CN114533995A - 一种在体循环肿瘤细胞透析系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在体循环肿瘤细胞透析系统，它基于微流控芯片和蠕动泵等仪器实现活体动物/患者外周血中循环肿瘤细胞的捕获，具体表现为血液中的循环肿瘤细胞被捕获在微流控芯片的捕获单元中，而其他血细胞如白细胞和红细胞则能流出芯片，进而被重新输回体内。本系统包括：CTC分离捕获模块，用于血液中循环肿瘤细胞和循环肿瘤细胞簇的分离和捕获；血液体外循环模块，用于实现血液的进样和回输。本发明可用来捕获和移除血液中的循环肿瘤细胞，抑制癌症的进展，预防/阻断癌症转移的进程，为肿瘤的控制和治疗提供了一种新的高效的手段。此外，基于获取的CTC可以获取活体动物/患者的基因组学蛋白组学等多维实时个性化信息。

Description

一种在体循环肿瘤细胞透析系统

本申请要求于2020年11月25日提交中国专利局、申请号为202022766020.3、发明名称为“一种在体循环肿瘤细胞透析系统”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，涉及一种在体循环肿瘤细胞透析系统，具体来说循环肿瘤细胞透析系统是指，通过捕获和去除活体动物/患者体内的CTC，阻断和抑制肿瘤的转移，通过定性和定量检测捕获的CTC，获取活体动物/患者的多组学实时全谱个性化肿瘤信息，实现精准诊断、快速药物筛选、实时疗效评估、长期复发监测预后等目的。

背景技术

绝大多数癌症患者(>95％)在诊断时就已经发生了转移，转移是癌症死亡的主要原因，90％以上的癌症患者死于转移而非原发瘤。目前的主流癌症治疗手段(手术、放疗和化疗)对此束手无策，过去10年，对已发生转移的癌症患者5年存活率几乎没有提高。癌细胞从原位瘤脱落，穿过血管内皮细胞之间的间隙进入血液成为循环肿瘤细胞(circulatingtumor cell，CTC)。CTC是癌症转移的关键一环，没有CTC就没有癌症的转移。大量研究表明早在癌症形成转移灶之前，血液中就可检测到CTC。此外，CTC的个数与病人预后密切相关，CTC个数≥5个/7.5mL的患者的总存活期(22.6个月)远低于<5个/7.5mL的患者(4.1个月)。因此，通过透析的方式去除血液中的CTC或降低血液中CTC的个数，能阻断癌症转移的进程，显著改善患者的预后。

尽管目前已经有多种方法能实现CTC的捕获，但离真正的CTC透析还有较大的距离。基于抗原抗体的CTC捕获，需要预先进行抗体的包被，操作过程较为复杂且成本高。更重要的是它所能应用的流速较低，与血液流速不匹配，且捕获位点有限。目前已有的方法(1)

采用EpCAM抗体对Seldinger导线进行包被，随后插入癌症患者的肘静脉持续30min时间，最后对导线上捕获到的CTC进行免疫荧光染色和检测。(2)采用基于抗原抗体的CTC捕获芯片，连接微控制器、蠕动泵、肝素注射器，捕获和检测犬类模型静脉血中的CTC。采用此方法，2h可分析10-20mL血液。除此以外，还有基于物理性质的CTC捕获，但也存在很大的问题，如：血液通常需要预处理——大比例稀释或裂解红细胞；以及流速不匹配往往过高或过低等，导致出口得到的血细胞不能直接无害回输。

发明内容

发明人经过多年研究，提出了一种在体循环肿瘤细胞透析系统。该系统能将血液循环中的肿瘤细胞进行捕获和清除，可以减缓或阻断癌症的转移，改善预后。除此之外，通过对捕获到的循环肿瘤细胞进行检测和分析，可以获取癌症多组学个性化实时信息，达到集精确诊断、药物筛选、疗效评估、复发监控预后等目的。此外，对CTC进行更深层次的研究也可以为深入了解癌症发生和转移的机理以及为寻找更好的临床治疗靶点奠定基础。

本发明第一方面提供了一种在体循环肿瘤细胞透析系统，包括：

CTC分离捕获模块，用于血液中循环肿瘤细胞和循环肿瘤细胞簇的分离和捕获；

血液体外循环模块，用于将所述CTC分离捕获模块和活体动物/患者建立连接，实现血液向CTC分离捕获模块的进样，和血液流出CTC分离捕获模块向活体动物/患者的回输。

本发明第二方面提供了一种采用本发明第一方面提供的在体循环肿瘤细胞透析系统的在体循环肿瘤细胞捕获方法，活体动物/患者的血液在CTC分离捕获模块进行循环过滤和捕获，捕获血液中的循环肿瘤细胞；所述血液体外循环模块，用于将微流控芯片出口流出的其他血细胞回输至活体动物/患者体内。

