CN109852544B - 细胞分离用微流控芯片及其在肿瘤细胞分离中的应用、细胞分离鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞分离用微流控芯片及其在肿瘤细胞分离中的应用、细胞分离鉴定方法。该微流控芯片包括进液流道、捕获区和出液流道，进液流道具有进液口，进液流道与捕获区的进液侧对应连通，出液流道具有出液口，出液流道与捕获区的出液侧对应连通；捕获区具有多个捕获单元，各捕获单元具有多个分流柱。该微流控芯片采用柱子分选方法，分流柱在捕获区的流道中可以起到分流阻挡的作用，通过分流柱阻挡分别形成捕获流道和通过流道，待捕获的目的细胞可被截留在捕获流道中，而其他非目的细胞可经由通过流道流出，整个微流控芯片结构设计精巧，可用于具有多种不同细胞直径的细胞混合液中目的细胞的分离，分离效果高且操作简单，可广泛推广应用。

Description

细胞分离用微流控芯片及其在肿瘤细胞分离中的应用、细胞 分离鉴定方法

技术领域

本发明涉及细胞检测领域，尤其是涉及一种细胞分离用微流控芯片及其在肿瘤细胞分离中的应用、细胞分离鉴定方法。

背景技术

外周血等样本中含有多种细胞，如何从多种细胞中分离得到目的细胞，一直是细胞检测领域的研究热点。例如，如何实现对多样性骨髓瘤这种血液性癌症患者的外周血内存在的循环克隆浆细胞进行有效的分离和精确的计数，对于骨髓瘤的早期临床诊断、预后和治疗都具有重要的意义。传统的实现细胞分离的方法有密度梯度离心法、物理吸附法、细胞电泳法、免疫磁珠法和流式细胞法等，但这些方法普遍存在细胞分离效果不高的问题，尤其是目前也没有一种简单且分离效果好的针对多样性骨髓瘤患者的外周血内的循环克隆浆细胞的分离技术。

发明内容

基于此，有必要提供一种细胞分离用微流控芯片，以解决传统的细胞分离方法存在的分离效果不高的问题。

一种细胞分离用微流控芯片，包括进液流道、捕获区和出液流道，所述进液流道具有进液口，所述进液流道与所述捕获区的进液侧对应连通，所述出液流道具有出液口，所述出液流道与所述捕获区的出液侧对应连通；

所述捕获区具有多个捕获单元，各所述捕获单元具有多个分流柱；各所述捕获单元的多个所述分流柱之间的间隙构成捕获流道和通过流道；从所述捕获区的进液侧至出液侧，一个所述捕获流道经至少一个所述分流柱分成多个所述通过流道。

进一步，还有必要提供一种上述细胞分离用微流控芯片在肿瘤细胞分离过程中的应用。

更进一步，还有必要提供一种使用该细胞分离用微流控芯片的细胞分离鉴定方法。

一种细胞分离鉴定方法，包括如下步骤：

使用上述细胞分离用微流控芯片对细胞样本液进行细胞分离；

使用原位染色的方法对分离后的微流控芯片进行染色；

通过荧光显微镜进行镜检鉴定。

上述细胞分离用微流控芯片采用柱子分选方法，分流柱在捕获区的流道中可以起到分流阻挡的作用，通过分流柱阻挡分别形成捕获流道和通过流道，待捕获的目的细胞可被截留在捕获流道中，而其他非目的细胞可经由通过流道流出，整个微流控芯片结构设计精巧，可用于具有多种不同细胞直径的细胞混合液中目的细胞的分离，分离效果高且操作简单，可广泛推广应用。

附图说明

图1为本发明一实施例的细胞分离用微流控芯片的结构示意图；

图2为图1中预过滤区的局部结构示意图；

图3为图1中出液过滤区的局部结构示意图；

图4为图1中进液流道的靠近捕获区进液侧的局部结构示意图；

图5为图1中捕获区的局部结构示意图；

图6为图5中第一级子捕获区的局部结构示意图；

图7为图6中第一级子捕获单元结构示意图；

图8为图5中第二级子捕获区的局部结构示意图；

图9为图8中第二级子捕获单元结构示意图；

图10为图5中第三级子捕获区的局部结构示意图；

图11为图10中第三级子捕获单元结构示意图；

图12a为白细胞通过微流控芯片的捕获单元受力变形分析，图12b循环克隆浆细胞通过微流控芯片的捕获单元受力变形分析；

图13为经过多种抗体染色的结果；

图14为不同抗体的颜色以及对应激发的波长。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

需要说明的是，当元件被称为“设于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”、“连通”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

如图1所示，本发明一实施例提供了一种细胞分离用微流控芯片10(又简称“微流控芯片10”)，其包括进液流道11、捕获区12和出液流道13。进液流道11具有进液口，进液流道11与捕获区12的进液侧对应连通。出液流道13具有出液口132。出液流道13与捕获区12的出液侧对应连通。

