KR20140084075A - 형상 기반 입자 분리를 위한 기기들 및 방법들 - Google Patents

형상 기반 입자 분리를 위한 기기들 및 방법들 Download PDF

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Abstract

입자 분류 시스템은 입구 및 기판에 배치되고 말단부에 하류 팽창 영역을 구비하며, 상기 입구가 마이크로 채널의 상류 단부에 연결되는 관성 집속 마이크로 채널을 포함한다. 상이한 형상의 입자들의 소스는 상기 입구로 연결되며, 상기 상이한 형상의 입자들의 소스는 입구로 연속적인 도입을 위해 구성된다. 복수의 출구들은 하류 팽창 영역에서 상기 마이크로 채널로 연결된다. 유체 저항기들은 각각의 출구들에 위치된다. 상이한 저항들은 출구들에서 특정한 입자 형상(들)을 갖는 입자들의 풍부해진 부분들을 포획하기 위해 사용될 수 있다.

Description

형상 기반 입자 분리를 위한 기기들 및 방법들 {DEVICES AND METHODS FOR SHAPE-BASED PARTICLE SEPARATION}
본 출원은 2011년 9월 30일 출원되어 출원 번호 제 61/541,934호가 할당된 미국 가특허출원 및 2012년 3월 2일 출원되어 출원 번호 제 61/606,287호가 할당된 미국 가특허출원의 우선권을 주장하고, 상기 출원들은 본 명세서에서 전체적으로 참고 문헌으로서 인용된다. 우선권은 35 U.S.C §119에 의하여 주장된다.
본 발명은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 수여된 그랜트 번호 제 0930501호 (Grant No. 0930501) 아래 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정한 권리들을 갖는다.
본 발명의 분야는 대체로 분리 및 분류 용도들에 사용되는 마이크로 유체 기기들에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 분야는 입자들 각각의 형상들에 기초하여 입자들을 분리하고 분류하는 데 사용되는 마이크로 유체 기기들에 관한 것이다.
세포들 또는 마이크로 입자 (microparticle)들의 연속 분리를 위해 마이크로 유체 공학을 사용하는 다양한 시도들이 이루어졌다. 몇몇의 접근 방법들은 마이크로 유체 공학과 외부에서 가해지는 역장 (force field)을 결합시킨다. 예를 들어, 전기, 자기, 광학 및 음향 기반 힘들이 입자들을 분리하기 위해 시도되었다. 또 다른 접근방법들은 마이크로 채널들에서 일어나는 수동 유체역학에 기초하고 있다. 예를 들어, 크기 배제 (size-exclusion) 원리들에 기초하여 작동하는 여러 필터들 [예를 들어, 웨어 타입 (weir-type), 크로스 플로우 타입 (cross-flow type)] 및 박막들이 제안되고 있다. 예를 들어, 타카기 등은 비대칭적으로 배열된 여러 가지 채널 (multiple branch channel)들을 구비한 마이크로 채널을 사용하는 연속 입자 분리 기술을 개발했다. Lab Chip의 2005년 7월 제 5권 제 7호 778 내지 784쪽의 타가기 등의 비대칭적으로 배열된 여러 가지들을 구비한 마이크로 채널에서의 연속 입자 분리를 참조 [Takagi et al., Continuous particle separation in a microchannel having asymmetrically arranged multiple branches, Lab Chip, Jul; 5(7) 778-84 (2005)]. 이 방법은 마이크로 채널 내에서 층류 (laminar flow)를 사용하는 핀치 플로 분류법 (pinched flow fractionation, PFF)의 분리 계획 (scheme)을 개선한다.
야마다 등은 유체 역학적 여과 (hydrodynamic filtration, HDF)를 사용하는 입자들의 연속 농도 및 분류를 위한 마이크로 유체 기기를 제안했다. 이 방법은 여러 측면 채널들을 사용하여 마이크로 유체 채널의 벽을 따라 입자들을 정렬하도록 한다. 추가적인 하류 선택 채널들은 주 채널로부터 상이한 입자들을 선택적으로 추출하는데 사용된다. Lab Chip의 2005년 11월 제 5권 제 11호 1233 내지 1239쪽의 야마다 등의 마이크로 유체 역학을 이용한 온 칩의 입자 농도 및 분류를 위한 유체 역학적 여과를 참조 [Yamada et al., Hydrodynamic filtration for on-chip particle concentration and classification utilizing microfluidics, Lab Chip, Nov; 5(11): 1233-39 (2005)]. 최 등은 미세 구조 유도 압력장 (microstructure-induced pressure field)의 영향 하에서 부유하는 입자들의 이동, 유체 영동 (hydrophoresis)을 사용하는, 마이크로 입자들을 위한 마이크로 유체 분리 및 사이징 (sizing) 기술을 개발했다. 마이크로 채널 내에서 비스듬한 장애물들을 이용함으로써, 측방향 압력 구배 (gradient)를 생성할 수 있어서 마이크로 입자들이 상기 구배에 의해 유도된 측방향 유동들을 따라 편향되고 배열될 수 있다. Lab Chip의 2007년 7월 제 7권 제 7호 890 내지 897쪽의 최 등의 마이크로 채널 내에서 비스듬한 장애물들을 사용하는 미세입자들의 연속 유체 영동 기반의 분리 및 사이징을 참조 [Choi et al., Continuous hydrophoretic separation and sizing of microparticles using slanted obstacles in a microchannel, Lab Chip, Jul; 7(7): 890-97 (2007)].
황 등은 결정론적 측방 이동법 (deterministic lateral displacement, DLD)을 통한 연속 입자 분리 방법을 제안했다. Science의 2004년 5월 제 304권 제 5673호 987 내지 990쪽의 황 등의 결정론적 측방 이동법을 통한 연속 입자 분리를 참조 [Huang et al., Continuous Particle Separation Through Deterministic Lateral Displacement, Science, Vol. 304 No. 5673 pp. 987-990 (May 2004)]. 이 기술은 장애물들 주변의 층류의 비대칭 분기 (bifurcation)를 이용한다. 입자는 그 크기에 따라 결정론적으로 그 경로를 선택한다. 다른 방법들은 원심 분리 (centrifugal separation)에 기초한다. 예를 들어, 오카와라 등은 원심 분리를 위해 2mm의 반원형의 반지름을 갖는 200㎛ × 170㎛의 마이크로 채널의 사용을 보고했으며, 여기서 슬러리 (slurry) 입자들은 분기 채널의 한 아암 (arm)으로 향하게 된다. Chem. Eng. J.의 2004년 제 101권 171 내지 178쪽의 오카와라 등의 마이크로 채널에 의한 슬러리의 농축 장치 및 함유된 입자들의 분류에 관한 타당성 조사를 참조 [Ookawara et al., K. Feasibility Study on Concentrator of Slurry and Classification of Contained Particles by Micro-Channel, Chem. Eng. J., v.101, 171-178 (2004)]. 더욱 최근에, 디 카를로 등은 마이크로 유체 채널 내에서 통제된 방식으로 입자들을 정렬하는 관성 집속 (inertial focusing), 배열 (ordering) 및 분리 기술을 개발했다. PNAS의 2007년 제 104권 제 48호 18892 내지 18897쪽의 디 카를로 등의 마이크로 채널들에서 입자들의 연속 관성 집속, 배열 및 분리를 참조 [Di Carlo et al., Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. PNAS, 104, 48, 18892-18897 (2007)].