进一步地，捕获的循环肿瘤细胞可以被在线检测，或被反冲收集实现CTC的多组学信息定性定量检测。

本发明第三方面提供了一种微流控芯片，包括相互连通的第一入口、一个或者串联排列的多个汇聚分流单元、第二入口，捕获单元，第二出口、流阻匹配通道以及第一出口。

本发明第四方面提供了本申请第三方面提供的微流控芯片用于捕获目标颗粒(例如CTC等)的用途。

本申请第五方面提供了采用本申请第三方面提供的微流控芯片捕获目标颗粒的方法，包括：将液体样品经所述微流控芯片的第一入口输入，样品中的目标颗粒被捕获单元捕获，去除目标颗粒后的液体样品经第一出口输出。

本发明提供的在体循环肿瘤细胞透析系统，具有以下有益效果：

1.采用基于物理性质的方法进行CTC的分离和捕获，流速能与体内血液流速相匹配，不会过高或过低，能在较短时间内透析较大体积的血液(几十到上千mL/h)；

2.血液不需要预处理，可以直接通入微流控芯片，并通过微流控芯片自身流道结构进行细胞的分离捕获；

3.整个过程只需要一步，一个固定的流速，即可实现CTC和其他血细胞的分离，简单方便；

4.出口得到的血细胞可以直接回输至体内。

本发明提供的在体循环肿瘤细胞透析系统，能将血液循环中的肿瘤细胞进行捕获和清除，可以减缓或阻断癌症的转移，改善预后。进一步地，可以通过对捕获到的循环肿瘤细胞进行检测和分析，获取癌症多组学个性化实时信息，达到集精确诊断、药物筛选、疗效评估、复发监控预后等目的。此外，对CTC进行更深层次的研究也可以为深入了解癌症发生和转移的机理以及为寻找更好的临床治疗靶点奠定基础。此外，该系统采用的微流控芯片也适用于大量处理体液，如：尿液，腹水，灌洗液，白细胞清除术富集液(Leukapheresis)等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为在体循环肿瘤细胞透析系统的模块构成示意图；

图2为在体循环肿瘤细胞透析系统的组成结构示意图；

图3为微流控芯片的实物图；

图4为微流控芯片整体结构的设计图；

图5为微流控芯片汇聚分流单元的放大图；

图6显示了采用本申请的在体循环肿瘤细胞透析系统进行“透析式”循环过滤CTC结果；

图7显示了采用本申请的在体循环肿瘤细胞透析系统进行CTC过滤后，捕获单元处CTC的染色图；

图8显示了采用本申请的在体循环肿瘤细胞透析系统进行CTC过滤后，反冲收集CTC的结果；

图9为小鼠血液透析预实验示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明采用的技术方案如下：

一种在体循环肿瘤细胞透析系统，如图1和2所示，包括：

CTC分离捕获模块，用于活体动物/患者血液中循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤细胞簇的分离和捕获；

血液体外循环模块，用于将所述CTC分离捕获模块和活体动物/患者建立连接，实现血液向CTC分离捕获模块的进样，和去除CTC的血液流出CTC分离捕获模块向活体动物/患者的回输。

进一步地，所述CTC分离捕获模块包括至少一个CTC分离捕获所用的微流控芯片2和与微流控芯片相连接的导管21和22。本申请对所述的导管的材质不做限定，只要能实现本发明的目的即可，例如可以采用具有较好的生物相容性的材料，具体可以选自但不限于硅胶类或聚氨基甲酸乙酯导管。本申请对所述的导管的内径不做限定，只要能实现本发明的目的即可，例如可以为0.1mm-6cm，优选0.3-0.6mm；外径不做限定，例如可以为0.2mm-6.5cm，优选0.8-1.2mm。

所述血液体外循环模块包括可控连接阀11和12，动静脉连接导管15和16，蠕动泵13和肝素泵14；所述可控连接阀11和12用于连接动静脉连接导管15和16和与微流控芯片相连接的导管21和22，同时控制导管之间的连通和封闭；所述动静脉连接导管用于活体动物/患者与外部仪器设备的连接，所述蠕动泵13用于实现血液从活体动物/患者流向所述微流控芯片2；进一步地，所述蠕动泵可用于控制血液从活体动物/患者流向微流控芯片的速度；所述肝素泵14用于实现血液的肝素滴注，以预防整个透析过程中发生凝血。

本申请对动静脉连接导管的材质不做限定，只要能实现本发明的目的即可，例如可以采用具有较好生物相容性的硅胶类导管或聚氨基甲酸乙酯导管。本申请对所述的动静脉连接导管的内径不做限定，只要能实现本发明的目的即可，例如可以为0.1mm-6cm，优选0.7-1mm；外径不做限定，例如可以为0.2mm-6.5cm，优选1-1.5mm。

本申请中，所述的动静脉连接导管为动脉连接导管15和静脉连接导管16的统称，本申请中，与微流控芯片相连接的导管包括与微流控芯片的第一入口相连接的导管21，以及与微流控芯片第一出口相连接的导管22；其中，动脉连接导管15一端用于与活体动物/患者的动脉相连，另一端和与微流控芯片2的第一入口相连接的导管21相连；所述静脉连接导管16一端用于与活体动物/患者的静脉相连，另一端和与微流控芯片的第一出口相连接的导管22相连。

