WO2014112671A1 - 핵산 추출용 미세유동 칩, 이를 포함하는 핵산 추출 장치, 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법 - Google Patents

핵산 추출용 미세유동 칩, 이를 포함하는 핵산 추출 장치, 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법 Download PDF

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김덕중
이동훈
김선진
최용해
류호선
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나노바이오시스(주)
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    • G01N2035/00158—Elements containing microarrays, i.e. "biochip"

Definitions

  • the present invention relates to apparatus and methods for extracting nucleic acids from biological samples such as cells, bacteria, or viruses.
  • nucleic acid amplification reaction technology a technique for extracting nucleic acids from biological samples such as cells, bacteria, or viruses to diagnose, treat, or prevent diseases at the genetic level.
  • nucleic acid amplification reaction technology In addition to the diagnosis, treatment, or prevention of diseases, there is a need for a technology for extracting nucleic acids from biological samples in various fields such as development of customized new drugs, forensic medicine, and detection of environmental hormones.
  • the conventional nucleic acid extraction technology there is a method of purifying nucleic acid by denatured protein with phenol after solubilizing a sample including cells by treatment with SDS or proteinase K.
  • the phenol extraction method is not only time-consuming because many processing steps have to be performed, but also has a problem in that the nucleic acid extraction efficiency is highly dependent on the researcher's experience and experience, and thus the reliability is greatly reduced.
  • kits using silica or glass fibers that specifically bind to nucleic acids have been used.
  • the silica or glass fiber has a low binding ratio with proteins and cellular metabolites, so that nucleic acids having a relatively high concentration can be obtained.
  • microfluidic chip capable of miniaturization and ultra-high speed, and can also maintain and / or improve reliable nucleic acid extraction efficiency, comprising the same It is to provide a nucleic acid extraction apparatus, and a nucleic acid extraction method using the same.
  • One embodiment of the present invention for extracting a nucleic acid from a biological sample the inlet;
  • a heating part disposed in a first channel region connected to the inlet part and configured to transfer heat obtained from the outside to a biological sample introduced through the inlet part;
  • a first filter disposed in a second channel region connected to the heating unit and capable of passing a material having a size corresponding to the nucleic acid;
  • a nucleic acid separation unit disposed in a third channel region connected to the first filter and having a nucleic acid binding material capable of specifically binding to the nucleic acid;
  • a second filter disposed in a fourth channel region connected to the nucleic acid separator and capable of passing a material having a size corresponding to the nucleic acid;
  • it may provide a microfluidic chip (microfluidic chip) for nucleic acid extraction comprising an outlet connected to the second filter.
  • microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • a chip mounting module implemented to mount the microfluidic chip;
  • a heating module implemented to apply heat to a heating part of the microfluidic chip mounted to the chip mounting module;
  • An apparatus for extracting nucleic acids from a biological sample may be provided, including a fluid control module configured to be discharged to the outside.
  • another embodiment of the present invention provides a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
  • the channel including the first channel region to the fourth channel region may be implemented in fluid communication, but the width and depth of the channel may be implemented within a range of 0.001 to 10 millimeters (mm), respectively. .
  • first filter and the second filter has a pore (pore) having a diameter in the range of 0.1 to 0.4 micrometers ( ⁇ m), but may have a thickness in the range of 0.01 to 10 millimeters (mm).
  • first filter and the second filter has a pore having a diameter of 0.2 micrometer ( ⁇ m), it may have a thickness of 0.01 to 0.5 millimeters (mm).
  • the nucleic acid separation unit may be a nucleic acid binding material is provided with a bead (bead) attached to the nucleic acid binding functional group on its surface.
  • the bead to which the nucleic acid binding functional group is attached may be one having a diameter within the range of 0.001 to 20 millimeters (mm).
  • the nucleic acid separation unit may include beads having a nucleic acid binding functional group attached within a range of 1 microgram ( ⁇ g) to 200 mg (mg).
  • microfluidic chip may be implemented with a plastic material.
  • the microfluidic chip may include a first plate; A second plate disposed on the first plate and having a channel including the first to fourth channel regions; And a third plate disposed on the second plate and having the inlet and the outlet disposed thereon.
  • the first and third plates are polydimethylsiloxane (PDMS), cyclo olefin copolymer (COC), polymethyl methacrylate (PMMA), polycarbonate, PC ), Polypropylene carbonate (PPC), polyether sulfone (PES), and polyethylene terephthalate (PET), and combinations thereof.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • COC cyclo olefin copolymer
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PC polycarbonate
  • PC Polypropylene carbonate
  • PES polyether sulfone
  • PET polyethylene terephthalate
  • the second edition is polymethylmethacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), cycloolefin copolymer (COC), polyamide (PA), polyethylene (PE), polypropylene (polypropylene, PP), polyphenylene ether (PPE), polystyrene (PS), polyoxymethylene (POM), polyether ether ketone (p olyetheretherketone (PEEK), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyvinylchloride (PVC), polyvinylidene fluoride (PVDF), polybutylene terephthalate (PBT), fluorinated ethylene It may comprise a thermoplastic or thermosetting resin material selected from the group consisting of propylene (fluorinated ethylenepropylene, FEP), perfluoralkoxyalkane (PFA), and combinations thereof.
  • PMMA polymethylmethacrylate
  • PC polycarbonate
  • COC cycloolefin copolymer
  • PA polyamide
  • PE
  • the inlet portion of the third plate is implemented in the range of 0.1 to 5.0 millimeters (mm) in diameter
  • the outlet portion is implemented in the range of 0.1 to 5.0 millimeters (mm) in diameter
  • the thickness of the first plate and the third plate Is implemented within the range of 0.01 to 20 millimeters (mm)
  • the thickness of the second plate may be implemented within the range of 30 micrometers ( ⁇ m) to 10 millimeters (mm).
  • the microfluidic chip and the nucleic acid extracting apparatus including the same unlike the existing nucleic acid extracting apparatus while maintaining and / or improving nucleic acid extracting efficiency, it is possible to greatly improve the microminiaturization and ease of use of the apparatus. .
  • nucleic acid extraction method using a microfluidic chip according to the present invention unlike the existing nucleic acid extraction method while maintaining and / or improving the nucleic acid extraction efficiency, it is possible to greatly improve the ultra-fast and process efficiency of nucleic acid extraction. .
  • a nucleic acid extracting apparatus comprising the same, and a nucleic acid extracting method using the same can be efficiently linked to a polymerase chain reaction (PCR), and can be used in various fields such as disease diagnosis, prevention, and treatment. High utilization.
  • PCR polymerase chain reaction
  • FIG. 1 illustrates a microfluidic chip for nucleic acid extraction and its components according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a cross-sectional view of the microfluidic chip for nucleic acid extraction according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a nucleic acid extraction apparatus equipped with a microfluidic chip for nucleic acid extraction according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a flowchart of a nucleic acid extraction method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 shows a result of comparing the nucleic acid extraction method according to the general nucleic acid extraction method and an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 shows gel electrophoresis results of amplification of nucleic acids obtained by a nucleic acid extraction method according to an embodiment of the present invention in a third-party PCR device and a PCR device of the present applicant, respectively.
  • FIG. 1 illustrates a microfluidic chip for nucleic acid extraction and its components according to an embodiment of the present invention.
  • the microfluidic chip for nucleic acid extraction is for extracting nucleic acid from a biological sample, the inlet 10;
  • a heating unit 20 disposed in a first channel region connected to the inlet unit 10 and configured to transfer heat obtained from the outside to a biological sample introduced through the inlet unit 10;
  • a first filter 30 disposed in a second channel region connected to the heating unit 20 and capable of passing a material having a size corresponding to the nucleic acid;
  • a nucleic acid separator 40 disposed in a third channel region connected to the first filter 30 and having a nucleic acid binding material 45 capable of specifically binding to the nucleic acid;
  • a second filter (50) disposed in a fourth channel region connected to the nucleic acid separation unit (40) and capable of passing a material having a size corresponding to the nucleic acid;
  • an outlet part 60 connected to the second filter 50.
  • the microfluidic chip for nucleic acid extraction is a component for nucleic acid extraction, that is, an inlet, an outlet, a channel connecting the inlet and the outlet, and a first filter.
  • the second filter, etc. refers to a microchip implemented in millimeter (mm) or micrometer ( ⁇ m) units.
  • the biological sample is a biological material including a nucleic acid such as DNA or RNA, and may be, for example, a liquid sample including animal cells, plant cells, pathogens, fungi, bacteria, viruses, and the like, but is not limited thereto.
  • the inlet 10 is a portion into which the biological sample or the solution for nucleic acid extraction is introduced into the microfluidic chip, and the outlet 60 is a nucleic acid obtained from the biological sample, a solution for nucleic acid extraction, Other waste (waste) and the like is discharged to the outside of the microfluidic chip.
