WO2017056844A1 - 前立腺癌の病理組織診断結果（グリーソンスコア）の推定方法 - Google Patents

前立腺癌の病理組織診断結果（グリーソンスコア）の推定方法 Download PDF

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WO2017056844A1
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galnac
gleason score
residue
affinity
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智典 金子
高敏 彼谷
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コニカミノルタ株式会社
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    • G01N2440/38—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of carbohydrates, e.g. glycosylation, glycation

Definitions

  • the present invention relates to a method for estimating a diagnosis result of a pathological tissue related to malignancy of prostate cancer, known as Gleason score.
  • Prostate cancer occurs mainly in men over 60 years old, and in Europe and the United States, it is the cause of death after lung cancer among male cancers.
  • the degree of progression (stage) and malignancy of cancer are important indicators.
  • prostate cancer has a wide distribution of malignancy, almost no growth is observed, and it is possible to observe without treatment, so that the progression to metastasis to bones and lymph nodes and resistance to antihormonal drugs Since there are various things to come, it is desired to accurately determine the malignancy of prostate cancer.
  • Gleason score obtained by scoring the diagnosis result of the pathological tissue of cancer is widely used.
  • Cancer tissue of prostate cancer can be classified into five grades, grade 1 to grade 5, depending on its form and invasive growth mode (Gleason classification).
  • the Gleason score is the grade assigned based on the Gleason classification for the tissue image that occupies the largest area when a certain pathological tissue is observed with a microscope, and the grade of the tissue image that occupies the next largest area (these two grades are It may be the same).
  • a Gleason score of 2 to 6 is low malignancy
  • 7 is moderate
  • 8 to 10 is high malignancy. Whether the Gleason score is 7 or higher It has become a main guide.
  • Needle biopsy is highly invasive and expensive for the patient, and has the disadvantages that it cannot be diagnosed unless the needle hits prostate cancer tissue.
  • PSA prostate specific antigen
  • total PSA total PSA
  • free PSA free PSA
  • Patent Document 1 International Publication No. 2009/008381 discloses, by mass spectrometry, a PSA having a non-fucose-linked sugar chain and a PSA having a fucose-linked sugar chain in a subject-derived sample by mass spectrometry. Analyze and identify as prostate cancer if the latter amount is greater than the former (ratio of the latter signal intensity to the former signal intensity is greater than 1.0), otherwise with benign prostatic hypertrophy A method of identifying as being is disclosed.
  • Patent Document 2 International Publication No. 2010/066483 describes the amount of a sugar chain having LacdiNAc (N-acetylgalactosamine-N-acetylglucosamine) of PSA in a sample derived from a subject, and LacNAc without LacdiNAc.
  • a method is disclosed in which the amount of a sugar chain having (galactose-N-acetylglucosamine) is quantified and a prostate cancer is determined when the former amount exceeds 30% of the latter amount.
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-137754 analyzes the sugar chain structure of PSA in a sample derived from a subject, and states that it is prostate cancer when there are three or more sugar chains having LacdiNAc. A method of determining is disclosed.
  • Patent Document 4 International Publication No. WO 2010/090264 describes PSA and / or fucose ⁇ (1,2) galactose residues having ⁇ -N-acetylgalactosamine residues in patient-derived samples (serums and the like).
  • a method is disclosed for quantifying PSA, and determining prostate cancer if the absolute amount and / or the ratio of the total PSA is greater than a predetermined cut-off value, and prostatic hypertrophy.
  • a PSA having a ⁇ -N-acetylgalactosamine residue is a lectin having an affinity for the residue, such as TJA-II (Trichosanthes japonica agglutinin-II) or WFA (Westeria floribunda agglutinin).
  • PSA having fucose ⁇ (1,2) galactose residue is quantified using a lectin having affinity with the residue, such as UEA-I (Ulex europaeus agglutinin-I) or TJA- It is described that it can be quantified using II. Further, it is described that the PSA having the predetermined residue can be quantified by adsorption and elution using, for example, a column (lectin affinity column) in which a lectin is bound to a carrier.
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-076666 discloses that PSA having the same specific residue as Patent Document 4 has a high affinity for the solid phase primary antibody against the PSA and the residues of the PSA.
  • a method of quantifying by a sandwich assay such as SPFS (Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy) using a secondary capture molecule obtained by labeling a lectin having a chrominance with a fluorescent dye is described.
  • Patent Documents 1 to 5 describes the correlation between the methods disclosed therein and the malignancy of prostate cancer such as Gleason score.
  • Example 1 of Patent Document 4 quantifies PSA having the specific sugar chain using TJA-II, and shows that it is possible to distinguish between patients with benign prostatic hyperplasia and those with prostate cancer.
  • TJA-II the specific sugar chain
  • PSA having the specific sugar chain is quantified using WFA and shows the same tendency as TJA-II (although the binding rate is somewhat low, it is almost correlated).
  • TJA-II is a ⁇ -N-acetylgalactosamine residue (GalNAc ⁇ 1 ⁇ R; R represents another residue of a sugar chain or an amino acid residue of a protein) and a fucose ⁇ (1,2) galactose residue ( It is a lectin having a strong affinity for both Fuc ⁇ 1 ⁇ 2Gal ⁇ 1 ⁇ R) (see paragraph [0022]).
  • WFA has a strong affinity for ⁇ -N-acetylgalactosamine residues (GalNAc ⁇ 1 ⁇ R), such as GalNAc ( ⁇ 1 ⁇ 4) Gal residues and GalNAc ( ⁇ 1 ⁇ 4) GlcNAc residues
  • GalNAc ⁇ 1 ⁇ R ⁇ -N-acetylgalactosamine residues
  • the conventional histopathological diagnosis requiring needle biopsy has a heavy burden on the patient. If a histopathological diagnosis result of prostate cancer such as a Gleason score representing the malignancy of prostate cancer can be obtained by a method that is low in invasiveness and low in cost as in a blood test, the benefit to the patient is great.
  • An object of the present invention is to provide a method for acquiring an index value used for histopathological diagnosis of prostate cancer, which can be implemented with low invasiveness and low cost.
  • the inventors of the present invention have a Gleason score for the content of PSA contained in a specimen prepared from blood that can be quantified by binding to WFA, that is, “PSA having affinity with WFA”.
  • Gleason score for the content of PSA contained in a specimen prepared from blood that can be quantified by binding to WFA, that is, “PSA having affinity with WFA”.
  • the content of “PSA having affinity with TJA-II” has no correlation with the Gleason score, and the discrimination of the Gleason score as described above is performed. Cannot be done.
  • the difference in the possibility of discrimination is that the difference in sugar chain recognition between WFA and TJA-II, that is, the PSA to which WFA binds does not include PSA having a fucose ⁇ (1,2) galactose residue, and ⁇ - While only PSA having N-acetylgalactosamine residue is included, PSA to which TJA-II binds includes PSA having fucose ⁇ (1,2) galactose residue and ⁇ -N-acetylgalactosamine residue. It is presumed that this is due to the difference that both PSAs are included.
  • PSA with affinity for WFA we extended and generalized the quantification of “PSA with affinity for WFA” as described above, not only for PSA having ⁇ -N-acetylgalactosamine residues, but also for ⁇ -N-acetyl. It is possible to make the same determination by including a PSA having a galactosamine residue (from the structural analysis result of mass spectrometry of PSA sugar chain, such an amount of PSA is considered to be low) as a quantification target. In other words, it has been found that PSA to be quantified can be defined not only as PSA having affinity for WFA but also as PSA having N-acetylgalactosamine residue at the non-reducing end of the sugar chain. It was.
