JP7360216B2 - 循環性腫瘍細胞の捕捉に適したマイクロ流体チップ - Google Patents

Description

（相互参照）
本願は、２０１９年０７月２３日に、中国特許庁に出願された出願番号が２０１９１０６６６２３９．５である中国特許出願に基づく優先権を主張し、その全内容は援用により本願に組み込まれる。

本発明は、リキッドバイオプシーおよび腫瘍理学療法（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ）の分野に属し、特に、腫瘍細胞（特に、例えば、ＣＴＣ）を捕捉するために使用することができるマイクロ流体チップに関する。

血液は、膨大な量の赤血球（約５×１０^９個／ｍＬのマグニチュード）及び白血球（約８×１０^６個／ｍＬのマグニチュード）および様々タンバク質を含むため、強い粒状性及び高い動的粘度係数を有する。最近の研究によると、がん患者、特にがん転移性癌病変のある患者は、一定の量の循環性腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ、ＣＴＣｓ）が存在すし、これらの循環性腫瘍細胞をうまく捕捉及び分離するのはがんの早期発見、診断及び治療に評価できないほどに役に立つが、その数が非常に少ない（約０から数十細胞／ｍＬ）ため、循環性腫瘍細胞を血液から効率的かつ特異的に分離することは技術的に非常に困難である。

現在、ＣＴＣの捕捉の原理に基づいて、ＣＴＣの分離方法は、抗原および抗体に基づく捕捉、物理的特性に基づく捕捉、およびその２つの方法を組み合わせた捕捉の３つの種類に分類される。

（抗原および抗体に基づく捕捉）
腫瘍細胞の表面には、例えば、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ及びＨＥＲ２などの幾つの腫瘍特異的抗原が発見することがある。腫瘍特異的抗原を認識する抗体を化学結合の連結又はほかのコーティング手段によって磁気ビーズやマイクロ流体チップの表面に固定し、抗原と抗体の組み合わせにより腫瘍細胞は捕捉される。

ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈは、現在、ＦＤＡに承認された唯一のＣＴＣの商業的分離のためのプラットフォームであるが、その検出率は高くない。その後の方法は、同様の原理、すなわち抗原－抗体特異的結合の原理とマイクロ流体チップとの組み合わせを採用し、検出率を大幅に向上させた。例えば、ＨＢ－ｃｈｉｐは、非対称に配置されたヘリンボーン状チャネルを使用してレイノルズ数を増加させた。そして、がん患者の血液をチップへ注入した後、乱流が形成され、それによって細胞と管壁との間の相互作用が増加し、細胞が抗体に結合する確率が増加し、検出率がＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ法よりも大幅に向上した。また、ＣＴＣ－ｃｈｉｐは、ＣＴＣを捕捉するために、ＥｐＣＡＭ抗体でコーティングされた千鳥状の円筒面を採用した。

抗原および抗体に基づいたＣＴＣの捕捉は利点が明らかであり、抗原に対する抗体の認識が高特異性を有するため、捕捉された細胞の純度は非常に高く、ほぼ１００％に近い。しかしながら、この方法には、多くの欠点もあり、例えば、（１）現在、分子マーカーとして主にＥｐＣＡＭが用いられているため、抗原の特異性及び抗原と抗体との親和性が捕捉効率を制限するが、ＣＴＣにおける多くの細胞はＥＭＴを経て、ＥｐＣＡＭの発現が低い一部の細胞は漏れて検出されなく、ＣＴＣの量が低く評価される。（２）コストが高い。（３）抗原と抗体が十分に認識して結合する必要があるため、一般的には、流速が遅く、処理時間が長く、血液の特性とＣＴＣの状態に影響を及ばすこともある。上記の欠点の存在は、その大規模な臨床への応用を制限する。

（物理的特性に基づく捕捉）
研究によると、腫瘍細胞と正常細胞との間には、物理的特性に一定の違いがあり、その違いは主に細胞のサイズ、変形性、密度などの特性に反映される。そこで、上記の物理的特性の違いを活用すれば、ＣＴＣを分離して捕捉することができる。従来技術では、物理的特性に基づく捕捉は、しばしばスパイラル構造を伴う。該スパイラル構造は、マイクロチャネル内の特徴的なサイズ及び流速が非常に小さいため、レイノルズ数が１未満であり、通常には、その慣性効果を無視するが、圧力駆動下で流速は０．１～１ｍ／ｓと高くなり、レイノルズ数は１０～１００に達する可能性があり、この時、慣性作用が現れ始める、という特性を利用する。このようなチップでは、希釈された血液が圧力によって湾曲したチャネルに押し込まれると、横方向の力及びディーンフォース（Ｄｅａｎ ｆｏｒｃｅ）の作用下で、細胞が断面で特定の平衡位置に達する。細胞の平衡位置が細胞のサイズに関連し、ＣＴＣのサイズと血球のサイズとはかなり異なるため、分離を達成するために、チャネル内の異なる平衡位置になる。さらに、例えば、適切なギャップを利用し、ＣＴＣと血球のサイズ及び変形能力との相違を基づいて分離を行う方法などの物理的特性に基づく他の多くの分離方法がある。

物理的特性に基づくＣＴＣの捕捉は、次の利点がある。（１）捕捉が抗原発現に依存せず、すべてのタイプのＣＴＣを捕捉することができる。（２）ＣＴＣが抗体やナノ粒子に結合せず、最も原始的な状態を維持している。（３）血液サンプルは、前処理を必要とせず、直接ろ過することができる。（４）コストが低い。（５）流速が速く、必要な時間が短くなる。ただし、ＣＴＣと白血球のサイズがわずかに重なるため、この方法の分離効率は十分に高くないことが多く、ある程度の白血球汚染の問題がある。

（２つの方法を組み合わせた捕捉）
抗原抗体に基づく方法と物理的特性に基づく方法との組み合わせを使用し、Ｓｕｎ Ｎらは、抗体でコーティングされた磁気ビーズをＣＴＣに結合し、ＣＴＣのサイズを効果的に増加させ、多孔質膜を使用してろ過することで、捕捉効率を大幅に向上させることができ、同時に、ＣＤ４５ネガティブセレクションで白血球を除去することで、純度を効果的に向上させる。ＣＴＣ－ｉｃｈｉｐは、ＤＬＤを使用して大細胞と小細胞を分離し、その後、収束させ、最後に免疫磁気ビーズを使用してネガティブセレクションで白血球を除去する。ただし、組み合わせ方法は、チップ構造が複雑であり、過程が煩雑であり、コストが高く、臨床応用に適していないことが多い。

そこで、当分野では、臨床応用におけるコスト、サンプルの処理スループット、及び精度に対する要求を満たすことができる、ＣＴＣを効果的に捕捉するための方法が緊急に必要とされている。

発明者らは、長年の研究を重ねた後、ターゲット粒子（例えば、循環性腫瘍細胞ＣＴＣ）を捕捉するために使用できるマイクロ流体チップを設計した。該チップは、収束・分流ユニットを備え、前記収束・分流ユニットは液体のサンプル（例えば、血液、灌流液など）中のターゲット粒子を液体流れの中央に収束させる同時に、一定割合のターゲット粒子を含まない液体流れを分離することができ、これにより、チップに注入した液体サンプルの流量・流速を効果的に減少させることができ、その中のターゲット粒子を捕捉するのにより適している。チップがターゲット粒子を捕捉するために使用される場合、捕捉ユニットをさらに備える。前記捕捉ユニットによりターゲット粒子の捕捉を実現する。具体的には、本発明は以下の実施形態を含む。

第１の態様においては、本発明は、マイクロ流体チップであって、入口（１）と、主チャネル（２）と、１つ又は複数（例えば、１～２０であり、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）の収束・分流ユニット（３）と、出口（５）と、を備え、前記入口（１）と、収束・分流ユニットと、出口（５）とが主チャネル（２）によって接続され、
サンプルは入口（１）から主チャネル（２）に入り、前記収束・分流ユニット（３）を通って流れ、前記収束・分流ユニット（３）は前記サンプル中のターゲット粒子を液体流れの中央に収束させると同時に、ターゲット粒子を含まない液体流れを出口（５）から排出するか又は部分的に排出することにより、ターゲット粒子を失うことなく、低減サンプルの流速及び／又は流量を低減させる、マイクロ流体チップを提供する。

一実施形態においては、前記収束・分流ユニット（３）は、収集ポート（３１）と、主チャネルくびれ部（３２）と、直列に配置された１つ又は２つ以上（例えば、１～２０、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）の収束構造（３３）と、分流チャネル（３４）とを備える。

