CN112924363A - 中间型循环肿瘤细胞作为肿瘤诊断和预后标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了中间型循环肿瘤细胞作为肿瘤诊断和预后标志物及其应用，所述中间型循环肿瘤细胞表达上皮细胞表型蛋白和间质细胞表型蛋白。本发明构建连接了特异性靶向上皮型或间质型循环肿瘤细胞的多肽‑微流控芯片系统用于捕获中间型CTCs，根据中间型CTCs计数区分未转移和转移期的卵巢癌患者，具有较高的诊断价值和疗效监测价值，诊断能力优于总CTCs计数，具有广阔的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及中间型循环肿瘤细胞作为肿瘤诊断和预后标志物及其应用。
背景技术
卵巢癌是常见的女性癌症之一，由于具有早期症状不明显、诊断率低、伴有腹膜转移等特点，约70％的患者在确诊时已为晚期，导致卵巢癌的死亡率呈持续增高的趋势。以铂类为代表的化学疗法存在耐药性问题，使得卵巢癌的5年复发率仍然高达80％。因此，确定有效的指标用于卵巢癌早期诊断、疗效监测和预后评估，可以为卵巢癌的诊治提供有力的工具。目前，临床上用于卵巢癌诊断和预后监测的方法主要包括检测糖蛋白724(CA724)、糖蛋白125(CA125)、人附睾蛋白(HE4)等生物学标志物以及CT、MRI等影像学方式。基于血清生物标志物的检测手段，敏感性和特异性具有一定的局限性，而CT、MRI等检测手段则由于价格昂贵、检测灵敏度有限，普及率较低且不能满足临床诊治的需求。
近年来，有关循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)的研究为卵巢癌的诊断和预后提供了新的思路。循环肿瘤细胞最初在1869年首次发现并命名，是一种自发或因诊疗操作技术由实体瘤原发病灶或转移灶扩散进入外周血液循环的肿瘤细胞。目前，利用总CTCs计数作为诊断和预后的指标已经在乳腺癌、肝癌、肺癌等癌症中开展临床应用，结果证实，总CTCs计数具有重要价值。考虑到CTCs本身具有异质性，CTCs中存在转移性强、恶性度高的亚群，根据CTCs的异质性特点，可以将CTCs分为不同的亚群，例如肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)样CTCs、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)样CTCs、转移起始细胞(metastasis initiate cells，MIC)样CTCs等。其中，根据CTCs不同的EMT转化程度进行异质性分型，可能对于疾病的诊断意义更大。EMT和间质-上皮转化(mesenchymal-to-epithelial transition，MET)在CTCs产生、侵袭和定植过程中具有重要作用。肿瘤细胞在原发部位发生EMT，侵入周围的局部血管后进入外周血，到达远端转移部位时发生MET，从而在局部增殖并形成转移灶。依据循环肿瘤细胞上皮-间质转化(EMT)程度可以将CTCs分为只表达上皮型标志物如EpCAM的上皮型CTCs、同时表达上皮型标志物如EpCAM和间质型标志物如Vimentin的中间型CTCs、以及只表达间质型标志物如Vimentin的间质型CTCs。
目前，总CTCs计数作为肿瘤诊断和预后指标已经应用于临床，计数方法包括基于抗体、适配体和多肽修饰的微流控芯片以及免疫磁珠等。CN108548920A公开了一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法，所述方法利用上皮型CTC特异性抗体EPCAM、CK以及间质型CTC特异性抗体N-Cadherin、vimentin联合进行CTC的检测，特异性强，细胞计数由流式细胞自动完成，采用免疫磁珠负向吸附法富集CTC，不依赖于肿瘤细胞大小及特异性抗原，所有种类CTC、CTM等异常细胞都会被富集，不会漏检。但是该方法的灵敏度和准确性存在很大的提高空间。
由于循环肿瘤细胞具有异质性特点，在循环肿瘤细胞群体中可能存在主导肿瘤转移定植的优势群体，单纯计数总CTCs、而不是针对在肿瘤转移定植中起主导作用的CTCs亚群，可能是影响其检测灵敏度和准确性的重要原因。确定引起卵巢癌恶化的优势CTCs亚群并进行计数，有可能为卵巢癌的早期诊断和预后监测提供更加灵敏的手段。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了中间型循环肿瘤细胞作为肿瘤诊断和预后标志物及其应用，所述中间型循环肿瘤细胞具有独特的异质性分型特点，在卵巢癌诊断和预后评价中具有重要的临床价值。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种肿瘤诊断和预后标志物，所述标志物为中间型循环肿瘤细胞；
所述中间型循环肿瘤细胞表达上皮细胞表型蛋白和间质细胞表型蛋白。