그러나, 이러한 대부분의 통합적인 분리 기술들에서 형상은 거의 고려되지 않고, 일반적으로 세포들 및 입자들이 구형이라고 추정하면서 입자의 크기, 변형성 (deformability), 밀도, 전기적 또는 자기적 특성들 또는 그 표면의 분자들도 사용하여 입자들을 분리하도록 한다. 마이크로 입자 분리를 위한 거시적 규모의 종래 기술인 원심 분리 (centrifugation)는 최근 구체들 및 막대 (rod)들의 형상 분리를 위해 고려되고 있다. PNAS의 2009년 제 106권 제 13호 4981 내지 4985쪽의 샤르마 등의 원심 분리를 이용한 금 나노막대들의 형상 분리를 참조 [Sharma et al., Shape separation of gold nanorods using centrifugation. PNAS, 106, 13, 4981-4985 (2009)]. 최근에, 유체 역학적 여과 (HDF), 결정론적 측방 이동법 (DLD) 및 유전 영동 (dielectrophoresis, DEP)이 마이크로 시스템들에 있어서 형상을 분리 기준으로서 고려하기 시작했다. 비치 등은 처음으로 DLD 기술을 사용하는 형상 기반 분류를 도입하고, 필라 네트워크 (pillars network)에 상이한 효과적인 치수들을 야기하는 기기 깊이의 통제를 통하여 비구형 입자들이 DLD 기기들 내에서 지향될 수 있다는 것을 보여준다. 2009년 대한민국 제주에서 개최된 미세 종합 분석 시스템 학회의 회보 800 내지 802쪽의 비치 등의 형상 기반 입자 분류 - 마이크로 유체공학에 있어서 새로운 패러다임을 참조 [Beech et al., Shape-based particle sorting - A new paradigm in microfluidics, Proc. Micro Total Analysis Systems, Jeju, Korea, 800-802 (2009)]. 보다 최근에, 스가야 등은 형상 기반 분리를 위한 HDF의 적용 가능성을 연구했고 분기점에서 구형 및 비구형 입자들의 분리 거동들에 있어서 차이를 입증했으며 효모 세포 혼합물로부터 출아 효모 세포 / 단일 효모 세포들 분류에 이 기술을 사용했다. Biomicrofluidics의 2011년 제 5권 024103쪽의 스가야 등의 유체 역학적 여과를 이용한 연속 형상 기반 분리에 대한 비구형 입자 거동들의 관찰을 참조 [Sugaya et al., Observation of nonspherical particle behaviors for continuous shape-based separation using hydrodynamic filtration, Biomicrofluidics, 5, 024103 (2011)]. 마찬가지로, 발레로 등은 다수의 주파수들에서 대향하는 DEP 힘들의 균형에 의한 효모의 형상 기반 분류를 입증하였다. Lab Chip의 2011년 제 11권 1754 내지 1760쪽의 발레로 등의 유전 영동적 불투명을 이용한 효모 세포 주기의 추적 및 동기화를 참조 [Valero et al., Tracking and synchronization of the yeast cell cycle using dielectrophoretic opacity, Lab Chip, 11, 1754-1760 (2011)].
HDF 및 DLD는 연속적이고 효율적인 기술들이지만 낮은 유속 (각각 2-3μL/min 및 60nL/min)들 및 높은 희석 인자들 모두를 필요로 하고, 결과적으로 낮은 처리량을 제공한다. 또한, 이러한 기술들은 정확히 형성된 제조 공정들 및 복잡한 설계들을 필요로 하며, 이는 상기 분리를 보증하는 데 필요한 상기 구성 (DLD를 위한 필라 네트워크, HDF를 위한 고도로 평행화된 채널들)들이 정확히 설계 (1μm미만의 해상도)되어야 하기 때문이다. 한편, DEP는 각각의 실험 사이에 능동 요소들의 통합 및 완충 전도율 (buffer conductivity)의 정밀하고 재현 가능한 통제를 필요로 하며, 이는 또한 전체의 통합된 마이크로 시스템에서 그 통합을 복잡하게 만든다. DEP 기반의 해결책들은 DEP 기반의 기기들을 복잡하고 비용이 들게 만드는 실행들 사이에서 능동 요소들의 추가적인 통합 및 완충 전도율의 정밀하고 재현 가능한 통제를 필요로 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 입자 분류 시스템은 입구 및 기판에 배치되고 말단부에 하류 팽창 영역 (downstream expanding region)을 구비하는 관성 집속 마이크로 채널 (inertial focusing microchannel)을 포함하며, 상기 입구는 마이크로 채널의 상류 단부에 연결된다. 상이한 형상의 입자들의 소스 (source of different shaped particles)는 입구로 연결되고, 상기 상이한 형상의 입자들의 소스는 상기 입구로 연속적인 도입을 위해 구성된다. 복수의 입구들은 하류 팽창 영역에 있는 마이크로 채널로 연결된다. 유체 저항기 (fluidic resistor)들은 각각의 입구들에 위치된다. 상이한 저항들은 입구들에서 특정한 입자 모양(들)을 갖는 입자들의 풍부해진 부분 (enriched fraction)들을 포획하기 위해 사용될 수 있다.
샘플 유체에서 부유하는 상이한 형상의 입자들을 분류하는 방법은 입자 분류 시스템을 통해 그 내부에 부유하는 상이한 형상의 입자들을 함유하는 샘플 유체를 유동시키게 하는 작동을 포함한다. 상기 시스템은 기판에 배치되고 말단부에 하류 팽창 영역을 구비한 관성 집속 마이크로 채널 및 하류 팽창 영역으로 결합 되는 복수의 출구들을 포함한다. 복수의 유체 저항기들은 각각의 출구들에 위치된다. 상기 방법에서, 유체는 각각의 복수의 출구들에서 수집되고, 적어도 하나의 출구들은 샘플 유체와 비교할 때 적어도 하나의 형상의 입자가 풍부해진 유체를 함유한다.
도 1은 일 실시예에 따르면 입자 분류 시스템 또는 기기를 예시한다.
도 2a는 세 개의 독립적인 입구들로 종결되는 하류 팽창 영역의 확대도를 예시한다. 두 입구들은 동일한 유체 저항기들을 갖는 반면에, 중심 유체 저항기는 적은 저항을 갖는다.
도 2b는 상기 복수의 입구들의 유체 저항들을 조정하기 위한 압력 제어기를 사용하는 입자 분류 기기의 대체 실시예를 예시한다.
도 3은 입자 분류 시스템의 입구로 결합된 입자들의 소스를 예시한다.
도 4a는 무작위의 입자 분포가 입구로 도입되는 높은 종횡비 (H>W)(high-aspect ratio)를 갖는 관성 집속 마이크로 채널과 같은 직사각형 형상의 채널을 예시한다.
도 4b는 도 1의 A영역에서 관성 집속 마이크로 채널(14)의 단면을 예시한다.
도 4c는 도 1의 B영역에서 관성 집속 마이크로 채널(14)의 단면을 예시한다.
도 4d는 입자 분류 시스템을 통해 유동하는 다양한 크기들 및 형상들을 갖는 여러 입자들의 종횡비들 및 치수들을 예시한다. 치수들은 전체적으로 서로 직교인 a 및 b 방향으로 도시되어 있다.
도 4e는 입구에서 포획된 입자들을 찍은 현미경 사진을 예시한다. 스케일 바 (scale bar)는 10μm이다.
도 4f는 입구에서 포획된 입자들을 찍은 현미경 사진을 예시한다. 스케일 바는 10μm이다.
도 5a는 여러 형상의 입자들 (구들, 3:1의 종횡비를 갖는 막대, 5:1의 종횡비를 갖는 막대)에 대한 분포의 변화를 예시하기 위해 플롯된 (패널 이미지들 A, D 및 G에 예시된) 히스토그램들을 예시하며 상이한 채널 구조들의 상이한 레이놀드 숫자들 (삽입)에서 얻어진 것이다.
도 5b는 테스트된 모든 세 채널의 구조들 및 유동 조건들에 대해 그려진 평균 Xeq를 예시한다.
도 6a는 패널 이미지 A에서 구형 및 1:5 막대형 입자들에 대해 Xeq의 함수로 정규화된 입자 카운트(%)의 전형적인 가우시안 피트 (representaive Gaussian fit)를 예시한다. 패널 이미지 B는 분리성 인자 1을 보여준다. 패널 이미지 C는 분리성 인자 2를 보여준다.
도 6b는 여러 유속들에서 25μm 폭 채널 (이미지 D), 30μm 폭 채널(이미지 E) 및 35μm 폭 채널(이미지 F)로부터 얻은 분리성 인자를 예시한다.
도 7a 내지 도 7c는 테스트된 입자 분류 시스템의 세 상이한 구성들을 예시한다.
도 7d는 출구 1 및 2들 사이 영역의 현미경 그래픽 이미지를 예시한다.
도 7e는 출구 4 및 5들 사이 영역의 현미경 그래픽 이미지를 예시한다.
도 7f는 출구 5의 주변 영역의 현미경 그래픽 이미지를 예시한다.
도 7g는 도 7a 기기의 각각의 출구에서 여러 입자들의 EY 및 ER을 예시한다.
도 7h는 도 7b 기기의 각각의 출구에서 여러 입자들의 EY 및 ER을 예시한다.
도 7i는 도 7c 기기의 각각의 출구에서 여러 입자들의 EY 및 ER을 예시한다.
도 7j는 도 7a 기기의 각각의 출구에서 여러 입자들의 EP를 예시한다.
도 7k는 도 7b 기기의 각각의 출구에서 여러 입자들의 EP를 예시한다.
도 7l은 도 7c 기기의 각각의 출구에서 여러 입자들의 EP를 예시한다.
도 8a는 또 다른 실시예에 따르는 입자 분류 시스템을 예시한다.
도 8b는 도 8a 기기의 다섯 출구들 각각에 대한 EY 그래프를 예시한다.
도 8c는 도 8a 기기의 다섯 출구들 각각에 대한 EP 그래프를 예시한다.
도 8d는 도 8a 기기의 다섯 출구들 각각에 대한 ER 그래프를 예시한다.