  • the inlet 10 and the outlet 60 may serve as outlets and inlets, respectively.
  • the solution for nucleic acid extraction includes all the solutions required for nucleic acid extraction, and may be, for example, distilled water, a nucleic acid binding buffer, an elution buffer, or the like.
  • the inlet 10 and the outlet 60 is connected in fluid communication by the channel 70, the heating unit 20, the first filter 30, the nucleic acid separation unit will be described in detail below
  • Components 40, the second filter 50, and the like are arranged to be driven in the channel 70 to perform each function.
  • the channel 70 may be implemented in various standards, but the width and depth of the channel are preferably implemented in a range of 0.001 to 10 millimeters (mm), respectively.
  • the first, second, third, and fourth channel regions to be described below mean a sequential arrangement from the inlet portion 10 to the outlet portion 60 and are limited to a specific position in the channel 70. It is not.
  • the heating part 20 is a portion in which heat obtained from the outside is applied to a solution (including a biological sample) introduced through the inlet part 10, and is disposed in a first channel region connected to the inlet part 10.
  • a solution including a biological sample
  • the heating unit 20 may be supplied with heat in a contact or non-contact manner from the heating module 600 of the nucleic acid extraction apparatus to be described below.
  • the first filter 30 is a structure having a pore of a predetermined size, and serves to distinguish the passing material and the non-passing material by size through the pore in the fluid flow direction.
  • the first filter 30 is disposed in the second channel region connected to the heating unit 20, it is implemented to pass a material of a size corresponding to the nucleic acid.
  • the first filter 30 collects a material having a size larger than that of the nucleic acid in the dissolution product generated by the heating in the heating unit 20 in the heating unit 20, the nucleic acid and the material having a corresponding size is filtered It is moved to the nucleic acid separation unit 40 to be described below.
  • the first filter 30 may be implemented in various standards, but having a pore having a diameter in the range of 0.1 to 0.4 micrometers ( ⁇ m), but having a thickness in the range of 0.01 to 10 millimeters (mm). desirable. More preferably, the first filter 30 has a pore having a diameter of 0.2 micrometer ( ⁇ m), but preferably has a thickness of 0.01 to 0.5 millimeters (mm).
  • the nucleic acid separation unit 40 is for selectively separating the nucleic acid from a nucleic acid or a substance having a size corresponding thereto. According to FIG. 1, the nucleic acid separation unit 40 is a space between the first filter 30 and the second filter 50 to be described below, and the nucleic acid binding material 45 capable of specifically binding to the nucleic acid. ) Is provided.
  • the nucleic acid binding material 45 includes all materials capable of specifically binding to nucleic acids.
  • the nucleic acid binding material 45 has a nucleic acid binding functional group attached thereto, and may be, for example, silica (SiO 2) beads, biotin, or strptavidin attachment beads.
  • the bead to which the nucleic acid binding functional group is attached may be implemented in various standards, but preferably has a diameter within the range of 0.001 to 20 millimeters (mm).
  • the nucleic acid separation unit 40 may include a bead having the nucleic acid binding functional group attached thereto in various contents, but preferably includes within a range of 1 microgram ( ⁇ g) to 200 mg (mg).
  • the second filter 50 is a structure having a pore of a constant size, and passes through the non-pass material by size through the pore in the direction of fluid flow. It plays a role of distinguishing.
  • the second filter 50 is disposed in the fourth channel region connected to the nucleic acid separation unit 40, it is implemented to pass a material of a size corresponding to the nucleic acid.
  • the second filter 50 collects the nucleic acid binding material 45 in the nucleic acid separation unit 40, and filters the nucleic acid separated from the nucleic acid binding material 45 to the outlet 60. .
  • the second filter 50 may be implemented in various standards, but having a pore having a diameter in the range of 0.1 to 0.4 micrometers ( ⁇ m), but having a thickness in the range of 0.01 to 0.5 millimeters (mm). desirable. More preferably, the second filter 50 has a pore having a diameter of 0.2 micrometer ( ⁇ m), but preferably has a thickness of 0.3 millimeter (mm).
  • Figure 2 is a cross-sectional view of the microfluidic chip for nucleic acid extraction according to an embodiment of the present invention.
  • Microfluidic chip for nucleic acid extraction according to an embodiment of the present invention is a silver first plate (100); A second plate (200) disposed on the first plate and having a channel (70) including the first to fourth channel regions; And a third plate 300 disposed on the second plate 200 and having the inlet 10 and the outlet 60 disposed thereon.
  • Nucleic acid extraction microfluidic chip according to an embodiment of the present invention may be implemented in a variety of materials, preferably may be implemented in a plastic material.
  • the first plate 100 and the third plate 300 may include polydimethylsiloxane (PDMS), cyclo olefin copolymer (COC), polymethyl methacrylate (PMMA), Material selected from the group consisting of polycarbonate (PC), polypropylene carbonate (PPC), polyether sulfone (PES), and polyethylene terephthalate (PET), and combinations thereof
  • the second plate 200 includes polymethylmethacrylate (PMMA), polycarbonate (PC), cycloolefin copolymer (COC), polyamide (PA), Polyethylene (PE), polypropylene (PP), polyphenylene ether (PPE), polystyrene (PS), polyoxymethylene (POM), polyether Polyetheretherketone (PEEK), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyvinylch
  • the inlet portion of the third plate is implemented in the range of 0.1 to 5.0 millimeters (mm) in diameter
  • the outlet portion is implemented in the range of 0.1 to 5.0 millimeters (mm) in diameter
  • the thickness of the first plate and the third plate Is implemented within the range of 0.01 to 20 millimeters (mm)
  • the thickness of the second plate may be implemented within the range of 30 micrometers ( ⁇ m) to 10 millimeters (mm).
  • the microfluidic chip for nucleic acid extraction may be implemented as two or more inlets, outlets, and channels connecting them, if necessary, in this case from two or more biological samples on one chip Nucleic acid can be extracted, and nucleic acid can be extracted quickly and efficiently.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a nucleic acid extraction apparatus equipped with a microfluidic chip for nucleic acid extraction according to an embodiment of the present invention.
  • the nucleic acid extracting apparatus is a nucleic acid extracting microfluidic chip (1) already described; A chip mounting module 500 implemented to mount the microfluidic chip 1; A heating module 600 implemented to apply heat to the heating unit 20 of the microfluidic chip 1 mounted on the chip mounting module 500; And a solution for extracting nucleic acids into the microfluidic chip 1 by being connected to the inlet 10 and / or the outlet 60 of the microfluidic chip 1 mounted on the chip mounting module 500. It may include a fluid control module 700 implemented to introduce and / or to discharge the solution present in the microfluidic chip (1) to the outside.
  • the nucleic acid extraction apparatus is a device implemented to perform all the steps for nucleic acid extraction in the state in which the microfluidic chip 1 according to an embodiment of the present invention, the chip mounting module 500, In addition to the heating module 600 and the fluid control module 700, it may further include various modules required for extracting other nucleic acids.
  • the nucleic acid extracting apparatus according to an embodiment of the present invention can be implemented so that all steps can be implemented in an automated manner, the nucleic acid amplification reaction can proceed immediately after nucleic acid extraction in conjunction with the polymerase chain reaction (PCR) apparatus have.
  • PCR polymerase chain reaction
  • microfluidic chip 1 for nucleic acid extraction is as described above.
  • the chip mounting module 500 is a portion on which the microfluidic chip 1 is mounted.
  • the chip mounting module 500 may be implemented in various ways corresponding to the shape of the contact surface of the microfluidic chip 1.
  • the heating module 600 is a module for supplying heat to the heating unit 20 of the microfluidic chip 1 when the microfluidic chip 1 is mounted on the chip mounting module 500.
  • the heating module 600 may be implemented in various ways, but a contact heating block is preferable.
  • the fluid control module 700 is connected to the inlet part 10 and / or the outlet part 60 of the microfluidic chip 1 mounted on the chip mounting module 500 to be inside the microfluidic chip 1. It is a module implemented to introduce a solution for nucleic acid extraction and / or to discharge the solution existing in the microfluidic chip (1) to the outside.
  • the fluid control module 700 may include various components, for example, a microchannel that is a fluid movement passage, a pneumatic pump providing a driving force for fluid movement, a valve for controlling opening and closing of fluid movement, and a nucleic acid. It may further include a storage chamber containing a variety of solutions required for nucleic acid extraction, such as binding buffer, elution buffer, silica gel (silica gel), distilled water (DW).
  • the nucleic acid extracting apparatus is an electronic control module (not shown) for automatically controlling the microfluidic chip 1, the heating module 600, and the fluid control module 700. ) May be further included.
  • the electronic control module can precisely control the respective modules so that the quantitative nucleic acid can be extracted from the microfluidic chip 1 according to a pre-stored program.