本发明中，中间型循环肿瘤细胞在经过上皮-间质转化(EMT)后具有独特的异质性分型特点，可以作为卵巢癌诊断和预后的有效指标，协助临床提高对卵巢癌的诊断和预后能力。
优选地，所述上皮细胞表型蛋白包括上皮细胞粘附分子EpCAM。
优选地，所述间质细胞表型蛋白包括波形蛋白Vimentin。
优选地，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、肝癌或肺癌中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供了一种肿瘤诊断和预后监测产品，所述产品的靶分子为中间型循环肿瘤细胞；
所述中间型循环肿瘤细胞表达上皮细胞表型蛋白和间质细胞表型蛋白。
优选地，所述产品包括微流控芯片和/或磁微粒；
所述微流控芯片和/或磁微粒上修饰有结合中间型循环肿瘤细胞的抗体、适配体或多肽中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述微流控芯片和/或磁微粒上修饰有结合上皮细胞表型蛋白和间质细胞表型蛋白的抗体、适配体或多肽中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供了一种计数中间型循环肿瘤细胞的微流控芯片，所述微流控芯片包括串联的第一捕获芯片和第二捕获芯片；
所述第一捕获芯片修饰有靶向上皮细胞表型蛋白的多肽；
所述第二捕获芯片修饰有靶向间质细胞表型蛋白的多肽。
本发明中，将修饰有靶向上皮细胞表型蛋白的多肽的第一捕获芯片和修饰有靶向间质细胞表型蛋白的多肽的第二捕获芯片相串联，中间型循环肿瘤细胞既可以结合在第一捕获芯片上，又可以结合在第二捕获芯片上，提高了中间型循环肿瘤细胞的捕获效率，降低了漏检概率。
第四方面，本发明提供了一种第三方面所述的计数中间型循环肿瘤细胞的微流控芯片的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备链霉亲和素修饰微流控芯片；
(2)向所述链霉亲和素修饰微流控芯片中分别加入生物素标记靶向上皮细胞表型蛋白的多肽或生物素标记靶向间质细胞表型蛋白的多肽，得到第一捕获芯片和第二捕获芯片；
(3)将所述第一捕获芯片和第二捕获芯片串联，得到所述计数中间型循环肿瘤细胞的微流控芯片。
优选地，步骤(2)所述靶向上皮细胞表型蛋白的多肽的浓度为100～500μM，例如可以是100μM、200μM、300μM、400μM或500μM，优选为300μM。
优选地，步骤(2)所述靶向间质细胞表型蛋白的多肽的浓度为100～500μM，例如可以是100μM、200μM、300μM、400μM或500μM，优选为300μM。
第五方面，本发明提供了一种以非疾病诊断为目的的中间型循环肿瘤细胞的计数方法，所述计数方法包括以下步骤：
(1’)向第三方面所述的计数中间型循环肿瘤细胞的微流控芯片中加入检测样本，所述中间型循环肿瘤细胞捕获于微流控芯片上；
(2’)对微流控芯片捕获的细胞进行细胞固定后，进行荧光染色，根据荧光染色结果计数中间型循环肿瘤细胞，其中，上皮型CTCs显示为红色荧光信号(EpCAM表达阳性)，间质型CTCs显示为绿色荧光信号(Vimentin表达阳性)，中间型CTCs同时显示红色和绿色荧光信号(EpCAM/Vimentin同时表达阳性)。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明以中间型循环肿瘤细胞(CTCs)作为标志物，利用中间型CTCs计数区分未转移和转移期的卵巢癌患者，具有较高的诊断价值(AUC＝0.73)，诊断能力优于总CTCs计数(AUC＝0.68)；
(2)本发明的中间型CTCs计数变化与卵巢癌患者治疗效果趋势一致，对卵巢癌具有良好的疗效监测价值，可以用来辅助临床治疗；
(3)本发明的中间型CTCs捕获工具多肽-串联微流控芯片将连接了特异性靶向上皮型或间质型循环肿瘤细胞的多肽-微流控芯片串联后进行异质性CTCs的捕获，灵敏度高、捕获效率高，且制备工艺简单、成本低廉，具有推广应用的潜力。
附图说明
图1A为多肽-串联微流控芯片系统的整体流道图，图1B为多肽-串联微流控芯片系统的连接示意图；
图2为利用多肽-串联微流控芯片系统在流道内捕获的循环肿瘤细胞的免疫荧光染色示意图；
图3A为52例卵巢癌分期患者血样中不同分型CTCs所占的百分比以及数量统计示意图，图3B为中间型CTCs计数和总CTCs计数对卵巢癌进展预测敏感性分析示意图；
图4为某IA期卵巢癌患者血样CTCs检测汇总结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1 CTCs捕获工具多肽-串联微流控芯片系统的制备