別の実施形態においては、前記収束構造（３３）は中央チャネル（３３１）と側方支流チャネル（３３２）とを備える。中央チャネル（３３１）は、両端で主チャネル（２）に接続されかつ同軸に配置され、好ましくは、中央チャネル（３３１）の幅は主チャネル（２）の幅よりも小さく、さらに好ましくは、中央チャネル（３３１）の幅は主チャネル（２）の幅の３０％～９９％、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、又は前記の任意の２つの値の間の任意の値である。前記側方支流チャネル（３３２）は、両端で主チャネル（２）及び中央チャネル（３３１）と交差し、さらに好ましくは、前記２つの側方支流チャネル（３３２）は中央チャネル（３３１）の両側に配置され、より好ましくは、前記２つの側方支流チャネル（３３２）は中央チャネル（３３１）の両側に対称的に配置され、かつ同じサイズパラメータを有する。

別の実施形態においては、前記中央チャネル（３３１）の流動抵抗と前記側方支流チャネル（３３２）の流動抵抗とは比例関係を満たすことにより、サンプルは主チャネル（２）から収束構造（３３）に入った後、ターゲット粒子を含む液体流れは中央チャネル（３３１）に入り、ターゲット粒子を含まない液体流れは側方支流チャネル（３３２）に流れ込んだ後、中央チャネル（３３１）から流出する液体流れと合流し、その後、再びに主チャネル（２）に流れ込む。

前記「流動抵抗」（ｆｌｏｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）は、液体（粘性液体）が一定の空間（パイプなど）内を移動する際に生じた流れを妨げる反力を意味する。パイプを流れる液体は、流動抵抗Ｒ_流動抵抗は、Ｒ_流動抵抗＝８ηＬ（Ｈ＋Ｗ）^２／（ＨＷ）^３で表され、ここで、ηは液体の粘度係数を表し、Ｌ、Ｗ、及びＨはそれぞれパイプの長さ、幅、及び高さを表す。本発明で言及される特定のチャネルの流動抵抗（例えば、中央チャネルの流動抵抗、側方直流チャネルの流動抵抗など）とは、液体が該チャネルを流れる際に生じた抵抗を指す。異なるチャネルに関しては、それらのチャネルを流れる液体が同じであり、同じ粘度係数を有するため、異なるチャネルで液体によって生じた流動抵抗の比例関係は、チャネルのサイズにのみ関係し、チャネルのＬ（Ｈ＋Ｗ）^２／（ＨＷ）^３の比に基づいて求められる。なお、上記の流動抵抗の表現方法及び流動抵抗の比例関係の計算方法は、中央チャネル（３３１）と側方支流チャネル（３３２）に限定されず、マイクロ流体チップ内の全てのチャネルに適用できる。

ポアズイユの式：Ｑ＝Δｐ／Ｒ（ただし、Ｑは液体流れの流量、Δｐはパイプの両端の圧力差、Ｒはパイプの流動抵抗を表す）に従って、流量Ｑの分布は、流れ抵抗Ｒに反比例する。即ち、Ｑ１／Ｑ２＝Ｒ２／Ｒ１である。

別の実施形態においては、Ｗ_Ｚを主チャネル（２）の幅の半分とし、Ｗ_２を主チャネルくびれ部（３２）の幅とし、ｒ_ｃｅｌｌをサンプル中のターゲット粒子の平均半径とし、ｄ１を液体流れの主チャネルくびれ部（３２）の一の側（例えば、右側であるが、同様に左側にも適用する）の境界に最も近いターゲット粒子の重心とこの側の境界との間の距離とし、Ｒ１を各収束・分流ユニット（３）における１番目の収束構造（３３）の中央チャネル（３３１）の流動抵抗とし、Ｒ２を１番目の収束構造（３３）における単一の側方支流チャネル（３３２）の流動抵抗とした場合、前記のパラメータは、以下の条件を満たしている。

ここで、ｄ１の値はｒ_ｃｅｌｌに等しいか、又はｒ_ｃｅｌｌよりわずかに小さい値である。不等式の左側は、全体の液体流れに対する主チャネルに残っている液体流れの割合を表し、右側は、全体流動抵抗／収束構造中央チャネルの流動抵抗を表す。

上記の式（不等式）を満たすことで、１番目の収束構造はターゲット粒子が分離されないと同時に、ターゲット粒子を含まない流体を可能な限り分離することができる。また、収束構造の中央チャネル（３３１）の流動抵抗と前記側方支流チャネル（３３２）の流動抵抗との間で満たされる必要がある比例関係を計算することができる。

別の実施形態においては、ｎ番目（ここで、ｎは、１以上かつ収束構造の総数未満の自然数）の収束構造（３３）の中央チャネル（３３１）の流動抵抗をＲ１^ｎとし、単一の側方支流チャネル（３３２）の流動抵抗をＲ２^ｎとし、ｎ＋１番目の収束構造（３３）の中央チャネル（３３１）の流動抵抗をＲ１^ｎ＋１とし、各側方支流チャネル（３３２）の流動抵抗をＲ２^ｎ＋１とした場合、以下の条件を満たしている。

ここで、ｄ１の値はｒ_ｃｅｌｌに等しいか、又はｒ_ｃｅｌｌよりわずかに小さいである。不等式の左側は、ｎ番目の収束構造を通過した後の全体の液体流れに占めるターゲット粒子が存在する液体流れの割合を表し、ここで、

は、全体流量に占めるｎ番目の収束構造の中央チャネルの流量の割合を表し、

は、中央チャネル流量に対する収束された後のターゲット粒子が占める領域の割合を表す。右側は、ｎ＋１番目の収束構造の全体の流動抵抗／収束構造中央チャネルの流動抵抗を表す。

上記の式（不等式）を満たすことで、ターゲット粒子がｎ番目の収束構造を通過してｎ＋１番目の収束構造に入る時に分離されないと同時に、ターゲット粒子を含まない流体が可能な限り分離されることができる。また、収束構造のｎ番目の組とｎ＋１番目の組との流動抵抗が満たす必要がある比例関係を計算することができる。

別の実施形態においては、前記分流チャネル（３４）の両端は主チャネル（２）と交差し、そのうちの上流の交差点は収束・分流ユニットの最後の収束構造付近にあり、下流の交差点はマイクロ流体チップの出口（５）付近にある。好ましくは、分流チャネル（３４）は、２つがあり、それぞれ主チャネル（２）の両側に配置され、より好ましくは、主チャネル（２）の両側に対称的に配置され、かつ同じサイズパラメータを有する。さらに好ましくは、分流チャネル（３４）と主チャネル（２）との交差点で、主チャネルの幅は大きくなり、例えば、幅は元の１．５倍乃至５倍の間、例えば、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、又は５倍、又は前記の任意の２つの値の間の任意の倍数値である。さらに好ましくは、前記交差位置の管壁は丸め処理が施される。

別の実施形態においては、分流チャネル（３４）の流動抵抗と分流チャネル（３４）と主チャネル（２）との２つの交差点の間の領域の全体流動抵抗とは比例関係を満たすことにより、ターゲット粒子は主チャネル（２）に流れ込み続け、ターゲット粒子を含まない液体流れは分流チャネル（３４）に流れ込む。

別の実施形態においては、ｍ番目（ｍは、１以上、且つ収束・分流ユニットの総数以下の自然数、例えば、ｍ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）の収束・分流ユニット（３）の分流チャネル（３４）の流動抵抗は、以下のように決定される。サンプルが前記ｍ番目の収束・分流ユニット（３）の最後の収束構造（３３）を通過した後、ターゲット粒子が主チャネル（２）の中央から［－ｒ，ｒ］（ここで、ｒの値は前記のｍ番目の収束・分流ユニットにおける各収束構造のチャネルの幅及び流動抵抗の比例に基づいて計算される。）の範囲に集束していることとし、また、主チャネルの幅の半分をＷ_Ｚとし、分流チャネル（３４）により分離された液体の幅をＷ_Ｚ－ｒ以下とすると、全体の液体流れに対する分流チャネル（３４）の液体流れの割合は

により計算される。前記ｍ番目の収束・分流ユニットの分流チャネル（３４）と主チャネル（２）との２つの交差点の間の領域の全体流動抵抗（分流チャネル内部領域の全体流動抵抗ともいう。）をＲ１^ｍとし、各分流チャネル（３４）の流動抵抗をＲ２^ｍとすると、下記の式が得られる。