  • the prestored program includes, for example, a program relating to a series of steps relating to a nucleic acid extraction method which will be described in detail below.
  • FIG. 4 is a flowchart of a nucleic acid extraction method according to an embodiment of the present invention.
  • the nucleic acid extraction method assumes a microfluidic chip 1 for nucleic acid extraction according to an embodiment of the present invention already described.
  • microfluidic chip providing step Providing a microfluidic chip for nucleic acid extraction according to an embodiment of the present invention (microfluidic chip providing step);
  • biological sample introduction step Introducing a biological sample selected from the group consisting of cells, bacteria, and viruses through an inlet of the microfluidic chip (biological sample introduction step);
  • biological sample dissolution step Moving the introduced biological sample to a heating part of the microfluidic chip and then heating the heating part of the microfluidic chip to dissolve the biological sample (biological sample dissolution step);
  • the material obtained from the dissolution step is transferred to the first filter of the microfluidic chip and then passed through the first filter, and removing the material not passed through the first filter (filtration step through the first filter) );
  • nucleic acid separation step After moving the material that passed through the first filter to the nucleic acid separation unit of the microfluidic chip, the nucleic acid of the material that passed through the first filter is bound to the nucleic acid binding material, and the material that is not bound to the nucleic acid binding material is removed.
  • nucleic acid extraction step Extracting the nucleic acid through the outlet part after moving the material passing through the second filter to the outlet part (nucleic acid extraction step);
  • DNA was extracted using a tube and a nucleic acid extracting microfluidic chip according to an embodiment of the present invention, respectively, for tuberculosis strain cells, and then the yield and progress time were confirmed.
  • Typical nucleic acid extraction steps are as follows.
  • Tuberculosis strain cells were prepared, and the tuberculosis strain cells were mixed with 6% NaOH and 4% NaLC in a 1: 1: 1 ratio to prepare a sample solution.
  • the sample solution was then centrifuged to remove supernatant (20 minutes, 4300 rpm, 4 ° C.). Thereafter, 1 ml of distilled water (DW) was added to the sample solution, and after vortexing, the sample solution was transferred to another tube. Thereafter, the sample solution was centrifuged again and the supernatant was removed (3 minutes, 12000 rpm, room temperature). Then, 1 ml of distilled water (DW) was added to the sample solution, and vortexed.
  • DW distilled water
  • nucleic acid was extracted from the same tuberculosis strain cells using a microfluidic chip for nucleic acid extraction according to an embodiment of the present invention.
  • Tuberculosis strain cells were prepared, and the tuberculosis strain cells were mixed with 6% NaOH and 4% NaLC in a 1: 1: 1 ratio to prepare a sample solution. Subsequently, the sample solution was introduced using a syringe at the inlet of the nucleic acid extraction microfluidic chip ⁇ 25 ⁇ 72 ⁇ 2 mm, silica beads (OPS Diagnostics, LLC), filter (Whatman) according to FIG. 1 (about 1 minute). Then, 300 ⁇ l of silica gel and 1X DNA binding buffer were introduced into the inlet of the microfluidic chip according to the present invention, followed by heating of the microfluidic chip according to the present invention. The section was rapidly heated to 95 ° C.
  • the amount of the nucleic acid extraction product can be maintained as it is, unlike the conventional nucleic acid extraction method, it is confirmed that the total time required can be significantly shortened Can be.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the polymerase chain reaction (PCR) used a PCR device including two heat blocks described in the applicant's Korean Patent Application No. 2011-0037352 and a commercially available third-party PCR device (Roche, Light cycler).
  • Applicant's PCR apparatus is a real time PCR apparatus, comprising: a first row block disposed on a substrate; A second thermal block spaced apart from the first thermal block on the substrate; And a chip holder which is movable left and right and / or up and down by a driving means over the first row block and the second row block, and is equipped with a PCR chip made of a transparent plastic material.
  • the driving means includes a rail extending in the left and right direction, and a sliding member disposed to be slidably movable in the left and right direction through the rail, the connecting member slidable in the vertical direction, one end of the connection member is the chip holder Characterized in that arranged.
  • a light source is further disposed between the first column block and the second column block, and a light detector for detecting light emitted from the light source is further disposed on the chip holder, or the first column block and the second column block.
  • a light detector for detecting light emitted from the light source is further disposed between the heat blocks, and the light source is further disposed on the chip holder.
  • the PCR chip and the PCR device By using the PCR chip and the PCR device, it is possible to significantly shorten the PCR execution time within about 5 to 15 minutes, the PCR chip and the PCR device for nucleic acid extraction microfluidic chip and nucleic acid extraction according to an embodiment of the present invention
  • the nucleic acid extraction time can be shortened to within about 5-7 minutes and at least about 20 minutes before obtaining the final nucleic acid amplification product.
  • PCR polymerase chain reaction
  • 8 microliters ( ⁇ l, final concentration 1X) 8 microliters ( ⁇ l, final concentration 1X)
  • real-time PCR mixed solution NBS SYBR Green I Real-time PCR mixture 2X
  • Forward Primer (10 ⁇ M) 1.6 microliters ( ⁇ l, final concentration 1 ⁇ M)
  • Reverse Primer (10 ⁇ M) 1.6 microliters ( ⁇ l, final concentration 1 ⁇ M)
  • template DNA 3 ⁇ L
  • a total of 16 microliters ( ⁇ l) of PCR reagents were prepared, including 1.8 microliters (DW) and 16 ⁇ l of distilled water (DW).
  • Real-time PCR mixed solution (Takara SYBR Green I) Real-time PCR mixture 2X) 10 microliters ( ⁇ l, final concentration 1X), forward primer (10 ⁇ M) 2 microliters ( ⁇ l, final concentration 1 ⁇ M), reverse primer (10 ⁇ M) 2 microliters ( ⁇ L) , Final concentration 1 ⁇ M), template DNA (Template DNA)
  • a total of 20 microliters ( ⁇ l) of PCR reagent was prepared, including 3 microliters ( ⁇ l), distilled water (DW), 3 microliters ( ⁇ l, adjusted to 20 ⁇ l) and the like.
  • Figure 5 shows the result of comparing the nucleic acid extraction method according to the general nucleic acid extraction method and an embodiment of the present invention.
  • Figure 5a is a graph measuring the real-time PCR results using the PCR device of the present applicant by the PCR cycle fluorescence
  • Figure 5b is a photograph of gel electrophoresis of the final PCR product.
  • curve (1) is a PCR result curve (X-axis: period, Y-axis: fluorescence) of a DNA product by a general nucleic acid extraction method in Example 1
  • curve (2) is seen in Example 1
  • curve (3) is a negative control curve using a solution that does not contain DNA.
  • curve (1) and curve (2) versus curve (3) start to rise from about 20 cycles, so that Example 2 can be seen to proceed with the appropriate polymerase chain reaction.
  • the nucleic acid extraction method according to the embodiment of the present invention can confirm that the DNA product was correctly extracted.
  • column 1 is the PCR result of the DNA product by the nucleic acid extraction method in general in Example 1
  • column 2 is the DNA product of the nucleic acid extraction method in accordance with an embodiment of the present invention in Example 1 PCR result
  • column 3 is a negative control result using a solution that does not contain DNA, according to the gel electrophoresis picture of Figure 5b, it can be confirmed again the final result of Figure 5a.
  • the DNA product obtained by the nucleic acid extraction method according to an embodiment of the present invention was amplified using a third-party PCR apparatus (Roche, LightCycler) and the applicant's PCR apparatus (the same as Example 2), respectively.
  • the PCR device of the third party is 30 cycles each for 1 minute (cycle) for 2 minutes for pre-modification step (95 ° C.), 10 seconds for denaturation step (95 ° C.) and 10 seconds for annealing and expansion step (72 ° C.)
  • the polymerase chain reaction (PCR) was carried out, and the applicant's PCR apparatus was subjected to one cycle for 8 seconds for the pre-modification step (95 ° C.), 8 seconds for the denaturation step (95 ° C.), and annealing and expansion step (72 ° C.).
  • the polymerase chain reaction (PCR) was carried out in 30 cycles for 14 seconds each.
  • FIG. 6 shows gel electrophoresis results of amplification of nucleic acids obtained by a nucleic acid extraction method according to an embodiment of the present invention in a third-party PCR device and a PCR device of the present applicant, respectively.
  • Figure 6a is a picture of the gel electrophoresis of the final PCR product using a third-party PCR device
  • Figure 6b is a picture of the gel electrophoresis of the final PCR product using the applicant's PCR device.
  • column 1 is a negative control result for a solution that does not contain DNA
  • column 2 to 4 DNA obtained by using the nucleic acid extraction method according to an embodiment of the present invention from 200 ⁇ l of Mycobacterium tuberculosis cells.

