CN103114078A - 一种植物抗病毒相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了一种植物抗病毒相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将SEQ ID NO.的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄抗病相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。本发明的植物抗病相关蛋白影响植物的抗病性。提高该蛋白编码基因的表达可导致感病植物抗病，从而可以培育植物抗病转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种植物抗病毒相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物抗病毒相关蛋白及其编码基因与应用。 

背景技术

寄主对病毒的抗性反应，可以影响病毒的侵染和在寄主体内的复制和移动。其中抗病毒蛋白在应对病毒的抗性反应中起到至关重要的作用，其可以在病毒进入寄主体内的不同阶段（侵染、复制和移动）激活寄主的抗性反应，最终诱导寄主产生系统抗性。同时，植物抗病毒蛋白具有重要的生产利用价值。 

磺基转移酶（sulfotransferase，SOTs）蛋白,通过催化反应将3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate）上的硫酸根转移到底物的羟基上，催化底物主要包括一些激素和多肽类物质。研究发现该酶催化的反应产物参与了植物对病原菌的抗性反应，其在植物对病原菌的侵害中发挥了重要的防御作用(Baek D,Pathange P,Chung JS,Jiang JF,Gao LQ,Oikawa A,Hirai MY,Saito K,Pare P,Shi H.2010,A stress-inducible sulphotransferase sulphonates salicylic acid and confers pathogen resistance in Arabidopsis.Plant,Cell and Enviro33:1383–1392；Lacomme C,Roby D.1996,Molecular cloning of a sulfotransferase in Arabidopsis thaliana and regulation during development and in response to infection with pathogenic bacteria.Plant Mol Biol30:995–1008)。但是，目前为止只有极个别的磺基转移酶基因得到分离并对其生物学功能进行了研究。 

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗病毒相关蛋白及其编码基因与应用。 

本发明提供的植物抗病毒相关蛋白（OsSOT1），来源于Kasalath水稻(Oryza sativa L.indica.cv），是如下（a）或（b）的蛋白质： 

（a）SEQ ID NO.1所示的蛋白质； 

（b）将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病毒相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。 

（c）SEQ ID NO.1中自氨基末端第63至363位为磺基转移酶的磺基转移功能结构域，将SEQ ID NO.1中具有磺基转移酶的磺基转移功能结构域的氨基酸序列经过几个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磺基转移酶活性的，且与植物抗病毒相关的，由SEQ IDNO.1中具有磺基转移酶的磺基转移功能结构域的氨基酸序列衍生的蛋白质。 

为了使（a）中的OsSOT1便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。 

表1标签的序列 

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的OsSOT1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的OsSOT11的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。 

编码上述植物抗病毒相关蛋白的基因（OsSOT1）也属于本发明的保护范围。 

所述基因可为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子： 

1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子； 

2）SEQ ID NO.3所示的DNA分子； 

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码植物抗病毒相关蛋白的DNA分子； 

4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物抗病毒相关蛋白的DNA分子。 

序列表中的序列2由1125个核苷酸组成。SEQ ID NO.3由3857个核苷酸组成。 

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下杂交并洗膜。 

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。 

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。 

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。 

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。 

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。 

扩增所述基因（OsSOT1）全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。 

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。 

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。 

有益效果： 

本发明的植物抗病毒相关蛋白影响植物抗病反应。将所述蛋白的编码基因导入植物中，可 以获得抗病性提高的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。 

附图说明

图1为感病品种越光和抗性品种Kasalath接种病毒前后的表型比较。 

图2为水稻条纹叶枯病病接种后，感病品种越光和抗性品种Kasalath体内病毒的检测。 

图3为基因在第11染色体上的精细定位。 

图4为转基因植株进行PCR分子检测结果。 

图5为转OsSOT1的植株和对照植株接种条纹叶枯病病毒后的发病情况照片。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 

实施例1、植物抗病毒相关蛋白及其编码基因的发现 

一、水稻品种Kasalath的抗病毒病分析 

水稻品种Kasalath高抗条纹叶枯病病毒。接种条纹叶枯病病毒后，Kasalath的表现为植株生长正常，无明显不良症状表现。而感病对照越光，表现为心叶褪绿卷曲，植株萎蔫直至枯死（见图1）。 

通过对水稻条纹叶枯病病毒接种后，感病对照越光和抗性品种Kasalath体内的病毒进行PCR检测发现，感病对照中有大量的病毒存在，而抗性品种Kasalath体内没有检测到病毒的存在，说明抗性品种Kasalath可以抑制病毒在其体内复制，从而达到抗病的结果。（见图2） 