  • the present invention made on the basis of such findings is, in one aspect, “a method for estimating a Gleason score representing the malignancy of prostate cancer, wherein an N-acetylgalactosamine residue in a sample is a sugar chain.
  • the content of PSA at the non-reducing end is measured, and the Gleason score is estimated to be 7 or more when the obtained measured value is larger than the threshold value, or the Gleason score is smaller than the threshold value when the measured value is smaller than the threshold value.
  • a Gleason score estimation method for estimating a value of 6 or less is provided.
  • the present invention provides, in one aspect, “a method for measuring the content of PSA having an N-acetylgalactosamine residue in a non-reducing end of a sugar chain in a sample, comprising at least N-acetylgalactosamine residue”
  • a measurement method comprising a step of binding a molecule having an affinity for a group to the PSA.
  • This measurement method can be used to estimate a Gleason score representing the malignancy of prostate cancer. If the obtained measurement value is larger than a threshold value, the Gleason score is estimated to be 7 or more. If the measured value is smaller than the threshold value, it can be estimated that the Gleason score is 6 or less.
  • the threshold for estimating that the Gleason score is 7 or more and the threshold for estimating that the Gleason score is 6 or less are thresholds for different purposes in the prior art, for example, Patent Document 4 It is different from the threshold value for determining whether it is prostate cancer or benign prostatic hyperplasia. From such a point of view, the present invention can be distinguished from the prior art.
  • a prostatic cancer malignancy having a diagnostically important meaning is not a test that imposes a heavy burden on a patient like a needle biopsy but a test that can be performed at a low invasiveness and low cost like a blood test.
  • the degree, that is, whether the Gleason score is 7 or more or 6 or less can be estimated with a desired accuracy.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a reaction that occurs in the measurement region 38 in the flow channel 36 when the GalNAc-PSA 100 in the sample is quantified using the SPFS measurement member 16.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a general embodiment of the SPFS system 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the fraction of GalNAc-PSA in each test sample by SPFS in Example 1 (Alexa Fluor 647-labeled WFA).
  • FIG. 4 is a graph showing the results of measuring the fraction of GalNAc-PSA in each test sample by SPFS in Example 2 (Alexa Fluor 647-labeled SBA). This graph is stratified by a Gleason score of 7 or more or 6 or less.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the fraction of GalNAc-PSA in each test sample by SPFS in Example 3 (AlexaAlFluor 647-labeled VVL). This graph is stratified by a Gleason score of 7 or more or 6 or less.
  • PSA having an N-acetylgalactosamine residue at the non-reducing end of a sugar chain may be referred to as “GalNAc-PSA”.
  • the “molecule having affinity for N-acetylgalactosamine residue” may be referred to as “GalNAc residue affinity molecule”.
  • N-acetylgalactosamine residue” and “ ⁇ -N-acetylgalactosamine residue” are referred to as “GalNAc residue” and “ ⁇ -GalNAc residue”, respectively, and have an affinity for “N-acetylgalactosamine residue”.
  • Molecule / lectin and "molecule / lectin having affinity for ⁇ -N-acetylgalactosamine residue” are "GalNAc residue affinity molecule / lectin” and “ ⁇ -GalNAc residue affinity molecule, respectively” / Lectin ".
  • the Gleason score estimation method measures the content of PSA (GalNAc-PSA) having an N-acetylgalactosamine residue at the non-reducing end of a sugar chain in a sample, and the measured value is larger than a threshold value.
  • the Gleason score is estimated to be 7 or more, or the Gleason score is estimated to be 6 or less when the measured value is smaller than the threshold value.
  • a “specimen” is a material for measuring the content of GalNAc-PSA collected from a subject to which the Gleason score estimation method of the present invention is applied, and is non-invasive or low in blood, urine, ascites, etc.
  • examples include liquid specimens that can be collected by invasive techniques.
  • specimens prepared from anticoagulated whole blood, preferably serum or plasma, are suitable as specimens in the present invention.
  • the sample may be a sample prepared by adding a diluent, a reagent or the like.
  • the target to which the Gleason score estimation method of the present invention is applied is typically a human, but may be a mammal other than a human, such as a human disease model animal.
  • Human subjects typically include patients who have been diagnosed with prostate cancer, or who may have prostate cancer who need to know the grade of prostate cancer. Examples of non-human mammal subjects include model animals such as mice and rats that have developed prostate cancer.
  • the method for measuring the content of GalNAc-PSA in a sample is not particularly limited as long as a measurement value having an accuracy that can be compared with a predetermined threshold is obtained, and various quantification methods are used. be able to.
  • GalNAc-PSA can be quantified by binding a molecule having affinity for N-acetylgalactosamine residues (galNAc residue affinity molecule) to GalNAc-PSA, which can be carried out by a relatively simple means. Although a method including a step is preferable, other methods such as a method based on mass spectrometry can also be used.
  • the GalNAc residue affinity molecule is preferably a molecule having affinity for ⁇ -N-acetylgalactosamine residues ( ⁇ -GalNAc residue affinity molecule).
  • a GalNAc residue affinity molecule a lectin having affinity for a GalNAc residue (GalNAc residue affinity lectin) or an antibody having a GalNAc residue as an epitope (anti-GalNAc antibody) can be used.
  • ⁇ -GalNAc residue affinity molecules include lectins having affinity for ⁇ -GalNAc residues ( ⁇ -GalNAc residue affinity lectins) or antibodies having an epitope of ⁇ -GalNAc residues (anti-antigens).
  • ⁇ -GalNAc antibody can be used.
  • GalNAc residue can be appropriately replaced with “ ⁇ -GalNAc residue”.
  • GalNAc residue affinity lectin A lectin is a protein that has an affinity for a specific sugar residue, that is, a protein that recognizes and binds to a specific sugar residue, and has many types of lectins derived from various organisms. (Sometimes called agglutinin). There are various sugar residues with affinity depending on the type of lectin, and many lectins have affinity not only for one type of sugar residue but also for multiple types of sugar residues (however, a specific sugar residue). Strong affinity for the group and low affinity for other sugar residues).
  • GalNAc residue-affinity lectins can be obtained in large quantities at low cost.
  • GalNAc residue affinity lectins are known and may be isolated from new organisms in the future. In the present invention, as long as it has a sufficiently strong affinity for GalNAc residues, that is, the lectin has no affinity for other sugar residues, or other sugar residues. Quantitative analysis of GalNAc-PSA with sufficient accuracy because the affinity for other sugar residues is sufficiently smaller than the affinity for GalNAc residues (eg, the binding constant is several orders of magnitude lower). Any lectin may be used as long as possible.
  • GalNAc residue affinity lectin preferably ⁇ -GalNAc residue affinity lectin
  • nodafuji lectin Westeria floribunda Agglutinin: WFA
  • soybean agglutinin SBA
  • corn pea lectin Vicia Villosa
  • Lectin VVL
  • These lectins can be purified by separating (extracting) from the organisms from which they are derived, for example, seeds, or commercially available products.
  • WFA is a lectin (agglutinin) derived from Nodafuji, sometimes referred to as WFL (Westeria floribunda Lectin).
  • WFA consists of N-acetyl-D-galactosamine residues (GalNAc), ie ⁇ -N-acetyl-D-galactosamine residues ( ⁇ -GalNAc) and ⁇ -N-acetyl-D-galactosamine residues ( ⁇ -GalNAc).
