcgagaa gatgaaggaa ttggaggcaa ataaatctgg aacatttgct 900

aggaactttg agagaaagta cttgttccga aaggctgaaa tgggagattg ggtgaactac 960

ctttcccctg aaatgggtga aaagttatcg caaattatgg aagaaaagtt aagtgggtca 1020

ggcttgtcat tttaa 1035

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物1-S

<400> 2

gaagatctat ggctccaaca aatgtcac 28

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物1-A

<400> 3

cttggttacc ttaaaatgac aagcctgac 29

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Bar-433-S

<400> 4

tgcaccatcg tcaaccacta catc 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Bar-433-A

<400> 5

gctgccagaa acccacgtca t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> ST1-S

<400> 6

aatgttgggt tattggaagg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> ST1- A

<400> 7

atgtataatt gcgggactct aa 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> qGmST1-S

<400> 8

tcccctttct cggattcatt 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> qGmST1-A

<400> 9

tgccaatcag tactagagat cg 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> SMV-CP-S

<400> 10

aggatccaaa gaagagcacc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> SMV-CP-A

<400> 11

gcctttcagt attttcggag t 21

Claims

1.一种抗大豆花叶病毒基因GmST1在提高大豆抗大豆花叶病毒能力中的应用，其特征在于，所述抗大豆花叶病毒基因GmST1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.包含权利要求1中所述的抗大豆花叶病毒基因GmST1的重组载体、重组菌或转基因植株在提高大豆抗大豆花叶病毒能力中的应用。

3.一种抗大豆花叶病毒转基因大豆的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将权利要求1中所述的抗大豆花叶病毒基因GmST1构建到植物表达载体上，得到大豆GmST1基因重组载体；所述植物表达载体为pCAMBIA3301；

2)将上述重组载体转化大豆，培养后经鉴定获得转基因阳性植株；所述大豆的品种为东农50、垦农30、Peking、绥农10、绥农14、东农594、红丰11或L-28。

4.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，步骤1)所述GmST1基因通过PCR扩增获得，所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；扩增所用的DNA为大豆抗病品种的cDNA，所述抗病品种为东农93-046、铁豆52或铁豆54。

5.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，步骤2)所述重组载体通过农杆菌介导法转入大豆，所述农杆菌为农杆菌EHA105。

6.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，步骤2)所述鉴定包括检测转基因植株是否同时转入目的基因GmST1与筛选标记基因、检测目的基因表达量以及转基因植株后代抗病表型鉴定。

7.根据权利要求6所述的培育方法，其特征在于，所述检测筛选标记基因转入所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；所述检测目的基因GmST1转入所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。

8.根据权利要求6所述的培育方法，其特征在于，所述目的基因表达量的检测采用qRT-PCR方法，其中检测GmST1基因表达量所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；用于对照的基因为病毒外壳蛋白基因，检测病毒外壳蛋白基因表达量所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。

9.权利要求3-8任意一项所述的培育方法获得的转基因大豆在抗花叶病毒作物育种中的应用。