KR20070027507A - 핵산 서열 증폭 및 검출 과정을 수행하기 위한 진단 시스템 - Google Patents
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Abstract
세포 및/또는 입자를 함유하는 유체 샘플에 대해 샘플 제조 과정을 수행하기 위한 통합된 칩상 실험실형 진단 시스템으로서, (a) 유체 샘플용 입구; (b) 유체 샘플 내에 함유된 세포 및/또는 입자의 용해를 위한 용해 유닛; (c) 유체 샘플 내에 함유된 세포 및/또는 입자로부터 핵산을 추출하기 위한 핵산 추출 유닛; (d) 용해 유체를 함유하는 저장소; 및 (e) 핵산 추출 유닛 내에 수집된 핵산을 제거하기 위한 용리제를 함유하는 저장소를 포함하며, 샘플 입구가 용해 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되며, 용해 유닛이 핵산 추출 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되며, 용해 유체를 함유하는 저장소가 용해 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되며, 용리제를 함유하는 저장소가 핵산 추출 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되는 시스템이 개시되어 있다.
Description
본 발명은 핵산(NA) 추출, 및 보다 구체적으로는 조합된 NA 추출 및 농축을 수행하기 위한 통합된 칩상 실험실(lab-on-a-chip)형 진단 시스템에 관한 것이다. 본 시스템은 세포를 함유하는 유체 샘플 상에서 NA 서열 증폭 및 검출 과정을 수행하는 데 사용될 수 있다.
미숙련된 사용자들도 과도한 오차 없이 복잡한 검정 과정을 수행할 수 있도록 하는, 생물학적 분자 검출을 위한 간편화된 검정 시스템을 개발하는 데 상당한 관심이 집중되어 왔다. 또한, 액체 시약을 최소로 취급해야 하고, 검정 과정이 사용자가 최소로 개입하여 수행될 수 있도록 자동화될 수 있으며, 바람직하게는 현장 검사(point-of-care)를 위한 편리한 시스템을 제공하도록 소형화된, 내장형(contained) 검정 시스템을 개발하는 데 많은 노력이 있어 왔다. 이는 특히 건강관리 분야, 특히 진단에 관련된 것이며, 이 분야에서는 의사의 수술, 임상, 수의학적 수술 또는 심지어 환자의 집 또는 현장에서 효율적이고 안전하게 작동될 수 있는 생물학적 검정 시스템에 대한 요구가 증가되고 있다.
미세제작된 "칩상 실험실" 장치는, 사용자에 의해 다루어지는 최소한의 시약을 요하며 소량의 샘플 용량을 사용할 수 있는 내재된 생물 반응을 수행하는 데 매력적인 수단이며, 고가의 시약을 요하는 생물 반응에 대해 현저한 이점이 있다.
정제 및 사전농축 모두를 수행하기 위해, 분석 화학자들은 일반적으로 일부 종류의 추출 과정에 의존해 왔다. 이러한 방법에는, 샘플 매트릭스로부터 주목하는 분석물을 제거하거나, 대안적으로 샘플 매트릭스로부터 주목되는 분석물은 남겨두고 다른 모든 종을 제거하는 것이 포함된다. 추출 과정에는 하나의 액체 상에서부터 다른 상으로 종을 이동시키거나, 액체 상으로부터 고체 표면으로 종을 포획시키는 것이 포함될 수 있다. 전자의 경우에는, 용매가 그러한 종을 함유하는 상으로부터 능동적으로 제거되지 않으면 종의 사전농축은 일반적으로 수행되지 않는다. 그러나, 후자의 경우에는, (a) 유효한 결합 영역이 표면과 접촉하는 용액 내에 존재하는 분자보다 더 많은 수의 분자와 한번에 결합하기에 충분히 크고 (b) 종이 단지 소량의 용리제를 이용하여 고체 상으로부터 효율적으로 제거될 수 있다면, 사전농축이 수행될 수 있다. 사전농축은 핵산 샘플 사전처리 과정의 중요한 부분이기 때문에, 고체상 추출이 채택될 수 있다. 잘 확립된 핵산 추출 방법은 무질서유발제(chaotropic agent)의 존재하에 DNA를 실리카 입자에 결합시키는 것을 포함한다 [참조: Boom et al, J. Clin. Microbiol. 1990, 28, 495-503]. 본 발명은 DNA에 대한 고체상 추출 방법을 미세유동 장치로 통합시키는 것을 포함한다.
본 발명에서는, NA 추출 및 농축이 조합될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "미세제작된 장치 또는 시스템"은, 일반적이나 배타적이지는 않게, 반도체 미세전자 장치의 회분식 제조, 및 최근에는 반도체 미소기계 장치의 제조에 사용되고 있는 공정들을 이용하여 제조된 임의의 장치를 의미한다. 그러한 미세제작 기술에는, 예를 들어 에피택셜 성장(epitaxial growth)(예를 들어, 기체 상, 액체 상, 분자 빔, 금속 유기 화학적 증기 증착), 리소그래피(예를 들어, 광-, 전자빔-, X선, 이온빔-), 에칭(예를 들어, 화학적, 기체 상, 플라즈마), 전기증착, 스퍼터링, 확산 도핑 및 이온 주입법이 포함된다. 유리와 같은 비결정성 재료가 사용될 수 있지만, 미세제작된 장치는 일반적으로 실리콘 또는 비화갈륨과 같은 결정성 반도체 기판 상에서 형성되는데, 이 경우 전자 회로가 종래의 집적 회로 제작 기술을 이용하여 시스템 내로 통합될 수 있다는 이점이 있다. 미세제작된 부품과, 유리 기판과 같은 하나 이상의 기타 부재 또는 상보적인 미세제작된 부재의 조합체가 빈번하게 사용되며, 이는 본원에서 사용된 용어 "미세제작된"의 범주에 포함된다. 또한, 예를 들어 결정성 반도체 기판으로부터 제조된 고분자 복제물(polymeric replicas)이 상기 용어 "미세제작된"의 범주에 포함된다.
세균 세포 및 바이러스 입자로부터 DNA 및/또는 RNA를 분리하고 정제하는 것은, 예를 들어 진단, 환경 감시, 법의학 및 분자 생물학적 연구와 같은 다수의 기술 영역에서 매우 중요한 단계이다.
미세제작은, 극소량의 샘플 용량이 요망된다는 이유로, DNA 서열 분석 및 검출과 같은 생물학적 공정을 수행하기 위한 장치를 제조하는 데 있어 매력있는 제작 방법이다.
중합효소 연쇄 반응(PCR) 후에 검출 단계를 수행하기 위한 하나의 장치가 미국 특허 제 5,674,742호에 개시되어 있다. 상기 특허에서는, 램파(lamb wave) 펌프가, PCR 공정을 실시하도록 요구되는 경우에, 반응 챔버의 온도를 요구에 따라 순환시키면서, DNA 프라이머, 중합효소 시약 및 누클레오타이드 시약을 3개의 개별 저장 챔버로부터 하나의 단일 반응 챔버로 이동시키는 데 사용된다.
화학 반응 단계 후에 전기영동 분리 단계를 실시하기 위한 또 다른 미세제작된 장치가 문헌 (참조: Analytical Chemistry 1994, 66, 4127-4132)에 개시되어 있다. 상기 특허에서는, 유리판으로 덮혀진 실리콘 기판 내의 에칭된 구조가 반응 챔버 및 완충액, 분석물, 시약 및 분석 폐기물 저장소로의 연결부 뿐만 아니라, 폐기물 저장소로 연결된 전기영동 컬럼을 제공한다.
핵산 서열 기초 증폭법 (NASBA)은 일정한 온도에서 단일 혼합물 중에서 핵산을 연속적으로 증폭시키는 데 사용할 수 있는 프라이머-의존적인 기술 (등온 핵산 증폭법)이며, 이는 최초의 RNA 전사 기초 증폭법 중의 하나로 기술되었다. NASBA는 일반적으로 핵산 증폭을 위한 PCR에 대한 간편하고 신속한 대안을 제공하며, 이는 90분 내에 10억 배의 RNA 증폭을 제공할 수 있다. PCR 기법과 같은 다른 증폭 시스템에 대하여, RNA 분석물을 균일하고 등온적으로 증폭시키는 NASBA의 능력은 이의 적용 범위를 바이러스 진단에서부터 유전자 발현 및 세포 생사판별(cell viability)과 같은 생물학적 활성의 지표로까지 확장시킨다. NASBA 기술은, 예를 들어 문헌 (참조: Nature volume 350 pages 91-92)에 논의되어 있다. NASBA에서의 핵산 증폭은, 프라이머 쌍과 함께, AMV 역전사효소, Rnase H 및 T7 RNA 중합효소의 조화된 효소 활성에 의해 수행되어, 결과적으로 하이브리드 형성법에 의한 검출에 대해 용이하게 사용될 수 있는 주로 단일 가닥의 RNA를 축적시키게 된다. NASBA에 대한 내부 RNA 표준의 적용은, 4로그의 동적 범위를 지니며 정량화 당 6회의 증폭 반응을 요하던 정량적인 핵산 검출 방법에 귀결된다. 이러한 방법은 다양한 양으로 첨가된 다중의 구별가능한 내부 RNA 표준의 적용에 의해 그리고 전기화학적발광(ELC) 검출 기술에 의해 극적으로 개선된다. 이러한 원-튜브 정량적(Q) NASBA는 정량화 당 단 한 단계의 증폭 공정만을 필요로 하며, 핵산의 실제적 분리 전에 용해 완충액(lysis buffer) 중의 임상 샘플에 내부 표준을 첨가할 수 있게 한다. 이러한 접근법은 핵산 분리 효율이 정량화 결과에 영향을 미치지 않는다는 이점이 있는 데, 이는 내부 표준을 임상 샘플로부터 분리시킨 후에 야생형 핵산과 혼합시키는 방법과 대조되는 것이다. 정량적 NASBA는 문헌 (참조: Nucleic Acid Research (1998) volume 26, pages 2150-2155)에 논의되어 있다. 그러나, 일반적으로 효소 비드에 기초한 검출 및 전기화학적 발광(ECL) 검출 또는 형광 상관 분광광도법(fluorescent correlation spectrophotometry)을 포함하는 후-NASBA 생성물 검출은 여전히 노동 집약적인 과정일 수 있다. 그러나, 이들 방법론은 불균일하거나, 현재 비용 효율적이지 않은 자동화 장치 또는 일부 샘플 조작을 요하기 때문에, 이들은 높은 처리량의 용도에 대해서는 상대적으로 거의 사용되고 있지 않다. 표적 특이적인 신호의 발생에 의해 표적 증폭과 동시에 생성물 검출이 이루어지는 균일한 과정은 대규모 스크리닝 및 충분한 자동화를 용이하게 할 것이다. 최근에는, 이들의 표적과 함께 단지 하이브리드 형성하는 경우에만 형광을 발하는 프로브 (분자 비콘)에 기초한 신규한 핵산 검출 기술이 도입되었다.