  • WFA also has a relatively weak affinity for lactose and galactose.
  • SBA is a lectin (agglutinin) derived from soybean.
  • SBA also has N-acetyl-D-galactosamine residues (GalNAc), ie ⁇ -N-acetyl-D-galactosamine residues ( ⁇ -GalNAc) and ⁇ -N-acetyl-D-galactosamine residues ( ⁇ -GalNAc).
  • GalNAc N-acetyl-D-galactosamine residues
  • ⁇ -GalNAc N-acetyl-D-galactosamine residues
  • ⁇ -GalNAc ⁇ -N-acetyl-D-galactosamine residues
  • VVL is a lectin (agglutinin) derived from hairy vetch, sometimes referred to as VVA (Vicia villosa Agglutinin).
  • VVL also has N-acetyl-D-galactosamine residues (GalNAc), ie ⁇ -N-acetyl-D-galactosamine residues ( ⁇ -GalNAc) and ⁇ -N-acetyl-D-galactosamine residues ( ⁇ -GalNAc).
  • GalNAc N-acetyl-D-galactosamine residues
  • ⁇ -GalNAc N-acetyl-D-galactosamine residues
  • GalNAc ⁇ 1 ⁇ 3
  • GalNAc ⁇ 1 ⁇ 4
  • GalNAc ⁇ 1 ⁇ 4
  • GlcNAc residue located at the non-reducing end of the sugar chain.
  • a representative embodiment (first embodiment) of a GalNAc-PSA quantification method including a step of binding a GalNAc residue-affinity molecule to GalNAc-PSA includes GalNAc residue
  • Specific examples of this sandwich-type complex include an anti-PSA antibody whose epitope is a PSA protein (immobilized) supported on a support, GalNAc-PSA, and fluorescence-labeled GalNAc affinity lectin or anti-antibody.
  • a sandwich type complex consisting of a GalNAc antibody can be mentioned.
  • Anti-PSA antibody can be prepared by a general technique, and a commercially available product can also be purchased. From the viewpoint of measurement stability, it is preferable to use a monoclonal antibody rather than a polyclonal antibody. In addition, an antibody having a protein portion as an epitope rather than a PSA sugar chain is preferred so as not to prevent the fluorescently labeled lectin from recognizing and binding a specific sugar residue in the sugar chain (GalNAc in the present invention). .
  • anti-PSA monoclonal antibody having such a PSA protein as an epitope examples include, for example, PS2, PS3, PS4, PS5, PS6, PS15, 2H9, 3B4, 5A6, 5G6, 8G4, 9A8, 9G2, PS1, 8A6, 2H9, 1H12, No. 1 79 and other clones are known and are also commercially available.
  • An anti-GalNAc antibody, preferably an anti- ⁇ -GalNAc antibody can be prepared in the same manner. For example, 100-2H5-A, 114-2H12-C, 259-2A1, 273-3F2, 99-2A5-B, SMLDN1 Clones such as .1 are known.
  • the fluorescently labeled GalNAc affinity lectin can be prepared by binding a desired fluorescent substance to the GalNAc affinity lectin as described above using a general technique, and in that case, a commercially available fluorescence is used.
  • a substance labeling kit or the like can also be used.
  • the fluorescent substance is not particularly limited, and a fluorescent dye or the like that can emit appropriate fluorescence by SPFS can be used.
  • a fluorescently labeled anti-GalNAc antibody can be prepared in the same manner.
  • the measurement target is quantified with high sensitivity and high accuracy.
  • SPFS Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy
  • GalNAc-PSA in the specimen can be quantified.
  • Second embodiment of the method for quantifying GalNAc-PSA which comprises the step of binding a GalNAc residue affinity molecule to GalNAc-PSA, a lectin having an affinity for GalNAc residue is bound. And a method using a column (lectin affinity column) packed with the above-described carrier. That is, a sample is applied to the lectin affinity column to bind GalNAc-PSA to the lectin, and then an elution buffer containing hapten sugar is applied to dissociate GalNAc-PSA and a fraction containing GalNAc-PSA. After collecting the fraction, the content of GalNAc-PSA in the fraction can be measured by immunoassay.
  • the PSA in the fraction has substantially all GalNAc residues, and thus is labeled.
  • a GalNAc residue affinity molecule lectin
  • a labeled anti-PSA antibody having a PSA protein as an epitope can be used.
  • a chemiluminescent enzyme immunoassay method in which an immunocomplex comprising an anti-PSA antibody-coupled magnetic particle / PSA / alkaline phosphatase-labeled anti-PSA antibody is formed, and then the luminescence intensity is measured by adding a chemiluminescent substrate.
  • GalNAc-PSA in the fraction containing GalNAc-PSA can be quantified by SPFS method in which the fluorescence intensity is measured by SPFS.
  • SPFS measurement method When SPFS irradiates incident light at an angle at which total reflection attenuation (ATR) occurs from the back surface (side in contact with the dielectric member) on the metal thin film formed on the top surface of the dielectric member Utilizing the fact that the evanescent wave that is transmitted through the metal thin film and is generated on the surface (the side where the measurement region is formed) is enhanced by several tens to several hundreds of times by resonance with the surface plasmon, the enhanced evanescent This is a method of efficiently generating fluorescence from a fluorescent substance that labels a measurement object captured in a measurement region using waves as excitation light.
  • ATR total reflection attenuation
  • the measurement object in the specimen can be quantified by measuring the intensity of the fluorescence, and the measured value for each specimen is measured with the measured value of the fluorescence intensity when measured using a standard sample with a known concentration. By comparison, the content (concentration) of the measurement object in the sample can be converted. Since SPFS performed in this manner is extremely sensitive compared to a conventional fluorescent labeling method such as ELISA, it is suitable as a quantitative method when the concentration of the measurement target in the sample is extremely low.
  • the Gleason score is estimated based on the content (concentration) of GalNAc-PSA in the specimen.
  • the “measured value” obtained according to a predetermined measurement protocol by a quantification method such as SPFS is ng / It can also be used for analysis without being converted to a “concentration” expressed in a predetermined unit such as mL or U (unit) / mL.
  • a fluorescence intensity measurement value is usually expressed in arbitrary units (arbitrary unit: au), but the threshold value of the unit is set based on a measurement value expressed in an arbitrary unit measured for each specimen under the same conditions. It is possible to set and estimate the Gleason score from the measured value of the specimen measured under the same conditions.
  • a general method for measuring the intensity of fluorescence emitted from a complex (fluorescent substance) by SPFS after forming a sandwich-type complex comprising an anti-PSA antibody / GalNAc-PSA / fluorescently labeled GalNAc residue affinity molecule An embodiment will be described with reference to FIG.
  • the process performed when SPFS is performed can be broadly divided into a “pre-measurement stage” process and a “measurement stage” process.
  • the pre-measurement step is a step up to formation of a sandwich-type complex composed of an anti-PSA antibody / GalNAc-PSA / fluorescently labeled GalNAc residue affinity molecule.
  • the process of the measurement stage includes a process (measurement process) of irradiating the back surface of the metal thin film 14 with incident light and measuring the intensity of fluorescence generated from a predetermined sandwich type complex formed in the measurement region 38. .
  • the SPFS uses a plasmon excitation sensor 16a including a dielectric member 12, a metal thin film 14 formed on the upper surface thereof, and a measurement region 38 formed on the surface thereof.