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Abstract

본 발명은 핵산 추출용 미세유동 칩, 이를 포함하는 핵산 추출 장치, 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법에 관한 것으로서, 이에 따르면 기존의 핵산 추출 장치 및 핵산 추출 방법과는 달리, 초소형화 및 초고속화가 가능하고, 아울러 신뢰성 있는 핵산 추출 효율을 유지 및/또는 개선할 수 있다.

Description

핵산 추출용 미세유동 칩, 이를 포함하는 핵산 추출 장치, 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법
본 발명은 세포, 박테리아, 또는 바이러스와 같은 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
최근 유전자 수준에서 질병을 진단, 치료, 또는 예방하기 위하여 세포, 박테리아, 또는 바이러스와 같은 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 기술이 핵산 증폭 반응 기술과 연계되어 널리 활용되고 있다. 또한, 질병의 진단, 치료, 또는 예방 이외에도 맞춤형 신약 개발, 법 의학, 환경 호르몬 검출 등 다양한 분야에서 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 기술이 요구되고 있는 실정이다.
종래 핵산 추출 기술의 일 예로서는 세포를 포함하는 시료를 SDS나 프로테이나아제(proteinase) K로 처리하여 가용화한 후 페놀로 단백질을 변성 제거하여 핵산을 정제하는 방법이 있었다. 그러나, 페놀 추출법은 많은 처리 단계를 수행해야 하기 때문에 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라 핵산 추출 효율이 연구자의 경험과 노련성에 의해 크게 좌우되어 신뢰성이 크게 떨어지는 문제점이 있었다. 최근에는 이러한 문제를 해소하기 위해 핵산과 특이적으로 결합하는 실리카나 유리섬유를 이용하는 키트가 사용되기도 한다. 상기 실리카나 유리섬유는 단백질, 세포 대사 물질들과 결합 비율이 낮으므로 상대적으로 높은 농도의 핵산을 얻을 수 있다. 이와 같은 방법은 페놀법과 비교했을 때 간편하다는 장점은 있지만, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 등의 효소 반응을 강하게 저해시키는 카오트로픽 시약이나 에탄올을 이용하기 때문에 이들 물질을 완전히 제거해야 하며, 이를 이유로 조작이 매우 번거롭고 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 최근 필터를 사용하여 핵산을 직접 정제하는 방법이 국제 공개특허 제00/21973호에 개시되었는데, 이 방법은 시료를 필터에 통과시켜 세포를 필터에 흡착시킨 후 필터에 흡착된 세포를 용해시키고 필터로 여과시킨 후 필터에 흡착된 핵산을 세척 및 용출시키는 것이다. 그러나 세포를 필터에 흡착시킨 후 핵산을 용출시키기 위해서는 세포의 종류에 따라 필터를 선택해야만 한다는 문제가 있고, 사용 장치들이 대형이고 복잡하여 연구자가 용이하게 사용할 수 없는 단점이 있다.
상기와 같은 종래 핵산 추출 기술의 문제점을 해결하고자,
본 발명은 기존의 핵산 추출 장치 및 핵산 추출 방법과는 달리, 초소형화 및 초고속화가 가능하고, 아울러 신뢰성 있는 핵산 추출 효율을 유지 및/또는 개선할 수 있는 미세유동 칩(microfluidic chip), 이를 포함하는 핵산 추출 장치, 및 이를 이용하는 핵산 추출 방법을 제공하기 위함이다.
본 발명의 일 구체예는 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 것으로서, 유입부; 상기 유입부와 연결된 제1 채널 영역에 배치되되, 상기 유입부를 통해 도입되는 생물학적 시료에 외부로부터 얻어진 열을 전달할 수 있도록 구현된 가열부; 상기 가열부와 연결된 제2 채널 영역에 배치되되, 핵산에 상응하는 크기의 물질을 통과시킬 수 있는 제1 필터; 상기 제1 필터와 연결된 제3 채널 영역에 배치되되, 상기 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 결합 물질이 구비되어 있는 핵산 분리부; 상기 핵산 분리부와 연결된 제4 채널 영역에 배치되되, 상기 핵산에 상응하는 크기의 물질을 통과시킬 수 있는 제2 필터; 및 상기 제2 필터와 연결된 유출부를 포함하는, 핵산 추출용 미세유동 칩(microfluidic chip)을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구체예는 상기 본 발명의 일 구체예에 따른 미세유동 칩; 상기 미세유동 칩이 장착되도록 구현된 칩 장착 모듈; 상기 칩 장착 모듈에 장착된 상기 미세유동 칩의 가열부에 열을 가할 수 있도록 구현된 가열 모듈; 및 상기 칩 장착 모듈에 장착된 상기 미세유동 칩의 유입부 및/또는 유출부와 연결되어 상기 미세유동 칩 내부로 핵산 추출을 위한 용액을 도입하거나 및/또는 상기 미세유동 칩 내부에 존재하는 용액을 외부로 배출할 수 있도록 구현된 유체 제어 모듈을 포함하는, 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 장치를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 구체예는 상기 본 발명의 일 구체예에 따른 미세유동 칩을 제공하는 단계; 상기 미세유동 칩의 유입부를 통해 세포, 박테리아, 및 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 시료를 도입하는 단계; 상기 도입된 생물학적 시료를 상기 미세유동 칩의 가열부로 이동시킨 후 상기 미세유동 칩의 가열부에 열을 가하여 상기 생물학적 시료를 용해(lysis)시키는 단계; 상기 용해 단계로부터 획득된 물질을 상기 미세유동 칩의 제1 필터로 이동시킨 후 상기 제1 필터를 통해 통과시키고, 상기 제1 필터를 통과하지 아니한 물질을 제거하는 단계; 상기 제1 필터를 통과한 물질을 상기 미세유동 칩의 핵산 분리부로 이동시킨 후 상기 제1 필터를 통과한 물질 중 핵산을 상기 핵산 결합 물질에 결합시키고, 상기 핵산 결합 물질에 결합되지 아니한 물질을 제거하는 단계; 상기 핵산 결합 물질로부터 상기 핵산을 분리시키고, 상기 분리된 핵산을 상기 제2 필터로 이동시킨 후 제2 필터를 통해 통과시키는 단계; 및 상기 제2 필터를 통과한 물질을 상기 유출부로 이동시킨 후 상기 유출부를 통해 상기 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 방법을 제공할 수 있다.
한편, 상기 본 발명의 일 구체예들에 있어서,
상기 제1 채널 영역 내지 제4 채널 영역을 포함하는 채널은 유체 소통 가능하게 구현되되, 상기 채널의 폭(width) 및 깊이(depth)는 각각 0.001 내지 10 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현될 수 있다.
또한, 상기 제1 필터 및 제2 필터는 0.1 내지 0.4 마이크로미터(㎛) 범위의 직경을 갖는 포어(pore)를 구비하되, 0.01 내지 10 밀리미터(mm) 범위의 두께를 가질 수 있다.
또한, 상기 제1 필터 및 제2 필터는 0.2 마이크로미터(㎛)의 직경을 갖는 포어를 구비하되, 0.01 내지 0.5 밀리미터(mm)의 두께를 가질 수 있다.
또한, 상기 핵산 분리부는 핵산 결합 물질로서 그 표면에 핵산 결합 작용기가 부착된 비드(bead)가 구비되어 있는 것일 수 있다.
또한, 상기 핵산 결합 작용기가 부착된 비드는 0.001 내지 20 밀리미터(mm) 범위 내의 직경을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 핵산 분리부는 1 마이크로그램(㎍) 내지 200 밀리그램(mg) 범위 내에서 핵산 결합 작용기가 부착된 비드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 미세유동 칩은 플라스틱 재질로 구현될 수 있다.
또한, 상기 미세유동 칩은 제1 판; 상기 제1 판 상에 배치되되 상기 제1 채널 영역 내지 제4 채널 영역을 포함하는 채널이 배치된 제2 판; 및 상기 제2 판 상에 배치되되 상기 유입부 및 상기 유출부가 배치된 제3 판을 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 판 및 제3 판은 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르설폰(polyether sulfone, PES), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 재질을 포함하고, 상기 제2 판은 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 사이클로올레핀 코폴리머(cycloolefin copolymer, COC), 폴리아미드(polyamide, PA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether, PPE), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene, POM), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone, PEEK), 폴리테트라프로오르에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate, PBT), 불소화에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene, FEP), 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane, PFA), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 열 가소성 수지 또는 열 경화성 수지 재질을 포함할 수 있다.
또한, 상기 제3 판의 유입부는 직경 0.1 내지 5.0 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현되고, 상기 유출부는 직경 0.1 내지 5.0 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현되고, 상기 제1판 및 제3 판의 두께는 0.01 내지 20 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현되며, 상기 제2 판의 두께는 30 마이크로미터(㎛) 내지 10 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현될 수 있다.