유체공학은, 예를 들어 튜브에서의 액체 흐름에 관한 과학이다. 미세제작된 장치에 있어서, 마이크로 또는 나노 크기의 반응 챔버의 하나 이상의 세트를 통한 유체 흐름은, 시린지와 같은 펌프, 회전 펌프, 또는 장치의 외부에 위치한 사전충전된 진공 또는 압력 공급원을 이용하여 일반적으로 달성된다. 대안적으로, 마이크로 펌프 또는 진공 펌프, 또는 램파 펌핑 장치가 장치 자체의 일부로서 제공될 수 있다. 펌프, 밸브 및 사전충전된 진공 및 압력 챔버를 포함하는 흐름 제어 부재의 기타 조합체가 반응 챔버를 통한 유체 흐름을 조절하는 데 사용될 수 있다. 시스템 내에서 유체를 이동시키기 위한 기타 메커니즘에는 전기-삼투압 흐름이 포함된다.
국제 특허출원 공개 번호 제 WO 02/22265호는 NASBA를 수행하는 방법에 사용될 수 있는 미세제작된 반응 챔버 시스템에 관한 것이다. 국제 특허 출원번호 제PCT/GB02/005945호는 미세제작된 반응 챔버 시스템, 및 유체 이동 방법에 관한 것이다. 상기 시스템은 또한 NASBA를 수행하는 방법에도 사용될 수 있다. 국제 특허 출원번호 제 PCT/GB03/004768호는 핵산 단편화를 위한 미세유동 장치에 관한 것이다. 상기 장치는 NASBA를 수행하기 위한 미세제작된 반응 챔버 시스템과 함께 또는 이 내에서 사용될 수 있다.
본 발명은, 세포 및/또는 입자를 함유하는 유체 샘플에 대해 샘플 제조 과정을 수행하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템이
(a) 유체 샘플용 입구;
(b) 유체 샘플 내에 함유된 세포 및/또는 입자의 용해를 위한 용해 유닛;
(c) 유체 샘플 내에 함유된 세포 및/또는 입자로부터 핵산을 추출하기 위한 핵산 추출 유닛;
(d) 용해 유체를 함유하는 저장소; 및
(e) 핵산 추출 유닛 내에 수집된 핵산을 제거하기 위한 용리제를 함유하는 저장소를 포함하며,
샘플 입구가 용해 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되며,
용해 유닛이 핵산 추출 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되며,
용해 유체를 함유하는 저장소가 용해 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되며,
용리제를 함유하는 저장소가 핵산 추출 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되는 시스템에 관한 것이다.
상기 시스템은 일반적인 진단을 위한 밀리리터 수준의 샘플 용량에 대해 사용될 수 있다. 또한 상기 시스템은 사전로딩되는 특정 시약에 의존한다.
본 발명에서는, 핵산 추출과 농축이 조합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 샘플 제조 공정을 수행하기 위한 통합된 "칩상 실험실형" 진단 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 NASBA를 수행하기 위한 미세제작된 반응 챔버 시스템과 함께 또는 이 내에서 사용될 수 있다.
상기 시스템의 부품중 적어도 일부가 바람직하게는 미세제작된다. 바람직하게는, 용해 유닛, 핵산 추출 유닛, 용해 유체 저장소 및 용리제 저장소가 미세제작되어 통합, 즉 공통의 기판 상에 형성된다.
용해 유체를 함유하는 저장소는 바람직하게는 입구와 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공된다.
용리제를 함유하는 저장소는 바람직하게는 입구와 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공된다.
본 발명에 따른 시스템은 일반적으로 (g) 핵산 반응 유닛을 추가로 포함할 것이며, 핵산 추출 유닛이 상기 핵산 반응 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공된다. 바람직하게는, 핵산 반응 유닛은 미세제작되며, 바람직하게는 다른 부품과 통합된다. 임의의 통상적인 반응이 반응 유닛 내에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 반응에 의해 특이적인 표적 서열의 검출 및/또는 정량적인 분석이 실시될 수 있을 것이다. 핵산 반응 유닛은 일반적으로 핵산 서열 증폭 및 검출 유닛을 포함할 것이며, 이로써 핵산 증폭 반응에 의해 특이적인 서열이 검출될 수 있다. 이의 예로는, PCR, 및 NASBA와 같은 등온 증폭 기법이 있다. 가장 바람직한 것은 분자 비콘을 이용하는 실시간 NASBA이다. 따라서, 바람직한 일 양태에서, 본 발명은 샘플의 제조, 세포 및/또는 입자를 함유하는 유체 샘플에 대해 핵산 서열 증폭 및 검출 공정을 수행하기 위한 통합된 "칩상 실험실형" 진단 시스템을 제공하는 것이며, 더욱 바람직하게는 실시간 NASBA를 제공하는 것이다. 국제 특허출원 공개 번호 제 WO 02/22265호에는 NASBA를 수행하기 위한 미세제작된 반응 챔버 시스템이 기술되어 있다.
본 발명에 따른 시스템은, 예를 들어 감염된 상피 세포의 농축, mRNA의 용해 및 추출, 및 실시간 증폭 및 검출을 바람직하게 포함한다.
상기 시스템은, 예를 들어 자궁경부 암종을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시스템은 일반적으로 (h) 폐기물 유닛을 추가로 포함할 것이며, 상기 폐기물 유닛은 용해 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공된다. 바람직하게는, 폐기물 유닛이 미세제작되며, 바람직하게는 다른 부품과 통합된다.
상기 시스템은 일반적으로 (i) 세척용 용매를 함유하는 저장소를 추가로 포함할 것이며, 상기 저장소는 핵산 추출 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공된다. 바람직하게는, 세척용 용매를 함유하는 저장소가 미세제작되며, 이는 바람직하게는 다른 부품과 통합된다. 세척용 용매는 임의의 적합한 용매로부터 선택될 수 있으나, 용이하게 증발할 수 있는 용매, 예를 들어 에탄올이 바람직하다.
상기 시스템은 일반적으로 (j) 세척용 용매를 함유하는 저장소를 추가로 포함할 것이며, 상기 저장소는 핵산 추출 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 위해 임의적인 밸브가 제공된다. 바람직하게는, 세척용 용매를 함유하는 저장소가 미세제작되며, 이는 바람직하게는 다른 부품과 통합된다. 세척용 용매는 임의의 적합한 용매로부터 선택될 수 있으나, 용이하게 증발할 수 있는 용매, 예를 들어 이소프로판올이 바람직하다.
용리제를 함유하는 저장소는 제 1 세척용 용매(예를 들어, 에탄올)를 함유하는 저장소, 및/또는 제 2 세척용 용매(예를 들어, 이소프로판올)를 함유하는 저장소와 유체 소통되는 것이 유리하다.
보다 유리하게는, 용리제, 제 1 세척용 용매(예를 들어, 에탄올) 및/또는 제 2 세척용 용매(예를 들어, 이소프로판올)가 공통의 저장소 내에 함유된다. 이는 용리제, 제 1 세척용 용매 및/또는 제 2 세척용 용매를 공통의 저장소 내에서, 예를 들어 공기와 같은 유체를 이용함으로써 서로 분리시킴으로써 달성될 수 있다. 그러나, 이들 유체가 용리제, 제 1 세척용 용매 및/또는 제 2 세척용 용매와 비혼화성이거나 적어도 사실상 비혼화성인 한, 기타 "분리용" 유체 (액체 또는 기체)가 사용될 수 있다.
바람직한 일 구체예에서, 용리제, 에탄올 및/또는 이소프로판올은 입구 및 용해 유닛과 유체 소통되는 도관 또는 채널 내에 함유된다. 용리제, 에탄올 및/또는 이소프로판올은, 예를 들어 공기 갭과 같은 유체 갭에 의해 분리될 수 있다.
상기 시스템은 일반적으로 (k) 유체 샘플 및/또는 공기를 입구로 도입시키기 위한 수단을 추가로 포함할 것이다. 상기 수단은 바람직하게는 펌프 또는 시린지를 포함한다. 대안적으로, 상기 수단은 입구 포트와 소통되는 하나 이상의 가변 용량 챔버를 포함할 수 있으며, 여기에서 가변 용량 챔버의 용량을 변화시키면 입구로 및/또는 입구 밖으로 유체 샘플의 흐름이 이루어지고/지거나 제한된다. 상기 가변 용량 챔버는 일반적으로 바닥 기판 내의 중공 리세스 위를 덮는 가요성 막을 포함한다. 국제 특허출원 번호 제 PCT/GB02/005945호에는 바람직한 유체 이동 시스템이 기술되어 있다.
상기 시스템은 유리하게는 단일 펌핑 시스템에 의해 구동될 수 있다.