上記式から

を求めることにより、Ｒ２^ｍとＲ１^ｍの比例関係である

、即ち、前記のｍ番目の収束・分流ユニットの分流チャネルの流動抵抗と後の全ての構造の流動抵抗との関係を求める。後ろから前への最後の分流チャネルの内部領域の全体流動抵抗である捕捉ユニットの流動抵抗に基づいて、前のいずれか、例えば、ｍ番目の収束・分流ユニット（３）の分流チャネル（３４）の流動抵抗値が得られ、さらに、チャネルの具体的なサイズまたはサイズの範囲を得ることができる。

別の実施形態においては、前記マイクロ流体チップはターゲット粒子を捕捉するための捕捉ユニット（４）をさらに備える。好ましくは、前記捕捉ユニット（４）は、収束・分流ユニット（３）の下流に配置され、両端は主チャネル（２）に連通している。さらに好ましくは、前記捕捉ユニットは、分岐パイプ（４１）を介して主チャネル（２）に連通している。

具体的な一実施形態においては、前記捕捉ユニット（４）は、１層又は１層以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０層）のアレイを備える。好ましくは、前記アレイは、任意の形状（例えば、立方体、直方体、三角柱、円筒などの形状、又は断面が正方形、長方形、三角形、円形などの形状）の小ブロック（４２）で配置されることによって構成され、隣接する小ブロック（４２）の間に隙間ｄがあり、前記隙間ｄの大きさが隣接する２つの小ブロック（４２）の表面上の最も近い２点間の距離として定義される。さらに好ましくは、各層のアレイの小ブロック（４２）の間の隙間ｄが同じである。またさらに好ましくは、異なる層のアレイの小ブロック（４２）の間の隙間ｄが上から下に段階的に減少、例えば、アレイ層の数が４である場合、上から下に前記隙間ｄの大きさは順に１４μｍ、１２μｍ、１０μｍ、及び８μｍである。

別の実施形態においては、入口（１）において、ろ過構造（１１）をさらに備える。

第２態様においては、本発明は、第１の態様に記載のマイクロ流体チップを備える、ターゲット粒子を濃化及び/又は捕捉するための装置を提供する。

第３態様においては、本発明は、第１の態様に記載のマイクロ流体チップ又は第２態様に記載の装置の使用を含む、サンプルの流量及び／又は流速を低減させるための方法を提供する。

第４態様においては、本発明は、
（１）ターゲット粒子を含むサンプル溶液を供給するステップと、
（２）前記サンプル溶液を第１の態様に記載のマイクロ流体チップ又は第２態様に記載の装置に注入するステップと、を含む、ターゲット粒子を濃化及び／又は捕捉するための方法を提供する。

第５態様においては、本発明は、サンプル溶液中のターゲット粒子を除去するための方法であって、
（１）ターゲット粒子を含むサンプル溶液を供給するステップと、
（２）前記サンプル溶液を第１の態様に記載のマイクロ流体チップ又は第２態様に記載の装置に注入するステップと、
（３）前記マイクロ流体チップの出口（５）から流出するサンプル溶液を収集するステップと、を含み、
任意選択的に、任意選択的に、ステップ（２）及び（３）を繰り返し、前記繰り返し回数は１回、２回、またはそれ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回）である、サンプル溶液中のターゲット粒子を除去するための方法を提供する。

本発明に係る方法では、前記サンプル溶液の注入速度は、５～２００ｍＬ／ｈ、１０～１５０ｍＬ／ｈ、２０～１００ｍＬ／ｈ、３０～８０ｍＬ／ｈ、４０～６０ｍＬ／ｈであり、具体的には、注入速度は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ｍＬ／ｈ、又は前記の任意の２つの値の間の流速値であってもよい。

本発明の全ての実施形態に使用されるサンプルは、全血、血漿、血清、灌流液、尿、組織液、脳脊髄液、細胞培養液、又は細胞混合液に由来し、好ましくは全血又は灌流液である。

本発明の全ての実施形態に係るターゲット粒子は、腫瘍細胞であり、好ましくは循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）である。

本発明に係るチップは、少なくとも４０ｍＬ／ｈの高流速での血液中の腫瘍細胞を捕捉することを実現し、捕捉効率は９０％を超え、白血球の平均残存速度はわずか０．００８％であり、他の単一の物理的分離方法よりもはるかに低いである。本発明に係るチップは高流速サンプル中のターゲット粒子（細胞）の分離及び捕捉に適しているため、実用的な臨床応用が可能であり、また、健康なボランティア及び肺癌、乳がん、肝臓癌と診断された患者からの血液サンプルの二重盲検陰性陽性識別分離の達成にも成功している。

実施例１のチップの構造概略図（ａ）及び実物を示す図（ｂ） 一実施形態における１組の収束・分流ユニットの構造概略図を示し、５つの収束構造及び主チャネルの両側の分流チャネルを備えるものである図 一実施形態における主チャネルくびれ部の概略図を示し、ｄ１は、ターゲット粒子の重心から主チャネルくびれ部の境界までの距離を表し、ｄ２は、ターゲット粒子の重心から主チャネルの境界までの距離を表す図 収束構造の流線概略図を示し、ｒは分離された液体の中央に近い境界から主チャネル中央までの距離を表し、Ｗ_Ｚは主チャネルの幅の半分である図 一実施形態における１番目の収束構造を通過した後の、主チャネルにおける蛍光標識された腫瘍細胞の位置の変化を示す図 一実施形態における１番目、３番目、５番目の収束構造を通過した後の、主チャネルにおける腫瘍細胞の位置分布を示す図 一実施形態における分流チャネルの全体設計を示す図 分流チャネルの部分拡大図を示す図 分流チャネルを流れる時の蛍光標識された腫瘍細胞を含む血液体流れの液体流れの形態を示し、左側は明視野と蛍光のオーバーレイであり、右側には蛍光画像である図 様々な流速でのＨｅＬａ細胞をドープした血液の捕捉効率を示し図（ａ）、４０ｍＬ／ｈ流速での様々な細胞株の腫瘍細胞をドープした血液の捕捉効率を示し図（ｂ）、及び４０ｍＬ／ｈ流速での様々な濃度のＨｅＬａ細胞をドープした血液の捕捉効率を示す図（ｃ） 様々な流速での捕捉領域における腫瘍細胞の分布（血液中のドーピング）を示し、腫瘍細胞は白い破線枠でマークされている図 血液に腫瘍細胞を添加した後、チップを通過してＰＢＳで洗浄し、ＡＣＫ溶解液で赤血球を溶解した後の典型的な捕捉状況を示す図（ただし、染色後の腫瘍細胞は赤い蛍光を持ち、図面で黒い破線枠でマークされ、染色の白血球は青い蛍光を持ち、図で黒い破線枠でマークされている） 臨床二重盲検試験により健康なボランティア及び腫瘍患者血液中のＣＴＣの数を検出することを示す図

本発明は、実施例を通じてさらに理解することができるが、これらの実施例は、本発明を限定するものではないことを理解されたい。現在知られているか又はさらに開発される本発明の変形は本明細書の説明及び保護請求しようとする本発明の範囲内にあると見なされる。

（マイクロ流体チップ）
本発明に係るマイクロ流体チップの第１の機能は、ターゲット粒子をサンプル液体流れの中央部に収束させるとともに、分流によりサンプル液体流れの流量・流速の低減を実現することで、その後のターゲット粒子の捕捉又は分離を容易にする、ことにある。この機能を実現するために、本発明に係るチップは、入口１、主チャネル２、収束・分流ユニット３、及び出口５を備える。同時にターゲット粒子の捕捉を実現しようとする場合は、ターゲット粒子捕捉ユニット（捕捉ユニットと略記される。）４をさらに備えることが好ましい。

収束・分流ユニット３の機能は、チップに注入したサンプル中のターゲット粒子（例えば、腫瘍細胞）を主流道２の中央線に収束させると同時に、非ターゲット粒子（例えば、赤血球、白血球など）を分流させることにある。これにより、ターゲット粒子の相対濃度を大幅に向上させることができ、さらに重要なことは、収束・分流ユニットから流出するサンプルが捕捉ユニット４に入ると、該サンプルの流速と流量が収束・分流ユニット３に入る前と比較して大幅に低減し、これもターゲット粒子の捕捉に有利な条件を提供する。この特点により、本発明に係るチップは高流速および高スループットのサンプル添加に適し、実際の臨床応用の効果を大幅に改善する。

（入口）
入口１は、チップのサンプル入口であり、被験サンプルをマイクロ流体チップに注入するために使用される。一実施形態においては、入口は、サンプル中の不純物をろ過して除去し、チップの閉塞を防ぐために、ろ過構造１１をさらに備える。