在本实施例中，捕获区12具有多个捕获单元120。各捕获单元120具有多个分流柱。各捕获单元120的多个分流柱之间的间隙构成用于截留目标细胞的捕获流道和用于供非目标细胞等通过的通过流道。从捕获区12的进液侧至出液侧，一个捕获流道经至少一个分流柱分成多个通过流道。

在一个具体示例中，进液流道11包括样品进液流道111和试剂进液流道112。样品进液流道111具有样品进液口1111。试剂进液流道112具有试剂进液口1121。优选地，样品进液流道111和试剂进液流道112汇合后与捕获区12的进液侧对应连通。可理解，在其他具体示例中，也可以将样品进液流道111与试剂进液流道112合二为一，二者也可以共用一个进液口。

进一步，请结合图1和图2，进液流道11中设有用于过滤杂质的预过滤区113。预过滤区113具有多个第一过滤柱1131，相邻的第一过滤柱1131之间的间隙构成第一过滤流道1132。对于样品进液流道111与试剂进液流道112分开设计的方案，优选地，在样品进液口1111和试剂进液口1121之后分别设有一个预过滤区113。

如图2所示，第一过滤柱1131的横截面在靠近进液口的一侧和靠近捕获区12的一侧均呈等腰三角形，且靠近进液口一侧的等腰三角形部分的顶角角度小于靠近捕获区12一侧的等腰三角形部分的顶角角度。多个第一过滤柱1131呈阵列分布，且相邻行上的第一过滤柱1131在列方向上错开设置。

请结合图1和图3，出液流道13中设有用于过滤杂质的出液过滤区131。出液过滤区131具有多个第二过滤柱1311。相邻的第二过滤柱1311之间的间隙构成第二过滤流道1312。

如图3所示，第二过滤柱1311的横截面在靠近出液口的一侧和靠近捕获区12的一侧均呈等腰三角形，且靠近捕获区12一侧的等腰三角形部分的顶角角度小于靠近出液口一侧的等腰三角形部分的顶角角度。多个第二过滤柱1311呈阵列分布，且相邻行上的第二过滤柱1311在列方向上错开设置。可理解，在其他具体示例中，出液流道13中也可以不设置出液过滤区131。

如图4所示，进液流道11的用于与捕获区12对应连通的一端经过至少一级分支分成多个分支进液流道114，相应地，捕获区12也有多个，一个或多个分支流道114对应于一个捕获区12。例如在图4所示的具体示例中，进液流道11经4级分支最终分支成16个分支进液流道114。通过将进液流道11分支成多个分支进液流道114，可以更便于均匀和匀速上样。

如图5所示，在一个具体示例中，捕获区12具有多级子捕获区，捕获单元120包括多级分别分布于各级子捕获区的子捕获单元。从捕获区12的进液侧至出液侧，下一级子捕获区中子捕获单元的捕获流道的宽度较上一级子捕获区中子捕获单元的捕获流道的宽度小。具有不同捕获流道宽度的不同级子捕获区或不同级子捕获单元可以用于截留不同直径的细胞。

更具体地，请结合图5、图6和图7，捕获区12具有第一级子捕获区121，第一级子捕获区121具有多个第一级子捕获单元1211。第一级子捕获单元1211包括三个在横向上依次排列的第一级分流柱1212、1213和1214。其中位于外侧的两个第一级分流柱1212和1214的横截面(平行于芯片底部的截面)均呈菱形且各自的两个锐角端分别朝向捕获区12的进液侧和出液侧，位于中间的第一级分流柱1213的横截面呈一个锐角端被圆弧替代的类菱形(即菱形的一个锐角端被削圆后形成的图形)，且圆弧替代的端部朝向捕获区12的进液侧，余下的锐角端朝向捕获区12的出液侧。中间的第一级分流柱1213朝向进液侧的端部采用圆弧替代，这样可以有效避免在截留细胞时对细胞的损伤，防止刺破细胞。

在各第一级子捕获单元1211中，位于中间的第一级分流柱1213的圆弧替代的端部较位于两侧的第一级分流柱1212和1214的中部钝角端更靠近出液侧，位于外侧的两个第一级分流柱1212和1214之间的间隙构成第一级捕获流道1215，外侧的任一第一级分流柱1212或1214与中间的第一级分流柱1213之间的间隙构成第一级通过流道1216。

进一步，各第一级子捕获单元1211中位于外侧的两个第一级分流柱1212和1214的形状和尺寸一致，位于外侧的两个第一级分流柱1212和1214各自的锐角端连线以及位于中间的第一级分流柱1213的圆弧替代的端部的圆心与锐角端的连线均平行于纵向，且位于外侧的两个第一级分流柱1212和1214的几何中心连线平行于横向，位于中间的第一级分流柱1213与两侧的两个第一级分流柱1212和1214之间的距离相等。三个第一级分流柱1212、1213和1214形成类似于蝙蝠的形状，且整体上构成以位于中间的第一级分流柱1213的圆弧替代的端部的圆心与锐角端的连线作为对称轴的轴对称图形。