本实施例制备多肽-串联微流控芯片系统用于富集外周血循环肿瘤细胞(CTCs)，该系统采用可以同时特异性靶向上皮型、间质型CTCs的EP-1(SEQ ID NO:1：Biotin-GGYEVHTYYLD)和INP(SEQ ID NO:2：INPISGQGGSGGSK-biotin)多肽组合，并采用串联的方式以提高捕获效率，整体流道图如图1A所示，连接示意图如图1B所示。具体步骤如下：
将聚二甲基硅氧烷(PDMS)的硅橡胶预聚物Sylgard184与固化剂按照质量比为10:1混合，搅拌混匀后浇筑在硅片模具上，厚度为3～5mm；使用真空泵抽真空，排出气泡后放入鼓风干燥箱中，90℃高温干燥两小时；从烘箱取出硅片模具，冷却后用手术刀片将PDMS的微流控基底芯片切割下来，用针头在PDMS芯片的进出口打孔后待用；
将载玻片和PDMS微流控基底芯片置于等离子清洗机中清洗30s，迅速取出后将载玻片与PDMS基底芯片紧密键合，置于90℃烘箱烘干5min，使两者永久键合；
将APTES修饰液吸进1mL注射器中，放在微量注射泵上，以10μL/min的流速通入微流控芯片中，时间为100min；将90％乙醇溶液吸进1mL注射器中，放在微量注射泵上，以10μL/min的流速通入微流控芯片中，时间为30min；将去离子水吸进1mL注射器中，放在微量注射泵上，以10μL/min的流速通入微流控芯片，时间为30min；将微流控芯片中的液体吹干，放置在110℃烘箱中干燥60min；干燥后在室温避光条件下，将戊二醛反应液吸进1mL注射器中，放在微量注射泵上，以10μL/min的流速通入微流控芯片中，清洗100min；清洗完成后将去离子水吸进1mL注射器中，放在微量注射泵上，以10μL/min的流速通入微流控芯片中，时间为30min；随后将微流控芯片缓慢吹干，用注射器缓慢注入10μL/mL PBS溶解的链霉亲和素；
将微流控芯片置于4℃封闭的湿盒中过夜孵育12h，次日用PBS溶液清洗10min；用注射器缓慢注入300μM生物素标记特异性多肽(EP-1、INP)，将微流控芯片置于4℃封闭的湿盒中孵育45min，以10μL/min的流速用PBS溶液清洗10min；用注射器缓慢注入封闭液，将微流控芯片置于4℃封闭的湿盒中孵育1h，以10μL/min的流速用PBS溶液清洗10min；吹干微流控芯片，置于湿盒中，保存于4℃冰箱中待用。
实施例2患者外周血CTCs检测样本的制备
采用EDTA抗凝采血管收集卵巢癌患者(每次化疗前或化疗结束后3～4个月)外周血10mL，颠倒混匀10次(抗凝血)；将10mL血样转移到50mL离心管中，加入30mL红细胞裂解液，混匀后放于冰盒中，在涡旋器上轻轻涡旋两次，待离心管中的血液变得澄澈透明时，红细胞完全裂解，4℃、400g离心10min，吸弃上清液，保留细胞沉淀；向细胞沉淀中加入20mL红细胞裂解液，重悬细胞沉淀，4℃、1000rpm离心10min，小心吸弃上清液，用1mL PBS溶液重悬细胞沉淀，通入微流控芯片中进行外周血CTCs捕获。
实施例3 CTCs荧光染色
利用注射泵将4％多聚甲醛固定液以3μL/min的流速通入微流控芯片中，固定细胞30min，然后使用PBS溶液以3μL/min的流速清洗微流控芯片5min；
用抗体稀释液稀释生物素标记的抗EpCAM抗体和鼠抗人Vimentin抗体至5μL/mL，将两种抗体混合均匀后，以3μL/min的流速通入微流控芯片中，孵育45min后，用PBS溶液以3μL/min的流速清洗微流控芯片5min；
用抗体稀释液稀释PE标记的链霉亲合素(SAPE)和DyLight 488标记的羊抗鼠IgG抗体至5μL/mL，混合均匀后，以3μL/min的流速通入微流控芯片中，避光孵育30min后，用PBS溶液以3μL/min的流速清洗微流控芯片5min，使用空的、干燥的注射器以3μL/min的流速吹干微流控芯片，避光操作，完成CTCs的荧光染色。
实施例4荧光显微镜下检测CTCs并计数
本实施例使用倒置荧光显微镜对微流控芯片中的细胞进行观察，并对微流控芯片捕获的CTCs进行拍照，统计微流控芯片中不同亚群CTCs的数量。
如图2所示，上皮型CTCs显示为红色荧光信号(EpCAM表达阳性)，间质型CTCs显示为绿色荧光信号(Vimentin表达阳性)，中间型CTCs同时显示红色和绿色荧光信号(EpCAM/Vimentin同时表达阳性)。
实施例5结果统计分析
将52例卵巢癌患者按照国际妇产科联合会(FIGO)临床分期归类，对每个患者的CTCs检测结果进行统计，采用SPSS20.0分析数据，CTCs与临床分期的关系采用Fisher确切概率法进行分析，用Medcalc软件分析接收者操作特征(receiver operatingcharacteristic curve，ROC)曲线，并对比ROC曲线下的面积。需要说明的是，52例卵巢癌患者的血样来自绍兴市妇幼保健院，供血者无艾滋病、乙肝、梅毒等传染性疾病，并且签署知情同意书。