본 발명에 따른 미세유체 칩 및 이를 포함하는 핵산 추출 장치에 따르면, 핵산 추출 효율을 유지 및/또는 개선하면서도 기존의 핵산 추출 장치와는 달리, 장치의 초소형화 및 사용 편리성을 크게 개선할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 미세유체 칩을 이용한 핵산 추출 방법에 따르면, 핵산 추출 효율을 유지 및/또는 개선하면서도 기존의 핵산 추출 방법과는 달리, 핵산 추출의 초고속화 및 공정 효율성을 크게 개선할 수 있다.
더 나아가, 본 발명에 따른 미세유동 칩, 이를 포함하는 핵산 추출 장치, 및 이를 이용한 핵산 추출 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 효율적으로 연계될 수 있어서 질병 진단, 예방, 치료 등 다양한 분야에서 그 활용도가 높다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩 및 그의 구성요소들을 도시한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩의 단면도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩이 장착된 핵산 추출 장치의 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법의 흐름도이다.
도 5는 일반적인 핵산 추출 방법 및 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법을 비교한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법에 의해 획득된 핵산을 타사 PCR 장치 및 본 출원인의 PCR 장치에서 각각 증폭한 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예를 상세하게 설명한다.
이하 기술된 설명은 본 발명의 일 실시예들을 쉽게 이해하기 위한 것일 뿐이며, 그러한 설명으로부터 본 발명의 보호범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩 및 그의 구성요소들을 도시한다.
도 1에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩은 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 것으로서, 유입부(10); 상기 유입부(10)와 연결된 제1 채널 영역에 배치되되, 상기 유입부(10)를 통해 도입되는 생물학적 시료에 외부로부터 얻어진 열을 전달할 수 있도록 구현된 가열부(20); 상기 가열부(20)와 연결된 제2 채널 영역에 배치되되, 핵산에 상응하는 크기의 물질을 통과시킬 수 있는 제1 필터(30); 상기 제1 필터(30)와 연결된 제3 채널 영역에 배치되되, 상기 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 결합 물질(45)이 구비되어 있는 핵산 분리부(40); 상기 핵산 분리부(40)와 연결된 제4 채널 영역에 배치되되, 상기 핵산에 상응하는 크기의 물질을 통과시킬 수 있는 제2 필터(50); 및 상기 제2 필터(50)와 연결된 유출부(60)를 포함한다.
상기 핵산 추출용 미세유동 칩(microfluidic chip)이라 함은 핵산 추출을 위한 구성요소, 즉 유입부(inlet), 유출부(outlet), 상기 유입부 및 유출부를 연결하는 채널(channel), 제1 필터, 및 제2 필터 등의 규격이 밀리미터(mm) 또는 마이크로미터(㎛) 단위에서 구현되는 초소형 칩(chip)을 말한다.
상기 생물학적 시료는 DNA 또는 RNA 등과 같은 핵산을 포함하는 생물학적 물질로서, 예를 들어, 동물 세포, 식물 세포, 병원균, 곰팡이, 박테리아, 바이러스 등을 포함하는 액체 시료일 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유입부(10)는 상기 생물학적 시료 또는 핵산 추출을 위한 용액 등이 상기 미세유체 칩 내부로 도입되는 부분이고, 상기 유출부(60)는 상기 생물학적 시료로부터 획득된 핵산, 핵산 추출을 위한 용액, 기타 폐기물(waste) 등이 상기 미세유체 칩 외부로 배출되는 부분이다. 이 경우 필요에 따라 유입부(10)과 유출부(60)은 각각 유출부 및 유입부의 역할을 수행할 수 있다. 상기 핵산 추출을 위한 용액은 핵산 추출 시 요구되는 모든 용액을 포함하고, 예를 들어 증류수, 핵산 결합 버퍼(binding buffer), 용출 버퍼(elution buffer) 등일 수 있다. 한편, 상기 유입부(10) 및 상기 유출부(60)는 채널(70)에 의해 유체 소통 가능하게 연결되고, 이하 상세하게 설명될 가열부(20), 제1 필터(30), 핵산 분리부(40), 제2 필터(50) 등의 구성요소는 상기 채널(70)에 구동가능하도록 배치되어 각 기능을 수행하게 된다. 상기 채널(70)은 다양한 규격으로 구현될 수 있지만, 상기 채널의 폭(width) 및 깊이(depth)는 각각 0.001 내지 10 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현되는 것이 바람직하다. 이하 설명될 제1, 제2, 제3, 제4 채널 영역은 상기 유입부(10)으로부터 상기 유출부(60)까지의 순차적 배치를 의미할 뿐, 상기 채널(70) 내의 특정 위치로 제한되는 것은 아니다.
상기 가열부(20)는 상기 유입부(10)를 통해 도입된 용액(생물학적 시료 포함)에 외부로부터 얻어진 열이 가해지는 부분으로서, 상기 유입부(10)와 연결된 제1 채널 영역에 배치된다. 예를 들어, 상기 유입부(10)를 통해 세포, 박테리아, 또는 바이러스를 포함하는 시료가 도입되는 경우 상기 세포, 박테리아, 또는 바이러스가 상기 가열부(20)에 도달하면 순간적으로 약 80 내지 100도(℃)로 가열되기 때문에 상기 세포, 박테리아, 또는 바이러스의 외벽이 파괴되고 그 세포 내 물질이 외부로 방출되게 된다(cell lysis). 상기 가열부(20)는 이하 설명될 핵산 추출 장치의 가열 모듈(600)로부터 접촉식 또는 비-접촉식 방식으로 열을 공급받을 수 있다.
상기 제1 필터(30)는 일정한 크기의 포어(pore)를 갖는 구조체로서, 유체 흐름 방향으로 상기 포어를 통해 크기별로 통과 물질과 비-통과 물질을 구별해 주는 역할을 수행한다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제1 필터(30)는 상기 가열부(20)와 연결된 제2 채널 영역에 배치되고, 핵산에 상응하는 크기의 물질을 통과시킬 수 있도록 구현된다. 상기 제1 필터(30)는 상기 가열부(20)에서 가열에 의해 생긴 용해 산물 중 핵산보다 큰 크기의 물질을 상기 가열부(20)에 포집하되, 핵산 및 그에 상응하는 크기를 갖는 물질은 여과하여 이하 설명될 핵산 분리부(40)로 이동시킨다. 상기 제1 필터(30)는 다양한 규격으로 구현될 수 있으나, 0.1 내지 0.4 마이크로미터(㎛) 범위의 직경을 갖는 포어(pore)를 구비하되, 0.01 내지 10 밀리미터(mm) 범위의 두께를 갖는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 상기 제1 필터(30)는 0.2 마이크로미터(㎛)의 직경을 갖는 포어를 구비하되, 0.01 내지 0.5 밀리미터(mm)의 두께를 갖는 것이 바람직하다.
상기 핵산 분리부(40)는 핵산 또는 이에 상응하는 크기를 갖는 물질 중에서 상기 핵산을 선택적으로 분리하기 위한 것이다. 도 1에 따르면, 상기 핵산 분리부(40)는 상기 제1 필터(30)와 이하 설명될 제2 필터(50) 사이의 공간으로서, 상기 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 결합 물질(45)이 구비되어 있다. 상기 핵산 결합 물질(45)은 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 모든 물질을 포함한다. 상기 핵산 결합 물질(45)은 핵산 결합 작용기가 부착된 것으로서, 예를 들어, 실리카(SiO2) 비드, 바이오틴(biotin) 또는 스트렙타비딘(strptavidin) 부착 비드일 수 있다. 상기 핵산 결합 작용기가 부착된 비드는 다양한 규격으로 구현될 수 있으나, 0.001 내지 20 밀리미터(mm) 범위 내의 직경을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 상기 핵산 분리부(40)는 상기 핵산 결합 작용기가 부착된 비드를 다양한 함량으로 포함할 수 있으나, 1 마이크로그램(㎍) 내지 200 밀리그램(mg) 범위 내에서 포함하는 것이 바람직하다. 상기 핵산 결합 물질(45)에 핵산이 특이적으로 결합된 후 상기 핵산 분리부(40)의 내부를 세척하여 이물질을 제거하면 상기 핵산 결합부(40)에는 표적 핵산-핵산 결합 물질(45)의 복합체(complex)만 남아 있게 된다. 그 후 상기 핵산 분리부(40)에 용출 버퍼(elution buffer)가 제공되면 상기 표적 핵산이 상기 복합체로부터 분리된다.
