KR20230014169A - 시료 전처리 카트리지 장치 및 이를 이용한 시료 전처리 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시료 전처리 카트리지 장치 및 방법에 관한 것으로서, 시료 용액이 투입되는 시료 챔버와, 상기 시료 챔버 일측에 형성되며, 상기 시료 용액에 포함된 세포는 거르고 용액은 통과하는 멤브레인 필터가 포함된 필터공간부와, 상기 필터공간부 일측에 형성되며, 상기 멤브레인 필터에 의해 걸려진 세포를 분해(lysis)시켜 핵산을 용출시키는 세포분해수단과, 상기 필터공간부와 연결되며, 상기 용출된 핵산이 이동되는 마이크로유체 채널과, 상기 시료 챔버와 마이크로유체 채널 사이에 인가된 전압에 의해 상기 핵산을 포집시키는 전기영동수단과, 상기 마이크로유체 채널 일측에 형성되며 상기 전기영동수단에 의해 포집된 핵산을 수집하는 수집 챔버와, 상기 필터공간부로부터 흘려보내진 용액을 저장하는 폐액 챔버 및 상기 마이크로유체 채널 또는 상기 폐액 챔버를 상기 필터공간부로부터 개폐시키는 밸브수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치를 기술적 요지로 한다. 이에 의해 본 발명은 시료 용액의 주입과 세척액의 주입 그리고 세포의 분해 및 핵산의 농축 과정이 카트리지 형태로 패키징되어 제공된 카트리지 장치 내에서 실현되어, 장소나 시간에 구애받지 않고, 편리하면서도 신속하게 시료의 전처리를 수행할 수 있게 된다.
Description
본 발명은 시료 전처리 카트리지 장치 및 방법에 관한 것으로서, 시료 용액의 주입과 세척액의 주입 그리고 세포의 분해 및 핵산의 농축 과정이 카트리지 장치 내에서 신속하게 수행되는 시료 전처리 카트리지 장치 및 이를 이용한 시료 전처리 방법에 관한 것이다.
COVID19와 같은 바이러스의 전염과 전파를 막기 위해서는 감염성 질환을 현장에서 신속하게 진단하고 감염자를 격리하는 것이 필요하다.
일반적으로 분자진단 기술은 면역진단에 비해 감염원을 정확하게 진단할 수 있지만 채취한 검체로부터 핵산 추출, 증폭, 결과 분석까지 30분 ~ 2시간 정도의 시간이 소요되는 단점이 있다.
따라서, 분자 진단 방법의 검사 시간을 단축하고 현장검사에 적용하기 위하여 시료에 대한 전처리를 신속하게 수행하고자 하는 연구가 진행되고 있다.
시료전처리는 세포 내에 있는 핵산(DNA, RNA 등)이 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통해 증폭되도록 추출하는 것으로, 증폭반응을 방해하거나 억제하는 성분은 제거하고 타겟 핵산만을 순도 높게 정제하는 것이다.
전통적인 시료전처리 방법은 유리섬유필터 또는 자성입자의 표면에 핵산을 흡착시킨 후 에탄올 용액으로 세척하고, 원심분리를 이용하여 세척액을 제거하고 용출 완충액(Elution buffer)을 넣으면 유리섬유필터 또는 자성입자 표면에 흡착되었던 핵산 분자가 용출되어 정제된 핵산을 추출한다.
이와 같은 전통적인 시료전처리 방법은 순도가 매우 높은 핵산 시료를 얻을 수 있지만 유리섬유필터 또는 자성입자와 원심분리기를 사용해야 하며, 추출 정제의 과정이 복잡하고 많은 시간이 소요된다.
최근에는 카트리지 형태로 소형화된 시료전처리 기기들이 소개되고 있다. 원심분리기를 사용하지 않고, 시료전처리 과정을 자동화하는 장치가 많이 제품화되고 있다.
먼저, 자성입자와 자석봉을 이용한 핵산시료 정제 및 농축 장치로, 자석봉 표면에 자성입자를 포획할 수 있으며, 용액 내 불순물과 함께 존재하는 핵산은 용액에 분산되어 있는 자성입자 표면에 흡착된다. 자성입자를 자력으로 제어하여 불순물을 제거하는 원리이며, 불순물 세척 후 용출 용액에 넣어 자성입자 표면으로부터 핵산을 떼어 내어 회수하면 정제된 핵산 시료를 얻을 수 있다. 분리 정제 후에는 자성입자와 자석봉의 외피는 폐기된다.
최근에는 세포막 또는 거대 단백질 분자와 같은 불순물은 물리적으로 통과할 수 없는 기공을 갖는 멤브레인 필터를 이용하여 검사 시료 내 세포들을 필터 표면에 위치시킨 후 초음파 에너지로 세포막을 파괴하고 핵산만 필터를 통과시켜 PCR 반응시료와 혼합하여 분자진단하는 카트리지 일체형 분자 진단 기기가 활용되고 있다.
이러한 카트리지 일체형 분자 진단 기기는 일반적으로 시료 전처리 과정을 멤브레인과 초음파 분해(lysis), 시린지(syringe) 동작을 이용하여 시료 전처리를 자동화하여 수행하는 것이다. 이는 PCR 믹스쳐(mixture)와 추출된 핵산 시료를 미리 혼합 후 시린지 동작을 통해 PCR 튜브(tube)로 일정량을 이송하여 PCR 반응을 실시간으로 확인하는 것으로, 카트리지 구조가 복잡하고 1회당 분석 비용이 매우 비싸다는 단점이 있다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로서, 시료 용액의 주입과 세척액의 주입 그리고 세포의 분해 및 핵산의 농축 과정이 카트리지 장치 내에서 신속하게 수행되는 시료 전처리 카트리지 장치 및 이를 이용한 시료 전처리 방법의 제공을 그 목적으로 한다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위한 것으로, 시료 용액이 투입되는 시료 챔버와, 상기 시료 챔버 일측에 형성되며, 상기 시료 용액에 포함된 세포는 거르고 용액은 통과하는 멤브레인 필터가 포함된 필터공간부와, 상기 필터공간부 일측에 형성되며, 상기 멤브레인 필터에 의해 걸려진 세포를 분해(lysis)시켜 핵산을 용출시키는 세포분해수단과, 상기 필터공간부와 연결되며, 상기 용출된 핵산이 이동되는 마이크로유체 채널과, 상기 시료 챔버와 마이크로유체 채널 사이에 인가된 전압에 의해 상기 핵산을 포집시키는 전기영동수단과, 상기 마이크로유체 채널 일측에 형성되며 상기 전기영동수단에 의해 포집된 핵산을 수집하는 수집 챔버와, 상기 필터공간부로부터 흘려보내진 용액을 저장하는 폐액 챔버 및 상기 마이크로유체 채널 또는 상기 폐액 챔버를 상기 필터공간부로부터 개폐시키는 밸브수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치를 기술적 요지로 한다
또한 본 발명은 시료 용액을 시료실에 투입하는 제1단계와, 상기 시료실에 투입된 시료 용액을 멤브레인 필터가 포함된 필터공간부로 주입하여, 상기 시료 용액에 포함된 세포는 거르고, 용액은 폐액 챔버로 흘려보내는 제2단계와, 세척실에 투입된 세척액을 상기 필터공간부로 주입하여 상기 필터공간부를 세척액 환경으로 전환시키는 제3단계와, 세포분해수단을 이용하여 상기 멤브레인 필터에 걸려진 세포를 분해하여 핵산을 용출시키는 제4단계와, 전기영동수단을 이용하여 상기 용출된 핵산을 마이크로유체 채널을 통해 이송하여 수집 챔버에 수집하는 제5단계;를 포함하며, 밸브수단에 의해 상기 시료 용액의 주입, 상기 세척액의 주입, 상기 세포의 분해 및 상기 핵산의 이송 과정에서 상기 시료실, 세척실, 마이크로유체 채널 및 폐액 챔버는 상기 필터공간부로부터 선택적으로 개폐되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지를 이용한 시료 전처리 방법을 또 다른 기술적 요지로 한다.