도 9a는 입자 분류 시스템의 입구에서 세포들의 현미경 이미지를 예시한다. 세포들은 작은 단일 세포 (맨 위 삽입), 큰 단일 세포 (맨 위 삽입으로부터 두 번째), 출아된 세포 (맨 위 삽입으로부터 세 번째), 더블릿 (doublet) 세포 (맨 위 삽입으로부터 네 번째), 집합체 (aggregate) 세포 (마지막 삽입)와 같은 다섯 군들로 분류된다.
도 9b는 출구 2 및 3의 각각의 이미지들을 예시한다. 단일 세포들은 출구 2에서 높은 추출 수율을 갖는 반면에, 출구 3에서 출아된 세포들의 순도는 증가하였다.
도 9c는 여섯 출구들 각각에 대한 EY 및 ER 그래프를 예시한다.
도 9d는 여섯 출구들 각각에 대한 EP 그래프를 예시한다.
도 1은 일 실시예에 따르는 입자 분류 시스템(10)을 예시한다. 상기 입자 분류 시스템(10)은 마이크로 유체 용도들에 적합한 많은 재료들로 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 입자 분류 시스템(10)의 구성들은 폴리다이메틸실록세인(Polydimethylsiloxane, PDMS)로 형성될 수 있고, 이 후 통상의 PDMS 복제 성형 공정을 사용하여 유리 또는 플라스틱과 같은 평면 기판으로 결합된다. 간단히, 표준 리소그래피 기술들은 SU-8 감광 수지 (photoresist)로 스핀 코팅된 실리콘 마스터로부터 주형 (mold)을 생산하기 위해 사용되었다. PDMS 칩들은 실가드 184 엘라스토머 키트 (Sylgard 184 Elastomer Kit)(다우 코닝 사) 및 가교제 (cross-linker) 대 고분자의 1:10의 비율을 사용하여 주형으로부터 생산되었다. 상기 채널들을 둘러싸기 위해, PDMS 및 유리는 함께 결합 되기 전에 공기 플라즈마 (플라즈마 클리너, 해릭 플라즈마, 500mTorr, 30초)에 의해 모두 활성화된다.
다르게는, 입자 분류 시스템(10)의 구성들은 실리콘 또는 플라스틱과 같은 고분자와 같은 기판 상에서 리소그래피 또는 마이크로 유체 기기들을 제조하는 데 공지된 다른 유사한 기술들을 사용하여 직접적으로 형성될 수 있다. 상기 입자 분류 시스템(10)의 장점은 제작 시간 및 비용을 감소시키는 표준 마이크로 유체 제작 기술들을 사용하여 제작될 수 있다는 것이다. 게다가, 활성 방법들과 반대로 입자 분리를 유도하기 위한 어떠한 외부 셋업도 필요 없다. 분리는 구동력으로서 유체의 존재 및 기기 구조에 의존한다. 낮은 유속들을 필요로 하는 DLD 및 HDF 기반의 기기들과는 다르게, 본 명세서에서 기술되는 입자 분류 시스템(10)은 비교적 높은 유속들로 사용될 수 있고, 이는 상기 기기가 높은 처리량을 달성할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, "입자"는 마이크로미터 또는 더 작은 스케일로 치수화되는 작은 물체를 말한다. 입자들은 살아있는 또는 살아있지 않은 물체들 모두를 포함할 수 있다. 입자들의 실례들은 세포들, 박테리아, 바이러스들 등을 포함한다. 입자들은 세포 기관 (organelle)들 또는 더 큰 생물학적 구성 요소들의 하위 요소 (sub-component)들을 포함할 수 있다. 또한, 입자들은 비드 (bead)들 등과 같은 무생물의 물체들을 포함할 수 있다. 입자들은 다른 종(species)들과 결합 되거나 접합될 수 있다. 입자들은 다른 더 작은 물체들의 응집들뿐만 아니라 단일 또는 독립적인 입자들 모두를 포함한다.
입자 분류 시스템은 관성 집속 마이크로 채널(14)의 상류 단부로 연결되는 입구(12)를 포함한다. 도 1에 도시되는 바와 같이, 찌꺼기 또는 관심 있는 다른 큰 입자들을 포획하기 위한 선택적 필터(16)가 있다. 상기 선택적 필터(16)는 규모가 크거나 부피가 큰 입자들이 관성 집속 마이크로 채널(14)로 가는 통로를 막는 하나 이상의 돌출부 (protuberance)들, 지주 (post)들 등에 형성될 수 있다. 상기 관성 집속 마이크로 채널(14)은 수 센티미터 (예를 들어, 4cm)의 길이 및 직사각형의 단면을 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 관성 집속 마이크로 채널(14)은 약 50μm의 높이 및 약 25-35μm의 범위 내의 폭 (비록 이 범위를 벗어나는 다른 치수들이 고려될 수 있지만)을 가질 수 있다.
상기 관성 집속 마이크로 채널(14)은 하류 팽창 영역(18)의 하류 단부에서 종결된다. 바람직하게는, 상기 하류 팽창 영역(18)은 유동 방향 (도 2a의 화살표 A 방향)을 따라 이동함에 따라 서서히 측방향으로 연장한다. 이와 관련하여, 도 2a에 도시되는 바와 같이, 하류 팽창 영역(18)을 형성하는 채널 에지(19)들의 윤곽들은 직선 팽창실 (straight-angled expansion chamber)과는 반대로 만곡되거나 포물선 모양이다. 일반적으로, 관성 집속 마이크로 채널(14)부터 하류 팽창 영역(18)까지 매끈한 형상 전환이 바람직하다. 예를 들어, 하류 팽창 영역(18)을 형성하는 벽들은 유체 유동 방향으로 하류로 이동함에 따라 계속해서 밖으로 향해 굽어지면서 나아갈 수 있다. 예를 들어, 하류 팽창 영역을 형성하는 벽들은 유체 유동 방향을 따라 100μm의 이동마다 2°각도로 계속해서 증가할 수 있다. 이하에서 설명되는 바와 같이, 상기 하류 팽창 영역(18)은 그들의 측방향 간격(Xeq)을 늘리지만, 집속 유선 (focusing streamline)들에 집속된 입자들을 유지한다.
도 1을 참조하면, 복수의 출구(20)들은 하류 팽창 영역(18)으로 연결된다. 각각의 출구(20)는 일 단부에서 팽창 영역(18)으로 개방되는 출구 채널일 수 있다. 더 많거나 적게 사용될 수 있지만, 다섯 개의 이러한 출구(20)들이 예시되어 있다. 각각의 출구(20)는 도 1에 도시된 유체 저항기(22)를 포함하여 도시된다. 상기 유체 저항기(22)는 출구(20)들에서 유동을 제한하는 구조 또는 구조들로부터 형성될 수 있다. 일 예로서, 유동 제한기 (flow restrictor)는 도 2a에 예시된 것과 같은 복수의 선회(turn)들을 갖는 구불구불한 채널(24)이다. 예를 들어, 유체 저항기(22)는 수 센티미터의 총 길이 동안 20개의 이러한 선회들을 가질 수 있다. 상기 선회들의 수는 유체 저항기(22)의 저항을 조절하거나 조정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 2a에 도시되는 바와 같이, 중앙의 유체 저항기(22b)는 외부 유체 저항기(22a, 22c)들 저항의 1/2인 저항을 갖는다. 또 다른 예로서, 유동 제한기는 축소된 지름을 갖는 채널 또는 그곳을 통과하는 유동을 줄이기 위해 형성된 하나 이상의 구조들을 포함하는 채널도 될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 유체 저항기(22)는 출구(20) 내부의 어떠한 종류의 구조가 아니지만 대신에 출구(20)들에서 가해지거나 생성된 압력이다.
예를 들어, 도 2b는 각각의 출구(20)로 결합된 압력 제어기(23)를 사용하는 입자 분류 시스템(10)의 실시예를 예시한다. 상기 압력 제어기(23)는 각각의 출구(20)로 연결되는 독립적인 유체 라인(25)들을 포함한다. 상기 압력 제어기(23)는 여러 출구(20)들로 상이한 압력을 선택적으로 가할 수 있도록 구성된다. 이와 관련하여, 상기 압력 제어기(23)는 상기 출구(20)들의 상대적인 유체 저항들을 조정할 수 있다. 이 실시예에서, 상기 유체 저항을 생성하기 위해 구불구불한 채널들을 만들 필요는 없다. 이 기능성은 압력 제어기(23)로 옮겨진다. 또한, 여러 유체 저항들은 압력 제어기(23)에 의해 역학적으로 조절되거나 조정될 수 있다. 따라서 입자 분류 시스템(10)은 상기 입자 분류 시스템(10)에 어떠한 물리적 변경들을 수행할 필요 없이 재구성될 수 있다.