进一步地，本申请中蠕动泵设置于动脉连接导管15上。

进一步地，所述肝素泵14可通过导管直接与活体动物/患者的静脉相连，用于向活体动物/患者的体内滴注肝素。

进一步地，如图3和图4所示，所述微流控芯片2包括第一入口23，一个或者串联排列的多个汇聚分流单元25、第二入口27，捕获单元26，第二出口28、流阻匹配通道29以及第一出口24；所述的汇聚分流单元25能够根据目标颗粒(如：需要分离的循环肿瘤细胞CTC)的大小对其实现特异性的分离，并且汇聚分流单元的设计可根据目标颗粒的大小进行调整。

进一步地，第一入口23、第一出口24、第二入口27和第二出口28可以处于开放或封闭的状态，在透析血液时，第一入口23和第一出口24处于开放状态，而第二入口27和第二出口28保持封闭，此时，血液从第一入口23流入微流控芯片，从第一出口24流出。在透析完成后，当需要对捕获单元26中的细胞进行染色时，将第一入口23和第一出口24封闭，开放第二入口27和第二出口28，染液和洗涤液从第一入口27进入，从第二出口28流出。此外，根据后续多组学和药物筛选等测试需求，通过保持第一入口23和第一出口24封闭，第二入口27和第二出口28开放，液流可以从第二出口28反向输入捕获单元26，在第二入口27收集捕获单元26捕获的目标颗粒(如CTC)。

本申请对封闭和开放各入口或出口的方法不做限定，只要能够实现本发明的目的即可，例如所述微流控芯片的各入口和出口均连接有导管，导管中设置有与导管内径相匹配的塑料棒，通过堵塞和拔出所述塑料棒，实现各入口或出口封闭和开放。

本申请对上述微流控芯片的材料不做限定，只要能够实现本发明的目的即可，例如可以由聚二甲基硅氧烷(PDMS)与玻璃键合制成。所述第一入口23，一个或者串联排列的多个汇聚分流单元25、第二入口27，捕获单元26，第二出口28、流阻匹配通道29以及第一出口24可采用现有的技术，例如光刻技术、模塑法等方法设置于模具上，采用PDMS复印模具的方式，即可呈现在所述的微流控芯片中。

发明人发现，当需要对捕获单元中捕获的目标颗粒(如CTC)进行染色时，从第一入口注入染色液会导致只有少量染色液能够进入捕获单元，造成染色液的大量浪费，而采用本申请的微流控芯片，可以将染色液直接从第二入口注入捕获单元，从而节省染色液，极大地降低了成本。此外，当后续有多组学或药物筛选等测试需求时，需要将捕获单元捕获的CTC从捕获单元中提取出来，此时可以将流液(冲洗液)从第二出口输入，将捕获单元中的CTC从第二入口冲出，极大提高了反冲收集的效率。

然而发明人还发现，增加第二入口和第二出口后，还需要对流道的流阻进行匹配才能够实现上述功能，不限于任何理论，发明人发现，当所述第二入口和第二出口开放，以使液流通过所述第二入口或第二出口进入捕获单元时，期望进入捕获单元的液流占注入总液流体积比Y，与捕获单元的流阻R_capture，汇聚分流单元总流阻R_{focus-separation}和流阻匹配通道的流阻R_match满足：

R_match＝[(R_capture+R_{focus-separation})Y-R_{focus-separation}]/(1-Y) (式I)

本申请对流阻匹配通道的形状不做限定，只要能够实现本发明的目的即可，本领域技术人员可根据式I获得所述流阻匹配通道的流阻R_match，并根据R_match具体设计流阻匹配通道的宽度、形状、长度，本申请在此不做限定。

进一步地，所述第一入口处还包括过滤装置，所述过滤装置中包括直角转弯结构231，上述直角转弯结构231可以用于过滤样品中的纤维状杂质；此外，所述过滤装置中还可以包括至少一层圆柱结构232，可用于过滤颗粒状杂质其中，进一步地，所述圆柱结构具有一定间隙，且规则排列。

进一步地，根据分离需要，所述的微流控芯片2可以包括一个或更多个(例如1-20个)汇聚分流单元，当包括多个汇聚分流单元时，所述汇聚分流单元之间串联排列。

进一步地，如图4和图5所示，所述汇聚分流单元25包括汇集口253、一个或通过主通道254连通的多个(例如1-10个)汇聚结构251和两个分流通道252；所述汇聚分流单元25能够通过各汇聚结构251将样本中的目标颗粒汇聚在液流中心，并进入下一个汇聚分流单元或捕获单元26，与此同时，一定比例的不包含目标颗粒的液流通过分流通道252直接分到第一出口24流出，从而实现了目标颗粒的浓缩和液流的降速，最终目标颗粒(如CTC)被捕获在捕获单元26处。