여기에서, 상기 시료 챔버는, 일측에 상기 시료 용액 및 세척액이 주입되는 주입구가 각각 또는 일체로 형성될 수 있다.
또한, 상기 시료 챔버는, 상기 시료 용액이 담기며, 일측에 시료 용액이 투입되는 시료용액 주입구와 타측에 상기 세척액이 투입되는 세척액 주입구가 형성된 시료실과, 상기 시료실의 세척액 주입구와 연결되며, 상기 필터공간부 내에 세척액을 공급하는 세척실로 이루어질 수 있다.
또한, 상기 시료실 및 세척실의 하단부 또는 상기 세척실의 하단부에는 실링막이 형성되고, 상기 실링막 하측에 펀쳐(puncher)가 형성되어 압력에 의해 상기 시료실 및 세척실은 순차적으로 개방되거나 상기 세척실이 개방될 수 있다.
또한, 상기 세포분해수단은, 상기 필터공간부 일측에 형성되며, 히팅부 및 초음파발생부 중 어느 하나 이상으로 구현되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 전기영동수단은, 상기 시료 챔버 일측에 형성된 기준 전극과, 상기 마이크로유체 채널에 형성된 핵산의 농축 및 이동을 위한 워킹 전극을 포함하여 상기 기준 전극 및 워킹 전극 사이에 전압이 인가되는 것이 바람직하다.
여기에서, 상기 워킹 전극은, 상기 마이크로유체 채널의 길이 방향을 따라 복수개로 이격되어 배치될 수 있으며, 상기 워킹 전극의 위치에 대응되어 선택적으로 수집 챔버가 형성되고, 상기 워킹 전극의 위치 중 어느 하나에 대응되어 불순물을 수집하는 폐기구가 형성될 수 있다. 상기 폐기구는, 상기 폐액 챔버와 연결될 수 있다.
또한, 상기 수집 챔버의 일측에는, 외부에서 핵산을 추출하기 위한 추출구가 형성될 수 있다.
또한, 상기 밸브수단은, 공압 방식, 기계 방식 및 유압 방식 중 어느 하나로 구현되며, 상기 필터공간부 및 마이크로유체 채널 사이 또는 상기 필터공간부 및 폐액 챔버 사이에 형성될 수 있다.
또한, 상기 밸브수단은, 공압 방식, 기계 방식 및 유압 방식 중 어느 하나로 구현되며, 상기 필터공간부와 시료실 사이, 상기 필터공간부 및 세척실 사이, 상기 필터공간부 및 폐액 챔버 사이 및 상기 필터공간부 및 마이크로유체 채널 사이에 형성되어 선택적으로 개폐될 수 있다.
또한, 상기 공압 방식의 밸브수단은, 각 위치에 멤브레인 범퍼(bumper)가 형성되어, 공압 변화에 따라 상기 멤브레인 범퍼의 높이가 조절되어 개폐가 제어될 수 있다.
본 발명은 시료 용액의 주입과 세척액의 주입 그리고 세포의 분해 및 핵산의 농축 과정이 카트리지 형태로 패키징되어 제공된 카트리지 장치 내에서 실현되어, 장소나 시간에 구애받지 않고, 편리하면서도 신속하게 시료의 전처리를 수행할 수 있는 것이다.
또한 본 발명은 초음파와 히팅 중 어느 하나 이상을 이용하여 세포를 분해하고, 멤브레인 필터로 불순물을 제거하고 추출된 핵산을 통과시켜 정제된 핵산 시료를 얻을 수 있으며, 여기에 더해 전기영동원리로 핵산을 농축하여 고순도, 고농도로 추출된 핵산 시료를 얻을 수 있어서 검출 감도를 향상시켜 시료 전처리 성능이 우수한 효과가 있다.
또한 세포 분해를 위해 초음파 및 히팅 중 어느 하나 이상을 활용하고, 세척액의 주입을 위한 구조가 단순하면서 절차가 간단한 카트리지 장치를 제공하게 된다.
또한 본 발명은 각 시료의 처리 상황에 따라 각 유로 등의 개폐가 신속하게 이루어지도록 하여, 시료의 전처리 및 핵산 시료 용액의 이송 및 농축이 신속하게 이루어지도록 하고, 불순물이 제거된 핵산 시료 용액을 신속하게 공급할 수 있어 고속 진단 및 정확한 진단이 가능하도록 한 것이다.
도 1 - 본 발명에 따른 시료 전처리 카트리지 장치의 주요부에 대한 블럭도.
도 2 내지 도 4 - 본 발명의 일실시예에 따른 시료 전처리 카트리지 장치의 주요부에 대한 모식도.
도 5 - 본 발명에 따른 마이크로유체 채널에 대한 다양한 실시예를 나타낸 도.
도 6 - 본 발명에 따른 전극의 일실시예에 대한 모식도.
도 7 - 본 발명에 따른 read-out 회로의 일실시예에 대한 모식도.
도 8 내지 도 10 - 본 발명의 다른 실시예에 따른 시료 전처리 카트리지 장치의 주요부에 대한 모식도.
도 11 - 본 발명에 따른 밸브수단의 일실시예에 대한 모식도.
도 12 - 본 발명의 실시예에 따른 전기영동수단을 이용한 핵산 농축 기초 실험을 위한 모식도 및 이에 대한 결과를 나타낸 데이타.
도 2 내지 도 4 - 본 발명의 일실시예에 따른 시료 전처리 카트리지 장치의 주요부에 대한 모식도.
도 5 - 본 발명에 따른 마이크로유체 채널에 대한 다양한 실시예를 나타낸 도.
도 6 - 본 발명에 따른 전극의 일실시예에 대한 모식도.
도 7 - 본 발명에 따른 read-out 회로의 일실시예에 대한 모식도.
도 8 내지 도 10 - 본 발명의 다른 실시예에 따른 시료 전처리 카트리지 장치의 주요부에 대한 모식도.
도 11 - 본 발명에 따른 밸브수단의 일실시예에 대한 모식도.
도 12 - 본 발명의 실시예에 따른 전기영동수단을 이용한 핵산 농축 기초 실험을 위한 모식도 및 이에 대한 결과를 나타낸 데이타.
본 발명은 분자진단을 통해 현장에서 신속하게 질병을 검사하기 위해 채취한 검체에 대한 전처리를 수행하기 위한 시료 전처리 장치에 관한 것으로서, 특히 카트리지 형태로 패키징되어 제공되는 시료 전처리 카트리지 장치에 관한 것이다.
특히, 본 발명은, 시료 챔버를 구비하고, 멤브레인 필터를 사용하여 시료 용액 속에 포함된 불순물을 물리적으로 제거하고, 전기영동 원리를 이용하여 고농도로 농축된 핵산 시료를 간단하고 신속하게 얻을 수 있도록 하는 것이다.
또한 세포 분해를 위해 초음파 및 히팅 중 어느 하나 이상을 활용하고, 세척액의 주입을 위한 구조가 단순하면서 절차가 간단하고, 불순물 제거 효율이 우수한 카트리지 장치를 제공하게 된다.
이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명하고자 한다. 도 1은 본 발명에 따른 시료 전처리 카트리지 장치의 주요부에 대한 블럭도이고, 도 2 내지 도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 시료 전처리 카트리지 장치의 주요부에 대한 모식도이고, 도 5는 본 발명에 따른 마이크로유체 채널에 대한 다양한 실시예를 나타낸 도이고, 도 6은 본 발명에 따른 전극의 일실시예에 대한 모식도이고, 도 6은 본 발명에 따른 전극의 일실시예에 대한 모식도이고, 도 7은 본 발명에 따른 read-out 회로의 일실시예에 대한 모식도이고, 도 8 내지 도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 시료 전처리 카트리지 장치의 주요부에 대한 모식도이고, 도 11은 본 발명에 따른 밸브수단의 일실시예에 대한 모식도이고, 도 12는 본 발명의 실시예에 따른 전기영동수단을 이용한 핵산 농축 기초 실험을 위한 모식도 및 이에 대한 결과를 나타낸 데이타이다.