（主チャネル）
主チャネル２は、チップ入口１と出口５を接続する主サンプルチャネルであり、その断面の幅は２_ＷＺ（Ｗ_Ｚは断面幅の半分である）である。異なる機能モジュール（例えば、収束・分流ユニット３）は主チャネルに接続され、サンプルに対する様々なタイプの操作を完了する。なお、主チャネル２は、物理的に連続したチャネルではなく、主チャネル２の延長方向においてほかの構造を備えることができ、例えば、主チャネル２の一セクションは後述の収束構造における中央チャネル３３１で置き換えられることが可能であり、該中央チャネル３３１は主チャネル２と同軸に配置され、その両端が主チャネル２に接続されている。この意味で、中央チャネル３３１は断面の幅が変更された主チャネル２と見なすこともできる。一実施形態においては、Ｗ_Ｚ＝４５μｍである場合、主チャネル２の幅２Ｗ_Ｚは９０μｍである。

（収束・分流ユニット）
収束・分流ユニット３の数は、１つであってもよく、より好ましくは２つ以上（例えば１～２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）である。２つ以上の収束・分流ユニット３が備えられる場合、異なる収束・分流ユニット３は順に直列に配置され、主チャネル２を介して互いに接続されている。異なる収束・分流ユニットは、同じサイズパラメータを有してもよく、異なるサイズパラメータを有してもよく、同じサイズパラメータを有することが好ましい。収束・分流ユニット３は、少なくとも１つの、収集ポート３１と、主チャネルくびれ部３２と、直列に配置された１つ又は複数（例えば、１～２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）の収束構造３３と、分流チャネル３４とを備える。ここで、収集ポート３１は、サンプル、特に、高流量及び高流量のサンプルを注入するために用いられる。サンプルは主チャネル２を通って収束・分流ユニット３に流れ込む。サンプルは、収束・分流ユニット３から流出した後、次の収束・分流ユニット３に流れ込むことができ、最後の収束・分流ユニット３から流出した後、流量・流速が低下したサンプルが得られる。チップが捕捉ユニット４を備える場合、前記の流出したサンプルは捕捉ユニット４に入ることが好ましい。

本発明における全てのチャネル（主チャネル２、中央チャネル３３１、側方支流チャネル３３２、又は分流チャネル３４などを含む）の断面は、任意の適切な形状であり、例えば、‘円形、楕円形、正方形、長方形、又はその他の任意的な多角形などである。

（収集ポート）
収集ポート３１は、主チャネル２からのサンプルを主チャネルくびれ部３２に導入するために使用され、漏斗状の構造を形成することが好ましい。ここで、収集ポートの最も広い部分の断面の幅をＷ_１とすると、Ｗ１は主チャネル断面の幅２Ｗ_Ｚ（Ｗ_Ｚは主チャネル断面の幅の半分である）以上である。一実施形態においては、Ｗ_１＝２Ｗ_Ｚである。別の実施形態において、Ｗ_１＞２Ｗ_Ｚである。具体的な一実施形態においては、Ｗ_１＝２００μｍである。

（主チャネルくびれ部）
主チャネルくびれ部３２は、収集ポート３１と主チャネル２との間に位置し、その断面の幅Ｗ_２は収集ポート断面の最も広い位置（Ｗ_１）よりも小さく、かつ、主チャネルの幅（２Ｗ_Ｚ）よりも小さい。それにより、両端が広く中央が狭い構造を局所的に形成する。

図３は、一具体的実施において、サンプルが主チャネルくびれ部３２を通って主チャネル２に流れ込む過程を示す。ここで、ｄ１を液体流れのくびれ部の右側の境界（同様に、左側にも適用される）に直接隣接するターゲット粒子の中央（重心ともいう）と右側の境界との間の距離とし、ｄ２を主チャネルに入った後の右側境界に最も近いターゲット粒子の重心と主チャネルの右側境界との間の距離とし、ｒ_ｃｅｌｌをターゲット粒子の半径とした場合、一定の剛性を持つターゲット粒子（例えば、細胞、特にがん細胞、例えばＣＴＣなど）は、ターゲット粒子が圧縮されにくいため、ｄ１はｒ_ｃｅｌｌと等しいと見なすことができる。実際の計算では、設計されたチャネルがすべてのターゲット粒子が誤って排出されないことが確保されるために、ｄ１はｒ_ｃｅｌｌよりわずかに小さくすることができる。いわゆる「わずかに小さい」は、当業者には理解できる。つまり、ｄ１の値がｒ_ｃｅｌ未満である限り、計算中でターゲット粒子がより多く中央チャネルに入ることが保証される。例えば、ｄ１は、ｒ_ｃｅｌｌの９０％以上であってもよく、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は前記の任意の２つの値の間にある範囲及び値である。

液体流れがくびれ部３２から通常の幅の主チャネル２に流れ込ると、流体力学の原理に従って、ｄ２＝２Ｗ_Ｚ／Ｗ_２×ｄ１が得られる。同様に、左側境界の細胞にも適用できる。続いて、液体流れは、さらに収束構造を流れる。

（収束構造）
収束構造３３は、側方支流チャネル３３２と中央チャネル３３１とを備える。好ましくは、側方支流チャネル３３２は２つがあり、それぞれ中央チャネル３３１の両側に配置され、対称的に分布し、また、好ましくは、同じの構造及びサイズパラメータを有する。各側方支流チャネル３３２は、上と下の両端（前と後の両端ともいう）で主チャネル２及び中央チャネル３３１と交差する。中央チャネル３３１の断面の幅は、主チャネル２の断面の幅よりも小さいことが好ましい。例えば、中央チャネル３３１の断面の幅は、主チャネル２の断面の幅の３０％～９９％であり、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％及び前記の任意の２つの値の間の任意の値である。サンプル（例えば、血液）は、主チャネルに入った後、液体の一部（ターゲット粒子を含む）は中央チャネルに流れ込み続け、残りの液体流れ（それにターゲット粒子を含まない）は両側の側方支流チャネルに流れ込み、その後、側方支流チャネル中の液体が中央チャネルから流出する液体と合流し、再び主チャネルに流れ込み、その後、次の収束構造に入るか又は分流チャネル（最後の収束構造から出てきた場合）を流れる。また、一実施形態においては、各側方支流チャネル３３２自体は、分岐構造をさらに備えることができ、即ち、並列の複数のチャネルの形態、又は、直列と並列の組み合わせの複数のチャネルの形態をしている。

図４に示すように、サンプルは主チャネルくびれ部３２を通過した後、１番目の収束構造３３に入ると、中央点から離れた主チャネル２中の液体流れの一部は分流されて側方支流チャネル３３２に流れ込み、その後、両側から中央チャネル３３１から流出する液体流れと合流する。従って、主チャネル２の液体流れの比較的無秩序に分布しているターゲット粒子を収束構造３３によって収束させる（即ち、ターゲット粒子を中央部に向かって集める）ために、分離された液体はターゲット粒子を含まなく、全てのターゲット粒子は中央チャネル３３１を流れ、中央チャネル３３１の境界に近いターゲット粒子がチャネルの左／右側壁によってチャネル中央に向かって一定距離押し込まれ、その後、分離された液体は逆流し、ターゲット粒子を含む液体流れと合流する、ことを確保することが必要である。つまり、収束構造を流れた後、細胞の重心は集められる。

上記の目的を達成するためには、その後側方支流チャネル３３２に流れ込む主チャネル２の液体流れを観測対象として、主チャネル２の中央側に最も近いこの液体流れの境界と中央との距離をｒとし、境界での液体流れの速度をｖとし、ｖ_ｍａｘは主チャネル２の中央での速度であり、同時に液体流れの断面での最大速度でもあり、Ｗ_Ｚを主チャネルの幅の半分とした場合、流体力学の原理に従って、ｖとｖ_ｍａｘは次の式を満たす。

速度分布とrを積分すると、元の関数は次のように得られる。

－Ｗ_ＺからＷ_Ｚの全体のチャネルを積分すると、下記の式で示すように全体の流量が得られる。

続いて、－ｒからｒまで積分すると、下記の式で示すように、主チャネルを通過した後の主チャネルに残っている液体の流量を計算できる。

全体流量に対する側方支流チャネル３３２に入る流量の割合である、分流割合をｋとした場合、下記の式に示すように、全体流量に対する主チャネルに残っている液体流量の割合が１－ｋであることが分かる。

上述から分かるように、主チャネルくびれ部を通じて流れ込んだ主チャネル右側（或いは、左側）の壁に最も近い細胞の重心から主チャネル右側（或いは、左側）の壁までの距離がｄ２であり、ここで、ｄ２＝２Ｗ_Ｚ／Ｗ_２＊ｄ１（図３）、Ｗ_２は主チャネルくびれ部の幅を表す。主チャネルくびれ部を流れ、１番目の収束構造に入る直前の液体流れは、この時、