优选地，分流通道252排列在主通道254两侧；更优选对称排列在主通道254两侧，并且具有相同的尺寸参数；还优选地，在分流通道252与主通道254的交汇处，主通道宽度变大，例如宽度变为原来的1.5倍至5倍之间，例如1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍，以及上述任意两点之间的任意倍数值；进一步优选地，对所述交汇处的管壁进行修圆。

进一步地，所述汇聚结构251包括中心通道255以及旁侧支流通道256，其中中心通道255在两端均与主通道254相接并且同轴排列；所述汇集口253和与之相连的主通道254之间包括主通道收窄处257。

优选地，中心通道255的宽度小于主通道254的宽度，例如，中心通道255的宽度是主通道254宽度的1％-99％，具体地，可以为95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％以及上述任意两点之间的任意值；所述旁侧支流通道256在两端均与主通道254以及中心通道255相交汇；进一步优选地，所述旁侧支流通道256为两条，再一步优选地，所述两条旁侧支流通道256排列在中心通道255两侧，更优选地，所述两条旁侧支流通道256对称排列在中心通道255两侧，并且具有相同的尺寸参数。

本申请对中心通道的宽度不做限定，只要能够实现本发明的目的即可，发明人发现，由于血液中存在一定的杂质，当采用本申请的体循环肿瘤细胞透析系统对大体积的血液进行透析时，中心通道宽度过窄容易造成微流控芯片的堵塞，因此在本申请的一些优选地实施方式中，所述中心通道的宽度为45-60μm；相应地，不限于任何理论，发明人发现，随着中心通道宽度的增大，要想达到同样的富集浓缩效果，需要串联的汇聚分流单元的数量需随之增多，在本申请的一些优选的实施方式中，所述汇聚分流单元的数量为11-18个。

进一步地，设W₂表示主通道收窄处257的宽度，r_cell表示样品中目标颗粒物平均半径，d1表示液流中最靠近主通道收窄处257一侧边界的目标颗粒物的质心与该侧边界的距离，R1是每个汇聚分流单元25中第一个汇聚结构251的中心通道的流阻，R2是第一个汇聚结构251中单条旁侧支流通道的流阻，上述参数满足下列条件：

其中d1的取值等于r_cell，或者稍小于r_cell。

进一步地，当存在多个汇聚结构时，设第n个(n是大于等于1且小于汇聚结构总数的自然数)汇聚结构的中心通道的流阻为R1ⁿ，宽度为W_s ⁿ，单条旁侧支流通道的流阻为R2ⁿ，第n+1汇聚结构中心通道的流阻为R1ⁿ⁺¹，每条旁侧支流通道的流阻为R2ⁿ⁺¹，其满足下列条件：

其中d1的取值等于r_cell，或者稍小于r_cell。

在本发明的一些实施方式中，活体动物/患者血液通过导管流入微流控芯片，通过汇聚分流单元将含有目标颗粒的血液汇聚在液流中心，最终目标颗粒在微流控芯片的捕获单元被捕获；将不包含目标颗粒的血液通过分流通道分到微流控芯片的第一出口流出，并通过静脉连接导管回输至活体动物/患者体内。

进一步地，与汇聚分流单元相连的，还包括一个或并联排列的多个捕获单元26，所述捕获单元26能够根据目标颗粒的大小对其实现分离和捕获，所述捕获单元26的设计可根据目标颗粒的大小进行调整。

输入芯片的样本经汇聚捕获单元降流降速，使得液流达到捕获单元时具有较低的速度，进而可以实现较高的目标颗粒捕获效率。

在本发明的一些实施方式中，所述的微流控芯片的捕获单元26由一层或者一层以上的阵列构成，所述阵列可以由任意形状的柱子通过规则排列构成；所述柱子之间有一定的间隙，使其能特异性地捕获目标颗粒。

进一步地，所述的微流控芯片的捕获单元由一组或一组以上间隙不同的阵列构成，每一组阵列又可以由一层或一层以上间隙相同的阵列构成，所述的阵列可以是由任意形状(例如正方体、立方体、三棱柱、圆柱等)的柱子通过规则排列构成。柱子之间有一定的间隙，间隙尺寸根据目标颗粒直径可调，使其能特异性地捕获目标颗粒。优选地，所述的间隙从上到下(所述从上到下可以理解为从第二入口到第二出口方向)逐渐减小，例如，当捕获单元包括4组阵列时，每组阵列的间隙从上到下可以分别为12-16μm、10-14μm、8-12μm和6-10μm。

示例性地，在本发明的一些实施方式中，所述微流控芯片包括第一入口23，18组串联排列的汇聚分流单元25、第二入口27，8组并联排列的捕获单元26、第二出口28、流阻匹配通道29和第一出口24。其中第一入口23处还包括直角转弯结构231和五层圆柱过滤结构232，分别用于滤去样本中的细长型杂质和其他小杂质。每一个汇聚分流单元25都包括五个汇聚结构251和两个分流通道252。捕获单元26包括从上到下的四组阵列，261，262，263和264，其间隙可调，优选分别为14μm，12μm，10μm和8μm。