상기 제2 필터(50)는 이미 설명된 제1 필터(30)과 같이, 일정한 크기의 포어(pore)를 갖는 구조체로서, 유체 흐름 방향으로 상기 포어를 통해 크기별로 통과 물질과 비-통과 물질을 구별해 주는 역할을 수행한다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제2 필터(50)는 상기 핵산 분리부(40)와 연결된 제4 채널 영역에 배치되고, 핵산에 상응하는 크기의 물질을 통과시킬 수 있도록 구현된다. 상기 제2 필터(50)는 상기 핵산 분리부(40)에서 상기 핵산 결합 물질(45)은 포집하되, 상기 핵산 결합 물질(45)로부터 분리된 핵산은 여과하여 상기 유출부(60)로 이동시킨다. 상기 제2 필터(50)는 다양한 규격으로 구현될 수 있으나, 0.1 내지 0.4 마이크로미터(㎛) 범위의 직경을 갖는 포어(pore)를 구비하되, 0.01 내지 0.5 밀리미터(mm) 범위의 두께를 갖는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, 상기 제2 필터(50)는 0.2 마이크로미터(㎛)의 직경을 갖는 포어를 구비하되, 0.3 밀리미터(mm)의 두께를 갖는 것이 바람직하다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩의 단면도이다.
도 2에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩의 단면도를 확인할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩은 은 제1 판(100); 상기 제1 판 상에 배치되되 상기 제1 채널 영역 내지 제4 채널 영역을 포함하는 채널(70)이 배치된 제2 판(200); 및 상기 제2 판(200) 상에 배치되되 상기 유입부(10) 및 상기 유출부(60)가 배치된 제3 판(300)을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩은 다양한 재질로 구현될 수 있으나, 바람직하게는 플라스틱 재질로 구현될 수 있다. 이와 같이, 플라스틱 재질을 사용하는 경우 플라스틱 두께 조절만으로 열 전달 효율을 증대시킬 수 있고, 제작 공정이 단순하여 제조 비용을 크게 절감시킬 수 있다. 한편, 상기 제1 판(100) 및 제3 판(300)은 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르설폰(polyether sulfone, PES), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 재질을 포함하고, 상기 제2 판(200)은 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 사이클로올레핀 코폴리머(cycloolefin copolymer, COC), 폴리아미드(polyamide, PA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether, PPE), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene, POM), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone, PEEK), 폴리테트라프로오르에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate, PBT), 불소화에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene, FEP), 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane, PFA), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 열 가소성 수지 또는 열 경화성 수지 재질을 포함할 수 있다. 또한, 상기 제3 판의 유입부는 직경 0.1 내지 5.0 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현되고, 상기 유출부는 직경 0.1 내지 5.0 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현되고, 상기 제1판 및 제3 판의 두께는 0.01 내지 20 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현되며, 상기 제2 판의 두께는 30 마이크로미터(㎛) 내지 10 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩은 필요에 따라 2 이상의 유입부, 유출부, 및 이를 연결하는 채널로 구현될 수 있고, 이 경우 하나의 칩 상에서 2 이상의 생물학적 시료로부터 핵산을 추출할 수 있어서 신속하고 효율적으로 핵산을 추출할 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩이 장착된 핵산 추출 장치의 개요도이다.
도 3에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 장치는 이미 설명된 핵산 추출용 미세유동 칩(1); 상기 미세유동 칩(1)이 장착되도록 구현된 칩 장착 모듈(500); 상기 칩 장착 모듈(500)에 장착된 상기 미세유동 칩(1)의 가열부(20)에 열을 가할 수 있도록 구현된 가열 모듈(600); 및 상기 칩 장착 모듈(500)에 장착된 상기 미세유동 칩(1)의 유입부(10) 및/또는 유출부(60)와 연결되어 상기 미세유동 칩(1) 내부로 핵산 추출을 위한 용액을 도입하거나 및/또는 상기 미세유동 칩(1) 내부에 존재하는 용액을 외부로 배출할 수 있도록 구현된 유체 제어 모듈(700)을 포함할 수 있다.
상기 핵산 추출 장치는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동 칩(1)이 장착된 상태에서 핵산 추출을 위한 모든 단계를 수행할 수 있도록 구현된 장치로서, 상기 언급된 칩 장착 모듈(500), 가열 모듈(600), 및 유체 제어 모듈(700) 이외에도 기타 핵산을 추출하기 위해 요구되는 다양한 모듈을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 장치는 모든 단계가 자동화 방식으로 구현될 수 있고, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 장치와 연계되어 핵산 추출 이후 핵산 증폭 반응이 즉시 진행될 수 있도록 구현될 수 있다.
상기 핵산 추출용 미세유동 칩(1)은 이미 설명된 바와 같다.
상기 칩 장착 모듈(500)은 상기 미세유동 칩(1)이 장착되는 부분이다. 상기 칩 장착 모듈(500)은 상기 미세유동 칩(1)의 접촉 면의 형상에 대응하여 다양하게 구현될 수 있다.
상기 가열 모듈(600)은 상기 미세유동 칩(1)이 상기 칩 장착 모듈(500)에 장착되었을 때 상기 미세유동 칩(1)의 가열부(20)에 열을 공급하는 모듈이다. 상기 가열 모듈(600)은 다양하게 구현될 수 있으나, 접촉식 열 블록(heating block)이 바람직하다.
상기 유체 제어 모듈(700)은 상기 칩 장착 모듈(500)에 장착된 상기 미세유동 칩(1)의 유입부(10) 및/또는 유출부(60)와 연결되어 상기 미세유동 칩(1) 내부로 핵산 추출을 위한 용액을 도입하거나 및/또는 상기 미세유동 칩(1) 내부에 존재하는 용액을 외부로 배출할 수 있도록 구현된 모듈이다. 상기 유체 제어 모듈(700)은 다양한 구성요소를 포함할 수 있는데, 예를 들어 유체 이동 통로인 미세 채널, 유체 이동의 구동력을 제공하는 공압 펌프, 유체 이동의 개폐를 제어할 수 있는 밸브, 및 핵산 결합 버퍼, 용출 버퍼, 실리카 겔(silica gel), 증류수(DW) 등 핵산 추출을 위해 요구되는 다양한 용액을 포함하는 저장 챔버 등을 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 장치는 상기 미세유동 칩(1), 상기 가열 모듈(600), 및 상기 유체 제어 모듈(700)을 자동으로 제어하기 위한 전자 제어 모듈(도시되지 않음)을 더 포함할 수 있다. 상기 전자 제어 모듈은 미리 저장된 프로그램에 따라 상기 미세유동 칩(1) 내에서 정량의 핵산이 추출될 수 있도록 상기 각 모듈들을 정밀하게 제어할 수 있다. 상기 미리 저장된 프로그램이라 함은 예를 들어, 이하 상세하게 설명될 핵산 추출 방법에 관한 일련의 단계에 관한 프로그램을 포함한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법의 흐름도이다.
도 4에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법은 이미 설명된 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩(1)을 전제로 한다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 방법은
본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩을 제공하는 단계(미세유동 칩 제공 단계);
상기 미세유동 칩의 유입부를 통해 세포, 박테리아, 및 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 시료를 도입하는 단계(생물학적 시료 도입 단계);
상기 도입된 생물학적 시료를 상기 미세유동 칩의 가열부로 이동시킨 후 상기 미세유동 칩의 가열부에 열을 가하여 상기 생물학적 시료를 용해(lysis)시키는 단계(생물학적 시료 용해 단계);
상기 용해 단계로부터 획득된 물질을 상기 미세유동 칩의 제1 필터로 이동시킨 후 상기 제1 필터를 통해 통과시키고, 상기 제1 필터를 통과하지 아니한 물질을 제거하는 단계(제1 필터를 통한 여과 단계);
상기 제1 필터를 통과한 물질을 상기 미세유동 칩의 핵산 분리부로 이동시킨 후 상기 제1 필터를 통과한 물질 중 핵산을 상기 핵산 결합 물질에 결합시키고, 상기 핵산 결합 물질에 결합되지 아니한 물질을 제거하는 단계(핵산 분리 단계);
상기 핵산 결합 물질로부터 상기 핵산을 분리시키고, 상기 분리된 핵산을 상기 제2 필터로 이동시킨 후 제2 필터를 통해 통과시키는 단계(제2 필터를 통한 여과 단계); 및
상기 제2 필터를 통과한 물질을 상기 유출부로 이동시킨 후 상기 유출부를 통해 상기 핵산을 추출하는 단계(핵산 추출 단계);
를 포함할 수 있다.
이하, 실시예 1 내지 3에서는 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하면서 핵산 추출물의 산출량과 진행 시간을 파악하고, 더 나아가 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 핵산 추출물의 결과 신뢰성을 재차 확인하였다.
실시예 1. 핵산 추출의 산출량 및 진행시간 확인
먼저, 결핵균주 세포를 대상으로 일반적인 튜브(tube) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩을 각각 이용하여 DNA를 추출한 후 그 산출량 및 진행시간을 확인하였다.
일반적인 핵산 추출 단계는 아래와 같다.