であり、これを式（Ｖ）に入れて、

が得られる。

Ｒ１を１番目の収束構造の中央チャネル３３１の流動抵抗とし、Ｒ２を１番目の収束構造の側方支流チャネル３３２の流動抵抗とした場合、パイプの流動抵抗はパイプのサイズ特性に関連し、本発明で流動抵抗の比例関係を計算する際に、計算式は次のようになる。流動抵抗Ｒ_流動抵抗は、Ｒ_流動抵抗＝８ηＬ（Ｈ＋Ｗ）^２／（ＨＷ）^３（ただし、ηは液体の粘度係数を表し、Ｌ、Ｈ及びＷはそれぞれチャネル（例えば中央チャネル及び側方支流チャネル）の長さ、高さ、幅である）として表される。流動抵抗が流量の分布に反比例することに基づき、流量の分布割合は、流動抵抗を基として計算することができる。

ターゲット粒子が主チャネルに残され続け、ターゲット粒子を含まない液体流れができるだけ分離されることを保証するために、下記の式を満さすことが必要である。

ここで、不等式の左側は、全体液体流れに占める細胞重心が位置する領域範囲に対応するその部分の液体流れの割合を表し、右側は、全体液体流れに占める１番目の収束構造の流動抵抗に基づいて計算された、主チャネルに残り続ける液体流れの割合を表す。ターゲット粒子が分離されないようにするには、右側が左側と等しくするか、又は左側よりもわずかに大きくする必要がある。

液体流れが全ての収束構造を流れる際にさらに収束できるようにするには、前と後の２つの収束構造が流動抵抗に関して一定の関係を満たすことが必要である。ｎ番目（ｎは１以上、収束構造の総数から１を引いた数以下である）の収束構造中央チャネルの流動抵抗をＲ１^ｎとし、側方支流チャネルの流動抵抗をＲ２^ｎとし、ｎ＋１番目の収束構造中央チャネルの流動抵抗をＲ１^ｎ＋１とし、側方支流チャネルの流動抵抗をＲ２^ｎ＋１とした場合、ｎ番目の収束構造を通過した後のターゲット粒子の中央から境界までの距離は、（Ｗ_Ｚ－ｒ＋ｐ）である。ここで、ｐは、元に分流境界に位置していたターゲット粒子がｎ番目の収束構造を通過した後で中心に進んだ距離を表す。ｎ＋１番目の収束構造を通過する際に、ターゲット粒子が側方支流チャネルに入ることがなく、全てのターゲット粒子が依然としてさらに収束されることを保証するようにする。

まず、中央チャネル流量に占める中央チャネルにおける左側に最も近い粒子状物質の重心から右側に最も近い粒子の重心までの領域範囲にあるその部分の流量の割合（図４ａ）を求める。同様な原理により、式Ｖに従って、その割合は

であり、ここで、この場合は、ｒをＷｓ^ｎ／２－ｄ１に置き換え、Ｗ_ＺをＷｓ^ｎ／２に置き換える。ここで、Ｗｓ^ｎは、ｎ番目の収束構造の中央チャネルの幅（ｎは１以上、収束構造の総数から１を引いた数以下である）を表す。さらに、上記の割合の具体的な表示式は

である。そして、主チャネル全体流量に占める中央チャネルの流量の割合が１－ｋであることに基づき、同様に、式（ＶＩＩ）に従って、

が得られ、主チャネル全体流量に占める中央チャネルにおける左側に最も近い粒子状物質の重心から右側に最も近い粒子状物質の重心までの領域範囲にあるその部分の流量の割合は

として求められる。さらに、式（ＶＩＩ）に従って、全体流量に占める液体流れがｎ＋１番目の収束構造に入る直前である時の主チャネルに残っている流量の割合は

として計算される。ターゲット粒子は主チャネルに残り続け、ターゲット粒子を含まない液体流れは可能な限り分離されることを確保するためには、下記の式を満たす必要である。

ここで、不等式の左側は、全体液体流れに占める細胞重心が位置する領域範囲に対応するその部分の液体流れの割合を表し、右側は、全体液体流れに占めるｎ＋１番目の収束構造の流動抵抗に従って計算された主チャネルに残り続ける液体流れの割合を表す。ターゲット粒子が分離されないようにするには、右側が左側と等しくするか、又は左側よりもわずかに大きくする必要がある。

式（ＶＩＩＩ）と式（ＩＸ）を組み合わせることで、異なるサイズのターゲット粒子（例えば、腫瘍細胞）については、ターゲット粒子を収束させ続けることができる収束構造の具体的なサイズと比例関係を決定することができ、特定のサイズと比例関係に限限定されない。

（分流チャネル）
分流チャネル３４の作用は、１つ又は複数の収束構造３３の収束後、ターゲット粒子が液体流れの中央近くに集中し、分流チャネル３４を主チャネル２に接続するように設けることで、ターゲット粒子を含まない液体流れの一部を排出することができ、それにより、サンプル液体流れの流速及び流量を低減させる、ことにある。その後、次の収束・分流ユニット３に入り、サンプルが最後の収束・分流ユニット３を流れた後、ターゲット粒子の捕捉が必要である場合は、主チャネル２を通して捕捉ユニット４に入る。

分流チャネルの設計規則は、以下の通りである。収束構造３３の収束後、主チャネル２における液体流れが分流チャネル３４を流れる前に、ターゲット粒子が液体流れの中央に近い範囲内に収束されたので、流量・流速を減少させる目的を達成するためには、液体流れの縁に近い部分のターゲット粒子を含まない液体流れの部分を排出すればよい。

分流チャネル３４は、２つがあることが好ましく、主チャネル２の両側に対称的に配置されて、各分流チャネル３４が上流と下流（或いは、前端と後端の両端）でそれぞれ主チャネルと交差し、分流チャネル３４に入った液体が下流の交差点で主チャネル２に入って出口５から排出されることが好ましい。一実施形態においては、各分流チャネル３４自身が分岐構造をさらに具備することができ、即ち、並列の複数のチャネルの形態、又は、直列と並列を組み合わせの複数のチャネルの形態をしている。

一実施形態においては、図５ｂに示すように、液体流れが１つ又は複数の収束構造を通過した後に主チャネル２に流れ込む時、液体流れの中央点からチャネルの境界（如右の境界）までの距離をＷ_Ｚとする同時に、全てのターゲット粒子が収束作用により液体流れの中央近くに集められ、ターゲット粒子を含む液体流れの境界から中央点までの距離をｒとした場合、分流される必要のある液体流れの幅がＷ_Ｚ－ｒ以下であることが必要である。

例示的な一実施形態においては、主チャネル２の全幅が９０μｍであり、即ちＷ_Ｚ＝４５μｍ。各収束・分流ユニット３が５つの収束構造３３を備えている。収束後、ターゲット粒子は［－１６μｍ、１６μｍ］の範囲内に集束され、即ち、ｒ＝１６μｍ（チャネルの中央点を座標原点とした）、そのため、Ｗ_Ｚ－ｒ＝２９μｍである。したがって、最適な設計は分流部が両側の幅が２９μｍの液体流れを分離し、非ターゲット粒子（例えば、白血球及び赤血球）を可能な限り多く除去できると同時に、ターゲット粒子（例えば、ＣＴＣ）が分離されないことを保証する。

Ｗ_Ｚ－ｒの液体流れが分離されることを保証するためには、どのぐらいの割合の液体流れが分流チャネルに入るべきであるかを決定する必要があるため、下記の計算を行う。以下の計算過程は、収束構造において側方支流チャネルによって分離される流量の計算過程と同様である。詳細は次のとおりである。

主チャネル２に入ってチャネル中央から離れて続いて分流チャネル３４に流れ込む液体流れを観察対象として、主チャネル中央側に近い該液体流れの境界と中央との間の距離をｒ（ターゲット粒子を含む部分の液体流れの境界と中央との間の距離ｒと同じである）とし、境界での液体流れの速度をｖとし、ｖ_ｍａｘは主チャネル中央での液体流れの流速であり、液体流れの断面での最大速度でもあり、Ｗ_Ｚを主チャネルの幅の半分とした場合、流体力学の原理によければ、ｖとｖ_ｍａｘは次の式を満たす。