第一级子捕获区121中的多个第一级子捕获单元1211呈阵列分布，相邻行上的第一级子捕获单元1211在列方向上错开设置，且其中一行上的第一级子捕获单元1211与另一行上与其相接近的两个第一级子捕获单元1211的距离相等。

在一个具体示例中，第一级子捕获单元1211中位于两侧的第一级分流柱1212和1214的对角线长度之比为0.4-0.7，优选为0.43，且第一级分流柱1212和1214的各自的两个钝角端的对角线长度均为8±2μm；位于中间的第一级分流柱1213的对角线长度之比为0.2-0.5，且第一级分流柱1213的两个钝角端的对角线长度为8±2μm。当流体绕过障碍物，可以形成涡流，研究表明当血液等样品流动的时候遇到障碍物产生旋涡，这种旋涡会导致血液凝结堵塞。本发明利用柱子分选法，分流柱在流道中可以起到分流阻拦的作用，此种情况适用于卡门涡街的物理情形。这也就要求部分分流柱的几何形状设计要能尽可能的减小其在流场中产生的阻力。因此，优选采用菱形结构的分流柱，菱形这种形状能很好的降低阻力系数，进一步采用合适的菱形的对角线之比，使分流柱具有更好的流线型。理论上来说对角线之比越小，菱形分流柱的阻力系数就最小，然而分流柱也需要有一定的横截面积来确保它能够拦截住细胞，因此，第一级分流柱1212和1214的对角线长度之比优选为0.4-0.7，更优选为0.43。

位于外侧的两个第一级分流柱1212和1214的最近距离(两个相靠近的钝角端之间的距离)是28±5μm。中间的第一级分流柱1213的钝角端与相应外侧的第一级分流柱1212或1214之间沿横向相距11.5±2.5μm。位于中间的第一级分流柱1213的圆弧替代的端部的圆心与位于外侧的第一级分流柱1212或1214的几何中心之间在纵向上相距8±3μm。

进一步，横向上看，同一行相邻的两个第一级子捕获单元1211的中间第一级分流柱1213的圆弧替代的端部的圆心之间相距80±5μm。纵向上看，相邻两列的其中一列中第一级子捕获单元1211的位于外侧的第一级分流柱1212或1214的几何中心与另一列上任意一位于外侧的第一级分流柱1212或1214的几何中心连线在纵向上的投影长度(或者其中一列上的第一级分流柱1212、1213或1214的锐角端与相邻列上的第一级分流柱1212、1213或1214的对应锐角端的连线在纵向上的投影长度)是82±8μm。

更进一步，在一个具体示例中，第一级子捕获区121宽度是570±50μm。第一级子捕获区121共有10-20行的第一级子捕获单元1211。整个捕获区12包括有8-16个第一级子捕获区121，多个第一级子捕获区121优选沿横向依次排列。各第一级子捕获区121优选对应一个分支进液流道114。

如图5、图8和图9所示，捕获区12进一步还包括第二级子捕获区122。第二级子捕获区122具有多个第二级子捕获单元1221。第二级子捕获单元1221包括三个在横向上依次排列的第二级分流柱1222、1223和1224，其中位于外侧的两个第二级分流柱1222和1224的横截面均呈菱形且各自的两个锐角端分别朝向捕获区12的进液侧和出液侧，位于中间的第二级分流柱1223的横截面呈一个锐角端被圆弧替代的类菱形，且圆弧替代的端部朝向捕获区12的进液侧，余下的锐角端朝向捕获区12的出液侧。中间的第二级分流柱1223朝向进液侧的端部采用圆弧替代，这样可以有效避免在截留细胞时对细胞的损伤，防止刺破细胞。

在各第二级子捕获单元1221中，位于中间的第二级分流柱1223的圆弧替代的端部较位于两侧的第二级分流柱1222和1224的中部钝角端更靠近出液侧，位于外侧的两个第二级分流柱1222和1224之间的间隙构成第二级捕获流道1225，外侧的任一第二级分流柱1222或1224与中间的第二级分流柱1223之间的间隙构成第二级通过流道1226。

进一步，各第二级子捕获单元1221中位于外侧的两个第二级分流柱1222和1224的形状和尺寸一致，位于外侧的两个第二级分流柱1222和1224各自的锐角端连线以及位于中间的第二级分流柱1223的圆弧替代的端部的圆心与锐角端的连线均平行于纵向，且位于外侧的两个第二级分流柱1222和1224的几何中心连线平行于横向，位于中间的第二级分流柱1223与两侧的第二级分流柱1222和1224之间的距离相等。三个第二级分流柱1222、1223和1224形成类似于蝙蝠的形状，且整体上构成以位于中间的第二级分流柱1223的圆弧替代的端部的圆心与锐角端的连线作为对称轴的轴对称图形。