在本发明的另一些实施方式中，活体动物/患者血液通过导管流入微流控芯片，CTC被卡在微流控芯片的捕获单元中，通过“透析式”多次循环捕获和分离，除去血液循环中几乎所有的CTC；经过捕获净化的，不含有CTC的血液则通过静脉连接导管回输至活体动物/患者体内；当所述在体循环肿瘤细胞透析系统中包含捕获单元时，CTC得到更有效地捕获，从而可以使更多血液能够回输至体内，减少血液的损耗。

进一步地，采用本发明的在体循环肿瘤细胞透析系统，整个透析过程自动进行，血液经蠕动泵进入微流控芯片第一入口23，目标颗粒CTC在捕获单元被捕获，而其他血细胞(白细胞，红细胞和血小板)则直接流到第一出口24，通过将微流控芯片2的第一出口24与活体动物/患者血管相连接，可以直接实现血样的回输。

进一步地，所述的微流控芯片可以放置在普通的光学显微镜上，以确定经过捕获单元是否饱和，进而确定是否需要更换微流控芯片。

在本申请的一些实施方式中，所述微流控芯片可以采用一个，也可以根据需要，由若干个微流控芯片2通过并联的方式进行组合获得，当存在多个并联连接的微流控芯片时，每个微流控芯片的第一入口处均连接有一个与微流控芯片相连接的导管21，动脉连接导管15通过所述可控连接阀11与这些与微流控芯片相连接的导管21连通；同样的，每个微流控芯片的第一出口处均连接有一个与微流控芯片相连接的导管22，静脉连接导管16通过所述可控连接阀12与这些与微流控芯片相连接的导管22连通。

在本发明的一些实施方式中，所述CTC分离捕获模块还可以包括CTC染色成像模块，所述CTC染色成像模块包括显微镜3和PC电脑4。所述CTC染色成像模块用于对捕获单元处的CTC进行染色、计数和/或鉴别，以实现CTC的定性、定量检测。此外，根据后续多组学和药物筛选等测试需求，通过保持第一入口23和第一出口24封闭，液流从第二出口28反向输入，在第二入口27收集捕获单元26捕获的目标颗粒(如CTC)。

本发明第二方面提供了一种采用本发明第一方面提供的在体循环肿瘤细胞透析和定量检测系统的在体循环肿瘤细胞捕获方法，活体动物/患者的血液在CTC分离捕获模块进行循环过滤，血液中的循环肿瘤细胞被捕获，进而通过芯片上特异性染色、反冲收集多组学检测等方法可以实现CTC的定性定量检测，获取实时的多组学全谱个性化信息；所述血液体外循环模块，用于将微流控芯片第一出口流出的其他血细胞回输至活体动物/患者体内。在本发明的一些实施方式中，可以对捕获到的循环肿瘤细胞进行检测和计数，采用免疫荧光染色的方法，使用细胞核染料Hoechst和带有荧光标记的pan-CK，CD45抗体对捕获单元处的CTC进行染色和鉴别。

活体动物/患者的血液在高效的CTC分离捕获模块中循环过滤，其中CTC分离捕获模块可以由若干个微流控芯片2通过并联的方式进行组合获得。将微流控芯片放置到显微镜3上，经过一定时间后，芯片的捕获单元捕获大量CTC，此时透析停止。之后引入CTC荧光标记物，标记30min后，使细胞可见。统计出活体动物/患者血液中的CTC个数。

示例性的，本发明在体循环肿瘤细胞透析系统的使用方法如下：

(1)用酒精消毒或者紫外照射的方式保证所有体外装置的无菌，所有管道经肝素浸泡，防止发生凝血反应，并且预先充满生理盐水，防止气泡。活体动物/患者在实验前半小时开始滴注肝素。

(2)将动静脉连接导管15和16分别接入活体动物的颈动脉和颈静脉或者接入患者的肘正中动脉和肘正中静脉，将微流控芯片与导管21和22连接，保证密封性的前提下依次打开蠕动泵13和控制阀11和12，进行透析。当血液流经微流控芯片2时，CTC会被捕获在芯片的捕获单元，其他较小的血细胞会重新返回体内。由于芯片流阻较小，整个循环过程的血流速度合适，因此透析不影响生命体征。

(3)将微流控芯片放置在显微镜3上。当微流控芯片的捕获单元几乎被卡满时，关闭蠕动泵13和控制阀11和12。

(4)将动静脉连接导管15和16从动物/患者体内拆卸下来，整个透析过程完成。

(5)向芯片内引入CTC荧光标记物，标记30min后，使细胞可见。统计出活体动物/患者血液中的CTC个数。

本申请第三方面提供了一种微流控芯片，如图3-图5所示，包括相互连通的第一入口23、一个或者串联排列的多个汇聚分流单元25、第二入口27，捕获单元26，第二出口28、流阻匹配通道29以及第一出口24。

进一步地，当所述第二入口27和第二出口28开放，以使液流通过所述第二入口27或第二出口28进入捕获单元时，期望进入捕获单元的液流占注入总液流体积比Y，与捕获单元流阻R_capture，汇聚分流单元总流阻R_{focus-separation}和流阻匹配通道流阻R_match满足：R_match＝[(R_capture+R_{focus-separation})Y-R_{focus-separation}]/(1-Y)。