二、抗病毒基因定位 

1、抗病毒基因初步定位 

利用Nipponbare/Kasalath//Nipponbare的回交重组自交系（BIL）群体（这套群体及其分子数据也均由日本农业生物资源研究所Yano博士提供）检测RSV抗性QTL。在第11染色体的中G257-S2260区间内检测到一个QTL，这一主效的QTL被命名为qSTV11_BIL。为了验证该QTL，利用39个片段置换系（高抗品种Kasalath为供体亲本，高感品种Koshihikari为遗传背景的CSSL群体，这套群体及其分子数据也均由日本农业生物资源研究所Yano博士提供）评估RSV抗性。结果其中的一个置换系（SL-234）表现为稳定的RSV抗性，同时将一个QTL（qSTV11_CSSL）定为于G320-C1172区间内。基于整合的连锁图谱，qSTV11_BIL和qSTV11_CSSL被定位于相同的区域内，这 说明它们拥有来源于Kasalath的相同的抗性等位基因（被命名为qSTV11^KAS）。总之，qSTV11^KAS等位基因解释了最大的表型变异，不依赖遗传背景和接种方法，因此也被认为是一个稳定的主效抗性QTL。 

2、抗病毒基因的精细定位 

根据初步定位的结果，利用286个BC₃F_2:3群体（SL-234和Koshihikari的次级群体）来验证高级作图群体中qSTV11^KAS遗传效应。在qSTV11的G320-C1172区间内，再利用复合区间作图将qSTV11^KAS定位于标记L104-R48的3.4cM区间内。这些结果显示一个主效QTL连锁于第11染色体L104。进一步精细定位该QTL，利用L104和R48两个标记对一个由5518个植株组成的BC₃F₂群体进行基因型筛选交换单株并结合表型鉴定。同时利用公共图谱上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的SSR、dCAPS分子标记对qSTV11^KAS进行了精细定位，并根据定位结果初步确定突变基因，具体方法如下： 

（1）SSR标记开发 

将公共图谱的InDel标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter（李强等，遗传，2005，27(5):808-810）或SSRIT软件搜索克隆中潜在的SSR序列（重复次数≥6）；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier5.0软件设计SSR引物,并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在越光和Kasalath之间的多态性，表现多态者用作精细定位qSTV11^KAS基因的分子标记。用于精细定位的分子标记见表2。 

表2用于精细定位的分子标记 

（2）dCAPS标记开发 

dCAPS引物设计：对Kasalath在qSTV11^KAS基因所在位置附近的部分区段进行测序，并与日本晴相对应的序列进行比对，发现两者之间存在的SNPs，通过“dCAPS Finder2.0”软件设计错配的PCR引物创造酶切位点，同时运用Primer Premier5.0软件设计对应的另一条引物。 

dCAPS标记分析的PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，C1(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O10ul，总体积20ul。 

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃（引物不同，有所调整）45sec，72℃2.5min，35个循环；72℃5min。 

PCR产物纯化回收，按试剂盒（北京Tiangen公司）步骤进行。PCR产物酶切反应过夜后，用1-4%的琼脂糖凝胶中电泳分离，经EB染色后于紫外灯下观察拍照。dCAPS用8%的非变性PAGE胶分离，银染。 

根据BC₃F₂群体中单株的分子数据和表型数据，最终把qSTV11^KAS基因精细定位在标记C1和R53之间，这两个标记位于同一PAC克隆OSJNBa0025K21上，物理距离约为39.2kb（图3）。 

(3）目的基因的获得 

根据定位的位点设计引物，序列如下所述： 

primer1(下划线所示的序列为attB1重组位点)： 

5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCATCACACAAAGAAGAGAC-3'（SEQ ID NO.4）； 

primer2(下划线所示的序列为attB2重组位点)： 

5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTAGATACTAGCTTGACACA-3'（SEQ ID NO.5）。 

以primer1和primer2为引物，以Kasalath的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因。该对引物位于序列2上游2.7kb和下游26bp，扩增产物包含了该基因的启动子部分。 

扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃10min，35个循环；72℃5min。将PCR产物回收纯化后经过一次BP重组克隆到载体pDONR-207(购自美国Invitrogen公司)中构建成一个Gateway^TM入门载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京Tiangen公司CB101），挑选阳性克隆后，进行测序。 

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，编码374个氨基酸残基组成的蛋白质（见SEQ ID NO.1）。将序列1所示的蛋白命名为OsSOT1（即为基因定位中所述的pss1基因），将序列1所示的蛋白的编码基因命名OsSOT1。OsSOT1的编码序列如SEQ ID NO.2所示。 

实施例2、转基因植物的获得和鉴定 

一、含有OsSOT1编码区cDNA表达载体构建 

用KpnⅠ和BamHⅠ双酶切潮霉素抗性表达载体pCUbi1390(中国农科院生物所路铁钢研究员提供；中国农科院博士论文，彭昊，2005)，回收载体片段，备用；以PCR介导，以Kasalath（购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库；购买途径获得，原始来源不清）的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得OsSOT1基因。同时将OsSOT1基因cDNA序列两端分别加入重组接头重组接入pCUbi1390载体，测序确认。 