용해 유닛은 임의의 적합한 형태 및 구성일 수 있으나, 이는 일반적으로 채널 또는 챔버 형태일 것이다. 용해 유닛은 바람직하게는 유체 샘플 내에 함유된 입자, 및 진핵 및 원핵 세포의 용해를 위한 것이다.
요망되는 경우, 상기 시스템은 여과 유닛을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 여과 유닛은 용해 유닛과 유체 소통된다. 여과 유닛은, 예를 들어 교차 흐름 필터 또는 중공 필터를 포함할 수 있다. 대안적으로, 용해 유닛은 자체적으로 유체 샘플을 여과시키는 수단을 추가로 포함할 수 있다. 상기 수단은, 예를 들어 교차 흐름 필터 또는 중공 필터를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 필터들은 용해 유닛과 통합될 수 있다.
요망되는 경우, 상기 시스템은 단편화 유닛을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 단편화 유닛은 용해 유닛과 유체 소통된다. 대안적으로, 용해 유닛은 자체적으로 유체 샘플을 단편화시키는 수단을 추가로 포함할 수 있다. DNA 또는 RNA의 무작위적인 단편화는 샘플 사전처리 단계로서 종종 필요하다. 단편화는 제한 효소를 이용하여 생화학적으로 수행될 수 있거나, 분자를 분해시키는 물리적 힘을 적용시킴으로써 수행될 수 있다 [참조: 예를 들어, P. N. Hengen, Trends in Biochem. Sci., vol. 22, pp. 273-274, 1997 and P. F. Davison, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, vol. 45, pp. 1560-1568, 1959]. 전단력에 의한 DNA 단편화는 대개 샘플을 짧은 수축부 내로 통과시키는 것을 포함한다. 바람직한 일 구체예에서, DNA 및/또는 RNA는 좁은 오리피스를 통해 펌핑시키는 경우에 분자의 급속한 스트레칭으로 인해 기계적인 힘 하에서 분해된다. 압력에 의해 구동되는 흐름은 전단력을 일으킬 수 있게 되고, 이러한 전단력은 핵산의 단편화를 유발시킨다. 국제 특허출원 번호 제 PCT/GB03/004768호에는 핵산 단편화를 위한 미세유동 장치가 기술되어 있다.
용해 유닛은 자체적으로 유체 샘플을 여과하기 위한 수단, 및 유체 샘플을 단편화하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.
상기 시스템은 용해 유닛 및/또는 핵산 추출 유닛의 내용물을 가열시키는 수단을 추가로 포함할 수 있다. 상기 수단은, 예를 들어, 용해 유닛 및/또는 핵산 추출 유닛에 인접하여 또는 그 내에 위치한 하나 이상의 펠티에(Peltier) 부재를 포함할 수 있다.
핵산 추출 유닛은 임의의 적합한 형태 및 구성을 지닐 수 있으나, 일반적으로는 채널 또는 챔버 형태일 것이다. 핵산 추출 유닛은 바람직하게는 유체 샘플 내에 함유된 입자, 및 원핵 및 진핵 세포의 추출을 위한 것이다.
핵산 추출 유닛은 실리카 비드 또는 입자로 적어도 부분적으로 충전될 수 있다. 하나 이상의 전극 세트가 용리된 핵산을 수집하고/하거나 사전농축시키기 위해 실리카 비드 또는 입자에 인접하여 제공될 수 있다. 하나 이상의 전극 세트는, 예를 들어 백금 전극을 포함할 수 있다. 따라서, 전극을 가로질러 전위 차를 인가시키기 위한 수단이 제공될 수 있다. 추출 세포는 바람직하게는 폴리(디메틸실록산)(PDMS)으로부터 형성되거나 이를 포함한다. 상기 유닛은 일반적으로 기판, 및 이 기판 위를 덮는 덮개를 포함할 것이며, 추출 유닛은 기판의 표면과 기판 덮개의 인접한 표면 내의 리세스에 의해 규정된다. 기판은 바람직하게는 실리콘 폴리(디메틸실록산)(PDMS)으로부터 형성된다. NA는 무질서유발제의 존재 하에 실리카 표면에 결합된다.
전극 (예를 들어, 백금 전극)의 통합은 칩상의 용리된 NA를 가역적으로 수집하고 사전농축시키는 데 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 조합된 핵산 추출 및 부화를 달성할 수 있게 된다.
바람직한 일 구체예에서, 핵산 추출 유닛은 실리카 비드가 충전된 폴리(디메틸실록산(PDMS) 채널을 포함한다.
상기 시스템 또는 적어도 이의 마스터 버전(master version)은 일반적으로 반도체 재료로부터 형성되거나 이를 포함할 것이나, 유전체 (예를 들어, 유리, 용융 실리카, 석영, 고분자 재료 및 세라믹 재료) 및/또는 금속 재료가 사용될 수도 있다. 반도체 재료의 예로는 하기한 것들 중 하나 이상이 포함된다: IV족 원소 (즉, 실리콘 및 게르마늄); III-V족 화합물 (예를 들어, 비화갈륨, 인화갈륨, 안티몬화갈륨, 인화인듐, 비화인듐, 비화알루미늄 및 안티몬화알루미늄); II-VI족 화합물 (예를 들어, 인화카드뮴, 셀렌화카드뮴, 인화아연, 셀렌화아연); 및 IV-VI족 화합물 (예를 들어, 인화납, 셀렌화납, 텔루르화납, 텔루르화주석). 실리콘 및 비화갈륨이 바람직한 반도체 재료이다. 상기 시스템은 반도체 미세전자 장치의 회분식 제조, 및 최근에는 반도체 미세기계 장치의 제조와 전통적으로 관련된 통상의 공정을 이용하여 제작될 수 있다. 그러한 미세제작 기술에는, 예를 들어 에피택셜 성장 (예를 들어, 기체 상, 액체 상, 분자 빔, 금속 유기 화학적 증기 증착), 리소그래피 (예를 들어, 광-, 전자 빔-, X선, 이온 빔-), 에칭 (예를 들어, 화학적, 기체 상, 플라즈마), 전기증착, 스퍼터링, 확산 도핑, 이온 주입법 및 미세기계가공법이 포함된다. 유리 및 고분자 재료와 같은 비결정성 재료가 또한 사용될 수 있다.
고분자 재료의 예로는 PMMA (폴리메틸 메틸아크릴레이트), COC (시클로 올레핀 공중합체), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, PL (폴리락티드), PBT (폴리부틸렌 테레프탈레이트) 및 PSU (폴리술폰), 또는 이들의 둘 이상의 배합물이 있다. 바람직한 중합체는 PDMS 또는 COC이다.
상기 장치/시스템은 일반적으로 통합적으로 형성될 것이다. 상기 장치/시스템은 공통의 기판 재료, 예를 들어 본원에서 정의된 반도체 재료 상에서 미세제작될 수 있으나, 예를 들어 유리와 같은 유전체 기판 재료 또는 세라믹 재료가 사용될 수 있다. 그러나, 공통의 기판 재료는 바람직하게는 플라스틱 또는 고분자 재료이며, 이의 적합한 예는 상기 기술되어 있다. 시스템은 바람직하게는, 예를 들어 실리콘 마스터의 복제물에 의해 형성될 수 있다.
소형화된 구조물에 대해 실리콘-유리 대신에 플라스틱을 이용하는 경우의 이점은 적어도 생물학적 용도에 대해서는 많다. 가장 큰 이점 중 하나는, 미세사출 성형, 고온 엠보싱 및 주조와 같은 방법을 이용하여 대규모로 제조하는 데 있어 비용 부담이 감소된다는 것이다. 복잡한 구조에 대해서는 100배 이상의 비용 감소 효과가 있다. 다층 분리된 금형 인서트(moulding insert)에 대해 구조물을 복제시킬 수 있다는 것은 설계 자유도에 매우 큰 융통성을 부여한다. 미세 세계와 거대 세계 사이를 상호연결시키는 것이 대다수의 경우에는 보다 용이한 데, 왜냐하면 이렇게 하는 것이 일반적으로 사용된 표준 부분들을 조합시키는 방법을 제공하기 때문이다. 조립 기법을 위해 다양한 접근법, 예를 들어 미세구조의 지지체와의 US-용접, 레이저 용접, 아교접착 및 라미네이션이 사용될 수 있다. 유리한 기타 특징은 표면 개질이다. 생물학적 분석을 위해 제안된 소형화된 구조는, 표면이 생체적합하다는 것이 중요하다. 플라즈마 처리 및 플라즈마 중합을 이용함으로써, 분류의 융통성 및 다양성이 코팅 내로 적용될 수 있다. 산 및 염기에 대한 화학적 내성은 용이하게 에칭되어 제거되는 실리콘 기판에 대해서보다 플라스틱에 대해서 훨씬 더 양호하다. 생체기술 분야에서 대부분의 검출 방법에는 광 측정이 포함된다. 따라서, 플라스틱의 투명도는 투명하지 않은 실리콘과 비교되는 주된 특징이다. 중합체 미세유동 기술은 "칩상 실험실"의 시장 내에서 현재 확립되어 있으나 여전히 성장 중인 분야이다.
본원에 기술된 미세제작된 시스템은 또한 나노제작된 장치를 포함한다.
실리콘 또는 반도체 마스터에 있어서, 가변 용량 챔버, 미세유동 채널, 반응 챔버, 및 정확한 미세규모 치수를 지닌 실리콘 기판 내에서의 유체 상호연결부 중 하나 이상을, 예를 들어 에칭시키거나 미세기계가공함으로써 형성시킬 수 있다. 이후, 플라스틱 복제물은 실리콘 마스터로 제조될 수 있다. 이러한 방식으로, 에칭되거나 기계가공된 미세구조를 지닌 플라스틱 기판은 임의의 적합한 수단 (예를 들어, 접착제를 이용하거나 가열에 의해)에 의해 덮개에 결합될 수 있다.