进一步地，所述第一入口处还包括过滤装置，所述过滤装置中包括直角转弯结构231。

进一步地，所述汇聚分流单元25包括汇集口253、一个或通过主通道254连通的多个汇聚结构251和两个分流通道252；所述汇聚结构251包括中心通道255以及旁侧支流通道256，其中中心通道255在两端均与主通道254相接并且同轴排列；所述汇集口253和与之相连的主通道254之间包括主通道收窄处257。

进一步地，其中设W₂表示主通道收窄处的宽度，r_cell表示样品中目标颗粒物平均半径，d1表示液流中最靠近主通道收窄处一侧边界的目标颗粒物的质心与该侧边界的距离，R1是每个汇聚分流单元中第一个汇聚结构的中心通道的流阻，R2是第一个汇聚结构中单条旁侧支流通道的流阻，上述参数满足下列条件：

其中d1的取值等于r_cell，或者稍小于r_cell。

进一步地，当存在多个汇聚结构时，设第n个(n是大于等于1且小于汇聚结构总数的自然数)汇聚结构的中心通道的流阻为R1ⁿ，宽度为W_s ⁿ，单条旁侧支流通道的流阻为R2ⁿ，第n+1汇聚结构中心通道的流阻为R1ⁿ⁺¹，每条旁侧支流通道的流阻为R2ⁿ⁺¹，其满足下列条件：

其中d1的取值等于r_cell，或者稍小于r_cell。

进一步地，所述捕获单元26由一层或者一层以上的阵列构成，所述阵列可以由任意形状的柱子通过规则排列构成；所述柱子之间有一定的间隙，使其能特异性地捕获目标颗粒。

本申请第四方面提供了本申请第三方面提供的微流控芯片用于捕获目标颗粒的用途。

本申请中对所述目标颗粒的种类不做限定，本申请的微流控芯片中汇聚分流单元和捕获单元中的各参数的设计可根据所述所述目标颗粒的大小进行调整。

本申请第五方面提供了采用本申请第三方面的微流控芯片捕获目标颗粒的方法，包括：将液体样品经所述微流控芯片的第一入口输入，样品中的目标颗粒被捕获单元捕获，去除目标颗粒后的液体样品经第一出口输出。

进一步地，所述液体样品包括血液、尿液、腹水、灌洗液、白细胞清除术富集液(Leukapheresis)中的至少一种。

进一步地，所述液体样品的体积为1-5000mL。可以理解为，采用本申请的微流控芯片，可以连续处理1-5000mL液体样品。

制备例1微流控芯片制备

微流控芯片参数设计：

如图3和图4所示，本制备例制备的微流控芯片包含汇聚分流单元的数量为18个，依次串联排列。其中收集口的最宽处截面直径W1＝200μm，整体呈现漏斗状结构，主通道收窄处的截面直径W2＝60μm，主通道2的截面直径为180μm。对于每一个汇聚分流单元，包括5个汇聚结构，其旁侧支流通道的宽度分别为45，51，48，46，43μm，长度分别为1256，1168，780，576，410μm(单侧的长度)，中心通道的宽度Ws为60μm，主通道的宽度为180μm。

所述17组汇聚分流单元具有相同个数和尺寸的汇聚结构，分流通道从上到下宽度分别为105、102、100、98、95、92、89、86、82、79、75、71、67、63、58、54、49和44μm，长度分别为75600、72958、70225、67552、64849、62148、59444、56740、54037、51335、48632、45928、43227、40494、37781、35054、32372和29665μm(单侧的长度)。

捕获单元数量为8组，并联连接，每个捕获单元包括从上到下的四组阵列，其间隙分别为14μm，12μm，10μm和8μm。

流阻匹配通道的宽度为90μm，长度为8210μm。

微流控芯片制作：

(1)根据上述设计参数，采用L-edit画出芯片图纸；

(2)采用铬板制作掩膜，采用硅片或铬板作为基底，su-8光胶匀胶，前烘，曝光，后烘，显影的方式制作模具；

(3)采用PDMS A胶：B胶＝8：1混匀倒在模具上，加热固化制作芯片，芯片打孔后与玻片通过空气等离子体(PLASMA)处理后键合，得到具有上述参数的微流控芯片。

实施例1

(1)用酒精消毒或者紫外照射的方式保证所有体外装置的无菌，所有管道经肝素浸泡，防止发生凝血反应，并且预先充满生理盐水，防止气泡。活体动物/患者在实验前半小时开始静脉滴注肝素。

(2)如图9所示，将动静脉连接导管分别接入各小鼠(通过尾静脉和皮下接种4T1同种属来源癌细胞形成的BALB/c乳腺癌肺转移模型小鼠)的颈动脉和颈静脉，将制备例1制备的微流控芯片与导管连接，保证密封性的前提下依次打开蠕动泵、动脉连接导管上的可控连接阀和静脉连接导管上的可控连接阀，进行透析，其中，动静脉连接导管的内径为0.8mm，外径1.2mm；导管21和22的内径0.5mm，外径0.85mm；各组小鼠透析流速分别为5mL/h、10mL/h、20mL/h、30mL/h、40mL/h、60mL/h。