결핵균주 세포를 준비하고, 상기 결핵균주 세포를 6% NaOH 및 4% NaLC와 1:1:1 비율로 혼합하여 샘플 용액으로 제조하였다. 그 후, 상기 샘플 용액을 원심분리하여 상층액을 제거하였다(20분, 4300 rpm, 4℃). 그 후, 샘플 용액에 증류수(DW) 1 ㎖를 첨가하고, 볼텍싱(vortexing)한 후 상기 샘플 용액을 다른 튜브에 옮겼다. 그 후, 상기 샘플 용액을 재차 원심분리 후 상층액을 제거하였다(3분, 12000 rpm, 상온). 그 후, 상기 샘플 용액에 증류수(DW) 1 ㎖를 첨가하고, 볼텍싱(vortexing)하였다. 그 후, 상기 샘플 용액에 증류수(DW) 500 ㎕를 첨가하고, 유전체 DNA를 획득하였다(이 경우 상업적으로 이용가능한 QIAamp DNA Kit를 사용함). 그 결과, 최종 DNA 산물은 약 100 ㎕가 획득되었고, 최종 DNA 산물을 획득하는데 약 1시간 이상이 소요되었다.
뒤이어, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩을 이용하여 동일한 결핵균주 세포로부터 핵산을 추출하였는데, 상세 과정은 아래와 같다.
결핵균주 세포를 준비하고, 상기 결핵균주 세포를 6% NaOH 및 4% NaLC와 1:1:1 비율로 혼합하여 샘플 용액으로 제조하였다. 그 후, 도 1에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩{25×72×2mm, 실리카 비드(OPS Diagnostics, LLC), 필터(Whatman)}의 유입부에 실린지를 이용하여 상기 샘플 용액을 도입하였다(약 1분 소요). 그 후, 본 발명의 일시예에 따른 미세유동 칩의 유입부에 실리카 겔(silica gel) 및 1X DNA 결합 버퍼(binding buffer) 300 ㎕을 도입한 후 본 발명의 일시예에 따른 미세유동 칩의 가열부를 95℃로 급속 가열하였다(약 1분 30초 소요). 그 후, 본 발명의 일시예에 따른 미세유동 칩의 유입부를 통해 샘플 용액 중 폐기물을 제거하고 용출 버퍼(elution buffer) 100 ㎕를 도입하였다(약 30초 소요). 그 후, 본 발명의 일시예에 따른 미세유동 칩의 유출부를 통해 최종 산물을 획득하고, 확인한 결과 최종 DNA 산물은 약 100 ㎕가 획득되었고, 최종 DNA 산물을 획득하는데 전체 약 7분 정도가 소요되었다. 이 경우 상기 실험을 수작업이 아닌 자동화 핵산 추출 장치로 진행했을 경우 그 소요시간은 약 5분 이내로 감소할 것임은 자명하다.
상기 실험 결과, 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동 칩을 이용하면, 핵산 추출 산물의 양은 그대로 유지될 수 있는데 반해, 기존 핵산 추출 방법과는 달리 총 소요시간은 크게 단축시킬 수 있다는 점을 확인할 수 있다.
실시예 2. 일반적인 핵산 추출 방법 및 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법에 의해 획득된 각각의 DNA 산물의 중합효소 연쇄 반응 결과
상기 실시예 1에서 획득된 DNA 산물의 신뢰성을 확보하기 위하여 상기 DNA 산물을 기초로 하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 진행하였다. 상기 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 본 출원인의 한국 특허출원 제2011-0037352호에 기재된 2개의 열 블록을 포함하는 PCR 장치 및 상업적으로 이용가능한 타사의 PCR 장치(Roche, Light cycler)를 이용하였다. 상기 본 출원인의 PCR 장치는 실시간(real time) PCR 장치로서, 기판 상에 배치된 제1 열 블록; 상기 기판 상에 상기 제1 열 블록과 이격 배치된 제2 열 블록; 및 상기 제1 열 블록 및 제2 열 블록 위로 구동 수단에 의해 좌우 및/또는 상하 이동 가능하고, 광투과성 플라스틱 재질의 PCR 칩이 장착된 칩 홀더를 포함한다. 또한, 상기 구동 수단은 좌우 방향으로 연장된 레일, 및 상기 레일을 통해 좌우 방향으로 슬라이딩 이동가능하게 배치되고, 상하 방향으로 슬라이딩 이동 가능한 연결 부재를 포함하고, 상기 연결 부재의 일 말단은 상기 칩 홀더가 배치된 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 제1 열 블록과 제2 열 블록 사이에 광원이 더 배치되고, 상기 칩 홀더 위에 상기 광원으로부터 방출되는 광을 검출하기 위한 광 검출부가 더 배치되거나, 또는 상기 제1 열 블록과 제2 열 블록 사이에 광원으로부터 방출되는 광을 검출하기 위한 광 검출부가 더 배치되고, 상기 칩 홀더 위에 광원이 더 배치되는 것을 특징으로 한다. 상기 PCR 칩 및 PCR 장치를 이용하면, PCR 수행 시간을 약 5 내지 15분 이내로 크게 단축시킬 수 있는데, 상기 PCR 칩 및 PCR 장치를 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출용 미세유동 칩 및 핵산 추출 장치와 연계할 경우 핵산 추출 시간을 약 5 내지 7분 이내로 단축할 수 있고, 최종 핵산 증폭 산물을 획득하기까지 최소 약 20분 이내로 단축할 수 있다. 한편, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하기 위하여, 상기 본 출원인의 PCR 장치를 이용하는 경우 실시간 PCR 혼합용액(NBS SYBR Green I Real-time PCR mixture 2X) 8 마이크로리터(㎕, 최종 농도 1X), 정방향 프라이머(Forward Primer, 10μM) 1.6 마이크로리터(㎕, 최종 농도 1μM), 역방향 프라이머(Reverse Primer, 10μM) 1.6 마이크로리터(㎕, 최종 농도 1μM), 주형 DNA(Template DNA) 3 마이크로리터(㎕), 증류수(DW) 1.8 마이크로리터(㎕, 16 ㎕로 조절) 등을 포함하는 총 16 마이크로리터(㎕)의 PCR 시약을 준비하였고, 타사의 PCR 장치를 이용하는 경우 실시간 PCR 혼합용액(Takara SYBR Green I Real-time PCR mixture 2X) 10 마이크로리터(㎕, 최종 농도 1X), 정방향 프라이머(Forward Primer, 10μM) 2 마이크로리터(㎕, 최종 농도 1μM), 역방향 프라이머(Reverse Primer, 10μM) 2 마이크로리터(㎕, 최종 농도 1μM), 주형 DNA(Template DNA) 3 마이크로리터(㎕), 증류수(DW) 3 마이크로리터(㎕, 20 ㎕로 조절) 등을 포함하는 총 20 마이크로리터(㎕)의 PCR 시약을 준비하였다.
도 5는 일반적인 핵산 추출 방법 및 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법을 비교한 결과를 도시한다. 구체적으로, 도 5a는 상기 본 출원인의 PCR 장치를 이용한 실시간 PCR 결과를 PCR 주기별 형광도로 측정한 그래프이고, 도 5b는 최종 PCR 산물의 겔(gel) 전기영동의 사진이다.
도 5a에 있어서, 곡선 (1)은 실시예 1에서 일반적인 핵산 추출 방법에 의한 DNA 산물의 PCR 결과 곡선(X축: 주기, Y축: 형광도)이고, 곡선 (2)는 실시예 1에서 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법에 의한 DNA 산물의 PCR 결과 곡선이며, 곡선 (3)은 DNA가 포함되지 아니한 용액을 이용한 음성 대조군 곡선이다. 도 5a에 따르면, 곡선 (3) 대비 곡선 (1) 및 곡선 (2)가 약 20 주기(cycle)부터 상승하기 시작하는 것으로 보아, 실시예 2는 적절한 중합효소 연쇄 반응을 진행하고 있는 것으로 볼 수 있고, 곡선 (2) 및 (3)이 약 30 주기일 때 각각 약 350 및 250 정도의 형광도를 나타내는 것으로 보아 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법은 DNA 산물을 정확하게 추출하였음을 확인할 수 있고, 더 나아가 일반적인 핵산 추출 방법에 비해 중합효소 연쇄 반응 산물의 양도 개선되었다는 점을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법의 경우 완료까지 약 15분이 소요되었다. 아울러, 도 5b에 있어서, 컬럼 1은 실시예 1에서 일반적인 핵산 추출 방법에 의한 DNA 산물의 PCR 결과이고, 컬럼 2는 실시예 1에서 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법에 의한 DNA 산물의 PCR 결과이며, 컬럼 3은 DNA가 포함되지 아니한 용액을 이용한 음성 대조군 결과인데, 도 5b의 겔 전기영동 사진에 따르면, 도 5a의 최종 결과를 재차 확인할 수 있다. 한편, 상기 타사의 PCR 장치를 이용한 실시간 PCR 결과를 PCR 주기별 형광도로 측정하고, 최종 PCR 산물의 겔(gel) 전기영동의 사진을 확인한 결과, 상기 도 5a 및 도 5b의 결과와 거의 동일하게 측정되었으나, 완료까지 약 30분이 소요되었다.