速度分布とrを積分すると、元の関数が次のように得られる。

－Ｗ_ＺからＷ_Ｚの全体のチャネルを積分すると、下記の式で示される全体の流量が得られる。

続いて、－Ｗ_Ｚから－ｒ、及びｒからＷ_Ｚまで積分すると、下記の式に示すように、主チャネルに流れ込んだ後の両側分流チャネルに分割される液体の流量を計算できる。

全液体流れに対する分流チャネルに入った流量の流量割合である分流割合をｋとした場合、ｋの計算は下記の式に示される。

同様に、前記の示例的な実施形態においては、Ｗ_Ｚ＝４５μｍ、ｒ＝１６μｍである場合、Ｗ_Ｚ及びｒを式（ＸＩ）に入れると、ｋの割合が約０．４４であることが分かる。

ここで、液体の分布は、下記の式に従う。

毎回の分流について、Ｒ１を分流チャネル（３４）内部領域の流動抵抗（その意味は後述する）とし、Ｒ２を両側の分流チャネルの流動抵抗とした場合、分流チャネル流動抵抗の計算式は、以下の通りである。

ここで、ηは液体の粘度係数を表し、Ｌ、Ｈ、及びＷはそれぞれチャネル（チャネルの長さ、高さ、幅）を表す。上記の方法に基づき、分流割合は

として得られる。

本発明の幾つの実施形態においては、マイクロ流体チップは、上下に順に直列に配置されている複数組の収束・分流ユニットを備える。各所定の分流部については、分流チャネル３４内部区域の流動抵抗は、分流チャネル（３４）と主チャネル（２）の２つの交差点の間の領域にある全てのパイプ又は他の構造の全体流動抵抗を指す。簡潔のために、本発明では、それを「交差点の間の流動抵抗」又は「交差点の内部流動抵抗」と呼ばれ、単に「内部全体流動抵抗」又は「内部流動抵抗」とも呼ばれる。以下、最後の組、すなわち、捕捉ユニットに接続されている収束・分流ユニットから計算して始め、計算過程を示す。

ｍ番目の組（ｍは、１以上、収束・分流ユニットの総数以下の自然数である）の収束・分流ユニットの交差位置の内部流動抵抗をＲ１^ｍとし、最後の収束・分流ユニット（即ち、ｍは収束・分流ユニットの数と等しい場合）に関しては、その内部全体流動抵抗は捕捉領域と主チャネルとを接続する接続チャネル４１の流動抵抗に捕捉ユニットの小ブロック４２の流動抵抗を加えたものを含み、分流部における両側分流チャネルの流動抵抗をＲ２^ｍとした場合、満たす必要のある割合ｋが知られている（各収束・分流ユニットが同じｋを満たしている）ので、

に従って、Ｒ１^ｍとＲ２^ｍとの関係、即ち、

を計算し、

が得られ、簡単にするために、

とする。

ｍ－１番目の組の分流部の両側分流チャネル内部の全体流動抵抗をＲ１^ｍ－１とした場合、両側分流チャネルの流動抵抗がＲ２^ｍ－１であり、式

に従って、Ｒ１^ｍ－１とＲ２^ｍ－１との関係を計算することができる。一方、Ｒ１^ｍ－１は実にその後ろの組の分流部におけるＲ１^ｍと２組のＲ２^ｍとが並列して接続し、２組のＲ２^ｍが並列した後の流動抵抗が１／２×Ｒ２^ｍであり、さらに、Ｒ１^ｍ－１＝Ｒ１^ｍ×１／２×Ｒ２^ｍ／（Ｒ１^ｍ＋１／２Ｒ２^ｍ）を計算し、ここで、Ｒ２^ｍ＝ｘ×Ｒ１^ｍであり、上記の式に入れて、
Ｒ１^ｍ－１＝［ｘ／（ｘ＋２）］×Ｒ１^ｍ （ＸＩＩ）
を得ることができる。

このように類推すれば、各組の収束・分流ユニットの分流部におけるＲ１とＲ２の具体的なパラメータを計算し、それにより、所定の分流目標を達成する必要がある場合、分流チャネル及び中央チャネルの長さ、幅、高さが満たす必要がある条件を決定する。

一実施形態においては、ｋ＝０．５（即ち、半分の流量の液体流れが分流により分離される）である。

具体的な一実施形態においては、前記チップは合わせて７組の収束・分流ユニット３を備え、各収束・分流ユニット３は１組の分流チャネル３４（主チャネル２の左側と右側の両側でそれぞれ１つの分流チャネル３４があり、両者が並列して配置される）を備え、合わせて７組の分流チャネル３４を含む。

最後の収束・分流ユニットの分流チャネル３４に関しては、サンプルの液体流れが分流チャネル内部の流動抵抗と分流チャネルの並列流動抵抗に基づいて分布し、前記分流チャネル３４内部の流動抵抗、即ち、捕捉ユニットの流動抵抗をＲ１^７とし、両側分流チャネル３４の片側流動抵抗をＲ２^７とした場合、半分の流量を分流により分離できることを保証するためには、両側分流チャネルの総流動抵抗（並列）が捕捉ユニットの流動抵抗Ｒ１^７と等しくなることが必要がある。その計算は以下の通りである。

両側分流チャネルの並列流動抵抗は、（Ｒ２^７×Ｒ２^７）／（Ｒ２^７＋Ｒ２^７）＝１／２×Ｒ２^７＝Ｒ１^７であるから、Ｒ２^７＝２Ｒ１^７が得られ、即ち、式ＸＩＩにおいてｘ＝２である。従って、
後ろから２、３、４、５、６、７番目の組の分流部内部領域の総流動抵抗は、約１／２×Ｒ１^７、１／４×Ｒ１^７、１／８×Ｒ１^７、１／１６×Ｒ１^７、１／３２×Ｒ１^７及び１／６４×Ｒ１^７であり、
後ろから２、３、４、５、６、７番目の組の分流部の分流チャネルの流動抵抗は約Ｒ１^７、１／２×Ｒ１^７、１／４×Ｒ１^７、１／８×Ｒ１^７、１／１６×Ｒ１^７及び１／３２×Ｒ１^７であることを容易に計算することができる。

上記の計算に基づいて、分流チャネルの流動抵抗の関係及び具体的なサイズ割合の設計を簡単に取得できる。

（捕捉ユニット）
従来技術における例えば腫瘍細胞などのターゲット粒子の様々な捕捉構造がある。理論的には、既存のすべての捕捉構造を本発明の捕捉ユニット４として使用することができる。好ましくは、本発明に係るチップは、複数層配置の隙間設計を採用する。ターゲット粒子を含む液体流れは流出捕捉ユニット４に入り、流出捕捉ユニット４は下端で出口５に接続され、その結果、捕捉された液体流れは出口５から排出され、また、液体流れが流れる隙間が徐々に小さくなることにより、特定のサイズのターゲット粒子を特異的に捕捉する。好ましくは、目粒子のサイズは液体流れ中の非ターゲット粒子よりも大きく、より好ましくは、前記ターゲット粒子は腫瘍細胞、例えば、循環性腫瘍細胞である。

一実施形態においては、捕捉ユニット４は、複数層（例えば、３～１０層、具体的には、３、４、５、６、７、８、９、１０層）のアレイ構造である。好ましくは、各層のアレイは、任意の形状の（例えば、立方体、直方体、三角柱、円筒などの形状の、又は、断面が正方形、長方形、三角形、円形などであってもよい）小ブロックで配置される。２つの小ブロックの間には隙間がある。前記隙間の値は、隣接する２つの小ブロック上の最も近い２点の間の距離として定義される。また、好ましくは、各層のアレイ内の隙間は同じである。さらに好ましくは、異なる層のアレイの隙間は、上から下に段階的に減少する。例えば、アレイの層数が４である場合、上から下への隙間は順に１４μｍ、１２μｍ、１０μｍ、および８μｍである。

一実施形態においては、捕捉ユニット４は、４層の三角形のアレイを備え、上から下への隙間が順に１４μｍ、１２μｍ、１０μｍ、及び８μｍであり、各層が均一に配置された３、３、３、５列の、辺の長さが８０μｍの正三角形である三角形を含むように設計される。

具体的な一実施形態においては、前記捕捉ユニット４は、腫瘍細胞、特にＣＴＣ細胞を捕捉するために用いられる。これは、ＣＴＣは、サイズが比較的大きく、かつ、変形しにくく、隙間に引っかかるが、白血球などの他の血液細胞は、サイズが比較的小さく、かつ、変形能が強く、隙間を自由に通り抜けることができるためである。

〈実施例〉
《実施例１ チップの設計》
図１に示すように、本実施例で製造したマイクロ流体チップは、収束・分流ユニット３と捕捉ユニット４とも含む。ここで、収束・分流ユニット３は、７つであり、順に直列に配置されている。各収束・分流ユニット３は、収集ポート３１、主チャネルくびれ部３２、５つの収束構造３３、及び両側に配置された２つの分流チャネル３４を含む。