도 1에 도시된 바와 같이 본 발명에 따른 시료 전처리 카트리지 장치는 시료 용액이 투입되는 시료 챔버(100)와, 상기 시료 챔버(100) 일측에 형성되며, 상기 시료 용액에 포함된 세포는 거르고 용액은 통과하는 멤브레인 필터(210)가 포함된 필터공간부(200)와, 상기 필터공간부(200) 일측에 형성되며, 상기 멤브레인 필터(210)에 의해 걸려진 세포를 분해(lysis)시켜 핵산을 용출시키는 세포분해수단(300)과, 상기 필터공간부(200)와 연결되며, 상기 용출된 핵산이 이동되는 마이크로유체 채널(400)과, 상기 시료 챔버(100)와 마이크로유체 채널(400)에 인가된 전압에 의해 상기 핵산을 포집시키는 전기영동수단(500)과, 상기 마이크로유체 채널(400) 일측에 형성되며 상기 전기영동수단(500)에 의해 포집된 핵산을 수집하는 수집 챔버(600)와, 상기 필터공간부(200)로부터 흘려보내진 용액을 저장하는 폐액 챔버(700) 및 상기 마이크로유체 채널(400) 또는 상기 폐액 챔버(700)를 상기 필터공간부(200)로부터 개폐시키는 밸브수단(800)을 포함한다.
먼저 본 발명의 일실시예에 따른 시료 챔버(100)는 시료 용액이 투입되는 것으로서, 카트리지 장치와 일체로 형성되거나 착탈되게 형성될 수 있으며, 원통형으로 형성되고, 일측에 시료 용액의 투입을 위한 주입구가 형성된다.
상기 시료 용액은 swab 시료, saliva 시료, 혈액 시료 또는 이를 보존하기 위한 용매(media)가 함께 섞인 용액일 수 있다. 필요에 따라 적정량의 용매가 혼합되어 희석한 용액을 상기 시료 챔버(100)에 투입할 수 있다.
이러한 시료 용액에는 각종 이온성 물질이나 핵산 증폭을 방해하는 성분들이 혼재하므로 핵산이 추출되어 정제된 용액은 침 등의 체액이나 swab 미디어 용액에서 세척액인 DW(deionized water) 환경으로 바꾸어주는 것이 바람직하다. 이를 위해 후술할 세척 챔버 및 세척액이 그 역할을 수행하게 된다.
또한 본 발명의 일실시예에 따른 시료 챔버(100)는 시료 용액은 중력에 의해 아래방향으로 이송되거나, 보다 원활한 이송을 위한 피스톤이 일측에 구비될 수 있으며, 상기 시료 챔버(100)의 일측부를 가압하는 동작에 의해서도 시료 용액의 원활한 이송이 이루어지도록 할 수 있다.
또한 본 발명의 일실시예에 따른 시료 챔버(100)의 하단부에는 실링막(sealing film)(130)으로 밀폐될 수도 있으며, 상기 시료 챔버(100)에 투입된 시료 용액을 이송시키고자 할 때는 상기 실링막(130)을 파괴하여 상기 시료 용액이 이송되도록 한다. 이를 위해 상기 시료 챔버(100)의 실링막(130) 하측에 펀쳐(puncher)(140) 구조물을 형성하고, 상기 시료 챔버(100)를 누르는 동작에 의해 상기 시료 챔버(100)가 하측으로 이동되어 펀쳐(140)에 의해 실링막(130)이 파괴되어 시료 챔버(100) 내부에 투입된 시료 용액이 이송되도록 할 수 있다.
또한 본 발명의 일실시예에 따른 시료 챔버(100)의 일측에는 상기 시료 용액 및 세척액이 주입되는 주입구가 각각 또는 일체로 형성될 수 있다. 즉, 상기 시료 챔버(100)로 시료 용액을 투입하고, DW 환경을 조성하기 위한 세척액도 시료 챔버(100)에 투입하여 구현할 수 있다. 여기에서 시료 용액 및 세척액은 동일한 주입구로 통해 투입될 수 있으며, 필요에 따라 각각의 주입구(시료용액 주입구, 세척액 주입구)로 투입될 수도 있다.
또한 본 발명의 일실시예에 따른 시료 챔버(100)는 시료 용액의 투입을 위한 시료실(110)과, 세척액이 보관되는 세척실(120)로 나누어질 수도 있다.
구체적으로는 상기 시료 챔버(100)는 상기 시료 용액이 담기며, 일측에 시료 용액이 투입되는 시료용액 주입구와 타측에 상기 세척액이 투입되는 세척액 주입구가 형성된 시료실(110)과, 상기 시료실(110)의 세척액 주입구와 연결되며, 상기 필터공간부(200) 내에 세척액을 공급하는 세척실(120)로 이루어질 수 있다.
즉, 상기 시료 챔버(100)는 시료 용액이 투입되는 시료실(110)과, 상기 시료실(110)과 세척액 주입구를 통해 연결되는 세척실(120)로 이루어지며, 필요에 따라 상기 세척실(120)은 하나 이상으로 형성될 수 있다. 본 발명의 일실시예로는 하나의 시료실(110)과, 상기 시료실(110) 양측으로 세척실(120)이 두 개 형성된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예로는 상기 시료실(110)에 투입되는 시료 용액은 500 ㎕ 정도이며, 세척액 환경으로 조성하기 위한 세척액은 2 ㎖ 정도 투입되게 되므로, 상기 세척실(120)을 하나 이상으로 형성하여 필요한 양의 세척액이 공급되도록 한다.
이에 의해 본 발명은 세척액으로 DW만을 사용함으로써 카트리지 장치의 구조를 단순화하고 세척액의 주입을 위한 절차를 간단하게 하면서도 불순물 제거 효율이 우수한 특징이 있다.
또한 상기 시료실(110) 및 세척실(120)의 하단부 또는 상기 세척실(120)의 하단부에는 실링막(130)이 형성될 수 있으며, 상기 실링막(130) 하측에 형성된 펀쳐(puncher)(140) 구조물과, 상기 시료실(110) 또는 세척실(120)을 누르는 동작에 의해 펀쳐(140)에 의해 실링막(130)이 파괴되어 상기 시료실(110) 및 세척실(120)이 순차적으로 개방되거나, 상기 세척실(120)이 개방되어 상기 시료실(110) 내부의 시료 용액 및 세척실(120) 내부의 세척액이 이송되도록 할 수 있다.
상기 시료실(110) 및 세척실(120)의 순차적인 개방은 시료실(110)의 하단부를 상기 세척실(120)의 하단부보다 더 낮게 형성하거나, 시료실(110)의 실링막(130)을 파괴하기 위한 펀쳐(140)를 더 높게 형성하여 구현할 수 있다.
즉, 상기 시료실(110)의 하단부에 형성된 실링막(130)이 먼저 파괴되어, 후술할 멤브레인 필터(210)로 불순물이 포함된 용액은 흘려보내고, 세포는 걸려지도록 하고, 그 다음 세척실(120)의 하단부에 형성된 실링막(130)이 파괴되어 세포 주변의 환경이 세척액으로 전환되도록 한다. 물론, 상기 시료실(110)은 필요에 따라 실링막(130)으로 실링되어 있지 않아도 무방하며, 이 경우에는 투입된 시료 용액이 바로 멤브레인 필터(210)로 공급되게 된다.
그리고, 본 발명에 따른 필터공간부(200)는 상기 시료 챔버(100) 일측에 형성되며, 상기 시료 용액에 포함된 세포는 거르고, 용액은 통과하는 멤브레인 필터(210)를 포함한다.
상기 시료 용액은 swab 시료, saliva 시료, 혈액 시료 또는 이를 보존하기 위한 용매(media)가 함께 섞인 용액일 수 있으며, 여기에는 각종 이온성 물질이나 핵산 증폭을 방해하는 성분들이 혼재하므로 이는 흘려보내고, 세포만 상기 멤브레인 필터(210)에 의해 걸려져 남도록 한다.