第二级子捕获区122中的多个第二级子捕获单元1221呈阵列分布，相邻行上的第二级子捕获单元1221在列方向上错开设置，且其中一行上的第二级子捕获单元1221与另一行上与其相接近的两个第二级子捕获单元1221的距离相等。

在一个具体示例中，第二级子捕获单元1221中第二级分流柱1222和1224的对角线长度之比为0.3-0.5且第二级分流柱1222和1224各自的两个钝角端的对角线长度均为9±1.5μm；第二级分流柱1223的对角线长度之比为0.3-0.5且第二级分流柱1223的两个钝角端的对角线长度为9±2μm。位于外侧的两个第二级分流柱1222和1224的最近距离是18±2μm。中间的第二级分流柱1223的钝角端与相应外侧的第二级分流柱1222或1224的锐角端之间沿横向相距9±2μm。位于中间的第二级分流柱1223的圆弧替代的端部的圆心与位于外侧的第二级分流柱1222或1224的几何中心之间在纵向上相距12±3μm。

进一步，横向上看，同一行相邻的两个第二级子捕获单元1221的中间第二级分流柱1223的圆弧替代的端部的圆心之间相距73±5μm。纵向上看，相邻两列的其中一列中第二级子捕获单元1221的位于外侧第二级分流柱1222或1224的几何中心与另一列上任意一位于外侧的第二级分流柱1222或1224的几何中心连线在纵向上的投影长度是73±5μm。

更进一步，在一个具体示例中，第二级子捕获区122的宽度是1220±200μm。第二级子捕获区122共有35-45行的第二级子捕获单元1221。整个捕获区12包括有6-10个第二级子捕获区122。多个第二级子捕获区122优选沿横向依次排列。各第二级子捕获区122可以对应一个或多个第一级子捕获区121。

如图5、图10和图11所示，捕获区12进一步还包括第三级子捕获区123。第三级子捕获区123具有多个第三级子捕获单元1231。第三级子捕获单元1231包括三个在横向上依次排列的第三级分流柱1232、1233和1234。各第三级分流柱1232、1233和1234的横截面均呈一个锐角端被圆弧替代的类菱形，且圆弧替代的端部朝向捕获区12的进液侧，余下的锐角端朝向捕获区12的出液侧。

在各第三级子捕获单元1231中，位于中间的第三级分流柱1233的圆弧替代的端部较位于两侧的第三级分流柱1232和1234的中部钝角端更靠近出液侧，位于外侧的两个第三级分流柱1232和1234之间的间隙构成第三级捕获流道1235，外侧的任一第三级分流柱1232或1234与中间的第三级分流柱1233之间的间隙构成第三级通过流道1236。

进一步，第三级子捕获单元1231中位于外侧的两个第三级分流柱1232和1234的形状和尺寸一致，各第三级分流柱1232、1233和1234的圆弧替代的端部的圆心与锐角端的连线均平行于纵向，且位于外侧的两个第三级分流柱1232和1234的锐角端连线平行于横向，位于中间的第三级分流柱1233与两侧的第三级分流柱1232和1234之间的距离相等。三个第三级分流柱1232、1233和1234形成类似于蝙蝠的形状，且整体上构成以位于中间的第三级分流柱1233的圆弧替代的端部的圆心与锐角端的连线作为对称轴的轴对称图形。

第三级子捕获区123中的多个第三级子捕获单元1231呈阵列分布，相邻行上的第三级子捕获单元1231在列方向上错开设置，且其中一行上的第三级子捕获单元1231与另一行上与其相接近的两个第三级子捕获单元1231的距离相等。

在一个具体示例中，第三级子捕获单元1231中各第三级分流柱1232、1233和1234的锐角端的角度是50°±10°，且各第三级分流柱1232、1233和1234的两个钝角端的对角线长度为7.65±1.5μm。位于外侧的两个第三级分流柱1232和1234的最近距离是19±3μm，中间的第三级分流柱1233的钝角端与相应外侧的第三级分流柱1232或1234的锐角端连线在横向上的投影长度7.5±2μm。位于中间的第三级分流柱1233的圆弧替代的端部的圆心与位于外侧的第三级分流柱1232或1234的圆弧替代的端部的圆心之间在纵向上相距15±3μm。

进一步，从横向上看，同一行相邻的两个第三级子捕获单元1231的中间第三级分流柱1233的圆弧替代的端部的圆心之间相距58±5μm。从纵向上看，相邻两列的其中一列中第三级子捕获单元1231的位于外侧的第三级分流柱1232或1234的锐角端与另一列上任意一位于外侧的第三级分流柱1232或1234的锐角端连线在纵向上的投影长度是60±5μm。