시스템에 사용된 임의적 밸브는 임의의 편리한 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 밸브들은 2개의 유닛을 연결하는 도관 또는 채널을 따라서 흐름을 간단하게 조절할 수 있다. 도관 또는 채널 내의 구멍에서 핀 장치의 작용에 의해 상승되거나 하강될 수 있는 피스톤 형태의 부재가 제공될 수 있다.
시스템의 사용에는 예를 들어 하기한 가능한 단계가 포함된다.
대안 1
(i) 간단한 수집 및 용해
(ii) mRNA의 추출 (수동 또는 자동 과정)
(iii) 실시간 증폭 및 검출 (바람직하게는 멀티플렉스)
대안 2
(iv) 단편화 유닛에는 샘플 용해 및 샘플 제조 모두가 포함될 수 있다.
(v) 실시간 증폭(NASBA) 및 검출 (바람직하게는 멀티플렉스).
본 발명은 또한, 본원에 기술된 통합된 칩상 실험실형 진단 시스템의 제조 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
A. 기판의 표면에, 입구 리세스, 용해 유닛 리세스, 핵산 추출 유닛 리세스, 용해 유체 저장소 리세스, 및 용리제 저장소 리세스를 제공하는 단계;
B. 덮개를 제공하는 단계; 및
C. 기판에 덮개를 결합시켜 (a) 입구, (b) 용해 유닛, (c) 핵산 추출 유닛, (d) 용해 유체 저장소, 및 (e) 용리제 저장소를 형성시키는 단계로서, 이들 각각의 장소가 상기한 기판 표면 내의 각각의 리세스와, 덮개의 인접한 표면에 의해 규정되는 단계.
본원에 사용된 용어 리세스는 또한, 예를 들어 홈, 슬롯, 구멍, 트렌치 및 채널, 또는 이들의 일부를 포함하는 다양한 특징을 포함한다.
상기 방법은 덮개를 기판에 결합시키기 전 또는 후에 용해 유체를 용해 유체 저장소로 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 덮개를 기판에 결합시키기 전 또는 후에 용리제를 용리제 저장소로 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 덮개를 기판에 결합시키기 전 또는 후에 에탄올을 용리제 저장소로 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 덮개를 기판에 결합시키기 전 또는 후에 이소프로판올을 용리제 저장소로 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
용리제, 및/또는 에탄올 및/또는 이소프로판올은 유체, 바람직하게는 공기에 의해 서로 분리되는 것이 바람직하며, 임의의 비혼화성 유체 (액체 또는 기체)가 사용될 수도 있다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
덮개를 기판에 결합시킨 후에 용리제를 용리제 저장소로 도입시키는 단계;
제 1 용량의 공기를 용리제 저장소로 도입시키는 단계;
에탄올을 용리제 저장소로 도입시켜, 에탄올을 상기한 제 1 용량의 공기에 의해 용리제로부터 분리시키는 단계;
제 2 용량의 공기를 용리제 저장소로 도입시키는 단계; 및
이소프로판올을 용리제 저장소로 도입시켜, 이소프로판올을 상기한 제 2 용량의 공기에 의해 에탄올로부터 분리시키는 단계.
기판은, 예를 들어 실리콘으로부터 형성될 수 있으며, 기판 위를 덮는 덮개는 예를 들어 유리로부터 형성될 수 있다. 이 경우에, 유리 덮개가, 임의적으로는 기판 표면 상에 형성된 산화실리콘 재질의 중간층을 통해, 실리콘 기판의 음극에 결합되는 것이 바람직하다. 실리콘 내의 리세스는 반응성 이온 에칭을 사용하여 형성될 수 있다. 고분자 재료와 같은 기타 재료가 또한 기판 및/또는 덮개에 대해 사용될 수 있다. 그러한 재료는, 예를 들어 실리콘 복제물을 이용하여 제작될 수 있다. 대안적으로, 상기 장치는 밀링 및 전기-방출 기계가공(EDM)에 의해 금형 인서트를 구조화시키고, 칩 부품을 사출 성형시킨 다음, 중합체 부품을 기계적 후가공, 예를 들어 드릴링시키고, 밀링시키고, 바리제거(debarring)시킴으로써 제작될 수 있다. 상기 과정에 후속하여 필터의 삽입, 용매 결합 및 유동 연결부의 장착이 실시될 수 있다.
고분자 재료의 예로는 PMMA (폴리메틸 메틸아크릴레이트), COC (시클로 올레핀 공중합체), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, PL (폴리락티드), PBT (폴리부틸렌 테레프탈레이트) 및 PSU (폴리술폰), 또는 이들의 둘 이상의 배합물이 있다. COC가 바람직하다.
바람직하게 그리고 특히 세포 내용물을 광학적으로 관찰해야 하는 경우에는, 기판 위를 덮는 덮개가 광학적으로 투명한 물질 또는 재료, 예컨대 유리, 파이렉스 또는 COC로 제조된다.
하나 이상의 기타 부재, 예컨대 유리판 또는 상보적인 미세제작된 부재와 미세제작된 부품의 조합체가 빈번하게 사용되며, 이는 본원에 사용된 용어 "미세제작된"의 범주에 포함된다.
기판 기부의 일부 또는 전부에 일반적으로 1㎛ 이하, 바람직하게는 0.5㎛ 미만의 두께로 된 코팅이 제공될 수 있다. 코팅은 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 소혈청 알부민 (BSA), 트윈스 및 덱스트란을 포함하는 군의 하나 이상으로부터 형성된다. 바람직한 덱스트란은 분자량이 9,000 내지 200,000, 특히 바람직하게는 분자량이 20,000 내지 100,000, 특히 분자량이 25,000 내지 75,000, 가장 바람직하게는 분자량이 35,000 내지 65,000인 것들이다. 트윈스 (또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄)는 시그마 알드리히 컴퍼니(Sigma Aldrich Company)로부터 입수가능한 임의의 것일 수 있다. PEG는 코팅 수단으로서 단독으로 또는 조합되어 사용하기에 바람직하다. PEG에는, 순수한 폴리에틸렌 글리콜, 즉 화학식 HO-(CH2CH2O)n-H (여기서, n은 정수이다)이고 일반적으로 200 - 10,000, 특히 1,000 - 5,000의 분자량을 제공할 수 있는 순수한 PEG; 또는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 올리고머가 동종이작용기, 예를 들어 인산염 잔기 또는 방향족 공간기에 의해 연결되는 화학적으로 개질된 PEG;가 포함된다. 특히 바람직한 것은 FK108 (인산염을 통해 또 다른 폴리에틸렌 글리콜 사슬로 연결된 폴리에틸렌 글리콜 사슬)로 공지된 폴리에틸렌 글리콜; 및 시그마 알드리히 컴퍼니로부터 제품 P2263으로서 시판되는 PEG이다. 세포/챔버, 입구, 출구, 및/또는 채널의 표면에 상기와 같이 코팅을 도포함으로써, 시스템을 통한 유체 흐름을 개선시킬 수 있다. 특히, 샘플은 그러한 표면에 덜 접합되거나 덜 고착되기 쉽다. PEG 코팅이 바람직하다.
실리콘 또는 반도체 마스터에 있어서, 가변 용량 챔버, 미세유동 채널, 반응 챔버, 및 정확한 미세규모 치수를 지닌 실리콘 기판 내에서의 유체 상호연결부 중 하나 이상을, 예를 들어 에칭시키거나 미세기계가공함으로써 형성시킬 수 있다 [반응성 이온 딥-에칭(Deep reactive ion etching (DRIE))이 바람직한 기법임]. 이후, 플라스틱 복제물은 실리콘 마스터로 제조될 수 있다. 이러한 방식으로, 에칭되거나 기계가공된 미세구조를 지닌 플라스틱 기판은 임의의 적합한 수단 (예를 들어, 접착제를 이용하거나 가열에 의해)에 의해 덮개에 결합되어, 둘러싸여진 단편화 세포(들), 입구(들), 출구(들) 및 연결 채널(들)을 형성할 수 있다.
상기 장치는 기판의 상부 표면 내에 목적하는 미세구조가 형성되어 있는 기판을 포함한다. 기판은, 예를 들어 실리콘, 또는 실리콘 마스터의 복제에 의해 형성된 플라스틱 기판일 수 있다. 기판의 상부 표면이 덮개에 결합되어, 일련의 유닛/세포, 입구, 출구 및/또는 채널이 형성된다. 덮개는, 예를 들어 플라스틱 또는 유리로부터 형성될 수 있다. 덮개는 바람직하게는 투명하며, 이것을 통해 유체를 관찰할 수 있다. 일반적으로, 상기 장치는 높은 어스펙트 비(aspect ratio)로 압축시키기 위해 실리콘을 반응성 이온 딥 에칭(DRIE)시킨 다음, 유리 덮개를 음극에 결합시킴으로써 제작되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 상기 장치는 밀링 및 전기-방출 기계가공(EDM)에 의해 금형 인서트를 구조화시키고, 칩 부품을 사출성형시킨 다음, 중합체 부품의 기계적 후가공을, 예를 들어 드릴링시키고, 밀링시키고, 바리제거시킴으로써 제작될 수 있다. 상기한 과정에 후속하여 필터의 삽입, 용매 결합 및 유동성 연결부의 장착이 실시될 수 있다.
핵산 샘플은, 예를 들어 생물학적 유체, 유제품, 환경 유체 및/또는 음용수로부터 취하거나 이들로부터 유래할 수 있다. 그 예로는, 혈액, 혈청, 타액, 소변, 우유, 음용수, 해수 및 샘물이 있다. 예를 들어 혈액 및 우유와 같은 다수의 복잡한 생물학적 샘플에 있어서, 당업자가 샘플 내의 세균 세포 및 바이러스 입자로부터 DNA 및/또는 RNA를 분리하고 정제할 수 있기 전에, 먼저 바이러스 입자 및 세균 세포를 샘플 내의 다른 입자로부터 분리시킬 필요가 있다. 또한, 세균 세포벽 또는 바이러스 단백질 코팅을 분해시키고 핵산을 분리시키는 처리 전에, 세균 세포 및 바이러스 입자를 농축, 즉 출발 물질의 용량을 감소시키기 위해서 부가적인 샘플 제조 단계를 실시할 필요가 있을 수 있다. 이것은, 출발 물질이 고용량의, 예를 들어 상대적으로 소량의 세균 세포 또는 바이러스 입자를 함유하는 수용액으로 이루어지는 경우에 있어서 중요하다. 이러한 유형의 출발 물질은, 음용수에서 세균 오염의 일반적인 감시와 같은 환경 시험 용도에서 일반적으로 보여진다.