PCR引物序列如下： 

primer3(下划线所示的序列为KpnⅠ重组位点)： 

5'-TTACTTCTGCACTAGGTACCAGCTTGACACATGCGATC-3'（SEQ ID NO.6）； 

primer4(下划线所示的序列为BamHⅠ重组位点)： 

5'-GAATTCCCGGGGATCCAGCTTGACACATGCGATC-3'（SEQ ID NO.7）。 

二、农杆菌介导转化 

以农杆菌菌株EHA105（购自美国英俊公司）为介导，将上述构建的OsSOT1基因重组载体导入感病品种日本晴。 

（1）28℃培养含重组OsSOT1的农杆菌16hr，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L的N6液体培养基中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液； 

（2）将培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与上述菌液混合侵染30min，滤纸吸干 菌液后转入共培养培养基（N6固体共培养培养基，Sigma公司购买）中，24℃共培养3天； 

（3）将上述愈伤接种在含有150mg/L潮霉素B（Sigma公司购买）的N6固体筛选培养基上第一次筛选16天； 

（4）挑取健康愈伤转入200mg/L潮霉素B的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次； 

（5）挑取抗性愈伤转入含有150mg/L潮霉素B的分化培养基上分化； 

（6）分化成苗的再生水稻植株即为所获得的OsSOT1基因的转基因植株。 

三、转基因植株的鉴定 

分别将T₀代转OsSOT1植株和日本晴种植在南京农业大学转基因作物试验网室内。 

水稻植株即将开花时，取叶片，提取基因组DNA,以基因组DNA为模板，利用Primer5和Primer6为引物对进行扩增（Primer5：GTTTGTCGGGTCATCTTTTCA（SEQ ID NO.8）和Primer6：GCTCAGTCTCAACGCCATAAT（SEQ ID NO.9））。PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，Primer5(10pmol/ul)2ul，Primer6(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O10ul，总体积20ul。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。 

用试剂盒（北京Tiangen公司）纯化回收PCR产物。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测。结果表明获得11株PCR检测阳性的植株。 

将待鉴定转OsSOT1家系及感病受体品种日本晴分别浸种催芽，播种于直径5.8cm、高6.0cm,盛满营养土的圆形塑料钵中(钵底有一小孔,便于渗透吸水)。置于65cm×44cm×14cm的塑料周转箱内(保持水层约2cm)。每钵播种30粒已露白的萌动种子,接虫前4d间苗,淘汰病、弱苗,每钵保留20棵整齐一致的健苗用于接种条纹叶枯病毒。2次重复。当秧苗长至1.5叶时,进行接种鉴定。每钵罩以透明罩，顶端纱布封口，按每苗5头1～2龄携带条纹叶枯病病毒灰飞虱接种。每天驱虫2次,使被测稻苗均匀受毒。48h后，移走全部灰飞虱，令接种后的苗置于温室周转箱内或移栽到大田内生长发病。注意水肥管理。3～4周后，待病情发展稳定进行调查。 

感病受体品种日本晴的发病率为98%，转OsSOT1家系的发病率为15%。验证了转基因前的抗病毒病性状是由OsSOT1基因控制的，即该OsSOT1基因为抗病毒相关基因。 

Claims (10)

1.一种蛋白质，其特征在于是如下（a）、（b）或（c）所述的蛋白质：

（a）SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

（b）将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病毒相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

（c）SEQ ID NO.1中自氨基末端第63至363位为磺基转移酶的磺基转移功能结构域，将SEQ ID NO.1中具有磺基转移酶的磺基转移功能结构域的氨基酸序列经过几个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有磺基转移酶活性的，且与植物抗病毒相关的，由SEQ IDNO.1中具有磺基转移酶的磺基转移功能结构域的氨基酸序列衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因具有如下1）或2）或3）或4）所述的DNA分子：

1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2）SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码植物抗病毒相关蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有80%以上同源性且编码植物抗病毒相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCUbi1390载体的重组位点KpnⅠ和BamHⅠ之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。

7.如去啊你俩要求6所述的引物对，其特征在于选自以下任意一组引物对：SEQ ID NO.4所示的primer1/SEQ ID NO.5所示的primer2，SEQ ID NO.6所示的primer3/SEQ ID NO.7所示的primer4，SEQ ID NO.8所示的primer5/SEQ ID NO.9所示的primer6。

8.权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4或5所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用，优选在培育抗病毒水稻品种中的应用；特别优选在培育抗条纹叶枯病毒水稻品种中的应用。

9.一种培育抗病毒转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入感病毒病植物中，得到抗病毒的转基因植物；所述感病毒植物为发病率高于50%的植物；所述抗病毒病的转基因植物为发病率低于30%的转基因植物。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述感病毒病植物中。

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