更进一步，在一个具体示例中，第三级子捕获区123的宽度是1220±200μm。第三级子捕获区123共有20-40行的第三级子捕获单元。整个捕获区12包括有6-10个第三级子捕获区123。优选地，一个第三级子捕获区123对应一个第二级子捕获区122。

各第三级子捕获区123均通过分支出液流道132引出。多个分支出液流道132汇总后共用同一出液口。优选地，出液过滤区131设在靠近出液口的端部，多个分支出液流道132汇总后经同一出液过滤区131后，可将液体从出液口排出。

表1

实验发现，在多发性骨髓瘤患者的外周血中，主要含有三种细胞，即红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和循环克隆浆细胞(clonal circulating plasma cells)。这三种细胞的物理尺寸等存在较大差异，如图表1所示。分流柱设计的目的是利用每个捕获单元分流柱间的空隙间隔，使得RBC和WBC顺利的通过，而循环克隆浆细胞因为其直径较大和细胞硬度较硬，使其被卡在捕获单元的分流柱内。值得注意的是，正常的白细胞和循环克隆浆细胞虽然在大小上有重叠之处，但因为它们的细胞硬度有差别，循环克隆浆细胞更硬一些，所以当同样大小的白细胞和循环克隆浆细胞通过分流柱时，白细胞因为更软，所以它受挤压变形的程度比循环克隆浆细胞更大，通过流体力学和接触力学的模拟运算，演示出了同等大小的白细胞(30μm直径，200Pa的杨氏模量)，和循环克隆浆细胞(30μm直径，560Pa杨氏模量)，通过多次不同组的实验，最终找到了最理想的流速和柱子的间距，即在流速为6mm/s的状态下，第一级子捕获单元1211中位于中间的第一级分流柱1213与两侧的第一级分流柱1212和1214横向上相距在11.5μm的距离下，白细胞因为受挤压变形的程度更大，所以顺利的通过了捕获单元，而受挤压变形程度更小的循环克隆浆细胞则被卡在里面了，如图12a和12b所示。当上述间距小于11.5μm时，同样的流速，则不能保证能使得白细胞能顺利通关，也就是说这个间距设的过小，白细胞也会卡在里面。

进一步，本发明一实施例采用了一个巧妙的增大循环克隆浆细胞与白细胞差异的信号放大法，通过将流道的高度设计在22±4μm，这就意味着体积直径大的细胞在经过流道时，会被芯片流道挤压，使得它在流道中的实际直径变大了，根据泊松比的概念，循环克隆浆细胞的尺寸在流道中会增大1.5-2倍。而白细胞直径通长小于18μm，所以白细胞的尺寸在流道中的实际大小是不会变的。这样一来，在流道里面，正常的血液细胞与循环克隆浆细胞在物理尺寸的差异变得更大了，更加有利于芯片的筛选。

本发明一实施例的细胞分流用微流控芯片采用具有三级子捕获区的捕获区设计，不同子捕获区可以捕获直径不同的循环克隆浆细胞，例如在一个具体示例中，第一级子捕获区121可捕获直径25-50μm的循环克隆浆细胞，第二级子捕获区122可捕获直径16-25μm的循环克隆浆细胞，第三级子捕获区123可用于捕获直径在14-16μm的循环克隆浆细胞。可理解，在其他实施例中，该细胞分离用微流控芯片10的捕获区12也不限于包含三级子捕获区，例如也可以只包含一级子捕获区、或者包含两级子捕获区、或者包含四级或四级以上的子捕获区等。

该细胞分离用微流控芯片10可以应用在疾病诊断或非疾病诊断等多种场合的多种不同直径的细胞分离过程中，例如对外周血中的循环克隆浆细胞的分离过程。优选地，在分离过程中，将外周血以0.5ml/h-1ml/h的速率吸入细胞分离用微流控芯片10。更具体地，在一个示例中，该细胞分离用微流控芯片10在使用时，可以将待检测的外周血标本通过导管进入样品进液口1111，出液口132由导管连接着蠕动泵，蠕动泵提供拉力将外周血标本以每小时0.5ml-1ml的流量速度吸入芯片中，使其通过整个捕获区12，然后由出液口132排出，在这个过程中循环克隆浆细胞就因为其独特的物理特性被卡在捕获区12中。

实际上，因为生物细胞学是一门难以绝对定量的学科，具有诸多不确定性，以及个体差异性。有些白细胞的物理尺寸，和硬度恰好与循环克隆浆细胞重叠，或者说有的白细胞表面的粘附力比较强，在通过分流柱的过程中，粘在了柱子上。因为在实际捕获过程中，也会捕获到一些正常的白细胞，这就需要通过后续对微流控芯片的流道清洗和抗体染色来做最后的鉴别，鉴别出哪个是真正的循环克隆浆细胞。