상기 시스템은 바람직하게는 10-100㎖의 샘플 용량에 맞게 설계된다.
본 발명은 또한 생물학적 및/또는 환경학적 샘플을 분석하기 위한 장치로서, 상기 장치가 본원에서 기술된 시스템을 포함하는 장치를 제공한다. 상기 장치는 일회용 장치일 수 있다.
본 발명은 또한 생물학적 및/또는 환경학적 샘플을 분석하기 위한 분석 키트로서, 상기 키트가 본원에서 기술된 시스템 및 상기 시스템과 샘플을 접촉시키는 수단을 포함하는 분석 키트를 제공한다. 상기 분석 키트는 일회용 키트일 수 있다.
도 1은 본 발명에 사용하기 위한 일회용 중합체 칩 장치 내로 평탄 막을 통합시키는 데 사용된 샌드위치 배치의 개략도이다.
도 2는 본 발명에 따른 시스템과 함께 사용하기 위한 밸브 설계의 개략도이다.
도 3a 내지 3d는 본 발명에 따른 시스템과 함께 사용하기 위한 밸브 설계의 개략도이다.
도 4는 본 발명에 따른 비드 챔버의 가능한 배치의 개략도이다.
도 5는 용해 완충액 (도 5a) 및 추출 유체 (도 5b)로 충전되어 있는, 본 발명에 따른 시스템 설계의 개략도이다.
도 6은 본 발명의 바람직한 일 구체예에 따른 칩 배치의 개략도이다.
도 7은 본 발명에 따른 또 다른 바람직한 구체예에 따른 시스템 설계의 개략도이다.
도 8은 실시예에 관한 것이다.
도 9는 실시예에 관한 것이다.
본 발명을 첨부되는 도면을 참조로 실시예를 이용하여 지금부터 설명할 것이다.
본 발명에 따른 플라스틱 칩 설계구조에는 바람직하게 공급 채널, 반응 챔버 및 미세유동 조작 시스템이 내장되어 있고, 이러한 칩은 시클로올레핀 공중합체 (COC)의 사출 성형에 의해 가공되는 것이 바람직하다. 예를 들어 12-채널 칩에 대한 금형 인서트는 높은 정확도로 밀링시킴으로써 제조될 수 있다. 검출 용량은 일반적으로 대략 80 nL (400 ×2000 ×100㎛)이다. 상기 플라스틱 칩은 바람직하게는 먼저 산소 플라즈마로 활성화시킨 다음, 5% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액 (미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마 케미컬 코포레이션 사 제품)으로 코팅된다. 코팅 후에, 칩을, 예를 들어 비시클로헥실을 이용하여 용매 용접시킴으로써 대략 75㎛의 COC 막으로 밀봉시킬 수 있다. 얇은 금 층(대략 25nm)을 칩의 후면에 바람직하게 증착시켜, 펠티에 부재의 최상부 상의 열 패드가 배경 형광(background fluorescence)되는 것을 방지한다.
필요한 경우, 펠티에 부재를 샘플 홀더 내로 통합시켜, 플라스틱 칩의 열 조절을 제공할 수 있다. 알루미늄 블럭은 펠티에 부재의 최상부에 놓여져서 칩에 대한 열의 균일한 분포를 보장한다. 열 패드는 칩과 가열원 사이에서 열 접촉이 이루어지도록 알루미늄 블럭 상에 장착되는 것이 바람직하다. 열전쌍은, 일반적으로 공기 온도를 측정하고 펠티에 부재로의 피드백 회로를 구비하는 샘플 홀더 상에 위치하게 될 것이다. 온도 조절은 랩탑 상에서 외부적으로 조절될 수 있다.
상기 기술한 바와 같이, NASBA는 임의의 단일 가닥 RNA 서열을 증폭시키기 위해 구체적으로 설계된 등온 (대략 41℃) 증폭 방법이다. NASBA 반응은 특이적인 바이러스성 RNA, 다른 감염성 또는 병원성 제제의 RNA 또는 특정 세포성 RNA의 존재를 검출하는 것과 같은 광범위한 용도로 적용될 수 있다. 3개의 효소, 즉 AMV 역 전사효소, RNase H 및 T7 RNA 중합효소의 동시 활성이 증폭 반응에서 핵심 기술을 이룬다. 2개의 올리고누클레오타이드 프라이머가 반응의 특이성과 표적 RNA에 대해 특이적인 형광성 분자 비콘 탐침을 결정한다. 대략 90분 내에, 주목되는 핵산 서열이 109개 초과의 복제물로 증폭될 수 있다. 광 검출 유닛은 반응 챔버 내의 형광발색단을 약 494nm에서 여기시키고, 대략 525nm에서 방출된 형광 광을 검출하도록 설계되는 것이 바람직하다. 여기된 광은 이것이 렌즈를 통해 조준되기 전에 광대역 필터(465nm 내지 500nm)를 이용하여 여과될 수 있다. 동일한 프레넬 렌즈가 형광 광의 조명 및 수집을 위한 집광에 사용될 수 있다. 또 다른 렌즈가 형광 광을 검출기 표면 (예를 들어, 광자증배관-튜브) 상으로 집광시키는 데 사용될 수 있다. 검출된 신호의 데이터 수집 및 준비는 매트랩(MATLAB) 6.0.088 릴리즈(Release) 12 [메사추세츠 내틱에 소재한 더 매쓰웍스 인코포레이티드(The MathWorks, Inc.) 사 제품]를 이용하여 랩탑 상에서 처리될 수 있다.
효율적인 샘플 사전처리는 미세기술적 분석 시스템에서 중요한 인자이다. 특히, 농축 장치는 적은 수의 특이적인 입자, 예컨대 생물학적 샘플 내에 존재하는 세균 세포 또는 바이러스를 검출할 수 있도록 하는데 있어서 필요하다. 예를 들어, 다양한 종류의 여재 (미세구조화된 채널, 다공성 중공 섬유 또는 막)를 이용하는 전량 여과(dead-end filtration) 및 교차 흐름 여과와 같은 여과 기법, 중력 침전기, 원심분리기, 음파 세포 필터, 광 트랩, 유전영동(DEP) 장치, 전기영동 장치, 유세포분류기 및 흡착 방법을 포함하는 다양한 농축 방법이 당업계에 공지되어 있 다.
바람직한 농축 방법에는 전량 여과법이 포함된다. 이 방법은 상대적으로 간단하고 경제적인 방법이며, 이를 위한 장치가 일회용 중합체 칩 내로 용이하게 통합될 수 있다. 또한, 평탄 막을 이용하면 넓은 적용 분야에 적용할 수 있는 데, 그 이유는 다양한 막이 이용가능하며, 예를 들어 PEG 또는 트윈20 코팅과 같은 표면 처리가 용이하게 실시될 수 있기 때문이다.
도 1에 개략적으로 도시된 샌드위치 배치를 이용하여 평탄 막을 중합체 일회용 칩 내로 통합시킬 수 있다. 상기 칩은 덮개 막(40), 유체 채널(41) 및 필터 막(44)을 포함한다. 칩의 최상부 및 바닥은 각각 (42) 및 (43)으로 도시되어 있다.
바람직하게는, 하나 이상의 밸브가 장치 내로 통합되어 칩 상에서의 흐름을 조절할 수 있다. 적합한 밸브 설계가 도 2 및 3에 도시되어 있다. 도 2에 대해, 사전성형된 막 또는 평탄 막이 사용될 수 있다. 칩(45)은 유체 채널(46) 및 사전성형된 막(47)을 포함한다. 수직 화살표는 개방 위치를 나타낸다.
도 3a 내지 3d에는, 최상부 바디부(50), 주 바디부(52), 및 이들 사이에 개재된 막(51)을 포함하는 바디를 구비한 칩이 도시되어 있다. 막(51)에 인접하여 미세유동 채널(57)이 설치되어 있다. 피스톤(54) 및 밸브(55)가 주 바디부(52) 내의 적합한 리세스에 설치되어 있다. 유체/액체가 피스톤(54) 위의 공간(53)에 제공된다 (도 3a 참조). 밸브(55)의 상부에는 억지끼워맞춤부가 장착되어 있다 (도 3a 참조). 이 위치에서, 상기 억지끼워맞춤부가 미세유동 채널(57)을 밀봉시켜 유체가 통과할 수 없게 된다. 원뿔형 핀(56b)이 밸브(55)를 개방 위치로 하강시키는 데 사용될 수 있다 (도 3b, 3c 및 3d 참조). 특히, 핀(56b)이 상방으로 밀려지게 되면, 이것은 밀착 맞춤(friction-fit)에 의해, 밸브(55) 내의 상응하는 리세스 내에 고정된다. 이와 유사한 방식으로, 피스톤(54)과 관련하여, 원뿔형 핀(56a)이 상방으로 밀려지게 되면, 이것은 밀착 맞춤에 의해 피스톤(54) 내의 상응하는 리세스 내에 고정된다. 공간(53)으로부터 액체를 이동시키기 위해서는, 핀(56a, 56b)이 각각 피스톤(54) 및 밸브(55) 내의 상응하는 리세스 내로 밀려 들어가는 반면, 액체가 공간(53)으로부터 밀려져 나오게 된다 (도 3c 및 3d 참조). 칩이 사용되면, 원뿔형 핀(56a, 56b)이 각각 피스톤(54) 및 밸브(55)로부터 배출된다.