상기 필터공간부(200)는 상기 시료 챔버(100) 일측과 연결되며, 내부에는 멤브레인 필터(210)를 포함하고, 이를 통과하여 흘려보내진 용액 또는 불순물을 저장하는 폐액 챔버(700)와 연결되고, 세포 분해된 핵산이 이동하는 마이크로유체 채널(400)과 연결되게 된다.
상기 필터공간부(200)는 카트리지 장치 내부에서 특별하게 공간을 점유하는 구조는 아닐 수 있으며, 상기 시료 챔버(100) 하측부에 멤브레인 필터(210)가 형성되는 경우, 상기 멤브레인 필터(210) 주변 공간을 필터공간부(200)로 정의한다. 또한 시료 챔버(100) 하측부가 아닌 일측으로 멤브레인 필터(210)가 형성된 경우에는 그 주변 공간을 필터공간부(200)로 정의한다.
본 발명의 일실시예(도 2 내지 도 4)로는 상기 시료실(110) 하측부에 멤브레인 필터(210)가 형성되고, 그 주변 공간이 필터공간부(200)로 정의되며, 상기 멤브레인 필터(210) 하측부로 상기 필터공간부(200)와 연결된 마이크로유체 채널(400)이 형성되거나, 다른 실시예(도 8 내지 도 10)로 상기 시료실(110) 또는 시료 챔버(100) 일측부에 멤브레인 필터(210)를 포함하는 필터공간부(200)가 형성되고, 상기 멤브레인 필터(210) 하측부로 상기 필터공간부(200)와 연결된 마이크로유체 채널(400)이 형성될 수 있다.
상기 멤브레인 필터(210)에 세포는 걸려지고, 용액은 폐액 챔버(700) 측으로 흘려보내게 되며, 상기 멤브레인 필터(210) 하측부에 폐액 챔버(700)가 형성되어 바로 폐액이 이송되도록 하거나(도 2 내지 도 4), 카트리지 장치의 내부 공간의 효율적인 배치를 고려하여 상기 멤브레인 필터(210)가 상기 시료실(110) 또는 시료 챔버(100) 일측부에 위치하는 경우에는 시료 용액이 공급되면 폐액이 상기 멤브레인 필터(210) 위쪽으로 통과하여 폐액 챔버(700)로 이송될 수도 있다(도 8 내지 도 10).
이때 상기 시료 용액의 주입, 세척액의 주입, 세포의 분해 및 핵산의 이송 과정에서 상기 시료실(110), 세척실(120), 마이크로유체 채널(400) 및 폐액 챔버(700)는 상기 필터공간부(200)로부터 선택적으로 개폐되도록 한다.
즉, 시료 용액 또는 세척액의 주입이나 세포가 분해되는 동안에는 마이크로유체 채널(400) 유로는 폐쇄되며, 시료 용액이 주입되면 시료실(110)과 필터공간부(200) 사이, 폐액 챔버(700)와 필터공간부(200) 사이가 오픈되고, 이것으로 멤브레인 필터(210)에 세포를 위치시킨다. 다음으로 필터공간부(200)에 세척액(DW)을 공급하여 환경이 완전히 전환될 때까지 세척실(120)과 폐액 챔버(700) 사이가 오픈되고, 세포가 분해되는 동안에는 모든 유로와 필터공간부(200)가 폐쇄되게 된다.
그리고 본 발명의 일실시예에 따른 세포분해수단(300)은 상기 필터공간부(200) 일측에 형성되며, 세척액(DW) 환경하에서 상기 멤브레인 필터(210)에 의해 걸려진 세포를 분해(lysis)시켜 핵산을 추출한다.
상기 세포분해수단(300)은 세포 내에 핵산(DNA, RNA)을 추출하기 위한 것으로서 세포벽을 분쇄하기 위한 과정이다.
본 발명의 일실시예에 따른 세포분해수단(300)은 상기 필터공간부(200) 일측에 형성되며, 멤브레인 필터(210)에 걸려진 세포를 분해하기 위한 것으로, 세포분해를 위한 다양한 방법에 의해 실현될 수 있다.
본 발명에 따른 세포분해수단(300)의 일실시예로는 화학적인 방식(용액의 pH 조절), 히팅부(95도 내외, 단백질 변성을 통한 거대 단백질 분자를 제거) 또는 초음파발생부(물리적 파괴)(310) 중 어느 하나 이상으로 구현될 수 있으며, 카트리지 장치의 소형화 및 패키지화 구현을 용이하게 하기 위해서 본 발명에서는 히팅부 또는 초음파발생부(310) 중 어느 하나 이상으로 구현되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 세척액 환경하에서 핵산이 용출되게 되며, 이 과정에서 멤브레인 필터(210)의 기공보다 크기가 큰 단백질이나 세포 껍질 등의 불순물은 멤브레인 필터(210)를 통과하지 못하여, 더욱 정제된 핵산 시료를 얻을 수 있게 된다.
그리고, 본 발명에 따른 마이크로유체 채널(400)은 상기 필터공간부(200)와 연결되며, 상기 용출된 핵산 즉, 세척액(DW) 환경하에서 용출된 핵산 시료 용액이 이동되는 유로이다.
상기 용출된 핵산 시료는 DW 용액 환경에서 음전하를 띠게 되며, 상기 시료 챔버(100)와 마이크로유체 채널(400) 사이에 전압을 인가하면 용출된 핵산은 마이크로유체 채널(400)을 따라 이송되어 특정 위치에서 포집되게 된다.
상기 마이크로유체 채널(400)은 핵산의 농축 속도나 농축량, 분석하고자 하는 시료의 종류에 따라 소정의 길이 및 직경으로 형성되며, 도 5(a), (b)에 도시한 바와 같이 다양한 형상으로 형성될 수 있다.
상기 마이크로유체 채널(400)의 길이 및 직경을 고려하여 핵산 시료 용액의 미터링(metering)을 할 수 있고, 피펫을 이용하거나, 상기 마이크로유체 채널(400)의 입구단에 압력을 가하여(상기 히팅부에 의한 고온 히팅하여 발생시키는 압력, 또한 시료 챔버(100)에 가해진 양압) 미터링된 핵산 시료 용액의 정량 회수가 가능하도록 한다.
예컨대, 마이크로유체 채널(400)에 채워진 핵산 시료 용액의 부피가 20 ㎕로 계산된 경우, 상기 마이크로유체 채널(400)의 시작부위에 위치한 시료 챔버(100) 또는 필터공간부(200)에 위치한 히팅부의 동작으로 발생하는 기포에 의한 압력으로 상기 마이크로유체 채널(400) 내부의 시료를 모두 수집 챔버(600)로 이송하게 되면 정량 부피의 농축된 핵산 시료를 간단하게 얻을 수 있게 된다.
본 발명의 일실시예로 상기 마이크로유체 채널(400)은 0.8 mm 이내의 직경으로 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)이 이루어지는 단면적을 갖는 것이 바람직하며, 0.8 mm 이하의 유리관을 사용하거나, 유체 채널칩을 사용할 수도 있다.
여기에서, 상기 마이크로유체 채널(400) 측으로 핵산 시료 용액을 이동시키고자 할 때는 시료실(110) 및 폐액 챔버(700) 측의 밸브는 닫고, 세척실(120) 및 마이크로유체 채널(400) 측 밸브는 오픈시킨다.
그리고, 상기 전기영동수단(500)은 상기 시료 챔버(100)와 마이크로유체 채널(400) 사이에 인가된 전압에 의해 상기 핵산을 포집시키는 것으로, 전기영동을 실현시키기 위해 상기 마이크로유체 채널(400) 내부는 세척액인 DW 용액으로 채워지게 되며, DW에 무작위로 분포된 핵산이 이동 및 농축된다.
상기 전기영동수단(500)은 상기 시료 챔버(100) 일측에 형성된 기준 전극과 상기 마이크로유체 채널(400)에 형성되어 핵산을 농축 및 이동시키는 워킹(working) 전극을 포함하며, 상기 기준 전극(510) 및 워킹 전극(520) 사이에 전압이 인가된다.