因此，本发明一实施例还提供了一种细胞分离鉴定方法，其包括如下步骤：

使用上述细胞分离用微流控芯片10对细胞样本液进行细胞分离；

使用原位染色的方法对分离后的微流控芯片进行染色；

通过荧光显微镜进行镜检鉴定。

具体地，上述细胞分离鉴定方法运用的原位染色方法可以按照但不限于如下步骤进行：

(1)在注射泵的控制下，将多聚甲醛以0.5-1ml/h的流速通过微流控芯片10，维持20min；

(2)在注射泵的控制下，将PBS混合EDTA(乙二胺四乙酸)溶液以0.5-1ml/h的流速通过微流控芯片10，维持10min；

(3)在注射泵的控制下，将浓度为0.1％的Triton X-100溶液以0.5-1ml/h的流速通过微流控芯片10，维持10min；

(4)在注射泵的控制下，将PBS混合EDTA溶液以0.5-4ml/h的流速通过微流控芯片10，维持3-5min；

(5)在注射泵的控制下，将BSA溶液以0.5-4ml/h的流速通过微流控芯片10，维持20min；

(6)在注射泵的控制下，通入以下几种抗体的混合溶液：4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、藻红蛋白结合的CD138小鼠单克隆抗体(phycoerythrin-conjugated CD138 mouse monoclonal antibody)、Alexa For647标记的CD45小鼠单克隆抗原(Alexa Fluor647-labeled CD45 mouse monoclonal antigen)和Alexa Furor488标记CD19小鼠单克隆抗体(Alexa Fluor488-labeled CD19 mousemonoclonal antibodies)(所有抗体获自Thermo Fisher)，以0.5ml/h的流速通过微流控芯片，维持40min；

(7)在注射泵的控制下，在荧光显微镜对应波长的激发光下，寻找CD138、DAPI同时阳性和CD45、CD19同时为阴性的细胞，为循环克隆浆细胞。

如图13和图14所示，图中数据验证了上述微流控芯片10的成功性，包括了对循环克隆浆细胞在不同流速下捕获效率的测试，以及采取不同阶段的多发性骨髓瘤病人标本，以及与健康人进行对照的测试。

下表是临床病例的数据

1.在混入克隆浆细胞的健康人外周血中初步验证捕获效率和特异度，U266是克隆浆细胞的细胞株，结果如下表2所示。

表2

2.在多发性骨髓瘤患者和健康人外周血中捕获的循环克隆浆细胞的数据，其中复发的多发性骨髓瘤患者的循环克隆浆细胞数量远远高于以缓解的患者，结果如下表3所示。

表3

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (17)

1.一种细胞分离用微流控芯片，其特征在于，包括进液流道、捕获区和出液流道，所述进液流道具有进液口，所述进液流道与所述捕获区的进液侧对应连通，所述出液流道具有出液口，所述出液流道与所述捕获区的出液侧对应连通；

所述捕获区具有多个捕获单元，各所述捕获单元具有多个分流柱；各所述捕获单元的多个所述分流柱之间的间隙构成捕获流道和通过流道；从所述捕获区的进液侧至出液侧，一个所述捕获流道经至少一个所述分流柱分成多个所述通过流道；

所述捕获区具有第一级子捕获区，所述第一级子捕获区具有多个第一级子捕获单元，所述第一级子捕获单元包括三个在横向上依次排列的第一级分流柱，其中位于外侧的两个第一级分流柱的横截面均呈菱形且各自的两个锐角端分别朝向所述捕获区的进液侧和出液侧，位于中间的第一级分流柱的横截面呈一个锐角端被圆弧替代的类菱形，且圆弧替代的端部朝向所述捕获区的进液侧，余下的锐角端朝向所述捕获区的出液侧；

在各所述第一级子捕获单元中，位于中间的第一级分流柱的圆弧替代的端部较位于两侧的第一级分流柱的中部钝角端更靠近出液侧，位于外侧的两个第一级分流柱之间的间隙构成第一级捕获流道，外侧的任一第一级分流柱与中间的第一级分流柱之间的间隙构成第一级通过流道；

所述进液流道包括样品进液流道和试剂进液流道，所述样品进液流道具有样品进液口，所述试剂进液流道具有试剂进液口，所述样品进液流道和所述试剂进液流道汇合后与所述捕获区的进液侧对应连通；

所述进液流道的用于与所述捕获区对应连通的一端经过至少一级分支分成多个分支进液流道；所述捕获区有多个，一个或多个所述分支进液流道与一个所述捕获区对应连通。

2.如权利要求1所述的细胞分离用微流控芯片，其特征在于，所述进液流道中设有用于过滤杂质的预过滤区，所述预过滤区具有多个第一过滤柱，相邻的所述第一过滤柱之间的间隙构成第一过滤流道；