본 발명자들은 실리카 비드가 RNA 추출 및 정제에 대해 매우 적합함을 발견하였다. 일반적으로 직경이 15 내지 35㎛인 비드 0.3 내지 0.4mg이 추출을 위해 사용될 수 있으나, 이보다 더 큰 실리카 비드 (직경이 대략 200㎛ 이하인 것)도 사용될 수 있다. 비드 챔버의 가능한 배치가 도 4에 도시되어 있다. 비드 챔버(60)는, 칩-대-칩 결합 전에 사전습윤화시킨 비드(61)로 로딩된다. 결합 후에, 비드 패키지는 100㎛의 병목부에 유지된다. 비드 챔버(60)가 완전히 채워지지 않더라도, 비드 챔버의 형태 및 유체 연결부(62: 입구) 및 (63: 출구)의 배열에 의해, 사용된 액체가 실리카 비드(61)를 통과하게 된다. 비드 챔버(60)의 용량은 약 6.5 ㎕이며, 이는 일반적으로 10 내지 50㎕의 샘플로부터 추출시키는 데 적합하다.
사전처리 공정을 통틀어 4개의 액체가 바람직하게 사용된다: 용해 완충액 (일반적으로 대략 100㎕), 이소프로판올(일반적으로 대략 40㎕), 에탄올(일반적으로 대략 40㎕) 및 용리 완충액(일반적으로 대략 5 내지 20㎕). 뒤의 3개는 추출을 위 해 필요한 것이다. 본 발명자들은, 용해 완충액을 최상부 칩(70a) 상의 채널 (일반적으로는 굽이치는(meandering) 채널) 내에 저장하고 (참조 도 5a), 추출 액체를 바닥부(70b) 상의 2개의 W형 저장소 및 하나의 U형 저장소에 저장하는 것 (참조 도 5b)이 유리함을 발견하였다.
이들 저장소 모두는, 도 5에서, 개략된 시린지(75a 내지 75d)의 바늘 위치에 의해 표시된 소형(0.5mm ×0.5mm) 측 채널에 의해 간단하게 충전될 수 있다. 충전 후에, 측 채널은 임의의 적합한 수단, 예컨대 액체 아교 또는 테이프를 이용하여 밀봉될 수 있다.
유리하게는, 상대적으로 간단하게 취급가능한 시스템을 위해서는, 모든 액체를 작동시키기 위해 단일 (시린지) 펌프를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 따른 칩 배치가 도 6에 도시되어 있다.
4개의 액체 저장소 (용해 완충액, 이소프로판올, 에탄올 및 용리 완충액)가 통상의 시린지 (바늘 직경 0.4mm)를 이용하여 연속적으로 충전되고, 충전된 채널이 밀봉된다.
첫째로, 세포 현탁액이 시린지 펌프에 의해 여과 유닛에 적용된다. 미립자 현탁액 이외에도, 시린지에는 약 200 내지 300㎕의 공기가 로딩되며, 이러한 공기는 칩상의 액체를 작동시키는 데 사용된다 (적용예에 따라, 기타 비혼화성 액체가 사용될 수 있다).
둘째로, 공기가 용해 완충액 저장소로 펌핑되고, 이에 따라 이동된 완충액이 필터 상에 유지되는 세포에 적용된다. 세포 용해물은 필터를 통해 밀려 들어가 서 비드 챔버로 향한다. 부가적인 여과 단계로 인해, 비드 챔버의 막힘 가능성이 감소된다.
셋째로, 작동 챔버(시린지)가 추출 액체 저장소에 연결되는 동시에, 필터 챔버 및 용해 완충액 저장소로의 연결부가 폐쇄된다. 추출 액체가 공기 플러그에 의해 분리된 단일 저장소 내에 저장된다. 압력이 저장소의 일 측면에 인가되면, 액체가 이와 동시에 이동하여, 비드 챔버로 연속적으로 안내된다.
밸브 작동을 포함하는 작동 프로토콜을 도 6을 참조로 하기에서 요약한다. 하기되지 않은 밸브는 폐쇄된 상태인 반면, 하기된 밸브는 상응하는 작동을 위해 개방된 것이다.
여과
밸브 (5, 7): 내부에 세포 현탁액, 여액 → 좌측 출구
용해
밸브 (2, 3, 7): 내부에 공기, 이동된 유체 → 좌측 출구
밸브 (2, 3, 6): 내부에 공기, 용해물 → 비드 패키지, 우측 출구
정제
밸브 (1, 4, 6): 내부에 공기, 이소프로판올 → 비드 패키지
내부에 공기, 에탄올 → 비드 패키지
내부에 공기, 용리 완충액 → 비드 패키지
도 7을 참조하면, 도 7에는 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예가 도시되어 있다. 이전 설명을 이 구체예에도 적용할 수 있다. 시스템(1)은 유체 샘플용 입 구(5), 용해/여과 유닛(10), 핵산 추출 유닛(15), 용해 유체를 함유하는 채널(20), 용리제, 에탄올 및 이소프로판올을 함유하는 채널(25), 핵산 서열증폭 및 검출 유닛(30), 및 폐기물 유닛(35)을 포함한다.
채널(11)은 샘플 입구(5)를 용해/여과 유닛(10)에 연결시킨다. 밸브(12)가 제공되어 이들 사이에서의 흐름을 조절한다.
채널(16)은 용해/여과 유닛(10)을 핵산 추출 유닛(15)에 연결시킨다. 밸브(17)가 제공되어 이들 사이에서의 흐름을 조절한다.
용해 유체를 함유하는 채널(20)이 용해/여과 유닛(10)과 샘플 입구(5)를 연결시킨다. 밸브(22, 23)가 제공되어 유체 흐름을 조절한다.
용리제, 에탄올 및 이소프로판올을 함유하는 채널(25)이 핵산 추출 유닛(15)과 샘플 입구(5)을 연결시킨다. 밸브(27, 28)가 제공되어 유체 흐름을 조절한다.
채널(31)은 핵산 추출 유닛(15)을 핵산 서열 증폭 및 검출 유닛(30)에 연결시킨다. 밸브(32)가 제공되어 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절한다.
채널(36)은 용해/여과 유닛(10)을 폐기물 유닛(35)에 연결시킨다. 밸브(37)가 제공되어 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절한다.
채널(25)은 용리제와, 에탄올 및 이소프로판올과 같은 세척용 용매를 함유한다. 용리제 및 세척용 용매가 공기 갭을 이용하여 채널내로 사전로딩되어, 액체가 서로 분리된다.
적합한 용해 완충액 유체의 예로는 100mM 트리스/HCl, 8M GuSCN (pH 6.4)가 있다.
적합한 용리 용액의 예로는 10mM 트리스/HCl, 1mM EDTA Na2 (pH 8) + 1mM YOYO-1이 있다.
핵산 정량화는 형광 현미경 및 픽셀-강도 분석 프로그램 (Lispix)을 이용하여 실시될 수 있다.
핵산 추출 유닛은 실리카 비드, 예를 들어 15 내지 30㎛ 크기의 실리카 비드 0.3mg을 함유한다. 음으로 하전된 용리되는 핵산을 전기역학적으로 수집하기 위해 패킹된 층 바로 아래에 백금 전극이 제공될 수 있다 (도시되지 않음).
작동 프로토콜에 대해서는 하기에 요약한다.
여과
밸브(12, 37)를 제외하고는 모든 밸브가 폐쇄되어 있다. 유체 샘플(분석할 세포를 함유하고 있음)을 함유하는 시린지가 샘플 입구(5)에 연결되고, 이 샘플이 일정 압력 하에 여과/용해 유닛(10)으로 주입된다. 이와 관련하여, 세포가 유닛(10) 내에 유지되고, 유체의 나머지 부분이 폐기물 유닛(35)으로 이동한다.
용해
밸브(22, 23, 37)를 제외하고는 모든 밸브가 폐쇄되어 있다. 제 1 단계 (임의적)에서, 시린지 내에 함유된 공기가 샘플 입구(5)로 주입된다. 이것에 의해 채널(20) 내에 함유된 용해 유체가 여과/용해 유닛(10)쪽으로 이동하게 된다. 그러나, 용해 유체가 여과/용해 유닛(10)으로 유입되기 전에, 용해 유체에 선행하는 공 기, 즉 밸브(23)와 유닛(10) 사이의 채널(20) 영역 내의 공기가 유닛(10) 내에 남아있는 유체를 이동시키고, 폐기물 유닛(35)으로 흐르게 한다. 다음으로, 제 2 단계에서, 밸브(37)가 폐쇄되고 밸브(17)가 개방된다. 시린지 내에 함유된 공기가 계속해서 샘플 입구(5)로 주입됨에 따라, 채널(20) 내에 함유된 용해 유체가 일정 압력 하에 여과/용해 유닛(10)으로 유동한다. 결과적으로, 유닛(10) 내에 유지된 세포가 용해되고, 이 용해물이 핵산 추출 유닛(15)으로 유동한다.