収集ポート３１は、幅が最も広い部分の断面直径がＷ_１＝２００μｍであり、全体が漏斗状の構造をしている。主チャネルくびれ部３２は断面直径がＷ_２＝３０μｍである。主チャネル２は、断面直径が９０μｍである。

各収束・分流ユニット３について、前記５つの収束構造３３の側分流チャネル３３２は、幅がそれぞれ３０、４０、４０、４０、４０μｍであり、長さがそれぞれ１１８０、９００、６００、４４０、４４０μｍ（片側の長さ）である。中央チャネル３３１は、幅Ｗｓが３０μｍである。主チャネル２は、幅２Ｗ_Ｚが９０μｍである。

前記７組の収束・分流ユニット３は、同じ数及びサイズの収束構造３３を有し、分流チャネル３４は、上から下への幅がそれぞれ２２０、２００、１８０、１６０、１４０、１１０、及び８５μｍであり、長さがそれぞれ７５１３１、７０４５５、６５８０９、６１３１３、５６９１７、５２６９１、及び４８５７０μｍ（片側の長さ）である。

（製造プロセス）
（１）特定のターゲット粒子については、理論計算に基づいて、収束・分流ユニット及び捕捉ユニットのサイズを設計し、Ｌ－ｅｄｉｔを使用してチップ図を描画した。
（２）クロム板を使用してマスクを作成し、シリコンシート又はクロム板を基板として使用し、ｓｕ－８光レジストによるスピン塗布、プリベーク、露光、ポストベーク、現像しモールドを作成した。
（３）ＰＤＭＳ Ａゲル：Ｂゲル＝８：１で均一に混合して金型に注ぎ、加熱して硬化させてチップを作成した。チップを打ち抜いた後、空気プラズマ処理によりスライドガラスに接着した。

《実施例２ チップによる血液中の腫瘍細胞の捕捉》
ＰＢＳをチップに事前に通して、チャネルの空気を排出し、その後、１％ＢＳＡで０．５時間インキュベートし、細胞接着を防いた。
ＨｅＬａ細胞を消化した後、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒで染色し、その後、１００００細胞／ｍＬの濃度まで希釈し、ウサギの血液を採取し、凝固を防ぐために等量のヘパリン（１０ｍｇ／ｍＬ）を加えて１：１で希釈した。
１ｍｌの希釈血液を採取し、濃度１００００細胞／ｍＬの染色後のＨｅＬａ細胞を１００μＬ加え、シリンジポンプを使用して流速を制御しながらチップ注射器に押し込み、出口を２４ウェルプレートに接続した。

蛍光顕微鏡によりチップの各レベルの収束分流領域を観察し、ＨｅＬａ細胞と血液中の他の細胞がフローラインに収束・分流される状況を統計してグラフを作成した（図４ｂ及びｃを参照）。観察結果は、腫瘍細胞が収束構造を通過した後、徐々に中央に収束する過程を確認した。同時に、赤血球及び白血球は分流チャネルにより分離され、腫瘍細胞は分流チャネルにより分離されない（図５ｃに示すように、赤蛍光は腫瘍細胞であり、蛍光が出ないのは赤血球及び白血球である）ことが観察された。

その後、様々なヒト腫瘍細胞（ＨｅＬａ、ＮＣＩ－Ｈ２２６、ＭＣＦ－７及びＭＢ－ＭＤＡ－２３１）を使用して実験を行った。前記腫瘍細胞は、同様のサイズであり、平均直径は約１２～１６μｍの間である。実施例１のチップは、前記のサイズに基づいて作製し、理論的にはこれらのすべての細胞の分離に使用することができる。また、チップの信頼性を検証するために、低から高への流量勾配と細胞密度を設定して実験を行う。

捕捉効率の計算式は、捕捉効率（％）＝チップ上で捕捉された細胞／（チップで捕捉された細胞＋チップから流出した細胞）×１００％である。腫瘍細胞が蛍光標識されているため、蛍光顕微鏡で捕捉領域の全体の画像を撮った後、捕捉された腫瘍細胞の数として蛍光細胞の数を読み取った。チップから流出した液体を２４ウェルプレートに収集し、ＡＣＫ溶解液を加えて赤血球を溶解することで、視野をより明確にした後、蛍光顕微鏡で画像を撮って計数し、流出した腫瘍細胞の数を得た。

結果は図６に示し、ＨｅＬａ細胞はさまざまな流量で高い捕捉効率を維持することができ、特に、流速が４０ｍＬ／ｈに達した場合でも、９０％を超えた捕捉効率を維持でき、流速が６０ｍＬ／ｈであった場合でも、捕捉効率は依然として８５％を超えた。図６ｂには４０ｍＬ／ｈ流速での様々な大きさのヒト腫瘍細胞の捕捉効率を示した。チップは、様々な腫瘍細胞株に対して、同様の捕捉効率を有し、すべて９０％以上に達したことがわかる。図６ｃは、腫瘍細胞の密度が異なる場合、特に、腫瘍細胞の密度が非常に低い場合、チップは安定的かつ高い捕捉効率を維持することができることを示した。

次に、様々な流速での捕捉領域における腫瘍細胞の分布を測定した。その結果は図７に示し、流速が増加するにつれて、腫瘍細胞は、徐々に後方に分布し、流速が６０ｍＬ／ｈに増加しても、腫瘍細胞が捕捉領域の隙間から漏れることがなく、これにより、本発明に係るチップが腫瘍細胞を効果的に捕捉することができることが分かった。

《実施例３ 白血球残留率測定》
白血球の残存は腫瘍細胞捕捉チップでよく発生する現象である。白血球の残留率が高すぎると、分離された腫瘍細胞の純度に影響を及ぼし、ひいてはその後の分析及び検出結果に影響を及ぼす。実施例１のチップでの白血球の残存状況を測定するために、幾つの異なる実験における白血球の残存数をサンプリングしてカウントした（図８）。その結果は、実施例１のチップでは、白血球の残留率が１０万分の８．１±６．６であり、即ち、残存白血球の割合が平均０．００８％であり、他の純粋な物理的分離方法よりもはるかに低いことを示した。

《実施例４ 臨床サンプルの検出》
がん患者の血液中にはわずかな循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）が存在することが知られている。血液ＣＴＣを有効的に捕捉することで、がんの早期発見と補助療法を実現することができる。がん患者の血液中の腫瘍細胞に対する本発明に係るチップの捕捉効率を確認するために、病院と協力して、３人の健康なボランティアの血液サンプル及び６人の確認されたがん患者の血液サンプルをそれぞれ２ｍＬ採取し、ランダムに番号を付き、実施例１のチップを使用して循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）の捕捉をそれぞれ行った。捕捉後、チップ上でインサイチュＣＤ４５／ＥｐＣＡＭ／Ｈｏｅｃｈｓｔ染色検証を行った。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ基準により、染色結果はＨｏｅｃｈｓｔ^＋ＣＤ４５^－ＥｐＣＡＭ^＋の細胞がＣＴＣであることを示した。その結果は図９に示し、本発明に係るチップでは、全ての健常血液サンプルから血液１ミリリットルあたり２つのＣＴＣを検出した。健常者の血液からもＣＴＣを検出される理由は、ＥｐＣＡＭがＥ型細胞を染色し、ＣＴＣがＥ型細胞である他に、血液中の皮膚細胞及びごくわずかな血液細胞もＥ型細胞であり、汚染が発生するためである。全てのがん患者の血液サンプルでは、有意に多くのＣＴＣが血液中に捕捉され、特に２人の第ＩＶ期の乳がん患者では、血液１ミリリットルあたりそれぞれ１１７個と４７個のＣＴＣが検出された。第ＩＩＩ期及び第ＩＶ期の肺癌の患者では、血液１ミリリットルあたりそれぞれ３０～４０個のＣＴＣを検出することができた。初期の肺癌患者（ＩＩＢ）では、血液１ミリリットルあたり１７個のＣＴＣを検出することができた。以上のデータは、本発明に係るチップが臨床サンプル中のＣＴＣを高感度かつ効果的に捕捉することができ、計り知れない臨床応用価値を有することを示している。

Claims (27)