(3)将微流控芯片放置在显微镜上。当微流控芯片的捕获单元几乎被卡满时，关闭蠕动泵和可控连接阀。

(4)将动静脉连接导管从动物/患者体内拆卸下来，整个透析过程完成。

(5)向芯片内引入CTC荧光标记物，标记30min后，使细胞可见，统计出血液中的CTC个数。

实施例2

(1)分别将混有带有荧光标记的HeLa细胞的兔子血液2mL通过第一入口注入制备例1制备的6个微流控芯片，流速分别为5mL/h、10mL/h、20mL/h、30mL/h、40mL/h、60mL/h；收集从微流控芯片的第一出口流出的血液；

(2)上样结束后，通过细胞计数，统计出芯片上捕获的癌细胞和流出芯片的癌细胞，捕获效率＝芯片上捕获的癌细胞/(芯片上捕获的癌细胞+流出芯片的癌细胞)×100％。

过滤癌细胞结果如图6所示，从图6中可以看出，不同流速下(5mL/h-60mL/h)，芯片对癌细胞的捕获效率均高于85％，说明此芯片的设计可以适用于连续处理大量液体样品，而且在较大流速范围内实现较高的捕获效率，实现较好的目标颗粒的分离。

采用本发明的在体循环肿瘤细胞透析系统进行CTC过滤后，由第二入口向芯片内引入CTC荧光标记物，标记30min后，使细胞可见，捕获单元处CTC的染色图如图7所示，其中Hoechst、pan-CK、CD45、Bright Field和Merged分别表示细胞核染色、循环肿瘤细胞角蛋白染色、白细胞表面抗原染色、明场图及三种标记物荧光合并图。图中CTC、CTC-cluster、WBC分别代表循环肿瘤细胞，循环肿瘤细胞簇和白细胞。从图7中可以看出，采用本申请的在体循环肿瘤细胞透析系统能够有效实现肿瘤细胞的捕获和鉴别。

采用本发明的在体循环肿瘤细胞透析系统进行CTC过滤后，通过向第二出口注入冲洗液(如磷酸盐缓冲液PBS)，从第二入口收集冲洗液，实现对捕获区捕获到的CTC进行反冲收集。如图8所示，白色虚线方框圈出的是染色后的CTC，从图8中可以看出，经过反冲后，捕获单元中残留的CTC明显减少，说明CTC能被有效收集。

本发明的CTC分离捕获模块不限于以上实施例中的结构，可为多个微流控芯片并联或者以其他任意方式组合。其中微流控芯片的汇聚分流单元的个数以及捕获单元的个数可以为任意值。其中汇聚分流单元中汇聚结构的个数也可以为任意值。

以上所述仅为本发明的部分实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (22)

1.一种在体循环肿瘤细胞透析系统，其特征在于，包括：

CTC分离捕获模块，用于血液中循环肿瘤细胞和循环肿瘤细胞簇的分离和捕获；

血液体外循环模块，用于将所述CTC分离捕获模块和活体动物/患者建立连接，实现血液向CTC分离捕获模块的进样，和去除CTC的血液流出CTC分离捕获模块，回输回活体动物/患者体内。

2.如权利要求1所述的在体循环肿瘤细胞透析系统，其特征在于，所述CTC分离捕获模块包括至少一个CTC分离捕获所用的微流控芯片和与微流控芯片相连接的导管；

所述血液体外循环模块包括可控连接阀，动静脉连接导管，蠕动泵和肝素泵；所述可控连接阀用于连接动静脉连接导管和与微流控芯片相连接的导管，同时控制导管之间的连通和封闭；所述动静脉连接导管用于活体动物/患者与外部仪器设备的连接，所述蠕动泵用于实现血液从活体动物/患者流向所述微流控芯片；所述肝素泵用于实现血液的肝素滴注。

3.如权利要求2所述的在体循环肿瘤细胞透析系统，其特征在于，所述微流控芯片包括相互连通的第一入口、一个或者串联排列的多个汇聚分流单元、第二入口，捕获单元，第二出口、流阻匹配通道以及第一出口。

4.如权利要求3所述的在体循环肿瘤细胞透析系统，其特征在于，当所述第二入口和第二出口开放，以使液流通过所述第二入口或第二出口进入捕获单元时，期望进入捕获单元的液流占注入总液流体积比Y，与捕获单元的流阻R_capture，汇聚分流单元总流阻R_{focus-separation}和流阻匹配通道的流阻R_match满足：R_match＝[(R_capture+R_{focus-separation})Y-R_{focus-separation}]/(1-Y)。