如图3A的统计结果表明，随着癌症分期的加深，中间型CTCs计数和总CTCs计数呈现明显上升趋势；根据ROC诊断曲线分析转移和未转移卵巢癌患者数据，如图3B结果显示，中间型CTCs计数和总CTCs计数都对卵巢癌具有诊断的能力，但是中间型CTCs计数AUC(AreaUnder roc Curve)＝0.73＞0.5的诊断能力优于总CTCs计数AUC＝0.68＞0.5的诊断能力。
如图4所示，对某IA期卵巢癌患者进行追踪治疗，并先后取该患者8次外周血进行CTCs检测来监测治疗效果，从8次CTCs检测汇总结果可以看出，该患者在手术完成后到第一次化疗前，中间型CTCs计数呈现明显上升趋势，这一结果可能与手术造成原发性肿瘤部位肿瘤细胞释放到血液中有关；而在患者接受有效化疗后，中间型CTCs计数呈现明显下降趋势，提示该患者病情得到有效缓解，与医院方面反馈患者病情信息一致。
综上所述，本发明采用多肽-串联微流控芯片系统捕获中间型CTCs，进行荧光染色后在荧光显微镜下进行计数分析，根据中间型CTCs计数这一指标可以显著区分未转移和转移期的卵巢癌患者，中间型CTCs计数具有较高的诊断价值和疗效监测价值，具有潜在应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 中间型循环肿瘤细胞作为肿瘤诊断和预后标志物及其应用
<130> 20210121
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Gly Tyr Glu Val His Thr Tyr Tyr Leu Asp
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ile Asn Pro Ile Ser Gly Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys
1 5 10
Claims (10)
1.一种肿瘤诊断和预后标志物，其特征在于，所述标志物为中间型循环肿瘤细胞；
所述中间型循环肿瘤细胞表达上皮细胞表型蛋白和间质细胞表型蛋白。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述上皮细胞表型蛋白包括上皮细胞粘附分子；
优选地，所述间质细胞表型蛋白包括波形蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的标志物，其特征在于，所述肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、肝癌或肺癌中的任意一种或至少两种的组合。
4.一种肿瘤诊断和预后监测产品，其特征在于，所述产品的靶分子为中间型循环肿瘤细胞；
所述中间型循环肿瘤细胞表达上皮细胞表型蛋白和间质细胞表型蛋白。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括微流控芯片和/或磁微粒；
所述微流控芯片和/或磁微粒上修饰有结合中间型循环肿瘤细胞的抗体、适配体或多肽中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求4或5所述的产品，其特征在于，所述微流控芯片和/或磁微粒上修饰有结合上皮细胞表型蛋白和间质细胞表型蛋白的抗体、适配体或多肽中的任意一种或至少两种的组合。
7.一种计数中间型循环肿瘤细胞的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括串联的第一捕获芯片和第二捕获芯片；
所述第一捕获芯片修饰有靶向上皮细胞表型蛋白的多肽；
所述第二捕获芯片修饰有靶向间质细胞表型蛋白的多肽。
8.一种权利要求7所述的计数中间型循环肿瘤细胞的微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备链霉亲和素修饰微流控芯片；
(2)向所述链霉亲和素修饰微流控芯片中分别加入生物素标记靶向上皮细胞表型蛋白的多肽或生物素标记靶向间质细胞表型蛋白的多肽，得到第一捕获芯片和第二捕获芯片；
(3)将所述第一捕获芯片和第二捕获芯片串联，得到所述计数中间型循环肿瘤细胞的微流控芯片。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述靶向上皮细胞表型蛋白的多肽的浓度为100～500μM；
优选地，步骤(2)所述靶向间质细胞表型蛋白的多肽的浓度为100～500μM。
10.一种以非疾病诊断为目的的中间型循环肿瘤细胞的计数方法，其特征在于，所述计数方法包括以下步骤：
(1’)向权利要求7所述的计数中间型循环肿瘤细胞的微流控芯片中加入检测样本，所述中间型循环肿瘤细胞捕获于微流控芯片上；
(2’)对微流控芯片捕获的细胞进行细胞固定后，进行荧光染色，根据荧光染色结果计数中间型循环肿瘤细胞。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210608 |