和/或，所述出液流道设有用于过滤杂质的出液过滤区，所述出液过滤区具有多个第二过滤柱，相邻的所述第二过滤柱之间的间隙构成第二过滤流道。

3.如权利要求2所述的细胞分离用微流控芯片，其特征在于，所述第一过滤柱的横截面在靠近所述进液口的一侧和靠近所述捕获区的一侧均呈等腰三角形，且靠近所述进液口一侧的等腰三角形部分的顶角角度小于靠近所述捕获区一侧的等腰三角形部分的顶角角度；多个所述第一过滤柱呈阵列分布，且相邻行上的第一过滤柱在列方向上错开设置；

和/或，所述第二过滤柱的横截面在靠近所述出液口的一侧和靠近所述捕获区的一侧均呈等腰三角形，且靠近所述捕获区一侧的等腰三角形部分的顶角角度小于靠近所述出液口一侧的等腰三角形部分的顶角角度；多个所述第二过滤柱呈阵列分布，且相邻行上的第二过滤柱在列方向上错开设置。

4.如权利要求1-3中任一项所述的细胞分离用微流控芯片，其特征在于，所述捕获区具有多级子捕获区，所述捕获单元包括多级分别分布于各级子捕获区的子捕获单元；从所述捕获区的进液侧至出液侧，下一级子捕获区中子捕获单元的捕获流道的宽度较上一级子捕获区中子捕获单元的捕获流道的宽度小。

5.如权利要求4所述的细胞分离用微流控芯片，其特征在于，各所述第一级子捕获单元中位于外侧的两个第一级分流柱的形状和尺寸一致，位于外侧的两个第一级分流柱各自的锐角端连线以及位于中间的第一级分流柱的圆弧替代的端部的圆心与锐角端的连线均平行于纵向，且位于外侧的两个第一级分流柱的几何中心连线平行于横向，位于中间的第一级分流柱与两侧的第一级分流柱之间的距离相等；

所述第一级子捕获区中的多个第一级子捕获单元呈阵列分布，相邻行上的第一级子捕获单元在列方向上错开设置，且其中一行上的第一级子捕获单元与另一行上与其相接近的两个第一级子捕获单元的距离相等。

6.如权利要求5所述的细胞分离用微流控芯片，其特征在于，所述第一级子捕获单元中位于两侧的第一级分流柱的对角线长度之比为0.4-0.7且各自的两个钝角端的对角线长度为8±2μm，位于中间的第一级分流柱的对角线长度之比为0.2-0.5且其钝角端的对角线长度为8±2μm，位于外侧的两个第一级分流柱的最近距离是28±5μm，中间的第一级分流柱的钝角端与相应外侧的第一级分流柱之间沿横向相距11.5±2.5μm，位于中间的第一级分流柱的圆弧替代的端部的圆心与位于外侧的第一级分流柱的几何中心之间在纵向上相距8±3μm；

和/或，同一行相邻的两个第一级子捕获单元的中间第一级分流柱的圆弧替代的端部的圆心之间相距80±5μm；

和/或，相邻两列的其中一列中第一级子捕获单元的位于外侧的第一级分流柱的几何中心与另一列上任意一位于外侧的第一级分流柱的几何中心连线在纵向上的投影长度是82±8μm；

和/或，所述第一级子捕获区的宽度是570±50μm；

和/或，所述第一级子捕获区共有10-20行的第一级子捕获单元；

和/或，所述捕获区包括有8-16个所述第一级子捕获区。

7.如权利要求5-6中任一项所述的细胞分离用微流控芯片，其特征在于，所述捕获区的第二级子捕获区具有多个第二级子捕获单元，所述第二级子捕获单元包括三个在横向上依次排列的第二级分流柱，其中位于外侧的两个第二级分流柱的横截面均呈菱形且各自的两个锐角端分别朝向进液侧和出液侧，位于中间的第二级分流柱的横截面呈一个锐角端被圆弧替代的类菱形，且圆弧替代的端部朝向进液侧，余下的锐角端朝向出液侧；

在各所述第二级子捕获单元中，位于中间的第二级分流柱的圆弧替代的端部较位于两侧的第二级分流柱的中部钝角端更靠近出液侧，位于外侧的两个第二级分流柱之间的间隙构成第二级捕获流道，外侧的任一第二级分流柱与中间的第二级分流柱之间的间隙构成第二级通过流道。

8.如权利要求7所述的细胞分离用微流控芯片，其特征在于，各所述第二级子捕获单元中位于外侧的两个第二级分流柱的形状和尺寸一致，位于外侧的两个第二级分流柱各自的锐角端连线以及位于中间的第二级分流柱的圆弧替代的端部的圆心与锐角端的连线均平行于纵向，且位于外侧的两个第二级分流柱的几何中心连线平行于横向，位于中间的第二级分流柱与两侧的第二级分流柱之间的距离相等；

所述第二级子捕获区中的多个第二级子捕获单元呈阵列分布，相邻行上的第二级子捕获单元在列方向上错开设置，且其中一行上的第二级子捕获单元与另一行上与其相接近的两个第二级子捕获单元的距离相等。