1. マイクロ流体チップであって、
   入口（１）と、主チャネル（２）と、１つ又は複数の収束・分流ユニット（３）と、ターゲット粒子を捕捉するための捕捉ユニット（４）と、出口（５）と、を備え、
   前記主チャネル（２）は、前記入口（１）から、出口（５）まで直線的に延び、
   前記収束・分流ユニット（３）は、前記主チャネル（２）に接続され、前記主チャネル（２）の側方両側の分岐するチャネルのセットにより構成され、
   前記収束・分流ユニット（３）は、
   サンプル溶液を注入するための収集ポート（３１）と、
   前記収集ポート（３１）の下流に配置され、断面の幅が前記収集ポート（３１）の断面の最も広い位置よりも小さく、かつ、前記主チャネル（２）の幅よりも小さく構成された主チャネルくびれ部（３２）と、
   前記主チャネルくびれ部（３２）の下流に配置され、直列に配置された１つ又は２つ以上の収束構造（３３）及び分流チャネル（３４）と、
   を含み、
   各々の前記収束構造（３３）は、１つ以上の中央チャネル（３３１）と１つ以上の側方支流チャネル（３３２）とを備え、各々の前記中央チャネル（３３１）は、両端で主チャネル（２）に接続され、かつ同軸に配置され、各々の前記側方支流チャネル（３３２）は、両端で前記中央チャネル（３３１）と交差し、
   各々の前記分流チャネル（３４）は、それぞれの前記収束構造（３３）の下流に配置され、両端が前記主チャネル（２）と交差し、そのうちの上流交差点は、前記収束構造（３３）の最も下流側の前記中央チャネル（３３１）及び前記側方支流チャネル（３３２）の下流端に接続し、下流交差点は、前記マイクロ流体チップの前記出口（５）付近にあり、
   前記捕捉ユニット（４）は、最も下流側の前記分流チャネル（３４）の前記上流交差点と、最も上流側の前記下流交差点との間に配置され、両端が前記主チャネル（２）に連通している、
   マイクロ流体チップ。
2. 前記中央チャネル（３３１）の幅は主チャネル（２）の幅よりも小さい、
   請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
3. 前記側方支流チャネル（３３２）は、前記中央チャネル（３３１）の側方両側に配置された２つの側方支流チャネル（３３２）を含み、
   請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
4. ２つの前記側方支流チャネル（３３２）は、前記中央チャネル（３３１）の側方両側に対称的に配置され、同じサイズを有する、
   請求項３に記載のマイクロ流体チップ。
5. 前記中央チャネル（３３１）の流動抵抗（ｆｌｏｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）と前記側方支流チャネル（３３２）の流動抵抗とは比例関係を満たし、
   前記流動抵抗の前記比例関係は、前記中央チャネル（３３１）と前記側方支流チャネル（３３２）とのそれぞれのチャネルのＬ（Ｈ＋Ｗ） ^２ ／（ＨＷ） ^３ の比（ここで、Ｌ、Ｗ、及びＨは、それぞれのチャネルの長さ、幅、及び高さを表す）に基づいて求められ、
   Ｗ _２ を主チャネルくびれ部（３２）の幅とし、ｒ _ｃｅｌｌ をサンプル中のターゲット粒子の平均半径とし、ｄ１を液体流れの主チャネルくびれ部（３２）の一方側の境界に最も近いターゲット粒子の重心と前記一方側の境界との間の距離とし、Ｒ１を各収束・分流ユニット（３）の１番目の収束構造（３３）の中央チャネル（３３１）の流動抵抗とし、Ｒ２を前記１番目の収束構造（３３）の単一の側方支流チャネル（３３２）の流動抵抗とした場合、これらのパラメータは以下の式を満足し、
   

   

   ここで、ｄ１の値はｒ _ｃｅｌｌ に等しいか、又はｒ _ｃｅｌｌ よりも小さい値である、
   請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
6. ｎ番目（ここで、ｎは、１以上かつ収束構造の総数未満の自然数である）の収束構造（３３）の中央チャネル（３３１）の流動抵抗をＲ１^ｎとし、幅をＷ_ｓ ^ｎとし、単一の側方支流チャネル（３３２）の流動抵抗をＲ２^ｎとし、ｎ＋１番目の収束構造（３３）の中央チャネル（３３１）の流動抵抗をＲ１^ｎ＋１とし、各側方支流チャネル（３３２）の流動抵抗をＲ２^ｎ＋１とした場合、以下の条件を満たし、
   

   

   ここで、ｄ１の値はｒ_ｃｅｌｌに等しいか、又はｒ_ｃｅｌｌよりわずかに小さい値である、
   請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
7. 前記分流チャネル（３４）は、主チャネル（２）の側方両側に配置された２つの分流チャネル（３４）を含む、
   請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
8. ２つの前記分流チャネル（３４）は、主チャネル（２）の両側に対称的に配置され、同じサイズを有する、
   請求項７に記載のマイクロ流体チップ。
9. 前記分流チャネル（３４）と前記主チャネル（２）との交差点において、前記主チャネルの幅は、前記入口（１）における幅の１．５から５倍である、
   請求項７に記載のマイクロ流体チップ。
10. 前記分流チャネル（３４）の流動抵抗と、前記分流チャネル（３４）と前記主チャネル（２）との２つの交差点の間の領域の全体流動抵抗とは、比例関係を満たし、
    ｍ番目（ｍは、１以上、且つ収束・分流ユニットの総数以下の自然数である）の収束・分流ユニット（３）の分流チャネル（３４）の流動抵抗は、
    前記ｍ番目の収束・分流ユニットの分流チャネル（３４）と主チャネル（２）との２つの交差点の間の領域の全体流動抵抗、すなわち、分流チャネル内部領域の全体流動抵抗をＲ１^ｍとし、各分流チャネル（３４）の流動抵抗をＲ２^ｍとした場合、下記の式を満たすように決定され、
    

    

    ここで、ｋは全体液体流れに占める分流チャネル（３４）の液体流れの割合である、
    請求項７に記載のマイクロ流体チップ。
11. 前記捕捉ユニットは、分岐パイプ（４１）を介して主チャネル（２）に連通する、
    請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
12. 前記捕捉ユニット（４）は、１層以上のアレイを備え、
    前記アレイは、複数の小ブロック（４２）が配置されることによって構成される、
    請求項１１に記載のマイクロ流体チップ。
13. 前記小ブロック（４２）は、立方体、直方体、三角柱、円柱の形状であるか、又は、断面が正方形、長方形、三角形、円形の形状を有する、
    請求項１２に記載のマイクロ流体チップ。
14. 隣接する前記小ブロック（４２）の間に隙間ｄがあり、前記隙間ｄの大きさは隣接する２つの前記小ブロック（４２）の表面上の最も近い２点間の距離として規定される、
    請求項１２に記載のマイクロ流体チップ。
15. 各層の前記アレイの前記小ブロック（４２）の間の前記隙間ｄは同じである、
    請求項１４に記載のマイクロ流体チップ。
16. 異なる層の前記アレイの前記小ブロック（４２）の間の前記隙間ｄは上から下に向かって徐々に減少する、
    請求項１４に記載のマイクロ流体チップ。
17. 前記入口（１）において、ろ過構造（１１）をさらに備える、請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
18. 請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の前記マイクロ流体チップを備える、サンプル中のターゲット粒子を濃化及び／又は捕捉するための装置。
19. 請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の前記マイクロ流体チップ、又は、請求項１８に記載の前記装置を使用することを含む、
    サンプルの流量及び／又は流速を低減させるための方法。
20. （１）ターゲット粒子を含むサンプル溶液を供給するステップと、
    （２）前記サンプル溶液を請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の前記マイクロ流体チップ又は請求項１８に記載の前記装置に注入するステップと、
    を含む、
    ターゲット粒子を濃化及び／又は捕捉するための方法。
21. サンプル溶液中のターゲット粒子を除去するための方法であって、
    （１）ターゲット粒子を含むサンプル溶液を供給するステップと、
    （２）前記サンプル溶液を請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の前記マイクロ流体チップ又は請求項１８に記載の前記装置に注入するステップと、
    （３）前記マイクロ流体チップの前記出口（５）から流出するサンプル溶液を収集するステップと、
    を含む、
    サンプル溶液中のターゲット粒子を除去するための方法。
22. 前記ステップ（２）及び前記ステップ（３）は、１回、又は２回以上繰り返される、
    請求項２１に記載の方法。
23. 前記サンプル溶液の注入速度は、５～２００ｍＬ／ｈである、
    請求項２０に記載の方法。
24. 前記サンプル溶液は、全血、血漿、血清、灌流液、尿、組織液、脳脊髄液、細胞培養液、又は細胞混合液である、
    請求項２０に記載の方法。
25. 前記サンプル溶液は、全血または灌流液である、
    請求項２４に記載の方法。
26. 前記ターゲット粒子は腫瘍細胞である、
    請求項２０に記載の方法。
27. 前記腫瘍細胞は循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）である、
    請求項２６に記載の方法。

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