본 발명의 일실시예로 상기 마이크로 유체 채널(400)에 형성된 기준 전극(510)과 워킹 전극(520)에 전압을 인가하면 음전하를 띤 핵산 분자는 양전압이 인가된 워킹 전극(520)에 모이게 되고 포집된 핵산들이 수집 챔버(600) 등에 수집되어 간단하고 신속한 방식으로 고농도의 전처리된 시료를 얻게 된다.
본 발명의 일실시예로 상기 워킹 전극(520)은 상기 마이크로유체 채널(400)의 길이 방향을 따라 복수개로 이격되어 배치될 수 있다. 도 6은 본 발명에 따른 전극의 일실시예에 대한 모식도를 나타낸 것으로, 기준 전극(V0) 및 워킹 전극(520)에 n개의 전극(V1, V2, V3,... Vn)이 배치된 것을 나타냈으며, 워킹 전극(520)에 인가되는 전압은 기준 전압보다 높은 값(V0 < Vn)을 가지고, 음전하를 띤 핵산 분자는 전기영동을 통해 각 전극이 위치하는 곳에 모이게 된다.
여기에서 복수개의 워킹 전극(520)에 각 인가되는 전압은 배치 순서와 무관하게 핵산 시료의 종류, 농축 속도, 농축량 등 필요에 따라 조절할 수 있도록 한다.
본 발명의 일실시예로 복수개로 이격되어 배치된 워킹 전극(520)의 전위변화를 측정하여 상기 마이크로유체 채널(400) 내에 핵산 또는 음이온성 불순물의 이동 상황을 모니터링 할 수 있다. 도 7은 각각의 워킹 전극에 연결되는 read-out 회로의 모식도로 워킹 전극 표면의 음이온 농도에 따라 출력 전압이 변화하게 된다. 기준 전극의 소재는 Ag/AgCl으로, 워킹 전극은 인듐 주석 산화물(Indium thin oxide, ITO) 또는 실리콘 산화막과 같은 금속 산화물 전극을 사용하는 것이 바람직하다.
그리고, 본 발명에 따른 수집 챔버(600)는 상기 마이크로유체 채널(400) 일측에 형성되며, 상기 전기영동수단(500)에 의해 포집된 핵산을 수집하는 것이다.
상기 수집 챔버(600)는 상기 워킹 전극(520)의 위치에 대응되어 선택적으로 상기 마이크로유체 채널(400) 일측에 형성될 수 있으며, 상기 워킹 전극(520)의 위치 중 어느 하나에 대응되어 멤브레인 필터(210)를 통과하여 핵산과 같이 용출된 음이온성 불순물을 수집하는 폐기구(700)가 형성될 수 있다.
즉, 복수개의 워킹 전극(520)이 형성된 경우, 핵산의 종류, 농축량 등을 고려하여 전극이 위치한 곳에 수집 챔버(600)가 각각 또는 특정 위치에 형성될 수 있으며, 핵산을 제외한 음이온성 불순물의 경우는 이를 수집할 수 있는 폐기구(700)를 형성하여 보다 순수한 핵산 시료를 수집할 수 있도록 한다.
여기에서 상기 폐기구(700)는 상술한 폐액 챔버(700)와 연결되도록 하여 상기 시료 용액에 포함된 불순물과 함께 음이온성 불순물을 모을 수 있도록 하였으며, 상기 폐기구(700) 또는 폐액 챔버(700)는 밸브에 의해 개폐될 수 있다.
상기 수집 챔버(600) 및 폐기구(700)는 상기 마이크로유체 채널(400)과 연결되며, 상기 수집 챔버(600)의 일측에는 외부에서 핵산(핵산 시료 용액)을 추출하기 위한 추출구(620)가 형성되어, 피펫 등으로 정량 추출할 수 있도록 하거나, 수집 챔버(600) 자체가 탈착 결합되도록 하여 정량 추출할 수 있도록 한다.
이렇게 피펫으로 정량 추출된 핵산 시료는 PCR 튜브에 옮겨지거나, 카트리지 장치에서 자동으로 PCR 튜브로 이송되는 방식으로 옮겨져 진단이 이루어지게 된다.
그리고, 본 발명에 따른 밸브수단(800)은 상기 마이크로유체 채널(400) 또는 상기 폐액 챔버(700)와 상기 필터공간부(200) 사이를 개폐시키게 된다.
즉, 상기 시료실(110)로부터 시료 용액이 상기 필터공간부(200)로 주입되고, 세척실(120)로부터 세척액이 상기 필터공간부(200)로 주입되어 DW 환경으로 조성되는 동안에는 폐액 챔버(700)는 오픈되게 되고, 마이크로유체 채널(400)은 폐쇄된다.
그리고, 상기 세포분해수단(300)에 의해 세포의 분해가 이루어지는 동안에는 폐액 챔버(700) 및 마이크로유체 채널(400)도 폐쇄되게 되며, 세포의 분해 후 마이크로유체 채널(400)로 핵산 시료 용액이 이송되는 동안에는 폐액 챔버(700)는 폐쇄되고, 마이크로유체 채널(400)은 오픈된다.
이와 같이 밸브수단(800)은 상기 필터공간부(200)로부터 마이크로유체 채널(400) 및 폐액 챔버(700)를 개폐시키게 되며, 시료 챔버(100)의 구조 및 위치 또는 시료실(110) 및 세척실(120)의 구조 및 위치, 또는 필터공간부(200)의 카트리지 장치 내에서의 구조 및 위치에 따라 시료의 주입, 시료의 세척, 시료의 분해(세포 분해), 용출된 핵산의 이송 등의 과정에서 시료 챔버(100), 시료실(110) 또는 세척실(120)의 개폐도 선택적으로 이루어질 수 있다.
이러한 본 발명에 따른 밸브수단(800)은 유로 또는 주입구, 유출구 등을 개폐시킬 수 있는 구조물 또는 방식이면 카트리지 장치 내의 패키징화가 가능한 어떠한 것이든 무방하며, 예컨대 공압 방식, 기계적 방식, 유압 방식 중 어느 하나로 구현될 수 있다.
즉, 공압 또는 유압을 조절하여 밸브가 개폐되도록 하거나, 기계적으로 밸브의 위치를 변동시켜 각 구조물의 유로 또는 주입구, 유출구 등을 개폐시키게 된다.
상기 밸브수단(800)은 상기 필터공간부(200) 및 마이크로유체 채널(400) 사이 또는 상기 필터공간부(200) 및 폐액 챔버(700) 사이에 형성될 수 있으며, 또한 상기 필터공간부(200)와 시료실(110) 사이, 상기 필터공간부(200) 및 세척실(120) 사이, 상기 필터공간부(200) 및 폐액 챔버(700) 사이, 상기 필터공간부(200) 및 마이크로유체 채널(400) 사이에 형성되어, 시료의 각 처리 상황에 따라 선택적으로 개폐되게 된다.
본 발명의 일실시예로 공압 방식의 밸브수단(800)을 사용한 경우, 상기의 각 해당 위치에 멤브레인 범퍼(bumper)(810)가 형성되어, 공압 변화에 따라 상기 멤브레인 범퍼(810)의 높이가 조절되어 개폐가 제어되도록 한다. 상기 멤브레인 범퍼(810)는 카트리지 내부 구조물 상의 해당 유로 등에 얇은 막으로 형성되며, 공압 변화에 따라 높이 조절, 또는 위치 변화 등이 이루어지도록 하여 상기 유로 등을 개폐시키게 된다. 각 멤브레인 범퍼(810)의 위치에 대응하여 공압 조절을 위한 공압채널이 형성되며, 공압 변화에 따라 멤브레인 범퍼(810)의 높이 등이 조절되어 각 유로를 개폐시키게 된다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 공압 방식의 밸브수단(800)을 도시한 것으로서, 상기 필터공간부(200)와 시료실(110) 사이①, 상기 필터공간부(200) 및 세척실(120) 사이②, 상기 필터공간부(200) 및 폐액 챔버(700)③ 사이, 상기 필터공간부(200) 및 마이크로유체 채널(400)④ 사이에 멤브레인 범퍼(810)가 형성되어, 시료의 처리 상황에 따른 공압 변화(도 10(a),(b))에 따라 각각 선택적으로 개폐되게 된다. 도 10(a)는 공압을 가하여 멤브레인 범퍼의 높이가 높아져 각 유로를 폐쇄한 상태를 나타낸 모식도이고, 도 10(b)는 공압을 빼서 멤브레인 범프의 높이를 낮추어 각 유로를 개방시킨 상태를 나타낸 모식도이다.