5.如权利要求3所述的在体循环肿瘤细胞透析系统，其特征在于，所述第一入口处还包括过滤装置，所述过滤装置中包括直角转弯结构。

6.如权利要求3所述的在体循环肿瘤细胞透析系统，其特征在于，所述汇聚分流单元包括汇集口、一个或通过主通道连通的多个汇聚结构和两个分流通道；所述汇聚结构包括中心通道以及旁侧支流通道，其中中心通道在两端均与主通道相接并且同轴排列；所述汇集口和与之相连的主通道之间包括主通道收窄处；所述汇聚分流单元能够根据目标颗粒的大小对其实现分离，其设计可根据目标颗粒的大小进行调整。

7.根据权利要求4所述的在体循环肿瘤细胞透析系统，其特征在于，设W₂表示主通道收窄处的宽度，r_cell表示样品中目标颗粒物平均半径，d1表示液流中最靠近主通道收窄处一侧边界的目标颗粒物的质心与该侧边界的距离，R1是每个汇聚分流单元中第一个汇聚结构的中心通道的流阻，R2是第一个汇聚结构中单条旁侧支流通道的流阻，上述参数满足下列条件：

其中d1的取值等于r_cell，或者稍小于r_cell。

8.如权利要求3所述的在体循环肿瘤细胞透析系统，其特征在于，所述的微流控芯片的汇聚分流单元能够将样品中的目标颗粒汇聚在液流的中心，同时将不含目标颗粒的液流分流到出口排出，实现了目标颗粒的浓缩和液流的降速。

9.如权利要求3所述的在体循环肿瘤细胞透析系统，其特征在于，所述捕获单元能够根据目标颗粒的大小对其实现分离和捕获，所述捕获单元的设计可根据目标颗粒的大小进行调整。

10.如权利要求3所述的在体循环肿瘤细胞透析系统，其特征在于，所述捕获单元由一层或者一层以上的阵列构成，所述阵列可以由任意形状的柱子通过规则排列构成；所述柱子之间有一定的间隙，使其能特异性地捕获目标颗粒。

11.如权利要求3所述的在体循环肿瘤细胞透析系统，其特征在于，整个过程自动进行，血液经蠕动泵进入微流控芯片第一入口，目标颗粒在捕获单元被捕获，而其他血细胞则直接流到第一出口，通过将微流控芯片的第一出口与活体动物/患者血管相连接，可以直接实现血样的回输。

12.一种采用权利要求1至11中任一项所述的在体循环肿瘤细胞透析系统的在体循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于，活体动物/患者的血液在CTC分离捕获模块进行循环过滤和捕获，捕获血液中的循环肿瘤细胞；所述血液体外循环模块，用于将微流控芯片出口流出的其他血细胞回输至活体动物/患者体内。

13.一种微流控芯片，其特征在于，包括相互连通的第一入口、一个或者串联排列的多个汇聚分流单元、第二入口，捕获单元，第二出口、流阻匹配通道以及第一出口。

14.如权利要求13所述的微流控芯片，其特征在于，当所述第二入口和第二出口开放，以使液流通过所述第二入口或第二出口进入捕获单元时，期望进入捕获单元的液流占注入总液流体积比Y，与捕获单元的流阻R_capture，汇聚分流单元总流阻R_{focus-separation}和流阻匹配通道的流阻R_match满足：R_match＝[(R_capture+R_{focus-separation})Y-R_{focus-separation}]/(1-Y)。

15.如权利要求13所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一入口处还包括过滤装置，所述过滤装置中包括直角转弯结构。

16.如权利要求13所述的微流控芯片，其特征在于，所述汇聚分流单元包括汇集口、一个或通过主通道连通的多个汇聚结构和两个分流通道；所述汇聚结构包括中心通道以及旁侧支流通道，其中中心通道在两端均与主通道相接并且同轴排列；所述汇集口和与之相连的主通道之间包括主通道收窄处。

17.如权利要求16所述的微流控芯片，其特征在于，设W₂表示主通道收窄处的宽度，r_cell表示样品中目标颗粒物平均半径，d1表示液流中最靠近主通道收窄处一侧边界的目标颗粒物的质心与该侧边界的距离，R1是每个汇聚分流单元中第一个汇聚结构的中心通道的流阻，R2是第一个汇聚结构中单条旁侧支流通道的流阻，上述参数满足下列条件：

其中d1的取值等于r_cell，或者稍小于r_cell。

18.如权利要求13所述的微流控芯片，其特征在于，所述捕获单元由一层或者一层以上的阵列构成，所述阵列可以由任意形状的柱子通过规则排列构成；所述柱子之间有一定的间隙，使其能特异性地捕获目标颗粒。

19.权利要求13至18中任一项所述的微流控芯片用于捕获目标颗粒的用途。

20.采用权利要求13至18中任一项所述的微流控芯片捕获目标颗粒的方法，其特征在于，将液体样品经所述微流控芯片的第一入口输入，样品中的目标颗粒被捕获单元捕获，去除目标颗粒后的液体样品经第一出口输出。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述液体样品包括血液、尿液、腹水、灌洗液、白细胞清除术富集液中的至少一种。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其特征在于，所述液体样品的体积为1-5000mL。

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