실시예 3. 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법에 의해 획득된 DNA 산물의 장치별 중합효소 연쇄 반응 결과
본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법에 의해 획득된 DNA 산물을 타사의 PCR 장치(Roche, LightCycler) 및 본 출원인의 PCR 장치(실시예 2와 동일)를 각각 이용하여 증폭하였다. 이 경우 상기 타사의 PCR 장치는 전-변성 단계(95℃) 2분간 1 사이클(cycle), 변성 단계(95℃) 10초 및 어닐링 및 확장 단계(72℃) 10초간 각각 30 사이클(cycle)로 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 진행하였고, 본 출원인의 PCR 장치는 전-변성 단계(95℃) 8초간 1 사이클(cycle), 변성 단계(95℃) 8초 및 어닐링 및 확장 단계(72℃) 14초간 각각 30 사이클(cycle)로 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 진행하였다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법에 의해 획득된 핵산을 타사 PCR 장치 및 본 출원인의 PCR 장치에서 각각 증폭한 겔 전기영동 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 6a는 타사 PCR 장치를 이용하여 최종 PCR 산물을 겔 전기영동한 사진이고, 도 6b는 본 출원인의 PCR 장치를 이용하여 최종 PCR 산물을 겔 전기영동한 사진이다. 도 6에 있어서, 이 경우 컬럼 1은 DNA가 포함되지 아니한 용액에 대한 음성 대조군 결과이고, 컬럼 2 내지 4는 결핵균 세포 200 ㎕로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법을 이용하여 획득한 DNA 산물을 이용한 최종 PCR 산물의 결과이고, 컬럼 5는 결핵균 세포 1 ㎖로부터 상업적으로 이용가능한 키트(QIAamp DNA Kit)를 이용한 최종 PCR 산물의 결과이다. 결과적으로, 도 6에 따르면, PCR 장치를 달리하더라도 거의 근접한 PCR 결과가 확인되는 바, 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산 추출 방법에 의할 경우 소요시간이 크게 단축됨에도 불구하고(타사의 PCR 장치는 완료까지 약 30분이 소요된 반면, 본 출원인의 PCR 장치는 완료까지 약 15분이 소요됨), 신뢰할 수 있는 핵산 추출 결과를 얻을 수 있음을 재차 확인할 수 있다.

Claims (13)

  1. 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 것으로서,
    유입부;
    상기 유입부와 연결된 제1 채널 영역에 배치되되, 상기 유입부를 통해 도입되는 생물학적 시료에 외부로부터 얻어진 열을 전달할 수 있도록 구현된 가열부;
    상기 가열부와 연결된 제2 채널 영역에 배치되되, 핵산에 상응하는 크기의 물질을 통과시킬 수 있는 제1 필터;
    상기 제1 필터와 연결된 제3 채널 영역에 배치되되, 상기 핵산과 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 결합 물질이 구비되어 있는 핵산 분리부;
    상기 핵산 분리부와 연결된 제4 채널 영역에 배치되되, 상기 핵산에 상응하는 크기의 물질을 통과시킬 수 있는 제2 필터; 및
    상기 제2 필터(50)와 연결된 유출부;
    를 포함하는, 핵산 추출용 미세유동 칩(microfluidic chip).
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 채널 영역 내지 제4 채널 영역을 포함하는 채널은 유체 소통 가능하게 구현되되, 상기 채널의 폭(width) 및 깊이(depth)는 각각 0.001 내지 10 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현되는 것을 특징으로 하는 미세유동 칩.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 필터 및 제2 필터는 0.1 내지 0.4 마이크로미터(㎛) 범위의 직경을 갖는 포어(pore)를 구비하되, 0.01 내지 10 밀리미터(mm) 범위의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 미세유동 칩.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제1 필터 및 제2 필터는 0.2 마이크로미터(㎛)의 직경을 갖는 포어를 구비하되, 0.01 내지 0.5 밀리미터(mm)의 두께를 갖는 것을 특징으로 하는 미세유동 칩.
  5. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분리부는 핵산 결합 물질로서 그 표면에 핵산 결합 작용기가 부착된 비드(bead)가 구비되어 있는 것을 특징으로 하는 미세유동 칩.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산 결합 작용기가 부착된 비드는 0.001 내지 20 밀리미터(mm) 범위 내의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 미세유동 칩.
  7. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분리부는 1 마이크로그램(㎍) 내지 200 밀리그램(mg) 범위 내에서 핵산 결합 작용기가 부착된 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유동 칩.
  8. 제1항에 있어서, 상기 미세유동 칩은 플라스틱 재질로 구현된 것을 특징으로 하는 미세유동 칩.
  9. 제1항에 있어서, 상기 미세유동 칩은 제1 판; 상기 제1 판 상에 배치되되 상기 제1 채널 영역 내지 제4 채널 영역을 포함하는 채널이 배치된 제2 판; 및 상기 제2 판 상에 배치되되 상기 유입부 및 상기 유출부가 배치된 제3 판을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유동 칩.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1 판 및 제3 판은 폴리디메틸실옥산(polydimethylsiloxane, PDMS), 사이클로올레핀코폴리머(cycle olefin copolymer, COC), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmetharcylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리프로필렌카보네이트(polypropylene carbonate, PPC), 폴리에테르설폰(polyether sulfone, PES), 및 폴리에틸렌텔레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 재질을 포함하고, 상기 제2 판은 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 사이클로올레핀 코폴리머(cycloolefin copolymer, COC), 폴리아미드(polyamide, PA), 폴리에틸렌(polyethylene, PE), 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리페닐렌 에테르(polyphenylene ether, PPE), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 폴리옥시메틸렌(polyoxymethylene, POM), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone, PEEK), 폴리테트라프로오르에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE), 폴리비닐클로라이드(polyvinylchloride, PVC), 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF), 폴리부틸렌테레프탈레이트(polybutyleneterephthalate, PBT), 불소화에틸렌프로필렌(fluorinated ethylenepropylene, FEP), 퍼플로로알콕시알칸(perfluoralkoxyalkane, PFA), 및 그의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 열 가소성 수지 또는 열 경화성 수지 재질을 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유동 칩.
  11. 제9항에 있어서, 상기 제3 판의 유입부는 직경 0.1 내지 5.0 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현되고, 상기 유출부는 직경 0.1 내지 5.0 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현되고, 상기 제1판 및 제3 판의 두께는 0.01 내지 20 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현되며, 상기 제2 판의 두께는 30 마이크로미터(㎛) 내지 10 밀리미터(mm) 범위 내에서 구현되는 것을 특징으로 하는 미세유동 칩.
  12. 제1항에 따른 미세유동 칩;
    상기 미세유동 칩이 장착되도록 구현된 칩 장착 모듈;
    상기 칩 장착 모듈에 장착된 상기 미세유동 칩의 가열부에 열을 가할 수 있도록 구현된 가열 모듈; 및
    상기 칩 장착 모듈에 장착된 상기 미세유동 칩의 유입부 및/또는 유출부와 연결되어 상기 미세유동 칩 내부로 핵산 추출을 위한 용액을 도입하거나 및/또는 상기 미세유동 칩 내부에 존재하는 용액을 외부로 배출할 수 있도록 구현된 유체 제어 모듈;
    을 포함하는, 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 장치.
  13. 제1항에 따른 미세유동 칩을 제공하는 단계;
    상기 미세유동 칩의 유입부를 통해 세포, 박테리아, 및 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 시료를 도입하는 단계;
    상기 도입된 생물학적 시료를 상기 미세유동 칩의 가열부로 이동시킨 후 상기 미세유동 칩의 가열부에 열을 가하여 상기 생물학적 시료를 용해(lysis)시키는 단계;
    상기 용해 단계로부터 획득된 물질을 상기 미세유동 칩의 제1 필터로 이동시킨 후 상기 제1 필터를 통해 통과시키고, 상기 제1 필터를 통과하지 아니한 물질을 제거하는 단계;
    상기 제1 필터를 통과한 물질을 상기 미세유동 칩의 핵산 분리부로 이동시킨 후 상기 제1 필터를 통과한 물질 중 핵산을 상기 핵산 결합 물질에 결합시키고, 상기 핵산 결합 물질에 결합되지 아니한 물질을 제거하는 단계;
    상기 핵산 결합 물질로부터 상기 핵산을 분리시키고, 상기 분리된 핵산을 상기 제2 필터로 이동시킨 후 제2 필터를 통해 통과시키는 단계; 및
    상기 제2 필터를 통과한 물질을 상기 유출부로 이동시킨 후 상기 유출부를 통해 상기 핵산을 추출하는 단계;
    를 포함하는, 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 방법.
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