상술한 바와 같이, 시료의 주입, 시료의 세척, 세포의 분해, 핵산 시료 용액의 이송의 경우 각 멤브레인 범퍼(810)의 개폐 동작이 다음 표 1과 같이 이루어지게 된다.
| 시료실① | 세척실② | 폐액 챔버③ | 마이크로유체 채널④ | |
| 시료의 주입 | 오픈 | 폐쇄 | 오픈 | 폐쇄 |
| 시료의 세척 | 폐쇄 | 오픈 | 오픈 | 폐쇄 |
| 세포의 분해 | 폐쇄 | 폐쇄 | 폐쇄 | 폐쇄 |
| 핵산 시료 용액의 이송 | 폐쇄 | 오픈 | 폐쇄 | 오픈 |
이와 같이, 본 발명은 각 시료의 처리 상황에 따라 각 유로 등의 개폐가 신속하게 이루어지도록 하여, 시료의 전처리 및 핵산 시료 용액의 이송 및 농축이 신속하게 이루어지도록 하고, 불순물이 제거된 핵산 시료 용액을 신속하게 공급할 수 있어 고속으로 정확한 진단이 가능하도록 한 것이다.
상술한 본 발명에 따른 시료 전처리 카트리지 장치를 이용한 시료 전처리 방법에 대해 설명하고자 하며, 상기에서 서술한 바 중복된 설명은 생략하거나 간략하게 서술하고자 한다.
본 발명에 따른 시료 전처리 방법은 시료 용액을 시료실(110)에 투입하는 제1단계와, 상기 시료실(110)에 투입된 시료 용액을 멤브레인 필터(210)가 포함된 필터공간부(200)로 주입하여, 상기 시료 용액에 포함된 세포는 거르고, 용액은 폐액 챔버(700)로 흘려보내는 제2단계와, 세척실(120)에 투입된 세척액을 상기 필터공간부(200)로 주입하여 상기 필터공간부(200)를 세척액 환경으로 전환시키는 제3단계와, 세포분해수단(300)을 이용하여 상기 멤브레인 필터(210)에 걸려진 세포를 분해하여 핵산을 용출시키는 제4단계와, 전기영동수단(500)을 이용하여 상기 용출된 핵산을 마이크로유체 채널(400)을 통해 이송하여 수집 챔버(600)에 수집하는 제5단계를 포함할 수 있다.
그리고, 밸브수단(800)에 의해 상기 시료 용액의 주입, 상기 세척액의 주입, 상기 세포의 분해 및 상기 핵산의 이송 과정에서 상기 시료실(110), 세척실(120), 마이크로유체 채널(400) 및 폐액 챔버(700)는 상기 필터공간부(200)로부터 선택적으로 개폐되게 된다.
먼저, 시료와 세포 보존 용액이 포함된 시료 용액을 시료실(110)에 투입하고, 상기 멤브레인 필터(210)가 포함된 필터공간부(200)로 상기 시료 용액을 주입한다. 주입된 시료 용액에 포함된 세포는 상기 멤브레인 필터(210)에 의해 걸려지고, 용액은 폐액 챔버(700)로 흘려보내 폐기한다. 이때 마이크로유체 채널(400)은 밸브수단(800)에 의해 폐쇄되어 있다.
세척실(120)에 포함된 세척액(DW)을 상기 필터공간부(200)로 주입하여 상기 필터공간부(200)를 세척액 환경으로 전환시킨다. 이때도 폐액 챔버(700)는 오픈되어 있으며, 마이크로유체 채널(400)은 폐쇄되어 있다.
용액의 교체가 종료되어 세척액 환경으로 조성이 완료되면, 폐액 챔버(700)를 폐쇄하고, 상기 세포분해수단(300)을 이용하여 상기 멤브레인 필터(210)에 걸려진 세포를 분해하여 핵산을 용액(세척액, DW) 내에 용출시킨다.
세포 분해가 완료되면 부피가 큰 단백질이나 세포 껍질 등은 멤브레인 필터(210)에 남게 되고, 핵산은 멤브레인 필터(210)를 통과하여 용액 내에 핵산만 존재하여 고순도의 핵산 시료를 얻게 된다.
그리고 전기영동수단(500)을 이용하여 상기 용출된 핵산을 마이크로유체 채널(400)을 통해 이송하여 수집 챔버(600)에 수집하게 된다. 이땐 마이크로유체 채널(400)을 오픈한다. 필요에 따라 세척실(120)을 오픈하여 세척액을 더 공급하여 전기영동이 원활하게 이루어지도록 한다.
전기영동을 위한 기준 전극(510) 및 워킹 전극(520)이 시료실(110) 및 마이크로유체 채널(400)의 각 위치에 형성되고, 전압을 인가하여 전기영동을 통해 마이크로유체 채널(400) 내의 양전극으로 핵산을 모두 이동시킨다.
양전극 쪽에 위치한 수집 챔버(600)에 핵산을 모두 수집하고, 이를 정량 회수하여 높은 농도의 핵산 시료 용액을 회수하게 된다.
이렇게 정량 회수된 핵산 시료는 PCR 튜브에 옮겨지거나, 카트리지 장치에서 자동으로 PCR 튜브로 이송되는 방식으로 옮겨져 진단이 이루어지게 된다.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 도면을 참조하여 다시 한번 설명하고자 한다.
도 2 내지 도 4는 본 발명의 제1실시예에 따른 시료 전처리 카트리지 장치의 주요부에 대한 모식도를 나타낸 것으로, 시료 용액이 투입되는 시료실(110)과, 상기 시료실(110) 양측에 두 개의 세척실(120)이 구현된 것이다.
상기 세척실(120)의 하단부에는 실링막(130)이 구현되고, 세척액을 주입하고자 할 때 펀쳐(140)에 의해 상기 실링막(130)이 제거되어 세척액의 주입이 이루어지게 된다.
상기 멤브레인 필터(210)가 포함된 필터공간부(200)는 시료실(110) 하측에 형성되고, 투입된 시료 용액은 바로 멤브레인 필터(210)로 제공되어 세포는 멤브레인 필터(210)에 의해 걸려지고, 용액은 폐액 챔버(700)로 흘려보내져 폐기되게 된다.
상기 필터공간부(200) 하측에 형성된 히팅부 또는 초음파발생부(310)에 의해 필터공간부(200)에 열 또는 초음파를 가해 멤브레인 필터(210)에 의해 걸려진 세포를 분해하여 핵산을 용출시킨다. 용출된 핵산은 멤브레인 필터(210)를 통과하게 되고, 세포 분해가 완료되면 마이크로유체 채널(400)을 오픈하여 용출된 핵산을 이송시키게 된다.
본 실시예에서 밸브수단(800)은 상기 폐액 챔버(700) 및 마이크로유체 채널(400)이 위치하는 곳에 기계적 방식의 밸브를 구현하여, 폐액 챔버(700) 및 마이크로유체 채널(400)의 오픈 및 폐쇄가 이루어지도록 한다.
도 5는 마이크로유체 채널(400)의 다양한 실시예를 나타낸 것으로, 상기 마이크로유체 채널(400)의 길이 및 직경을 고려하여 핵산 시료 용액의 미터링(metering)을 할 수 있고, 미터링된 핵산 시료 용액의 정량 회수가 가능하도록 한다.