  • the measurement region 38 is a place where a reaction for forming a predetermined sandwich-type composite is performed, and includes a SAM 60 formed on the surface of the metal thin film 14, a support 62 bonded to the surface of the SAM 60, and The anti-PSA antibody 64 bound (supported) to the support 62 is preferably used.
  • a plasmon excitation sensor 16a is prepared in advance prior to the capturing step.
  • a SAM (Self-Assembled Monolayer) 60 provides a scaffold for connecting the support 62 to the surface of the metal thin film 14, and excitation light is generated when the fluorescent material 84 is in contact with the metal thin film 14. It is formed in order to prevent metal quenching that does not emit fluorescence even when irradiated.
  • the SAM 60 is a silane coupling agent having functional groups capable of reacting directly or indirectly with the metal thin film 14 and functional groups capable of reacting directly or indirectly with the molecules constituting the support 62 at both ends. It is preferable to form.
  • the support 62 is formed so that the anti-PSA antibody 64 is included in the measurement region 38 at a higher density. That is, in the case where the support body 62 is bound to the SAM 60 and the anti-PSA antibody 64 is bound to the support body 62, the support body 62 is moved in the height direction rather than the case where the anti-PSA antibody 64 is bound directly to the SAM 60. Therefore, the number (ie, density) of the anti-PSA antibodies 64 per unit area can be increased.
  • Such a support 62 is mainly composed of a hydrophilic polymer such as dextran, which suppresses nonspecific adsorption due to hydrophobic bonds and has many functional groups capable of reacting with the anti-PSA antibody 64.
  • CMD Carboxymethyldextran
  • the SAM 60 composed of the molecule can be formed.
  • the SAM 60 formed from 10-carboxy-1-decanethiol is reacted with N-hydroxysuccinimide (NHS) and water-soluble carbodiimide (WSC), whereby the carboxyl oriented on the surface side of the SAM 60.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • WSC water-soluble carbodiimide
  • NHS and WSC are reacted with CMD, and the carboxyl group possessed by CMD is activated esterified, and then contacted with a solution containing anti-PSA antibody 64, whereby a support 62 made of CMD is contacted with a number of anti-PSA antibodies 64. Can be supported.
  • a specimen containing GalNAc-PSA100 and non-GalNAc-PSA110 is introduced into the flow path 36 and brought into contact with the measurement region 38.
  • non-GalNAc-PSA110 is included in the specimen together with GalNAc-PSA100. Accordingly, not only GalNAc-PSA100 but also non-GalNAc-PSA110 is bound and captured by the anti-PSA antibody 64 in the measurement region 38.
  • a solution containing the fluorescently labeled GalNAc affinity molecule 80 is introduced into the flow path 36 and brought into contact with the measurement region 38.
  • the fluorescently labeled GalNAc affinity molecule 80 binds to GalNAc-PSA10 captured in the measurement region 38 to form a predetermined sandwich-type complex, but non-GalNAc-PSA110 having no GalNAc residue. Does not bind (except unavoidable binding due to non-specific adsorption).
  • a washing solution for example, a buffer solution containing a surfactant
  • the measurement region 38 support 62, anti-PSA antibody 64, SAM60, etc.
  • the SPFS system 1 includes an SPFS measurement member 16, an SPFS measurement device 10, and a control arithmetic device 40.
  • FIG. 2A shows an embodiment in which the metal thin film 14 is directly formed on the upper surface 12 a of the dielectric member 12, and the plasmon excitation sensor 16 a is formed from the dielectric member 12, the metal thin film 14, and the measurement region 38.
  • FIG. 2B shows an embodiment in which a metal thin film 14 is formed on the upper surface of a transparent flat substrate 13 that can be separated from the dielectric member 12, and the plasmon excitation sensor 16a includes the transparent flat substrate 13, the metal thin film. 14 and a measurement area 38.
  • the SPFS measurement member 16 includes a plasmon excitation sensor 16a and a flow path member 16b.
  • a region in which a layer made of the support 62 and the anti-PSA antibody 64 is formed in a part or the whole of the upper surface of the plasmon excitation sensor 16 a, that is, a part or the whole of the bottom surface of the flow path 36 becomes the measurement region 38.
  • the area of the measurement region 38 is usually adjusted to be equal to or larger than the irradiation area of the incident light 22 that is generally irradiated as laser light. For example, if the spot diameter of the incident light 22 is about 1 mm ⁇ , the measurement is performed.
  • Region 38 typically has an area of at least a few millimeters square.
  • the flow path member 16b is a member for forming a flow path 36 having openings at both ends at the upper part of the plasmon excitation sensor 16a, and the intensity of the fluorescence 32 by the fluorescence detection means 32 provided at the upper part of the flow path member 16b. Is made of a colorless and transparent material, for example, polymethyl methacrylate (PMMA) so that the measurement can be accurately performed.
  • the flow path member 16b is pressure-bonded to the plasmon excitation sensor 16a (the dielectric member 12 in FIG. 2A and the transparent flat substrate 13 in FIG. 2B), and adhesive, matching oil, and transparent as necessary. You may make it prevent the leakage of the solution from a clearance gap using an adhesive sheet.
  • the flow path member 16b may be comprised by combining a side wall part (spacer) and a top-plate part.
  • a side wall part for example, a sheet-like member made of polydimethylsiloxane (PDMS) and having a through hole serving as a flow path in the central portion can be used.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the top plate portion for example, a plate-shaped member made of polymethyl methacrylate (PMMA) is transparent and has two through holes at positions corresponding to both ends of the through holes (channels) in the side wall portion. it can.
  • a sample such as a sample, a solution of the fluorescently labeled GalNAc affinity molecule 80, and a washing solution are provided at both ends by a liquid feeding means (not shown). It is introduced into the flow path 36 through the opening, and is sent back and forth or circulated.
  • the SPFS measurement member 16 can be a “well type” that stores the solution.
  • a well member that can form a well having a larger volume than the flow path may be used on the upper surface of the plasmon excitation sensor 16a.
  • the upper part of the well may be opened, and various liquids can be added to the well and removed by using, for example, a pipette-like instrument.
  • the SPFS measurement apparatus 10 basically includes a measurement member loading unit 18, an irradiation unit 20, a light receiving unit 26, and a fluorescence detection unit 32, and may further include a liquid feeding unit (not shown) as necessary. Good.
  • the SPFS measurement member 16 is detachably attached to the measurement member loading unit (stage) 18.
  • the measurement member loading unit 18 can install the prism-shaped dielectric member 12.
  • a prism-shaped dielectric member 12 is installed in the measurement member loading unit 18 in advance.
  • the transparent flat substrate 13 can be placed in close contact with the upper surface 12a.
  • the liquid feeding means can be constituted by, for example, a pipette-like instrument provided with moving means. After the various solutions such as samples and reagents were sucked in a container (not shown), they were sucked in the opening provided at the end of the flow path 36 of the flow path type SPFS measuring member 16.
  • the solution can be introduced into the flow path 36 by discharging the solution. If necessary, by repeating suction and discharge on the spot, the solution can be reciprocated in the flow path 36 and the reaction in the measurement region 38 can be promoted.
  • the SPFS measuring member 16 is a well type, the solution sucked into the well may be discharged.
  • the liquid feeding means can be configured by an external flow channel and a pump.
  • the external flow path is a member that communicates the opening provided at both ends of the flow path 36 of the SPFS measuring member 16 with the pump.
  • the pump can introduce various solutions such as a sample and a reagent into the flow path 36 via the external flow path, and can reciprocate or circulate the liquid.