각각의 유체 저항기(22)는 동일하거나 상이한 유체 저항을 가질 수 있으며, 이는 입자 분류 시스템(10)에서 분류된 입자들의 성질에 따른다. 각각의 출구(20)에 있는 상기 유체 저항기(22)는 구체적으로 설계 또는 "조정"될 수 있어 특정한 입자 모양(들)을 갖는 입자들의 풍부해진 부분들을 포획하도록 한다. 압력이 유체 저항기(22)로서 사용되는 경우에, 여러 출구(20)들을 통과하는 상대적인 유동은 각각의 출구(20)들에서 한정된 할당량들로 개별적으로 압력을 설정함으로써 통제될 수 있다. 더 많거나 적게 사용될 수 있지만, 도 1은 다섯 개의 유체 저항기(22)(R1, R2, R3, R4, R5)들을 예시하고 있다. 또한, 몇몇의 실시예들에서, (압력이 유체 저항기(22)가 되는 경우) 그 내부에 또는 그곳에 적용되는 어떠한 유체 저항기(22)도 구비하지 않은 하나 이상의 출구(20)들이 있을 수 있다. 도 1 및 도 2에 도시되는 바와 같이, 각각의 유체 저항기(22) 뒤에, (도 1에서 1, 2, 3, 4 및 5로 참조되는) 각각의 출구(26)들이 있다.
도 3은 상기 입자 분류 시스템(10)의 일 부분의 측면도를 예시한다. 상기 입자 분류 시스템(10)은 입구(12)를 통해 입구(12)로의 연속 도입을 위해 구성된 상이한 형상의 입자들의 소스(30)로 결합된다. 도 3은 세포(32)들 형태인 입자들을 예시한다. 상기 소스(30)는 다른 입자 타입들 및 형상들이 고려될 수 있지만, 이 실례에서 원형, 막대형 및 불규칙형인 세포(32)들을 함유한다. 도 3은 상이한 형상의 입자들의 소스(30)로서 주입기 (syringe)를 예시하며, 이는 세포(32)들을 상기 입자 분류 시스템(10)으로 연속적으로 주입하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 연속 도입은 단일 배치 유동 프로세스 (single batch flow process)와 반대로 입자들이 연장된 기간에 걸쳐 주입된다는 것을 의미한다. 상기 주입기 (또는 복수의 주입기들)는 입자 분류 시스템(10)을 통하여 세포(32)들을 함유하는 유체를 펌핑하도록 흔히 사용되는 주입기 펌프로 결합될 수 있다. 또한, 상기 입자들은 입구(12)로 주입되는 캐리어 유체 (전형적으로 액체)에 의해 운반된다. 상기 입자 분류 시스템(10)은 넓은 범위의 유속들에 걸쳐 작동할 수 있다. 이하에서 설명되는 바와 같이, 집속 위치에 있어서 형상 기반의 차이들은 20μL/min 내지 110μL/min의 범위 내의 유속들에서 관측되지만, 상기 상한은 유체 현상 그 자체보다는 기기의 결합 강도 (bonding strength)에 의해 제한된다. 따라서, 이 특정한 범위 밖의 유속들 또한 작동할 것으로 예상된다.
도 3의 주입기가 상기 입자 분류 시스템(10)을 통해 상이한 형상의 입자들의 소스(30)를 펌핑하는 것으로서 예시되지만, 마이크로 유체 기기들과 관련하여 사용되는 다른 압력 또는 유동 기반의 이송 기기들도 입자 분류 시스템(10)을 통해 입자들을 연속적으로 유동하도록 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 상이한 크기들 및 형상들의 입자들을 함유하는 유체는 상기 입자 분류 시스템(10)을 통해 연속적으로 펌핑된다. 입자 분류 시스템(10)을 통과하는 입자들의 유속은 상이한 형상의 입자들의 상이한 농축 (enrichment) 및 축적을 유효하게 하도록 조절될 수 있다. 상이한 유체 저항 비율들, 채널 구조들 및 시스템을 통해 유체가 유동하는 속도에 의해 유속들이 달라질 수 있다. 더 넓게 말하자면, 조건들은 레이놀드 수를 변경하기 위해 바뀔 수 있다.
입자 분류 시스템(10)을 사용하기 위해, 상이한 형상의 입자들의 소스(30)는 본 명세서에서 논의된 바와 같이 압력 또는 유동 기술을 사용하여 입구(12)로 연속적으로 유도된다. 상기 입자의 형상들은 원형, 막대형, 직사각형, 타원형, 불규칙형 입자들을 포함하는 여러 상이한 형상들을 포함할 수 있다. 도 1을 참조하면, 입자 분류 시스템(10)의 위치 A에서 상이한 형상의 입자들은 관성 집속 마이크로 채널(14) 전체에 걸쳐 무작위로 분포되어 있다. 관성 집속 마이크로 채널(14)의 대부분을 따라 유동한 후 (예를 들어, 위치 B에서 4cm 주변), 상기 상이한 형상의 입자들은 관성 집속 마이크로 채널(14) 내의 상이한 위치들 또는 흐름들에 집속된다.
각각의 흐름은 특정 형상 입자들의 특정의 풍부해진 양을 갖는다. 이 후 이 흐름들은 출구(20)들에서 입자들이 수집되는 하류 팽창 영역(18)에 의해 추가적인 측방향 분리가 제공된다. 유체 저항기(22)들에 있어서 상이한 저항들은 입자들의 상이한 풍부해진 부분들을 수집하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 입자 분류 시스템(10)을 통과하는 입자들의 유속 또는 레이놀드 수뿐만 아니라 상기 관성 집속 마이크로 채널(14)의 치수들은 상기 수 및 기기 내에서 생성된 독립적인 흐름들의 위치를 수정하기 위해 조절될 수 있다.
도 4a는 높은 종횡비 (H>W)를 갖는 관성 집속 마이크로 채널(14)과 같은 직사각형 형상의 채널을 개략적으로 예시하고 있고, 도시된 바와 같이 무작위의 입자 분포가 입구로 도입된다. 적당한 입자 레이놀드 (Rp) 수들 (예를 들어, 약 0.3 내지 약 4의 범위 내의 수들)에서 무작위로 분포된 입자들이 채널 면들에 중심을 두는 두 평형 영역들로 집속하는 것으로 공지되어 있다. 도 4b는 도 1의 영역 A에서 상기 관성 집속 마이크로 채널(14)의 단면을 예시한다. 도 4b에 도시되는 바와 같이, 여러 형상의 입자들은 유체 내에서 무작위적으로 분포되어 있다. 입자들은 FL /W (벽 효과) 및 FL /S (전단 그레디언트, shear gradient)의 결합된 효과로 인해 관성에 의해 집속된다. 도 4c는 도 1의 영역 B에서 관성 집속 마이크로 채널(14)의 단면을 예시한다. 도 4c에 도시되는 바와 같이, 상기 상이한 형상의 입자들은 관성 집속 마이크로 채널(14)의 폭을 따라 여러 평형 위치들 Xeq에 도달한다. 도 4c에 도시되는 바와 같이, 원형의 입자들은 상기 관성 집속 마이크로 채널(14)의 벽들에 가깝게 정렬되며, 반면에 길이가 긴 또는 막대형 입자들은 관성 집속 마이크로 채널(14)의 중심선에 가깝게 위치된 유선들 내에 위치된다. 막대형 입자들은 동일한 체적을 갖는 구형 입자들보다 채널 중심선으로 더 가까운 안정한 위치로 이동하고, 제프리 궤도들을 따르는 짧은 축 주변으로 주기적으로 "소용돌이" 회전하도록 정렬하며, 채널 벽으로부터 밀쳐진다. 위에서 언급된 관찰들과 유사하게, 더 큰 회전 직경(Dmax)들을 갖는 입자들은 채널 중심선에 가깝게 위치한 유선들 내에서 수집되는 경향을 갖게 되며 (관성 집속 마이크로 채널(14)을 참조), 반면에 더 작은 회전 직경들을 갖는 입자들은 채널 중심선으로부터 측방향으로 떨어져 위치한 유선들 내에서 수집되는 경향을 갖게 될 것이다. 따라서, 출구들은 관성 집속 마이크로 채널(14)에 대해 측방향으로 선택적으로 배치될 수 있어서, 상이한 회전 직경들을 갖는 입자들의 하위 집단 (sub-population)들을 선택적으로 포획한다.