본 실시예에 따른 카트리지 장치는 하측에 히팅부의 발열을 위한 단열공간 또는 초음파발생부 구현을 위한 공간부가 형성될 수 있다.
상기 시료실(110) 및 마이크로유체 채널(400)에 각각 기준 전극(510) 및 워킹 전극(520)을 구현하고, 전압을 인가하여 용출된 핵산을 워킹 전극(520) 쪽으로 이송시킨다. 본 실시예에 따르면 도 6에 도시한 바와 같이, 4개의 워킹 전극(520)이 마이크로유체 채널(400) 측에 형성되고, 마이크로유체 채널(400) 말단부에 형성된 워킹 전극(520) 근처에는 수집 챔버(600)를 형성하여 전기영동에 의해 이송된 핵산 시료 용액을 수집하게 된다. 이에 의해 상기 수집 챔버(600)에 고농도의 핵산 시료 용액이 수집되게 된다.
상기 수집 챔버(600)의 일측에는 외부에서 핵산(핵산 시료 용액)을 추출하기 위한 추출구(620)가 형성되어, 피펫 등으로 정량 추출할 수 있도록 하고, 피펫으로 정량 추출된 핵산 시료는 PCR 튜브에 옮겨지거나, 카트리지 장치에서 자동으로 PCR 튜브로 이송되는 방식으로 옮겨져 진단이 이루어지게 된다.
도 8 내지 도 10은 본 발명의 제2실시예에 따른 시료 전처리 카트리지 장치에 대한 모식도를 나타낸 것으로, 카트리지 장치의 소형화, 효율적인 패키징을 위해 시료실(110) 및 세척실(120)이 일체로 형성된 것으로서, 시료실(110) 내부에 시료 용액을 투입한 후 주입구를 통해 세척액을 주입하는 것이다.
본 제2실시예도 상기 제1실시예와 기본적으로 구조는 비슷하여 중복된 설명은 생략하고자 한다.
본 실시예에 따르면 상기 필터공간부(200)가 시료실(110) 일측에 형성되고, 시료실(110)에서 주입된 시료 용액은 필터공간부(200)로 이동하여 세척액의 주입완료 후 세포 분해를 수행한다.
여기에서 용액은 멤브레인 필터(210) 아래에서 위쪽으로 통과하여 폐액 챔버(700)로 폐기되며, 세척액은 필터공간부(200)에서 마이크로유체 채널(400)로 바로 이송되면서 세척액 환경으로 조성되게 된다.
본 실시예에서 밸브수단(800)은 상기 제1실시예에서처럼 상기 폐액 챔버(700) 및 마이크로유체 채널(400)이 위치하는 곳에 기계적 방식의 밸브를 구현하여, 폐액 챔버(700) 및 마이크로유체 채널(400)의 오픈 및 폐쇄가 이루어지도록 할 수 있다.
도 11은 본 발명에 따른 밸브수단(800)의 일실시예에 대한 모식도를 나타낸 것으로서, 멤브레인 범퍼(810)를 이용한 공압 방식의 밸브수단(800)을 도시한 것이다.
상술한 바와 같이, 상기 필터공간부(200)와 시료실(110) 사이①, 상기 필터공간부(200) 및 세척실(120) 사이②, 상기 필터공간부(200) 및 폐액 챔버(700)③ 사이, 상기 필터공간부(200) 및 마이크로유체 채널(400)④ 사이에 멤브레인 범퍼(810)가 형성되어, 시료의 처리 상황에 따른 공압 변화(도 10(a),(b))에 따라 각각 선택적으로 개폐되도록 하며, 시료의 주입, 시료의 세척, 세포의 분해, 핵산 시료 용액의 이송의 경우 각 멤브레인 범퍼(810)의 개폐 동작은 상기 표 1에서와 같이 이루어지게 된다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 전기영동수단(500)을 이용한 시료 전처리 기초 실험을 위한 모식도 및 이에 대한 핵산 시료의 농축이 가능하다는 것을 보여주는 PCR 증폭 결과이다. 핵산은 음전하를 띠므로 양전극에 가까운 시료의 핵산 농도가 높아 PCR 증폭이 빨리 진행되는 것을 확인할 수 있다.
도 12(a)는 본 발명에 따른 시료 전처리 카트리지 장치에 대한 개략도이고, 도 12(b)는 도 12(a)에서 표시한 시료 챔버(100) 내부(위치 5, 위치 6), 마이크로유체 채널(위치 1 내지 위치 4)(400)의 각 위치에 따른 핵산 시료의 농축 결과를 나타낸 것이다.
세척액(DW) 환경에서 용출된 핵산 시료를 전기영동수단(500)에 의해 마이크로유체 채널(400)로 이송시킨다. 즉, 상기 핵산 시료 용액이 포함된 시료 챔버(100)와 마이크로유체 채널(400) 양단에 각각 기준 전극(510) 및 워킹 전극(520)을 구현하고, 전압을 인가하여 전기영동에 의해 음전하를 띤 핵산 시료는 양전극(워킹 전극(520))으로 이동하게 된다.
마이크로유체 채널(400)의 길이는 30 mm로 하고, 직경을 0.8 mm로 하면 10 mm 길이에 담긴 용액의 양은 대락 5 ㎕가 된다. 세척액 환경하에서 두 전극 사이에 2 kV를 인가하고, 5분 후 시료의 핵산 농도를 PCR 반응을 통해 확인하였다. 본 발명의 실시예에 따라 전기영동수단에 의한 핵산 시료의 농축 효과를 증명하기 위해 실험에 사용한 핵산 시료를 비교군으로 하고 이를 DW 용액에 1/1000 농도로 희석하여 실험한 결과이다.
전기영동 원리에 의한 핵산의 이동으로 양전극 주변의 용액 5 ㎕의 PCR 결과와 순차적으로 5 ㎕ 구간별로 PCR 반응결과를 보면 양전극 주변의 핵산 농도가 매우 높게 나타나는 것을 확인할 수 있으며, 농축에 의해 원액에 비해 3싸이클(cycles) 낮지만 실험에 사용된 1/1000배 희석한 용액이 배해 7싸이클의 PCR 반응이 당겨져서 농도가 2^7배 높아진 것을 확인할 수 있었다. 또한 시료 챔버에 남아 있는 시료는 1/1000배보다 더 묽혀져서 1~2싸이클 밀리고 있음을 확인할 수 있었다.
이와 같이 본 발명은 마이크로유체 채널 및 전기영동수단을 이용하여 고농도로 추출된 핵산 시료를 얻을 수 있어서 검출 감도를 향상시킬 수 있고, 멤브레인 필터와 DW 용액을 세척액으로 사용하여 전처리 절차를 간소화하면서도 신속하게 수행할 수 있어, 전처리 효율이 우수한 농축된 핵산 시료를 얻을 수 있다.