  • the irradiation unit 20 includes a light source and a light source movable unit, and may further include a polarizing filter and a neutral density filter between the light source and the dielectric member 12 as necessary.
  • the light source irradiates incident light 22 having a wavelength and intensity suitable for exciting the fluorescent substance 84 included in the fluorescently labeled lectin 80, and is generally a laser diode (that is, the incident light 22 is a laser beam). Is).
  • the light source moving means moves the light source so that the incident light 22 is irradiated from the incident side surface 12b of the dielectric member 12 to the back surface of the metal thin film 14 at a predetermined incident angle ⁇ 1.
  • the polarizing filter is used to change the incident light 22 irradiated from the light source into P-polarized light that allows the metal thin film 14 to efficiently generate surface plasmon resonance.
  • the neutral density filter is used to adjust the intensity (photon amount) of the incident light 22 emitted from the light source so that the fluorescence detection means 32 can acquire a signal value having an appropriate intensity.
  • the light receiving means 26 includes a light receiver and a light receiver moving means.
  • the light receiver can receive the reflected light 24, which is the light reflected by the back surface of the metal thin film 14, and measure the intensity thereof.
  • the light receiver moving means can move the light receiver so as to reliably receive the reflected light 24 whose reflection angle has changed in synchronization with the change in the incident angle ⁇ 1 of the incident light 22 by the light source moving means.
  • the ratio of the intensity of the reflected light 24 to the intensity of the incident light 22, that is, the measurement of measuring the intensity of the fluorescence 32 at such an incident angle ⁇ 1 when the electric field enhancement effect by surface plasmon resonance is the highest when the reflectance is the lowest. It is preferable to perform a process.
  • the fluorescence detection means 32 includes a detector, a condenser lens, and a filter.
  • the detector is for receiving the fluorescence 30 emitted from the surface of the plasmon excitation sensor 16a, that is, the fluorescence 30 emitted from the fluorescent substance 84 included in the fluorescently labeled lectin 80 captured in the measurement region 38, and measuring the intensity thereof.
  • a photomultiplier tube (PMT) can be used.
  • the condenser lens concentrates the fluorescence 30 on the detector so that the intensity can be accurately measured.
  • an objective lens similar to a microscope can be used.
  • the filter is for transmitting only light in a predetermined range including the fluorescence 30 to reach the detector, and removes light that becomes noise such as scattered light having a wavelength outside the range. Can do.
  • the configuration including the SPFS measurement member 16 (plasmon excitation sensor 16a), the irradiation unit 20, and the light reception unit 26 may be referred to as an SPR measurement unit 28.
  • the SPR measurement unit 28 does not measure the fluorescence 30, but quantifies the target substance by the intensity of the reflected light 24 being attenuated by the target substance being captured in the measurement region 38.
  • the SPR method surface plasmon resonance method This is because it has a configuration that is basically the same as that of the apparatus for).
  • the configuration including the SPFS measurement member 16 (plasmon excitation sensor 16a), the irradiation unit 20, and the fluorescence detection unit 32 may be referred to as an SPFS measurement unit 34.
  • the control arithmetic device 40 is connected to the irradiation means 20, the light receiving means 26, the fluorescence detection means 32, and a liquid feeding means (not shown) provided as necessary, and controls the operation of members provided in each means. In addition, signals are transmitted and received so that information measured by each means can be recorded, stored, and calculated.
  • the control arithmetic device 40 can be configured using a personal computer capable of storing a predetermined control arithmetic program and information.
  • the irradiation means 20 Each means can be automatically operated according to a program so that the incident light 22 is irradiated at a predetermined timing and incident angle, and the fluorescence detection means 32 measures the intensity of the fluorescence 30 generated in the measurement region 38. Further, the control arithmetic unit 40 receives the intensity data of the fluorescence 30 measured for each specimen from the fluorescence detection means 32 and stores it, preferably immediately with the predetermined threshold value stored in advance. In contrast, the estimation result of the Gleason score may be further stored.
  • a threshold for determining that the Gleason score is 7 or more and a threshold for estimating that the Gleason score is 6 or less are the other threshold values, respectively. It can set by the general method according to the threshold value about a diagnostic marker or a tumor marker.
  • the concentration of GalNAc-PSA is measured for specimens from a plurality of patients who have been diagnosed with prostate cancer and whose Gleason score is also examined, the actual Gleason score in a population with a measured value equal to or higher than a certain concentration is obtained.
  • a concentration at which a sample of 7 or more occupies a desired ratio or more can be obtained, and this concentration can be used as a threshold for estimating that the Gleason score is 7 or more.
  • the “desired ratio” corresponds to the reliability regarding the estimation that the Gleason score is 7 or more, that is, the probability that the estimation is correct. As the number of samples, which are the population of measurement data, increases, a highly reliable threshold value can be set.
  • the measured value of the content (concentration) of GalNAc-PSA in a sample is compared with the threshold value thus set, and if the measured value is larger than the threshold value, the prostate cancer patient from whom the sample was collected has a Gleason score If it is 7 or more, it can be estimated with a predetermined probability.
  • a threshold is set so that the estimation that the Gleason score is 7 or more can be performed with as high accuracy as possible, and the Gleason score is 7 without performing a highly invasive needle biopsy when the concentration of the measured value is larger than the threshold. It is desirable to be able to estimate (diagnose) the above.
  • the concentration at which a sample having an actual Gleason score of 6 or less occupies a desired ratio or more in a population whose measured value is a certain concentration or less is obtained.
  • This concentration can be used as a threshold for estimating that the Gleason score is 6 or less.
  • the threshold for estimating that the Gleason score is 7 or more and the threshold for estimating that the Gleason score is 6 or less are likely to be different values.
  • a method for quantifying a glycoprotein having a sugar chain containing a specific sugar residue such as GalNAc-PSA, particularly a quantification method based on the SPFS method, and comparing such a content with a predetermined threshold
  • a method for obtaining specific information for example, International Publication No. 2010/090264 (Patent Document) 4), Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-076666 (Patent Document 5) and the like can be referred to.
  • An SPFS measuring apparatus was made by itself and used in the following examples.
  • a laser diode (LD) capable of irradiating light with a wavelength of 635 nm is used as the light source of the irradiation means 20, and a neutral density filter (neutral density filter) is provided between the light source and the dielectric member 12. The amount of photons can be adjusted.
  • a 60 degree prism (Sigma Koki Co., Ltd.) was used.
  • a measurement member is obtained. 16 was constructed.
  • a photomultiplier tube (PMT) was used as a photodetector of the fluorescence detection means 32, and an objective lens was provided as a condenser lens.
  • the substrate on which the gold thin film was thus formed was immersed in an ethanol solution containing 1 mM 10-carboxy-1-decanethiol for 24 hours or more to form a SAM composed of the molecule on the surface of the gold thin film.
  • the substrate was removed from this solution, washed with ethanol and isopropanol, and then dried using an air gun.
  • N-hydroxysuccinimide (NHS) 0.5 mM, water-soluble carbodiimide (WSC) 0.5 mM, and carboxymethyldextran (CMD) (Meito Sangyo Co., Ltd. “CMD-500-06I4”, average molecular weight 500,000, substitution degree 0.51) 25 mM MES buffered saline containing 1 mg / mL and 10 mM NaCl solution (pH 6.0) were each added dropwise in an amount of 0.8 mL and reacted for 20 minutes to give SAM.