도 4d는 입자 분류 시스템을 통해 유동하는 상이한 크기들 및 형상들을 갖는 여러 입자들의 종횡비들 및 치수들을 예시한다. 도 4e는 입구에서 포획된 입자들을 찍은 현미경 사진을 예시한다. 도 4f는 출구에서 포획된 입자들을 찍은 현미경 사진을 예시한다. 도 4e 및 도 4f의 스케일 바는 10μm이다. 여러 구형 또는 막대형 입자들은 비드들로부터 형성되었다. 3μm 및 6μm 구형 비드들 (폴리사이언스 사)은 챔피언 등에 의해 이전에 발표된 프로토콜을 따라 상이한 종횡비 (R=1:3 및 1:5)들을 갖는 막대들로 늘어진다. 2006년 미국에서 개최된 국립과학원회보 제 103권 제 13호 4930 내지 4934쪽의 챔피언 등의 식균 작용에 있어서 표적 구조의 역할을 참조 [Champion et al., Role of target geometry in phagocytosis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(13):4930-4934 (2006)]. 비드들은 75℃ 물에 열수 가용성 폴리(비닐 알코올) (PVA)의 10% wt/vol의 최종 농도 용액, 5% wt/vol 글리세롤 및 0.08% wt/vol 구형 폴리스티렌 입자들 용액에서 부유되었다. 이 용액은 19 x 27cm의 평평한 표면 상에서 밤새 확산 및 건조되었다. 이 후 상기 막들은 120℃에서 미네랄 오일에서 펼쳐지고 20분 동안 실온에서 건조되었다. 막대형 입자들을 회수하기 위해서, 상기 막들은 이소프로판올 (isopropanol)로 세척되었고 75℃에서 30% 이소프로판올/물에 용해되었다. 상기 입자들은 입자 표면으로부터 모든 PVA를 제거하기 위해 최종적으로 여덟 번 세척되었으며, 각각의 시기마다 이소프로판올의 양을 줄여갔다. 입자 현탁액 (suspension)들은 1x106 beads/mL의 최대 농도에서, 주입기 펌프 (하버드 장치 PHD 2000) 및 유리 주입기 (해밀턴)를 사용하여, 20 내지 110μL/min의 범위의 유속들 Q로 시험 기기로 주입되었다.
상이한 형상의 입자들은 상이한 평형 위치들 Xeq에서 정렬된 후, 여전히 각각의 집속된 유선들에서 유지하고 있는 입자들 사이의 Xeq 차이들을 늘리는 하류 팽창 영역(18)으로 유입된다. 이 후 상기 입자들은 여러 출구 채널(20)들에서 포획된다. 이상 설명된 바와 같이, 상기 유체 저항기(22)들의 저항들은 각각의 출구(20)로부터 수집될 입자들의 부분을 조정하기 위해 조절될 수 있다. 이는 출구(20)들의 유체 저항들의 비율을 조정함으로써 이루어진다. 이는 특정한 출구 채널로부터 출구 유속(Q)들의 비율을 나타내는 α에 의해 표현될 수 있고 (α1:2=QOutlet #1 / QOutlet #2), 이는 직접적으로 출구 유체 저항들의 비율과 관련된다 (α1:2= R1/R2).
본 발명의 일 실시예에서, 입자 분류 시스템(10)을 통해 진행되고 출구(26)들에서 수집된 입자들은 입자 분류 시스템(10)을 통해 한 번 이상의 추가적인 횟수로 진행되어 추가로 양호한 입자 부분에 대한 입자를 농축시키거나 풍부하게 하도록 할 수 있다. 예를 들어, 입자들은 처음에 제1 유속 (예를 들어, 레이놀드 수)으로 입자 분류 시스템을 통해 진행될 수 있고, 후속하여 상이한 유속 (예를 들어, 상이한 레이놀드 수)에서 동일 기기를 통해 한 번 이상 진행된다. 다른 실시예들에서, 입자들은 입자 분류 시스템(10)을 통해 오로지 한 번 진행될 수 있다.
형상은 입자를 구체적으로 식별하기 위한 가장 중요한 인자 중 하나를 나타낸다. 다른 사양 (specification)들 가운데, 형상은 세포 주기 상태의 표지가 될 수 있다. 예를 들어, 구형에서 쌍구면 트윈 (bispherical twin) 또는 더 큰 집합체로 발달하는 효모 세포와 같이, 진핵 세포들은 그 세포 주기 단계에 따라 세포 주기에 의존하는 형상에 있어서의 물리적 변화를 보여준다. 또한, 형상은 세포 상태의 지표이며 임상적 진단들에 사용되는 징후가 될 수 있다. 예를 들어, (예를 들어, 겸상 적혈구 빈혈증, 빈혈증, 말라리아와 같은) 기생충 감염들이 원인이 되는 적혈구 세포 형태의 변화와 같이, 많은 임상적 조건들, 질병들 및 약물들로 인해 혈액 세포 형상은 변할 수 있다. 따라서, 형상은 마이크로 유체 입자 분리에 있어서 특정한 표지로서 사용될 수 있고 무 라벨 (label-free)입자 분류를 위한 기초로서 기능할 수 있다. 다르게는, 기생균들 또는 다른 병원균들과 같은 상이한 크기의 입자들은 체액들로부터 제거 또는 추출될 수 있다. 입자들의 형상에 기초하여 입자들을 연속적으로 집속하고 분리하는 기능은 여러 산업, 임상 및 연구 응용들에 대해 넓은 유용성을 갖는다. 상이한 형상들을 갖지만 유사한 체적들을 갖는 입자들도 분류될 수 있다.
상기 입자 분류 시스템(10)의 또 다른 응용은 오염된 물, 혈액 등과 같은 구형 물체들을 가진 복합 샘플로부터 비구형 표적을 추출하는 형상 기반 처리이다. 예를 들어, 시멘트 강도 및 안정성은 결정적으로 입자의 형상 및 크기와 관련된다. 시멘트 마이크로 입자들의 순수한 부분들로의 분리는 기존 필터들에서 막힘으로 이어지는 입자들의 불규칙한 형상들에 의해 방해받는다. 막히기 쉬운 필터들 없이 상당히 한정된 크기의 입자들의 여과를 위한 접근책은 최적화된 시멘트 공식 (formulation)들의 개발에 도움을 줄 것이며, 여러 건축 응용들에 대한 재료 비용들을 절감하게 된다.
또한, 상기 입자 분류 시스템(10)은 상이한 신장 (elongation) 비율들을 갖는 입자들을 분류하는데 사용될 수 있다. 진핵세포 및 원핵세포들이 물리적인 주기 의존 변화들을 보여주기 때문에, 세포 형상의 신장 또한 세포 주기의 지표로 확인되었다. 세포 주기들을 이해하는 것은 많은 연구 조사들의 주제이며, 이는 효모 세포의 주지된 유전학과 증식 (proliferation) 중에 그들의 특징적인 형상 변화들로 인해 주로 효모 세포들을 사용하여 이루어진다 (예를 들어, 출아 효모 세포들은 구형에서 쌍구면 트윈 또는 더 큰 집합체로 발달한다). 또 다른 실례는 세포 주기의 단계에 따라 동일한 짧은 치수를 유지하면서 길어지는 막대형 박테리아 [예를 들어, 바실루스 (bacilli)]이다. 특정 수명 주기 단계에서 세포들의 풍부함은 세포 주기 의존성 잡음 (cell-cycle dependent noise)을 회피할 수 있고, 집단을 동기화하는데 있어서 미생물학자들을 도와 집단 역학, 비동기화로 이어지는 환경적인 효과들 및 단일 세포 거동에 있어서 확률성을 더 잘 이해하도록 한다. 주어진 주기 단계들에서 이러한 동기화는 대체로 (i) 세포 생리학을 방해하는 화학 약품 (신진대사 물질들)을 사용하거나 온도 상승을 사용하는 침습적 방법들 또는 (ii) 작은 세포들을 분리하는 크기 기반의 세정 (elutriation)에 의해 이루어진다. 침습적 방법들은 세포의 신진 대사를 방해하고 자연적 주기를 교란시키며, 반면에 세정은 아직 활성화 부분에 있지 않은 어린 세포들만을 제공한다. 상기 입자 분류 시스템(10)은 형상 기반 효모 세포 분류 및 동기화를 위한 비침습적, 무 라벨 및 약물이 없는 연속적인 방법을 제공한다.
좀 더 일반적으로, 비구형 입자들의 관성 집속은 여려 연구 분야들에서 관심이 있다. 많은 임의의 형상의 입자들이 계산 및 분석 목적들을 위해 집속하는 것이 중요한 산업 공정 및 생물학에서 널리 연구된다. 구형 대칭성으로부터 이 입자들의 편차는 임피던스 불확실성에 있어 현저한 증가를 야기하는 것으로 최근 입증되었고, 이는 형상의 전기적 측정들의 해석 중에 고려될 필요가 있다. 마찬가지로, 스캐터링 (scattering) 측정들과 같은 크기에 기반한 입자들의 광학 측정들에 있어서, 형상은 결정하기 어려울 수 있다. 관성 집속에 의한 형상 입자들의 정밀한 정렬 및 특히 그들 배향의 예측 가능성은 이러한 종류의 불확실성을 처리하고 더욱 신뢰할 수 있는 측정들을 생산하도록 도울 것이다.