정제/추출
밸브(27, 28, 32)를 제외하고 모든 밸브가 폐쇄되어 있다. 제 1 단계에서, 시린지 내에 함유된 공기가 샘플 입구(5)로 주입된다. 이로써, 채널(25) 내에 함유된 유체 (이소프로판올, 공기 갭, 에탄올, 공기 갭, 용리 완충액)가 유체 컬럼으로서 핵산 추출 유닛(15)쪽으로 이동하게 된다. 이소프로판올 전부(즉, 유체 컬럼의 제 1 부분)가 핵산 추출 유닛(15)으로 이동하게 되면 이 공정은 중단된다. 단기간(유닛(15)의 내용물의 임의적인 가열과 함께) 후에, 상기 공정은 계속되고, 이소프로판올과 에탄올 사이의 공기 갭이 이소프로판올을 이동시킨다. 이소프로판올은 증발되고/되거나 폐기물 유닛으로 진행한다. 이후, 에탄올이 일정 압력 하에 핵산 추출 유닛(15)으로 유동한다. 에탄올 전부가 유닛(15)으로 이동하게 되면 이 공정은 다시 한번 중단된다. 단기간(유닛(15)의 내용물의 임의적인 가열과 함께) 후에, 상기 공정은 계속되고, 에탄올과 용리 완충액 사이의 공기 갭이 에탄올을 이동시킨다. 에탄올이 증발되고/되거나 폐기물 유닛으로 진행한다. 그런 다음, 용리 완충액이 일정 압력 하에 핵산 추출 유닛(15)으로 유동하고, 실리카 비드의 표 면으로부터 분리된 핵산을 용리시킨다. 이후, 용리된 핵산은 핵산 서열 증폭 및 검출 유닛(30)으로 이동한다.
본 발명은 핵산(NA) 추출 및 분석을 위한 장치 및 방법을 제공한다. 사람 세포 용해물과 같은 생물학적 샘플로부터의 추출은, 제 1의 용리물 15㎖ 내의 NA의 수집과 함께 연속적으로 이루어졌다.
실시간의 핵산 서열 기초한 증폭(NASBA)은, 공급 채널 및 평행한 반응 챔버를 구비한 시클로올레핀 공중합체(COC) 플라스틱 마이크로칩 내에서 측정되었다. 인공 사람 파필로마바이러스(HPV) 16 서열, HPV 16이 혼입된 SiHa 세포주, 및 HPV 16에 대해 양성으로 시험된 환자 샘플의 연속적인 검출이 수행되었다. 칩에 적용된 샘플 재료를 11개의 평행하게 배열된 반응 챔버로 나누고, 이 반응 챔버에서 80nℓ의 검출 용량으로 동시에 검출하였다.
지금부터 본 발명을 하기한 실시예를 참조로 추가로 설명할 것이다.
실시예
샘플 재료
자궁경부 암종 세포주 SiHa (편평 세포 암종)를 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, USA)으로부터 입수하였다. SiHa 세포주를 10% 우태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민 및 25 ㎍/㎖ 젠타마이신이 공급된, 둘베코의 개질된 이글 배지(DMEM)에 유지시켰다. 세포를 5% CO2의 대기 하의 37℃에서 항온배양시켰다. 세포를 트립신으로 처리하고, 브루커 챔버에서 계수한 다음, NASBA 용해 완충액 (네덜란드에 소재한 바이오메리욱스(bioMerieux) 사 제품, 5M 구아니딘 티오시아네이트를 함유함)중에서 용해시켰다. 핵산을 분리시키고, 누클리센스(NucliSense) 추출기 상에서 붐의 방법 (참조: Boom, R., Sol. J. A., Salimans, M. M. M., Jansen, C. L., Wertheimvandillen P. M. E., Vandernoordaa, J. J. of Clinical Microbiol ., 1990, 28, (3), 495-503)을 이용하여 추출하였다. SiHa 세포는 세포 당 통합된 HPV 16 DNA의 1 내지 2개의 복제물을 함유하고 있었다 [참조: Syrjanen, S., Partanen, P., Mantyjarvi, R., and Syrjanen, K. J Virol Methods, 1988, 19, 225-238]. SiHa 세포주 추출물의 10배의 연속 희석액을 시험하였다. 또한, HPV 프루퍼 키트(노르웨이에 소재한 노칩 에이에스(Norchip AS) 사 제품)로부터 취한 인공 HPV 타입 16 서열을 표적으로 사용하였다. 연속 희석액을 시스템의 검출 한계를 규정하기 위해 시험하였다.
NASBA
프리텍트(PreTect)® HPV-프루퍼 키트 내의 시약을 제조업자의 사양 (노르웨이에 소재한 노칩 에이에스)에 따라 혼합하였다. 모든 프라이머 및 탐침을 키트 내에서 이용하였다. 또한, BSA를 상기 혼합물에 첨가하여 동적 코팅으로서 0.05%의 최종 농도가 되게 하였다. 상기 키트로부터의 시약 용액 (26㎕)과 샘플 재료 (SiHa 세포주 샘플, 및 키트로부터의 HPV 타입 16 서열 샘플) 13㎕를 혼합시키고, 이것을 2분 동안 65℃로 가열하였다. 그런 다음, 혼합물을 2분 동안 41℃로 냉각시키고, 효소(13㎕)를 첨가하였다. 각각의 반응 채널 상에 하나의 작동 챔버를 개방 컷팅하여 형성시킨 다음, 혼합물을 중합체 마이크로칩 내로 첨가하였다. 모세 관 력을 이용하여 칩 내의 각각의 반응 채널에 상기 혼합물을 충전시켰다. 남아있는 혼합물을 공급 채널 끝에 위치한 폐기물 챔버로 배출시켰다. 이후, 칩 홀더를 렌즈 아래에서 이동시키고, 채널을 차례대로 측정하였다. 측정은 매 30초 간격으로 실시되었다. 단지 2 ×2 ㎟의 영역만 LED로 조명하였는 데, 이 영역은 80nℓ의 검출 영역에 상응하는 것이다. HPV 16 서열 및 SiHa 세포주 둘 모두의 10배 연속 희석액을 마이크로칩 검출과 비교하기 위해 통상의 장치를 이용하여 시험하였다. 모든 실험은 2.5 시간 동안 수행되었다.
계산
모든 결과를 프리텍트 데이터 분석기 (PDA)(노칩 에이에스 사 제품)를 이용하여 계산하였다. 마이크로칩은 12개의 반응 챔버를 구비하도록 설계되었으나, 측정시의 계통 오차로 인해 각 측면 상에 2개의 반응 채널은 계산에서 배제하였다. 계산은 다항식 회귀 알고리즘에 기초하고 있었다. 비는 반응의 종료 시점에서의 형광도와 반응의 개시 시점에서의 형광도의 차로서 정의되었다. 모든 샘플이 1.7 이상의 비를 나타냈기 때문에, 이들은 모두 양성인 것으로 정의되었다. 시간 경과에 따른 양성화도(time-to-positivity) 또는 출발점은 곡선이 출발하여 지수적으로 증가하기 시작하는 지점으로 설정되었다. 출발점으로부터 형광도에서 10% 증가값 및 형광도에서 80% 증가값을 이용하여 평균 경사각을 계산하였다. 중합체 마이크로칩에 대한 검출 한계가 시험된 최후 농도로 설정되었으며, 이 농도에서는 10개의 반응 채널 모두가 양성이었다.
결과
실시간 NASBA를 이용하는 HPV 16 바이러스의 동정은 80nℓ 검출 용량의 중합체 마이크로 칩 내에서 연속적으로 수행되었다. 도 8 및 9는 각각 SiHa 세포주 및 HPV 16 올리고 서열에 대해 실시된 하나의 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 이들 도면에는, 명확히 양성을 나타내고, 평균 20㎕ 용량으로 그리고 통상적인 판독기 (도시되지 않음)를 이용하여 수행된 샘플과 동일한 곡선을 나타내는 그래프가 도시되어 있다. 하기 표 1은 중합체 마이크로칩을 이용하여 수득된 인공 HPV 16 서열 및 SiHa 세포주의 연속 희석액의 결과를 나타낸다. 증폭 반응을 특성화하기 위해, 다수의 상이한 파라미터를 평가하였다: 형광도 비, 시간 경과에 따른 양성화도, 곡선의 선형 부분의 평균 경사각, 양성 증폭의 수, 및 시험된 중합체 마이크로칩의 수. 표 내의 값은 시험한 양성 샘플의 표준 편차 및 평균 값을 나타낸다. 마이크로칩 상에서 시험된 HPV 16 서열 및 SiHa 세포주 모두에 대해, 비가 다소 일정하였다. 동일한 샘플 재료를 이용한 통상의 시험 결과 (표 2)와 비교하여, 농도가 낮아질 수록 비가 감소함을 알 수 있다. 한편 다른 파라미터는 마이크로칩 및 통상의 방법 모두에 대해 매우 잘 상응하였다. 시간 경과에 따른 양성도화는 농도가 낮아질수록 증가하는 한편, 평균 경사각은 농도가 낮아질수록 감소하였다. 100aM에서 100nM으로의 10배 연속 희석액을 인공 HPV 16 서열에 대해 시험하는 한편, SiHa 세포주는 0.02 세포/㎕에서 2000 세포/㎕에 대해 시험하였다. 통상적으로 제조된 광 검출 시스템의 검출 한계는 인공 HPV 16 서열 및 SiHa 세포주 물질에 대해서 각각 1 pM 및 20 세포/㎕이었다. 이들은 통상의 바이오테크 판독기에 대해 수득된 검출 한계와 동일한 것이었다. 양 시스템에 대해 보다 낮은 농도를 검출할 수 있으나, 결과는 일치되지 않았다. 결과로부터, 입력 표적의 샘플 농도가 감소되는 경우에 표준 편차가 증가됨을 알 수 있었다. HPV 16 올리고 서열과 SiHa 세포주 모두에 대한 NASBA 결과를 비교함으로써, 모든 파라미터가 증폭 반응의 개시 시점 및 종료 시점에서의 형광도 사이의 비를 제외하고는, 마이크로시스템 뿐만 아니라 통상의 방법에 대해서 동일한 경향을 나타냄을 알 수 있었다. 배경 소음은 매크로스코픽한 형광 방법에 대해서보다 소형 반응 챔버에서 더욱 분명하였다. 중합체 마이크로칩의 후면 상에 얇은 금 층을 도포함으로써, 배경 형광 부분이 검정으로부터 제거되었다. COC는 그 자체로 자동형광성을 나타내기 때문에, 항상 약간의 배경 형광을 제공하였다. 소음 검출에 대한 또 다른 기여로는, 덜 완전한 중합체 표면으로부터 기인하는 광 분산이 있었다. 시간경과에 따른 양성화도는 예상대로 농도가 감소함에 따라 감소되었는 데, 그 이유는 사용된 기판이 기판을 확인하고 이와 상호작용하도록 시간을 지연시키기 때문이다. 특히 실험 중의 인공 HPV 16에 대한 가장 높은 농도에서는, 시간경과 양성도화가 증가하였다. 매우 높은 샘플 농도는 또한 반응을 억제시키므로, 이상적인 반응 혼합물보다 더 오랜시간 동안 사용할 수 있다. 동일한 방식으로, 평균 경사각이 감소하였다. 더욱 소량의 표적이 반응 혼합물 내에서 개시되는 경우, 더욱 적은 증폭산물이 생성될 것이며, 경사각은 더욱 높은 농도에 대해서보다 더욱 낮아질 것이다. NASBA 반응의 검출 한계는 주목되는 표적, 프라이머의 설계구조 및 프로브에 따라 달라진다. 이러한 실험에서, 본 발명자는 양 검출 시스템에서 1pM 및 20 세포/㎕로 감소된 농도를 검출할 수 있었다. 따라서, 본 실시예는, 실시간 NASBA를 이용하는 중합체 마이크로칩 내 에서 1pM 농도로 감소된 인공 HPV 16 서열을 검출할 수 있음을 나타낸다. 세포주 샘플에 대한 검출 한계는 20 세포/㎕이었다. 이러한 검출 한계는 통상의 바이오테크 판독기에서 수행된 실험에 대해 수득된 것과 동일한 것이었다.