  • CMD carboxymethyldextran
  • a spacer made of polydimethylsiloxane (PDMS) having a thickness of 0.5 mm and having a through hole having a width of 2 mm and a length of 14 mm was loaded on the plasmon excitation sensor on which the CMD film was formed. Furthermore, a top plate made of polymethyl methacrylate (PMMA) having a thickness of 2 mm and having through holes at positions corresponding to both ends of the through holes of the spacer was loaded thereon.
  • a flow path comprising a through-hole of a spacer through which a sample, a reagent, etc. can be fed through a through-hole in the top plate by crimping a plasmon excitation sensor, a spacer, and a top plate and fixing with a screw.
  • a mold SPFS measuring member was produced.
  • PBS phosphate buffered saline
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • WSC water-soluble carbodiimide
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • a diluted solution (100 ⁇ L) was added to a test sample (serum) (20 ⁇ L), and the mixture was stirred well in a tube to prepare a mixed solution. 100 ⁇ L of this mixed solution was circulated through the flow path and reacted with the measurement region for 60 minutes. Thereafter, TBS (TBS-T) containing 0.05% by weight of “Tween (registered trademark) 20” was fed and washed for 3 minutes. Subsequently, 100 ⁇ L of Alexa Fluor 647-labeled WFA solution (WFA concentration: 10 ⁇ g / mL) obtained in Preparation Example 1 was circulated through the flow path and reacted with the measurement region for 10 minutes.
  • TBS-T was again fed and washed for 5 minutes. Then, excitation light was irradiated in a state where the channel was filled with TBS-T, and the fluorescence intensity (signal) of Alexa Fluor 647 was measured by SPFS.
  • Example 2 SPFS measurement using Alexa Fluor 647-labeled SBA From the test samples shown in Table 1, 4 samples from prostate cancer patients with a Gleason score of 7 or more and 4 from prostate cancer patients with a Gleason score of less than 6 A total of 8 specimens were selected at random to be measured, and instead of Alexa Fluor 647 labeled WFA solution (WFA concentration: 10 ⁇ g / mL), Alexa Fluor 647 labeled SBA (SBA concentration) obtained in Preparation Example 2 was used.
  • WFA concentration WFA concentration: 10 ⁇ g / mL
  • Example 3 SPFS measurement using Alexa Fluor 647-labeled VVL Among the test samples shown in Table 1, 4 samples derived from prostate cancer patients with a Gleason score of 7 or more and from prostate cancer patients with a Gleason score of less than 6 A total of 8 specimens of 4 specimens were randomly selected for measurement, and instead of Alexa Fluor 647-labeled WFA solution (WFA concentration: 10 ⁇ g / mL), Alexa Fluor 647-labeled VVL (SBA obtained in Preparation Example 3) was used. Except for this, the fluorescence intensity (signal) of Alexa Fluor 647 was measured by SPFS in the same manner as in Example 1, and the concentration (fractionated amount) of GalNAc-PSA in each test sample was measured. Calculated.

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Abstract

本発明は、低侵襲性かつ低コストで実施することができる、前立腺癌の病理組織診断に用いられている指標値を取得する方法を提供する。本発明に係る方法は、前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコアを推定する方法であって、検体中の、Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（Prostate Specific Antigen：前立腺特異抗原）の含有量を測定し、その測定値が閾値よりも大きいことをもってグリーソンスコアが７以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってグリーソンスコアが６以下であると推定するグリーソンスコアの推定方法である。前記ＰＳＡの定量は、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子、例えばノダフジレクチン（ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）またはカラスノエンドウレクチン（ＶＶＬ）、あるいは抗β－Ｎ－アセチルガラクトサミン抗体を前記ＰＳＡに結合させる工程を含む方法によって行うことが好ましい。

Description

前立腺癌の病理組織診断結果（グリーソンスコア）の推定方法
　本発明は、グリーソンスコアとして知られている、前立腺癌の悪性度に係る病理組織の診断結果を推定する方法に関する。
　前立腺癌は、主に６０歳以上の男性に発病し、欧米諸国では男性の癌において肺癌に次ぐ死亡原因となっている。前立腺癌の治療方針を決める上で、がんの進行度（病期）および悪性度が重要な指標となる。このうち、前立腺癌の悪性度には幅広い分布があり、ほとんど増殖が認められず無治療経過観察が可能であるものから、骨やリンパ節に転移し抗ホルモン薬への抵抗性を示す増悪をきたすものまで様々であるため、前立腺癌の悪性度を正確に判断することが望まれている。
　前立腺癌の悪性度を示す分類として、がんの病理組織の診断結果を点数化した「グリーソンスコア」が広く用いられている。前立腺癌のがん組織は、その形態や浸潤増殖様式によってグレード１からグレード５の５段階に分類することができる（グリーソン分類）。グリーソンスコアは、ある病理組織を顕微鏡で観察したときに、最も大きな面積を占める組織像についてグリーソン分類に基づき付与されるグレードと、その次に大きな面積を占める組織像のグレード（これら２つのグレードが同じになる場合もある）を合計した値である。一般的に、グリーソンスコアが２～６の場合は悪性度が低い、７の場合は中程度、８～１０の場合は悪性度が高いとされ、グリーソンスコアが７以上であるかそうでないかが主要な目安となっている。
　しかしながら、このような病理組織診断を行うためには、直腸から針（合計８本以上）を刺して前立腺組織を採取すること（針生検）が必要である。針生検は患者にとって侵襲性が高く、費用も高額である上、針が前立腺癌組織に当たらないと診断ができないという欠点もある。
　一方、前立腺癌および前立腺肥大症等の前立腺関連疾患について、患者の血液等の試料中に存在する、特定の糖鎖を有するＰＳＡ（prostate specific antigen：前立腺特異抗原）との関係性に注目した研究が進められている。従来、試料中の全てのＰＳＡ（トータルＰＳＡ）を定量し、その値を閾値と比較すること、またはα１－アンチキモトリプシンと結合しない遊離型ＰＳＡ（フリーＰＳＡ）を定量し、全てのＰＳＡの量に対する遊離型ＰＳＡの量の比率（フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比）を閾値と比較することによって、前立腺癌に罹患しているか否かを診断する方法が知られていた。しかしながら近年では、患者が罹患している疾患によってＰＳＡが有する糖鎖の性状が変化すること、換言すれば特定の糖鎖を有するＰＳＡの量（割合）が変化することが分かってきており、そのことを利用して前立腺癌または前立腺肥大症疾患に罹患しているか否かを診断する方法がいくつか提案されている。
　たとえば、特許文献１（国際公開２００９／００８３８１号公報）には、質量分析法により、被験者由来の試料中のフコース非結合糖鎖を有するＰＳＡおよびフコース結合糖鎖を有するＰＳＡを、質量分析法により分析し、前者に対して後者の量が多い（前者のシグナル強度に対する後者のシグナル強度の比が１．０を超える）場合に前立腺癌であると識別し、そうでなければ良性前立腺肥大症であると識別する方法が開示されている。