상기 입자 분류 시스템(10)의 또 다른 응용은 바코드화 (bar-coded)된 입자들의 유체 정렬이다. 바코드화된 입자들은 정지 유동 리소그래피를 사용하여 제조되고, 다중 고 처리량 생화학적 분석 (multiplexed and high-throughput biochemical assay)들에 사용된다. 마이크로 시스템들에서 그들의 통합을 복잡하게 하는 능동 안내 레일 (active guiding rail)들 또는 외피 유동 (sheath flow)들에 의한 그들의 정렬의 필요 때문에, 이 입자들은 여전히 적은 연구 응용들에 한정된다. 관성 효과들은 그들 패턴들의 광학적 판독을 위한 정렬의 정밀한 제어 및 바코드화된 입자들의 집속을 가능하게 할 수 있다. 높은 유속들에서 작동할 수 있는 가능성과 함께 외피 유동에 대한 필요를 제거함으로써, 광범위의 광학적 탐지와 통합된 상기 집속 시스템의 높은 평행화를 통해, 입자 기반 생물학적 검사들의 처리량을 크게 증가시킬 수 있다.
또 다른 잠재적인 응용은 물에서 해양 미생물들의 더 효과적인 식별을 위해 세포 분석에 앞서 미세 조류를 분류하는 것이다. 식물성 플랑크톤은 형상 및 크기에 있어서 많은 다양성을 갖추고 있는 바, 비구형 물체들은 채널 내부에서 회전하고 진동하는 패턴으로 수직으로 병진 운동하며 그들의 초기 각도에 의존하고, 동일한 길이를 갖는 세포들은 상이한 각도로 호출 영역을 통과할 수 있고, 상이한 비산 (scatter) 신호들을 유발한다. 또한, 상기 입자 분류 시스템(10)은 마이크로 입자 제조를 위한 품질 관리의 독창적이고 수동적인 공정으로써 사용될 수 있고, 예를 들어, 합성된 입자들로부터 그들의 종횡비에 기초하여 집합체의 선택적 제거를 위해 사용될 수 있다.
- 실험예
관성 집속 위치들에 있어 형상 차이들의 효과를 연구하기 위해, 체계적인 연구가 여러 채널 폭들 (25, 30 및 35μm) 및 4cm 길이의 관성 집속 채널을 구비한 입자 분류 시스템을 사용하여 수행되었다. 넓은 범위의 유속 (20 내지 110μL/min)들이 테스트되었고 Xeq는 이 조건들 각각에 대하여 평가되었다. Xeq는 입자 평균 평형 위치이며, 입자 중심과 채널 벽 사이의 거리를 측정함으로써 예측되고 (0% 또는 50%는 각각, 입자 중심이 채널 벽에 위치하는 것 (0%) 또는 채널 중심에 위치하는 것 (50%)을 가리킴), 각 조건에 대해 100개 이상의 데이터 포인트들로써 예측된다. 도 5a는 여러 형상의 입자들 (구들, 3:1의 종횡비를 갖는 막대, 5:1의 종횡비를 갖는 막대)에 대한 분포의 변화를 예시하기 위해 플롯된 히스토그램들을 예시하며, 이는 상이한 채널 구조들의 (삽입된) 상이한 레이놀드 수들에서 얻어진 것이다. 도 5a의 히스토그램 A는 35μm의 폭 및 20μL/min의 유속을 갖는 채널로부터 작성되었다. 도 5a의 히스토그램 B는 35μm의 폭 및 110μL/min의 유속을 갖는 채널로부터 작성되었다. 도 5a의 히스토그램 D는 30μm의 폭 및 30μL/min의 유속을 갖는 채널로부터 작성되었다. 도 5a의 히스토그램 E는 30μm의 폭 및 40μL/min의 유속을 갖는 채널로부터 작성되었다. 도 5a의 히스토그램 G는 25μm의 폭 및 20μL/min의 유속을 갖는 채널로부터 작성되었다. 도 5a의 히스토그램 H는 25μm의 폭 및 50μL/min의 유속을 갖는 채널로부터 작성되었다.
도 5b는 테스트된 모든 세 채널의 구조들 및 유동 조건들에 대해 플롯된 평균 Xeq를 예시한다. 도 5b의 그래프 C는 35μm 폭의 채널을 갖는 기기로부터 작성되었다. 도 5b의 그래프 F는 30μm 폭의 채널을 갖는 기기로부터 작성되었다. 도 5b의 그래프 I는 25μm 폭의 채널을 갖는 기기로부터 작성되었다. 오차 막대들은 적어도 100회 측정들로부터 얻은 표준 편차를 나타낸다. 유속 및 채널 폭은 상기 형상 입자들의 평형 위치에 크게 영향을 준다.
(채널 종횡비가 1에 가까운) 35μm 폭의 채널에서, 10보다 높은 레이놀드 수들에서 (Re=13 또는 20μL/min), 관성 효과들은 구형 및 막대형 입자들 모두를 농축시키기 시작한다. 먼저, 여러 형상들을 갖는 무작위로 분포된 입자들은 채널 중심선을 향해 이동하고, 가장 중요한 것은 상이한 형상의 입자들은 입자 위치의 매우 상이한 주파수 패턴들을 보여준다는 것이다. 구들은 정확히 집속되고 네 곳의 집속 위치들을 점유하기 시작하였다. 반면에 막대들은 채널 폭을 따라 더 넓게 퍼진다. 상기 유체 관성이 더 증가함에 따라 (Re=72 또는 110μL/min), 상이한 입자 타입들은 서로로부터 더욱 뚜렷하게 이동한다. 구형 입자들은 벽들로 가장 가까워지며, 반면에 더 높은 입자 종횡비들에 대해서는 양쪽 벽으로부터의 거리가 모두 증가한다.
채널 폭을 35μm로부터 30μm로 줄이는 것은 상기 채널 단면의 종횡비를 바꾸고, 이에 따라 오직 두 별개의 평형 위치들로의 이동에 이르게 된다. 먼저 30μL/min (Re=21)에서 1:5의 막대들은 구들 및 1:3 막대들로부터 분리된다. 분리 가능성을 특성화하기 위해, 두 종류의 입자들 사이의 평균 집속 위치들의 차이로서 계산되는 분리가능성 인자가 정의되며 (SFType1 - Type2), 아래 식 (1)에 의해 보는 바와 같이 그들의 표준 편차들의 평균에 의해 표준화된다.
Figure pct00001
도 6a는 패널 이미지 A에서 구형 및 1:5 막대형 입자들에 대해 Xeq의 함수로 정규화된 입자 카운트(%)의 전형적인 가우시안 피트를 예시한다. 도 6a의 이미지 B는 분리성 인자가 1일 때의 두 플롯의 가우시안 피트를 예시한다. 도 6a의 이미지 C는 분리성 인자가 2일 때의 두 플롯의 가우시안 피트를 예시한다. 상기 채널 폭이 30μm로 유속이 30μL/min (Re=21)으로 감소될 때, 다음의 분리성 인자가 측정되었다. SSpheres / Rods1 :3=0.24, SRods1 :3/ Rods1 :5=2.26.
Q가 40μL/min (Re=28)로 증가됨에 따라, 막대 계열들 모두 구들 및 서로로부터 더 멀어지게 이동하며, 일어날 수 있는 형상 기반 분리를 가능한 한 만든다 (SSpheres/Rods1:3=0.85, SRods1 :3/ Rods1 :5=1.46). Re가 더 증가됨에 따라 (Re=49 또는 70μL/min), 막대들은 구들이 위치하는 벽들로 가깝게 이동하는 경향이 있었고, 집속 위치들 사이의 틈을 감소시킨다 (SSpheres / Rods1 :3=1.05, SRods1 :3/ Rods1 :5=0.61). 채널 폭을 25μm로 더 감소시키는 것은 모든 입자들을 집속시키는 것을 어렵게 한다. 실제로, Re=37 (50μL/min)에서조차, 1:5 막대들은 여전히 유일한 유선으로 집속되지 않는다. 또한, 이 결과는 특히 더 큰 막대 (5:1 종횡비)들에서 이 협소한 채널이 자주 막힌다는 사실로부터 어느 정도 기인한다. 이러한 결과들은 입자 위치들 사이의 거리를 극대화하고 가장 효율적인 입자 분리를 가능케 하는 최적의 조건들이 존재한다는 것을 분명히 암시한다. 도 6b는 여러 유속들에서 25μm 폭 채널 (이미지 D), 30μm 폭 채널 (이미지 E) 및 35μm 폭 채널 (이미지 F)에 대해 얻은 분리성 인자를 예시한다.