표 1: HPV 16 올리고 서열 및 SiHa 세포주 연속 희석액을 검출하는 마이크로칩 상에서 수행된 NASBA. 결과는 실험에서 수행된 모든 값의 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
표 2: HPV 16 올리고 서열 및 SiHa 세포주 상에서 수행된 통상적인 NASBA 시험. 결과는 실험에서 수득된 모든 값의 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
Claims (32)
- 세포 및/또는 입자를 함유하는 유체 샘플에 대해 샘플 제조 과정을 수행하기 위한 통합된 칩상 실험실(integrated lab-on-a-chip)형 진단 시스템으로서,(a) 유체 샘플용 입구;(b) 유체 샘플 내에 함유된 세포 및/또는 입자의 용해를 위한 용해 유닛;(c) 유체 샘플 내에 함유된 세포 및/또는 입자로부터 핵산을 추출하기 위한 핵산 추출 유닛;(d) 용해 유체를 함유하는 저장소; 및(e) 핵산 추출 유닛 내에 수집된 핵산을 제거하기 위한 용리제를 함유하는 저장소;를 포함하며,샘플 입구가 용해 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되며,용해 유닛이 핵산 추출 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되며,용해 유체를 함유하는 저장소가 용해 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되며,용리제를 함유하는 저장소가 핵산 추출 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되는 시스템.
- 제 1항에 있어서, 용해 유체를 함유하는 저장소가 샘플 입구와 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되는 시스템.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 용리제를 함유하는 저장소가 샘플 입구와 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되는 시스템.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, (g) 핵산 반응 유닛, 바람직하게는 핵산 서열 증폭 및 검출 유닛을 추가로 포함하며, 핵산 추출 유닛이 핵산 반응 유닛과 유체 소통되며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되는 시스템.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, (h) 용해 유닛과 유체 소통되는 폐기물 유닛을 추가로 포함하며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되는 시스템.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 핵산 추출 유닛과 유체 소통되는, 세척용 용매, 바람직하게는 에탄올을 함유하는 저장소를 추가로 포함하며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 조절하기 위해 임의적인 밸브가 제공되는 시스템.
- 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, (j) 핵산 추출 유닛과 유체 소통되는, 추가의 세척용 용매, 바람직하게는 이소프로판올을 함유하는 저장소를 추가로 포함하며, 이들 사이에서의 유체 흐름을 위해 임의적인 밸브가 제공되는 시스템.
- 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 용리제를 함유하는 저장소가, 제 1 세척용 용매를 함유하는 저장소 및/또는 제 2 세척용 용매를 함유하는 저장소와 유체 소통되는 시스템.
- 제 8항에 있어서, 용리제, 제 1 세척용 용매 및/또는 제 2 세척용 용매가 공통의 저장소 내에 함유되는 시스템.
- 제 9항에 있어서, 용리제, 제 1 세척용 용매 및/또는 제 2 세척용 용매가 공통의 저장소 내에서, 유체, 바람직하게는 공기에 의해 서로 분리되는 시스템.
- 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 공통의 저장소가 샘플 입구 및 용해 유닛과 유체 소통되는 도관을 포함하는 시스템.
- 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, (k) 유체 샘플 및/또는 공기 를 샘플 입구로 도입시키기 위한 수단을 추가로 포함하며, 상기 수단이 바람직하게는 펌프 또는 시린지를 포함하는 시스템.
- 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 유닛과 유체 소통되는 여과 유닛을 추가로 포함하는 시스템.
- 제 13항에 있어서, 여과 유닛이, 전량 여과(dead-end filtration) 필터, 교차 흐름 필터 (예를 들어, 미세구조화된 채널, 다공성 중공 섬유 또는 막), 중력 침전기, 원심분리기, 음파(acoustic) 세포 필터, 광 트랩, 유전영동(DEP) 장치, 전기영동 장치, 유세포 분류기 및 흡착 장치 중 하나 이상을 포함하는 시스템.
- 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 유닛이 유체 샘플을 여과시키기 위한 수단을 추가로 포함하는 시스템.
- 제 15항에 있어서, 여과 수단이, 전량 여과 필터, 교차 흐름 필터 (예를 들어, 미세구조화된 채널, 다공성 중공 섬유 또는 막), 중력 침전기, 원심분리기, 음파 세포 필터, 광 트랩, 유전영동(DEP) 장치, 전기영동 장치, 유세포 분류기 및 흡착 장치 중 하나 이상을 포함하는 시스템.
- 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템이, 용해 유닛 및/또는 핵산 추출 유닛의 내용물을 가열시키기 위한 수단을 추가로 포함하는 시스템.
- 제 17항에 있어서, 가열 수단이, 용해 유닛 및/또는 핵산 추출 유닛 내에 위치하거나 이에 인접하여 위치한 하나 이상의 펠티에 부재(Peltier elements)를 포함하는 시스템.
- 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 추출 유닛이 실리카 비드 또는 입자로 부분적으로 또는 전체적으로 충전되는 시스템.
- 제 19항에 있어서, 핵산 추출 유닛이, 용리된 핵산을 수집하고/하거나 사전농축시키기 위해 실리카 비드 또는 입자에 인접하여 하나 이상의 전극 세트를 추가로 포함하는 시스템.
- 제 20항에 있어서, 하나 이상의 전극 세트가 백금 전극을 포함하는 시스템.
- 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 유체, 유제품, 환경 유체 또는 음용수 중에 존재하는 핵산을 추출하기 위한 시스템.
- 생물학적 및/또는 환경학적 샘플을 분석하기 위한 장치로서,제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 시스템을 포함하는 장치.
- 생물학적 및/또는 환경학적 샘플을 분석하기 위한 분석 키트로서,제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 시스템, 및 상기 시스템과 샘플을 접촉시키기 위한 수단을 포함하는 키트.
- 일회용인, 제 23항에 따른 장치 또는 제 24항에 따른 분석 키트.
- 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 따른 통합된 칩상 실험실형 진단 시스템의 제조 방법으로서,A. 기판의 표면에, 입구 리세스, 용해 유닛 리세스, 핵산 추출 유닛 리세스, 용해 유체 저장소 리세스, 및 용리제 저장소 리세스를 제공하는 단계;B. 덮개를 제공하는 단계; 및C. 덮개를 기판에 결합시켜 (a) 입구, (b) 용해 유닛, (c) 핵산 추출 유닛, (d) 용해 유체 저장소, 및 (e) 용리제 저장소를 형성시키는 단계로서, 이들 각각의 장소가 상기한 기판 표면 내의 각각의 리세스와, 덮개의 인접한 표면에 의해 규정되는 단계;를 포함하는 방법.
- 제 26항에 있어서, 덮개를 기판에 결합시키기 전 또는 후에 용해 유체를 용해 유체 저장소로 도입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 26항 또는 제 27항에 있어서, 덮개를 기판에 결합시키기 전 또는 후에 용리제를 용리제 저장소로 도입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 26항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 덮개를 기판에 결합시키기 전 또는 후에 제 1 세척용 용매, 바람직하게는 에탄올을 용리제 저장소로 도입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 26항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 덮개를 기판에 결합시키기 전 또는 후에 제 2 세척용 용매, 바람직하게는 이소프로판올을 용리제 저장소로 도입시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 26항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 용리제, 및/또는 제 1 세척용 용매 및/또는 제 2 세척용 용매가 유체, 바람직하게는 공기에 의해 서로 분리되는 방법.
- 제 26항 또는 제 27항에 있어서,덮개를 기판에 결합시킨 후에 용리제를 용리제 저장소로 도입시키는 단계;제 1 용량의 비혼화성 유체, 바람직하게는 공기를 용리제 저장소로 도입시키는 단계;제 1 세척용 용매, 바람직하게는 에탄올을 용리제 저장소로 도입시켜, 제 1 세척용 용매를 상기한 제 1 용량의 비혼화성 유체에 의해 용리제로부터 분리시키는 단계;제 2 용량의 비혼화성 유체, 바람직하게는 공기를 용리제 저장소로 도입시키는 단계; 및제 2 세척용 용매, 바람직하게는 이소프로판올을 용리제 저장소로 도입시켜, 제 2 세척용 용매를 상기한 제 2 용량의 비혼화성 유체에 의해 제 1 세척용 용매로부터 분리시키는 단계;를 추가로 포함하는 방법.
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