　特許文献２（国際公開２０１０／０６４６８３号公報）には、被験者由来の試料中のＰＳＡの、ＬａｃｄｉＮＡｃ（Ｎ－アセチルガラクトサミン－Ｎ－アセチルグルコサミン）を有する糖鎖の量と、ＬａｃｄｉＮＡｃを持たないがＬａｃＮＡｃ（ガラクトース－Ｎ－アセチルグルコサミン）を有する糖鎖の量とを定量し、前者の量が後者の量の３０％を超える場合に前立腺癌であると判定する方法が開示されている。
　特許文献３（特開２０１１－１３７７５４号公報）には、被験者由来の試料中のＰＳＡの糖鎖構造を分析し、ＬａｃｄｉＮＡｃを有する３本鎖以上の糖鎖が存在するときに前立腺癌であると判定する方法が開示されている。
　特許文献４（国際公開２０１０／０９０２６４号公報）には、患者由来の試料（血清等）中のβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡおよび／またはフコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡを定量し、それらの絶対量および／またはＰＳＡ全体に対する割合を所定のカットオフ値より大きければ前立腺癌、そうでなければ前立腺肥大症と判定する方法が開示されている。β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡは、当該残基と親和性を有するレクチン、例えばＴＪＡ－ＩＩ（Trichosanthes japonica agglutinin-II：キカラスウリレクチン－ＩＩ）またはＷＦＡ（Westeria floribunda agglutinin：ノダフジレクチン）を用いて定量で、フコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡは、当該残基と親和性を有するレクチン、例えばＵＥＡ－Ｉ（Ulex europaeus agglutinin-I：ハリエニシダレクチン－Ｉ）またはＴＪＡ－ＩＩを用いて定量できると記載されている。また、前記所定の残基を有するＰＳＡは、例えば、担体にレクチンを結合させたカラム（レクチンアフィニティーカラム）を用いて吸着および溶出させることにより定量できると記載されている。
　さらに、特許文献５（特開２０１３－０７６６６６号公報）には、特許文献４と同じ特定の残基を有するＰＳＡを、当該ＰＳＡに対する固相一次抗体、および当該ＰＳＡが有する残基と高い親和性を有するレクチンを蛍光色素により標識化した二次捕捉分子を用いた、ＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）等のサンドイッチアッセイにより定量する方法が記載されている。
　しかしながら特許文献１～５のいずれにも、それらに開示されている方法とグリーソンスコア等の前立腺癌の悪性度との相関性は記載されていない。特に、特許文献４の実施例１では、ＴＪＡ－ＩＩを用いて前記特定の糖鎖を有するＰＳＡを定量しており、前立腺肥大症患者と前立腺癌患者を区別することが可能であることが示されている一方、グリーソンスコアについては有意差が認められなかったと分析されている。また、特許文献４の実施例２では、ＷＦＡを用いて前記特定の糖鎖を有するＰＳＡを定量しており、ＴＪＡ－ＩＩと同様の傾向を示す（結合率はやや低いがほぼ相関している）こと、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基は有さずフコースα（１，２）ガラクトース残基のみを有するＰＳＡが存在する可能性があることなどが分析されているが、定量の対象としているのは前立腺癌患者由来の３検体のみであり、グリーソンスコアについては全く分析されていない。なお、特許文献４では、ＴＪＡ－ＩＩおよびＷＦＡはともに、糖鎖の非還元末端（タンパク質と結合している還元末端とは逆側の末端）に結合したβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有するレクチンとして例示されているが（段落［００２０］参照）、その他の残基に対する親和性においてこれらのレクチンには相違点がある。すなわち、ＴＪＡ－ＩＩは、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ；Ｒは糖鎖の他の残基またはタンパク質のアミノ酸残基を表す）およびフコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）の両方に強い親和性を有するレクチンである（段落［００２２］参照）。これに対して、ＷＦＡは、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）、例えばＧａｌＮＡｃ（β１→４）Ｇａｌ残基およびＧａｌＮＡｃ（β１→４）ＧｌｃＮＡｃ残基に強い親和性を有するものの、フコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）には親和性を有さない（段落［００２３］参照）。
国際公開２００９／００８３８１号公報 国際公開２０１０／０６４６８３号公報 特開２０１１－１３７７５４号公報 国際公開２０１０／０９０２６４号公報 特開２０１３－０７６６６６号公報
　前述したように、針生検を必要とする従来の病理組織診断は患者にとっての負担が大きい。前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコアのような前立腺癌の病理組織診断結果を、血液検査のように侵襲性が低く、コストも低い方法によって取得することができれば、患者にもたらされる利益は大きい。
　本発明は、低侵襲性かつ低コストで実施することができる、前立腺癌の病理組織診断に用いられている指標値を取得する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、血液から調製された検体に含まれるＰＳＡのうち、ＷＦＡと結合させることによって定量することのできるＰＳＡ、つまり"ＷＦＡと親和性を有するＰＳＡ"の含有量について、グリーソンスコアが７以上の前立腺癌患者に由来するサンプル群とそれ以外のサンプル群との間、およびグリーソンスコアが６以下の前立腺癌患者に由来するサンプル群とそれ以外のサンプル群との間、それぞれで統計学的に有意な差があり、適切な閾値を設定することにより、グリーソンスコアが７以上または６以下であることを高い精度で推定することができることを見出した。
　ここで、特許文献４に既に記載されているように、"ＴＪＡ－ＩＩと親和性を有するＰＳＡ"の含有量は、グリーソンスコアとの相関性を有さず、上記のようなグリーソンスコアの判別は行えない。このような判別の可否の違いは、ＷＦＡとＴＪＡ－ＩＩの糖鎖認識の違い、すなわちＷＦＡが結合するＰＳＡには、フコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡは含まれず、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡのみが含まれるのに対し、ＴＪＡ－ＩＩが結合するＰＳＡには、フコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡとβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡの両方が含まれる、という違いに起因しているものと推測される。
　さらに、本発明者らは上記のように"ＷＦＡと親和性を有するＰＳＡ"を定量することを拡張および一般化し、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡだけではなく、α－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡ（ＰＳＡ糖鎖の質量分析の構造解析結果からは、このようなＰＳＡの存在量は低いと考えられる）を定量の対象に含めても同様の判定が可能であること、換言すれば、定量の対象とするＰＳＡは、ＷＦＡと親和性を有するＰＳＡだけでなく、Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡと規定することが可能であることを見出した。
　このような知見に基づいてなされた本発明は、一つの側面において、「前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコアを推定する方法であって、検体中の、Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡの含有量を測定し、得られた測定値が閾値よりも大きいことをもってグリーソンスコアが７以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってグリーソンスコアが６以下であると推定する、グリーソンスコアの推定方法」を提供する。
　換言すれば、本発明は一つの側面において、「検体中の、Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡの含有量の測定方法であって、少なくとも、Ｎ－アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子を前記ＰＳＡに結合させる工程を含む、測定方法」を提供する。この測定方法は、前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコアを推定するために利用することのできるものであり、得られた測定値が閾値よりも大きい場合はグリーソンスコアが７以上であると推定することができ、その測定値が閾値よりも小さい場合はグリーソンスコアが６以下であると推定することができる。
　なお、本発明における、グリーソンスコアが７以上であると推定するための閾値およびグリーソンスコアが６以下であると推定するための閾値は、従来技術における異なる目的のための閾値、例えば特許文献４に記載されている、前立腺癌か前立腺肥大症かを判定するための閾値とは相違する。そのような観点から、本発明を従来技術と区別することが可能である。
　本発明によって、針生検のように患者に重い負担を強いる検査ではなく、血液検査のように低侵襲性かつ低コストで実施することができる検査によって、診断上重要な意味を持つ前立腺癌の悪性度、すなわちグリーソンスコアが７以上か否か、または６以下か否かを所望の精度で推定することができるようになる。それにより、前立腺癌患者のＱＯＬを維持しつつ、必要な治療をしたり、経過観察をしたりすることが可能となる。
図１は、ＳＰＦＳ測定部材１６を用いて検体中のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１００を定量する際の、流路３６内の測定領域３８で起きる反応の模式図である。［Ａ］支持体６２に担持された抗ＰＳＡ抗体６４に、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１００を結合させるための捕捉工程における反応。［Ｂ］抗ＰＳＡ抗体６４に捕捉されたＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１００に、蛍光標識ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０を結合させるための標識工程における反応。 図２は、ＳＰＦＳシステム１の一般的な実施形態を示す模式図である。［Ａ］誘電体部材１２の上面１２ａに金属薄膜１４が直接形成されており、プラズモン励起センサ１６ａが、誘電体部材１２、金属薄膜１４および測定領域３８によって構成されている実施形態。［Ｂ］誘電体部材１２と分離可能な透明平面基板１３の上面に金属薄膜１４が形成されており、プラズモン励起センサ１６ａが、透明平面基板１３、金属薄膜１４および測定領域３８によって構成されている場合。 図３は、実施例１（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ）における、各被験試料中のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ分画量をＳＰＦＳで測定した結果を示すグラフである。このグラフは、表１に示す被検試料に付属する診療情報および病理組織診断結果（グリーソンスコア）をもとに層別化されている。 図４は、実施例２（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＳＢＡ）における、各被験試料中のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ分画量をＳＰＦＳで測定した結果を示すグラフである。このグラフは、グリーソンスコアが７以上か、６以下かで層別化されている。 図５は、実施例３（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＶＶＬ）における、各被験試料中のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ分画量をＳＰＦＳで測定した結果を示すグラフである。このグラフは、グリーソンスコアが７以上か、６以下かで層別化されている。