또한, 형상 기반 분리 실험들은 입자 분류 시스템을 사용하여 수행되었다. 구들 및 막대들의 혼합물은 상이한 출구 설계들에 대해 상이한 유속들로 주입되었다. 각각의 출구로부터 수집된 입자들의 부분들은 분석되며, 상기 분리는 입자 타입 a 및 출구 i에 대해 정의된 세 파라미터들을 사용하여 특징지어졌다.
Figure pct00002
상기 추출 수율 (Extraction Yield, EY)은 주어진 입자 타입의 출구 재분배를 예시하고, 상기 추출 순도 (Extraction Purity, EP)는 주어진 출구의 입자 조성을 예시하며, 상기 농축 비율 (Enrichment Ratio, ER)은 입구에서의 입자 a의 비율에 대한 출구 i에서 입자 a의 비율을 정의한다. 도 7a 내지 도 7c는 테스트된 입자 분류 시스템의 세 가지 상이한 구성들을 예시한다. 도 7a에 예시된 기기는 0.53의 채널 종횡비 (ARc)를 갖는 25μm 폭의 관성 집속 마이크로 채널을 사용하며, 각각의 출구에 다섯 개의 동일한 유체 저항을 구비한다. 40μL/min의 유속이 사용되었다. 도 7b에 예시된 기기는 0.64의 채널 종횡비 및 80μL/min의 유속을 갖는 관성 집속 마이크로 채널을 사용한다. 다섯 개의 출구들은 다음의 저항들을 포함한다. α1:2=3/4 및 α1:3=1/2. 도 7c에 예시된 기기는 0.64의 채널 종횡비 및 70μL/min의 유속을 갖는 관성 집속 마이크로 채널을 사용한다. 다음의 저항들을 포함하는 일곱 개의 출구들이 사용된다. α1:2=3/4, α1:3=1/2, α1:4=1/4. 도 7a에 예시된 기기들에서 (상이한 저항들을 갖는) 상기 상이한 출구 디자인들은 상이한 출구들에서 유체의 상이한 상대적 포획 할당량들을 제공한다. 이 기기의 파라미터들을 조정함으로써 우리는 구들, 1:3 막대들 및 1:5 막대들 사이의 가능한 분리들의 범위를 입증한다.
도 7d는 출구 1 및 2들 사이 영역의 현미경 그래픽 스냅 사진을 예시하는데 상기 사진에 따르면, 1:5 막대들은 주로 출구 2로부터 포획되는 반면에, 대부분의 구들 및 1:3 막대들은 출구 1로부터 나간다. 도 7a 기기의 각각의 출구에서 상이한 입자들의 ER, EY 및 EP는 도 7g 및 도 7j에 아래에 도시된다. 도 7e는 출구 4 및 5들 사이 영역의 현미경 그래픽 스냅 사진을 예시한다. 도 7b 기기의 각각의 출구에서 상이한 입자들의 ER, EY 및 EP는 도 7h 및 도 7k에 아래에 도시된다. 도 7f는 출구 5의 주변 영역의 현미경 그래픽 스냅 사진을 예시한다. 도 7c 기기의 각각의 출구에서 상이한 입자들의 ER, EY 및 EP는 도 7i 및 도 7l에 아래에 도시된다.
이러한 유동 조건들에 대한 SF측정들과 일치하여 (SFRods1 :3/ Rods1 :5=1.9, SFSpheres/Rods1:5=2.4 반면에 SFSpheres / Rods1 :3=0.5), 도 7a의 기기에서, 주로 출구 1 및 5들에서 함께 수집되는 1:3 막대들 및 구들과 비교하면 (주입된 모든 구들 중의 83% 및 모든 1:3 막대들 중의 70% ), 1:5 막대들은 출구 2 및 4들에서 최대 90%까지의 순도와 함께 높은 추출 수율을 갖는 것으로 발견되었다 (1:5 막대들의 86%). 더 높은 유속을 사용하여 또 다른 분리의 시나리오를 달성하기 위해, 실험 조건들이 0.64의 채널 폭 종횡비 및 도 7b의 기기에서 80μL/min의 유속으로 조정되었으며, 상이한 출구들 사이의 유체 저항의 비율이 수정되었다 (α1:2=3/4, α1:3=1/2). 이전과는 달리, 막대들 타입 모두는 함께 유지하는 반면에 (모든 막대들의 90%가 출구 2 및 4에서 추출된다), 구형 입자들에 대해 우수한 추출 수율이 달성되었으며 (모든 구들의 85%가 출구 1 및 5들에 있다), 이는 구들에 대해 96%의 추출 순도로 이어진다 (도 7h 및 도 7k). 이러한 결과들은 여전히 SF값들과 일치하며, 이는 이러한 조건들에 대해 SFRods1:3/Rods1:5가 처음에 1.9에서 0.6으로 감소된 반면에, SFSpheres / Rods1 :3이 0.5로부터 1로 증가 되었기 때문이다. 도 7c에 예시된 기기를 사용하여 30μm채널 (ARc=0.64)에서 유속을 60μL/min로 감소시키는 것은, SF측정들에 의해 예측되는 바와 같이 (SFSpheres/Rods1:3은 1에 유지하나 SFRods1 :3/ Rods1 :5는 0.6으로부터 1.3으로 증가한다), 구들의 순도는 약간 감소하는 반면에 모든 세 타입들의 입자들의 분리를 가능케 한다. 이 기기에서 일곱 개의 출구들의 존재는 유선들 사이에서 더 정확한 분리를 제공한다 (α1:2=3/4, α1:3=1/2, α1:4=1/4). 실제로, 구들의 88%는 87%의 순도로 출구 2 및 6들에서 분리되며, 1:5 막대들의 49%가 78%의 순도로 출구 4에서, 보다 흥미롭게도 1:3 막대들의 77%가 최대 80%의 순도로 분리된다 (도 7i 및 도 7l).
관성 형상 기반 분리는 매우 상이한 범위의 입자 크기들에 대해 가능하다. 3μm 구들 및 3μm 유도 타원체 (derived ellipsoid)들의 분리는, 약간 수정된 파라미터들을 사용하여 6μm 비드들을 분리하는데 사용되었던 것과 같은 동일한 개념을 적용함으로써 실험적으로 확인되었다. 도 8a의 입자 분류 시스템을 사용하여, 구들은 도 8b에 도시되는 바와 같이, 출구 1 및 5들에서 90%의 수율 (EY)로, 도 8c에 도시되는 바와 같이, 최대 90%의 순도 (EP)로 수집되었다. 3:1 막대들에 대하여 도 8b에 도시되는 바와 같이, 출구 2, 3 및 4들에서 81%의 수율 (EY)이 달성되었고, 도 8c에 도시되는 바와 같이, 출구 2, 3 및 4들에서 5:1 막대들의 97% 수율은 최대 88% 순도 (EP)로 달성되었다. 도 8d는 세 형상들에 대한 상기 농축 비율 (ER)을 예시한다. 2μm보다 작은 입자들의 관성에 의한 집속을 위해서는 열경화성 폴리에스테르 (Thermoset Polyester, TPE)와 같은 더 높은 결합 강도들을 갖는 재료들을 필요하게 만드는 더 높은 유속들 및 압력들을 필요로 한다. 상기 3μm 비드들의 분리 가능성은 박테리아의 분리에 있어서 새로운 범위의 응용들을 열어, 예를 들어 막대형 박테리아가 그들의 두 배 길이까지 할 수 있는, 세포 성장의 상이한 단계들에서 집단들을 동기화하도록 한다.
또한, 관성 효과들을 사용한 형상 기반 분리는 효모 세포 분류 및 세포 주기 동기화에 사용될 수 있다. 세포 주기를 이해하는 것은 현재 연구의 주제이며, 출아 효모 세포가 구형으로부터 쌍구면 트윈 또는 더 큰 집합체로 생장하는 것과 같은, 주지된 유전학과 특징적인 형상 변화들로 인해 주로 효모 세포 (맥주 효모균, S. cerevisiae)들을 사용하여 이루어진다. 도 7c의 입자 분류 시스템을 사용할 때 (ARc=0.64, α1:2=3/4, α1:3=1/2, α1:4=1/4인 7개의 출구들), 효모 분류는 60μL/min의 유속에서 수행되었다. 효모는 분리 실험에 앞서 하루 동안 배양 통 (incubated shaker)에서 (37℃) Tryptic Soy Broth (TSB)에서 배양되었다. 배양된 현탁액은 1.5x106 cells/mL의 anon 제한 농도로 PBS에서 희석되었고, 비드들과 유사하게, 하버드 장치 주입기 펌프 및 해밀턴 유리 주입기를 사용하여 여러 유속들로 주입되었다. 혈구 계산기 (hemocytometer)(고속 판독)를 사용하여 즉각적인 계산에 의해 분석되는 각각의 출구의 함유량과 함께, 상기 분리 거동은 고속 화상 형성을 통해 포획된다. 효모 세포들의 형태들은 그들의 주기 단계에 따라 (i) 작은 비분할 단일 세포들, (ii) 큰 단일 세포들, (iii) 출아된 효모, (iv) 더블릿들, (v) 셋 이상의 세포들로 구성되는 집합체로 관찰되고 분류된다.