9.如权利要求8所述的细胞分离用微流控芯片，其特征在于，所述第二级子捕获单元中位于两侧的第二级分流柱的对角线长度之比为0.3-0.5且各自的两个钝角端的对角线长度为9±1.5μm，位于中间的第二级分流柱的对角线长度之比为0.3-0.5且两个钝角端的对角线长度为9±2μm，位于外侧的两个第二级分流柱的最近距离是18±2μm，中间的第二级分流柱的钝角端与相应外侧的第二级分流柱的锐角端之间沿横向相距9±2μm，位于中间的第二级分流柱的圆弧替代的端部的圆心与位于外侧的第二级分流柱的几何中心之间在纵向上相距12±3μm；

和/或，同一行相邻的两个第二级子捕获单元的中间第二级分流柱的圆弧替代的端部的圆心之间相距73±5μm；

和/或，相邻两列的其中一列中第一级子捕获单元的位于外侧的第一级分流柱的几何中心与另一列上任意一位于外侧的第一级分流柱的几何中心连线在纵向上的投影长度是73±5μm；

和/或，所述第二级子捕获区的宽度是1220±200μm；

和/或，所述第二级子捕获区共有35-45行的第二级子捕获单元；

和/或，所述捕获区包括有6-10个所述第二级子捕获区。

10.如权利要求5-6、8-9中任一项所述的细胞分离用微流控芯片，其特征在于，所述捕获区的第三级子捕获区具有多个第三级子捕获单元，所述第三级子捕获单元包括三个在横向上依次排列的第三级分流柱，各所述第三级分流柱的横截面均呈一个锐角端被圆弧替代的类菱形，且圆弧替代的端部朝向进液侧，余下的锐角端朝向出液侧；

在各所述第三级子捕获单元中，位于中间的第三级分流柱的圆弧替代的端部较位于两侧的第三级分流柱的中部钝角端更靠近出液侧，位于外侧的两个第三级分流柱之间的间隙构成第三级捕获流道，外侧的任一第三级分流柱与中间的第三级分流柱之间的间隙构成第三级通过流道。

11.如权利要求10所述的细胞分离用微流控芯片，其特征在于，所述第三级子捕获单元中位于外侧的两个第三级分流柱的形状和尺寸一致，各所述第三级分流柱的圆弧替代的端部的圆心与锐角端的连线均平行于纵向，且位于外侧的两个第三级分流柱的锐角端连线平行于横向，位于中间的第三级分流柱与两侧的第三级分流柱之间的距离相等；

所述第三级子捕获区中的多个第三级子捕获单元呈阵列分布，相邻行上的第三级子捕获单元在列方向上错开设置，且其中一行上的第三级子捕获单元与另一行上与其相接近的两个第三级子捕获单元的距离相等。

12.如权利要求11所述的细胞分离用微流控芯片，其特征在于，所述第三级子捕获单元中各第三级分流柱的锐角端的角度是50°±10°且两个钝角端的对角线长度为7.65±1.5μm，位于外侧的两个第三级分流柱的最近距离是19±3μm，中间的第三级分流柱的钝角端与相应外侧的第三级分流柱的锐角端连线在横向上的投影长度7.5±2μm，位于中间的第三级分流柱的圆弧替代的端部的圆心与位于外侧的第三级分流柱的圆弧替代的端部的圆心之间在纵向上相距15±3μm；

和/或，同一行相邻的两个第三级子捕获单元的中间第三级分流柱的圆弧替代的端部的圆心之间相距58±5μm；

和/或，相邻两列的其中一列中第三级子捕获单元的位于外侧的第三级分流柱的锐角端与另一列上任意一位于外侧的第三级分流柱的锐角端连线在纵向上的投影长度是60±5μm；

和/或，所述第三级子捕获区的宽度是1220±200μm；

和/或，所述第三级子捕获区共有20-40行的第三级子捕获单元；

和/或，所述捕获区包括有6-10个所述第三级子捕获区。

13.如权利要求5-6、8-9、11-12中任一项所述的细胞分离用微流控芯片，其特征在于，各所述分流柱的高度是22±4μm。

14.如权利要求1-13中任一项所述的细胞分离用微流控芯片在肿瘤细胞分离过程中的应用，所述应用不涉及疾病的诊断和治疗。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞分离过程是对外周血中的循环克隆浆细胞的分离过程。

16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，在分离过程中，将外周血以0.5ml/h-1ml/h的速率吸入所述细胞分离用微流控芯片。

17.一种细胞分离鉴定方法，其特征在于，所述方法不涉及疾病的诊断和治疗，包括如下步骤：

使用如权利要求1-13中任一项所述的细胞分离用微流控芯片对细胞样本液进行细胞分离；

使用原位染色的方法对分离后的微流控芯片进行染色；

通过荧光显微镜进行镜检鉴定。

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