100 : 시료 챔버
110 : 시료실
111 : 시료용액 주입구 112 : 세척액 주입구
120 : 세척실 130 : 실링막
140 : 펀쳐 200 : 필터공간부
210 : 멤브레인 필터 300 : 세포분해수단
310 : 히팅부 또는 초음파발생부 400 : 마이크로유체 채널
500 : 전기영동수단 510 : 기준 전극
520 : 워킹 전극 600 : 수집 챔버
620 : 추출구 700 : 폐액 챔버
720 : 폐기구 800 : 밸브수단
810 : 멤브레인 범퍼
111 : 시료용액 주입구 112 : 세척액 주입구
120 : 세척실 130 : 실링막
140 : 펀쳐 200 : 필터공간부
210 : 멤브레인 필터 300 : 세포분해수단
310 : 히팅부 또는 초음파발생부 400 : 마이크로유체 채널
500 : 전기영동수단 510 : 기준 전극
520 : 워킹 전극 600 : 수집 챔버
620 : 추출구 700 : 폐액 챔버
720 : 폐기구 800 : 밸브수단
810 : 멤브레인 범퍼
Claims (24)
- 시료 용액이 투입되는 시료 챔버;
상기 시료 챔버 일측에 형성되며, 상기 시료 용액에 포함된 세포는 거르고 용액은 통과하는 멤브레인 필터가 포함된 필터공간부;
상기 필터공간부 일측에 형성되며, 상기 멤브레인 필터에 의해 걸려진 세포를 분해(lysis)시켜 핵산을 용출시키는 세포분해수단;
상기 필터공간부와 연결되며, 상기 용출된 핵산이 이동되는 마이크로유체 채널;
상기 시료 챔버와 마이크로유체 채널 사이에 인가된 전압에 의해 상기 핵산을 포집시키는 전기영동수단;
상기 마이크로유체 채널 일측에 형성되며 상기 전기영동수단에 의해 포집된 핵산을 수집하는 수집 챔버;
상기 필터공간부로부터 흘려보내진 용액을 저장하는 폐액 챔버; 및
상기 마이크로유체 채널 또는 상기 폐액 챔버를 상기 필터공간부로부터 개폐시키는 밸브수단;을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치. - 제 1항에 있어서, 상기 시료 챔버는,
일측에 상기 시료 용액 및 세척액이 주입되는 주입구가 각각 또는 일체로 형성된 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치. - 제 2항에 있어서, 상기 시료 챔버는,
상기 시료 용액이 담기며, 일측에 시료 용액이 투입되는 시료용액 주입구와 타측에 상기 세척액이 투입되는 세척액 주입구가 형성된 시료실;
상기 시료실의 세척액 주입구와 연결되며, 상기 필터공간부 내에 세척액을 공급하는 세척실;로 이루어진 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치. - 제 3항에 있어서, 상기 시료실 및 세척실의 하단부 또는 상기 세척실의 하단부에는 실링막이 형성되고, 상기 실링막 하측에 펀쳐(puncher)가 형성되어 압력에 의해 상기 시료실 및 세척실은 순차적으로 개방되거나 상기 세척실이 개방되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치.
- 제 1항에 있어서, 상기 세포분해수단은,
상기 필터공간부 일측에 형성되며, 히팅부 및 초음파발생부 중 어느 하나 이상으로 구현되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치. - 제 1항에 있어서, 상기 전기영동수단은,
상기 시료 챔버 일측에 형성된 기준 전극;
상기 마이크로유체 채널에 형성된 핵산의 농축 및 이동을 위한 워킹 전극;을 포함하여 상기 기준 전극 및 워킹 전극 사이에 전압이 인가되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치. - 제 6항에 있어서, 상기 워킹 전극은,
상기 마이크로유체 채널의 길이 방향을 따라 복수개로 이격되어 배치된 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치. - 제 7항에 있어서, 상기 워킹 전극의 위치에 대응되어 선택적으로 수집 챔버가 형성되고, 상기 워킹 전극의 위치 중 어느 하나에 대응되어 불순물을 수집하는 폐기구가 형성된 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치.
- 제 8항에 있어서, 상기 폐기구는,
상기 폐액 챔버와 연결되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치. - 제 1항에 있어서, 상기 수집 챔버의 일측에는,
외부에서 핵산을 추출하기 위한 추출구가 형성된 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치. - 제 1항에 있어서, 상기 밸브수단은,
공압 방식, 기계 방식 및 유압 방식 중 어느 하나로 구현되며, 상기 필터공간부 및 마이크로유체 채널 사이 또는 상기 필터공간부 및 폐액 챔버 사이에 형성된 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치. - 제 3항에 있어서, 상기 밸브수단은,
공압 방식, 기계 방식 및 유압 방식 중 어느 하나로 구현되며, 상기 필터공간부와 시료실 사이, 상기 필터공간부 및 세척실 사이, 상기 필터공간부 및 폐액 챔버 사이 및 상기 필터공간부 및 마이크로유체 채널 사이에 형성되어 선택적으로 개폐되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치. - 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 공압 방식의 밸브수단은,
각 위치에 멤브레인 범퍼(bumper)가 형성되어, 공압 변화에 따라 상기 멤브레인 범퍼의 높이가 조절되어 개폐가 제어되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지 장치. - 시료 용액을 시료실에 투입하는 제1단계;
상기 시료실에 투입된 시료 용액을 멤브레인 필터가 포함된 필터공간부로 주입하여, 상기 시료 용액에 포함된 세포는 거르고, 용액은 폐액 챔버로 흘려보내는 제2단계;
세척실에 투입된 세척액을 상기 필터공간부로 주입하여 상기 필터공간부를 세척액 환경으로 전환시키는 제3단계;
세포분해수단을 이용하여 상기 멤브레인 필터에 걸려진 세포를 분해하여 핵산을 용출시키는 제4단계;
전기영동수단을 이용하여 상기 용출된 핵산을 마이크로유체 채널을 통해 이송하여 수집 챔버에 수집하는 제5단계;를 포함하며,
밸브수단에 의해 상기 시료 용액의 주입, 상기 세척액의 주입, 상기 세포의 분해 및 상기 핵산의 이송 과정에서 상기 시료실, 세척실, 마이크로유체 채널 및 폐액 챔버는 상기 필터공간부로부터 선택적으로 개폐되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지를 이용한 시료 전처리 방법. - 제 14항에 있어서, 상기 시료실 및 세척실의 하단부 또는 상기 세척실의 하단부에는 실링막이 형성되고, 상기 실링막 하측에 펀쳐(puncher)가 형성되어 압력에 의해 상기 시료실 및 세척실은 순차적으로 개방되거나 상기 세척실이 개방되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지를 이용한 시료 전처리 방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 세포분해수단은,
상기 필터공간부 일측에 형성되며, 히팅부 및 초음파발생부 중 어느 하나 이상으로 구현되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지를 이용한 시료 전처리 방법. - 제 14항에 있어서, 상기 전기영동수단은,
상기 시료 챔버 일측에 형성된 기준 전극;
상기 마이크로유체 채널에 형성된 핵산의 농축 및 이동을 위한 워킹 전극;을 포함하여 상기 기준 전극 및 워킹 전극 사이에 전압이 인가되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지를 이용한 시료 전처리 방법. - 제 17항에 있어서, 상기 워킹 전극은,
상기 마이크로유체 채널의 길이 방향을 따라 복수개로 이격되어 배치된 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지를 이용한 시료 전처리 방법. - 제 18항에 있어서, 상기 워킹 전극의 위치에 대응되어 선택적으로 수집 챔버가 형성되고, 상기 워킹 전극의 위치 중 어느 하나에 대응되어 불순물을 수집하는 폐기구가 형성된 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지를 이용한 시료 전처리 방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 폐기구는,
상기 폐액 챔버와 연결되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지를 이용한 시료 전처리 방법. - 제 14항에 있어서, 상기 수집 챔버의 일측에는,
외부에서 핵산을 추출하기 위한 추출구가 형성된 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지를 이용한 시료 전처리 방법. - 제 14항에 있어서, 상기 밸브수단은,
공압 방식, 기계 방식 및 유압 방식 중 어느 하나로 구현되며, 상기 필터공간부 및 마이크로유체 채널 사이 또는 상기 필터공간부 및 폐액 챔버 사이에 형성된 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지를 이용한 시료 전처리 방법. - 제 14항에 있어서, 상기 밸브수단은,
공압 방식, 기계 방식 및 유압 방식 중 어느 하나로 구현되며, 상기 필터공간부와 시료실 사이, 상기 필터공간부 및 세척실 사이, 상기 필터공간부 및 폐액 챔버 사이 및 상기 필터공간부 및 마이크로유체 채널 사이에 형성되어 선택적으로 개폐되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지를 이용한 시료 전처리 방법. - 제 22항 또는 제 23항에 있어서, 상기 공압 방식의 밸브수단은,
각 위치에 멤브레인 범퍼(bumper)가 형성되어, 공압 변화에 따라 상기 멤브레인 범퍼의 높이가 조절되어 개폐가 제어되는 것을 특징으로 하는 시료 전처리 카트리지를 이용한 시료 전처리 방법.
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