도 9a는 기기의 입구에서의 세포들의 현미경 이미지를 예시한다. 세포들은 작은 단일 세포 (맨 위 삽입), 큰 단일 세포 (맨 위 삽입으로부터 두 번째), 출아된 세포 (맨 위 삽입으로부터 세 번째), 더블릿 세포 (맨 위 삽입으로부터 네 번째), 집합체 세포 (마지막 삽입)와 같은 다섯 군들로 분류된다. 도 9b는 출구 2 및 출구 3의 각각의 이미지들을 예시한다. 단일 세포들은 출구 2에서 높은 추출 수율을 가지는 반면에, 출구 3에서 출아된 세포들의 순도는 증가되었다.
비분할 단일 세포들은 출구 2 및 6들에서 최대 94% 순도 (도 9d)로 높은 추출 수율을 갖는 것으로 발견되었고 (도 9c에 도시되는 바와 같이, 단일 세포들의 90% 및 큰 단일 세포들의 91%는 이 출구들에서 회수되었다), 반면에 출아된 효모 세포들은 주로 출구 3 및 5들에서 수집되었다 (입구에서의 순도 6.6%와 비교하여 출아된 효모의 54%, 최대 31%의 순도). 상기 입자 분류 시스템의 더 높은 처리량 (60μL/min, 예를 들어, 100cells/sec와 비교하여 1500cells/sec)은 집속 채널들의 평행화에 의해 더욱 증가될 수 있고, 반면에 이러한 동기화 응용에 특히 필요한 상기 순도 및 농축은 일련의 여러 기기들을 단계적으로 행함에 따라 개선된다.
실험들에서 6μm의 길다란 막대 (1:5)들을 구들 및 짧은 막대 (1:3)들로부터 분리하기 위한 가장 좋은 장치로 Q=40μL/min에서 동일한 저항들을 구비한 다섯 개의 출구들을 갖는 ARc=0.53 (폭=25μm, 높이=47μm)인 입자 분류 시스템이라는 것이 발견되었고, 반면에 6μm 구들을 두 종류의 막대들로부터 분리하는 것은 Q=80μL/min에서 α1:2=3/4 및 α1:3=1/2인 다섯 개의 출구들을 갖는 ARc=0.64 (폭=30μm, 높이=47μm)를 사용하는 것이 가장 잘 수행되었다. 모든 세 종류의 6μm입자들을 분리하기 위한 가장 좋은 기기는 Q=70μL/min에서 α1:2=3/4, α1:3=1/2, α1:4=1/4인 일곱 개의 출구들을 갖는 ARc=0.64 (폭=30μm, 높이=47μm)이었다. 3μm입자들에 대해 구들은 Q=80μL/min에서 α1:2=3/4 및 α1:3=1/2인 다섯 개의 출구들을 갖는 ARc=0.53 (폭=25μm, 높이=47μm)인 기기를 사용하여 두 종류의 막대들로부터 가장 잘 분리되었다. 전체 세포 집단으로부터 출아된 효모의 농축은 α1:2=3/4, α1:3=1/2, α1:4=1/4인 일곱 개의 출구들을 갖는 ARc=0.64 (폭=30μm, 높이=47μm)인 기기를 사용하여 성공적이었다. 조건들은 단일 세포들의 농축 등과 같은 다른 원하는 분리 유형들에 대해 최적화될 수 있다.
본 발명의 실시예들이 도시되고 기재되어 있는 반면에, 여러 수정들은 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 다음의 청구항들 및 그들의 등가물들을 제외하고는 제한되어서는 안된다.

Claims (20)

  1. 입구와,
    기판에 배치되고 말단부에 하류 팽창 영역을 구비하는 관성 집속 마이크로 채널과,
    상기 입구에 연결되는 상이한 형상의 입자들의 소스와,
    상기 하류 팽창 영역에서 마이크로 채널로 연결되는 복수의 출구들과,
    복수의 유체 저항기들을 포함하며,
    상기 입구가 마이크로 채널의 상류 단부에 연결되며,
    상기 상이한 형상의 입자들의 소스가 상기 입구로의 연속적인 도입을 위해 구성되며,
    각각의 저항기는 각각의 출구에 연결되는,
    입자 분류 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 입자들은 세포들을 포함하는,
    입자 분류 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 복수의 유체 저항기들은 유동 제한기를 포함하는,
    입자 분류 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유동 제한기는 구불구불한 채널을 포함하는,
    입자 분류 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 상기 복수의 유체 저항기들은 상기 복수의 출구들에 가해지거나 출구들에서 생성되는 하나 이상의 압력들을 포함하는,
    입자 분류 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 복수의 유체 저항기들은 상이한 유체 저항들을 포함하는,
    입자 분류 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 상기 복수의 유체 저항기들의 유체 저항은 조절 가능한,
    입자 분류 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 상기 상이한 형상의 입자들의 소스의 유속은 조절 가능한,
    입자 분류 시스템.
  9. 제1항에 있어서, 상기 하류 팽창 영역은 유체 유동 방향으로 계속해서 외향으로 굽어지는 대향하는 벽들을 포함하는,
    입자 분류 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 상기 대향하는 벽들은 유체 유동 방향으로 100μm의 이동마다 2°각도로 계속해서 외향으로 굽어지는,
    입자 분류 시스템.
  11. 샘플 유체에서 부유하는 상이한 형상의 입자들을 분류하는 방법이며,
    상기 방법은, 기판에 배치되고 말단부에 하류 팽창 영역을 구비한 관성 집속 마이크로 채널과, 상기 하류 팽창 영역으로 결합되는 복수의 출구들과, 복수의 유체 저항기들을 포함하는 입자 분류 시스템을 통해 그 내부에 부유하는 상이한 형상의 입자들을 함유하는 샘플 유체를 유동시키는 단계와,
    상기 복수의 출구들의 각각에서 유체를 수집하는 단계를 포함하며,
    각각의 저항기가 각각의 출구에 연결되며,
    상기 출구들 중 적어도 하나는 샘플 유체와 비교하여 적어도 하나의 입자의 형상이 풍부해진 유체를 함유하는,
    상이한 형상의 입자들을 분류하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 입자들은 세포들을 포함하는,
    상이한 형상의 입자들을 분류하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 샘플 유체의 유속은 가변적인,
    상이한 형상의 입자들을 분류하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 복수의 유체 저항기들의 유체 저항은 조절 가능한,
    상이한 형상의 입자들을 분류하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 유체 저항은 압력을 통해 조절 가능한,
    상이한 형상의 입자들을 분류하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 적어도 일부의 유체 저항기들은 상이한 유체 저항들을 갖는,
    상이한 형상의 입자들을 분류하는 방법.
  17. 제11항에 있어서, 분류된 상이한 형상의 분류된 입자들 중 적어도 일부는 실질적으로 동일한 체적을 갖는,
    상이한 형상의 입자들을 분류하는 방법.
  18. 제11항에 있어서, 분류된 상이한 형상의 분류된 입자들 중 적어도 일부는 하나의 차원에서 유사한 단면 프로파일을 가지나 다른 차원에서는 상이한 단면 프로파일을 갖는,
    상이한 형상의 입자들을 분류하는 방법.
  19. 제11항에 있어서, 그 내부에 부유하는 상이한 형상의 입자들을 함유하는 샘플 유체를 제1 레이놀드 수에서 입자 분류 시스템을 통과하여 유동시키는 단계와, 그 내부에 부유하는 상이한 형상의 입자들을 함유하는 수집된 샘플 유체를 제1 레이놀드 수와 상이한 제2 레이놀드 수에서 입자 분류 시스템을 통과하여 이어서 유동시키는 단계를 포함하는,
    상이한 형상의 입자들을 분류하는 방법.
  20. 제11항에 있어서, 상기 복수의 출구들은 상기 관성 집속 마이크로 채널의 중심선에 위치하거나 인접하는 적어도 하나의 출구와 상기 관성 집속 마이크로 채널의 중심선으로부터 측방향으로 떨어져 배치된 적어도 하나의 출구를 포함하며,
    상기 관성 집속 마이크로 채널의 중심선에 위치하거나 인접하는 상기 적어도 하나의 출구는 상기 관성 집속 마이크로 채널의 중심선으로부터 측방향으로 떨어져 배치된 상기 적어도 하나의 출구에서 수집된 더 작은 회전 직경을 갖는 입자들의 또 다른 하위 집합보다 더 큰 회전 직경을 갖는 입자들의 하위 집합을 포획하는,
    상이한 형상의 입자들을 분류하는 방법.
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