　本明細書において、下記の語句はそれぞれ短縮して称することがある。すなわち、「Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ」は「ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ」と称することがある。「Ｎ－アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子」は「ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子」と称することがある。「Ｎ－アセチルガラクトサミン残基」および「β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基」は、それぞれ「ＧａｌＮＡｃ残基」および「β－ＧａｌＮＡｃ残基」と称し、「Ｎ－アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子／レクチン」および「β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子／レクチン」は、それぞれ「ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子／レクチン」および「β－ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子／レクチン」と称することがある。
　本発明によるグリーソンスコアの推定方法は、検体中の、Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ）の含有量を測定し、その測定値が閾値よりも大きいことをもって、グリーソンスコアが７以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってグリーソンスコアが６以下であると推定する方法である。
　「検体」は、本発明のグリーソンスコアの推定方法を適用する対象から採取される、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの含有量を測定するための材料であって、血液、尿、腹水など、非侵襲性ないし低侵襲性の手法によって採取することのできる液性の検体が挙げられる。たとえば、抗凝固処理された全血から調製された検体、好ましくは血清または血漿は、本発明における検体として好適である。ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの定量方法に応じて必要であれば、検体は希釈液、試薬等を添加して調製された試料であってもよい。
　本発明のグリーソンスコアの推定方法の適用対象、すなわち検体を採取する対象は、典型的にはヒトであるが、ヒトの疾患のモデル動物など、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。ヒトの対象としては、典型的には前立腺癌であると確定診断された患者、または前立腺癌に罹患している可能性のある者であって、前立腺癌の悪性度を知る必要のある者が挙げられ、ヒト以外の哺乳動物の対象としては、前立腺癌を発症させたマウス、ラット等のモデル動物が挙げられる。
　［定量方法］
　検体中のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの含有量を測定するための方法は、所定の閾値と比較することのできる精度を有する測定値が得られる限り、特に限定されるものではなく、様々な定量方法を用いることができる。
　ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの定量方法としては、比較的簡便な手段によって実施することのできる、Ｎ－アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子（ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子）をＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡに結合させる工程を含む方法が好ましいが、その他の方法、例えば質量分析法に基づく方法を用いることも可能である。
　・ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子
　ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子は、好ましくはβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子（β－ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子）である。また、ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子としては、ＧａｌＮＡｃ残基に対して親和性を有するレクチン（ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチン）またはＧａｌＮＡｃ残基をエピトープとする抗体（抗ＧａｌＮＡｃ抗体）用いることができる。
　同様に、β－ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子としては、β－ＧａｌＮＡｃ残基に対して親和性を有するレクチン（β－ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチン）またはβ－ＧａｌＮＡｃ残基をエピトープとする抗体（抗β－ＧａｌＮＡｃ抗体）を用いることができる。以下に説明されている事項について、「ＧａｌＮＡｃ残基」は適宜「β－ＧａｌＮＡｃ残基」に読み替えることができる。
　・ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチン
　レクチンは、特定の糖残基に対する親和性を有する、つまり特定の糖残基を認識してそこに結合するタンパク質であり、様々な生物に由来する多数の種類のレクチン（凝集素と呼ばれることもある）が知られている。レクチンの種類によって親和性を有する糖残基は様々であり、また多くのレクチンは、１種類の糖残基だけでなく複数の種類の糖残基と親和性を有する（ただし、特定の糖残基に対する親和性が強く、他の糖残基に対する親和性は弱い）。一般的に、抗ＧａｌＮＡｃ抗体のように、糖鎖中の特定の糖残基をエピトープとする抗体は作製しにくいのに対し、ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチンは、安価で大量に入手することができ、また安定性にも優れており長期間保存も可能であるため、ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子として好ましい。
　ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチンとしては様々なものが公知であり、また今後も新たな生物から単離される可能性もある。本発明では、ＧａｌＮＡｃ残基に対して十分に強い親和性を有している限り、つまり、そのレクチンが、他の糖残基に対する親和性を有さないものであるか、他の糖残基と親和性を有するが、他の糖残基に対する親和性がＧａｌＮＡｃ残基に対する親和性よりも十分に小さく（例えば、結合定数が数オーダー低く）、十分な精度でＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの定量を行うことができる限り、どのようなレクチンを用いてもよい。
　ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチン、好ましくはβ－ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチンの具体例としては、ノダフジレクチン（Westeria floribunda Agglutinin：ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（Soybean Agglutinin：ＳＢＡ）およびカラスノエンドウレクチン（Vicia Villosa Lectin：ＶＶＬ）を挙げることができる。これらのレクチンは、それぞれが由来する生物体、例えば種子から分離（抽出）して精製することもできるし、商品としても市販されているものを入手することもできる。
　ＷＦＡは、ＷＦＬ（Westeria floribunda Lectin）と表記されることもある、ノダフジに由来するレクチン（凝集素）である。ＷＦＡは、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃ）、すなわちα－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン残基（α－ＧａｌＮＡｃ）およびβ－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン残基（β－ＧａｌＮＡｃ）の両方に親和性を有し、例えば糖鎖の非還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ(α１→６)Ｇａｌ残基、ＧａｌＮＡｃ(α１→３)Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ残基、ＧａｌＮＡｃ(β１→４)Ｇａｌ残基、およびＧａｌＮＡｃ(β１→４)ＧｌｃＮＡｃ残基、ならびに糖鎖の還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（セリンまたはスレオニン）などに結合することができる。また、ＷＦＡは、ラクトースおよびガラクトースに対しても比較的弱い親和性を有する。
　ＳＢＡは、ダイズに由来するレクチン（凝集素）である。ＳＢＡも、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃ）、すなわちα－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン残基（α－ＧａｌＮＡｃ）およびβ－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン残基（β－ＧａｌＮＡｃ）の両方に親和性を有するが、前者に対する親和性の方が後者に対する親和性よりもやや強く、例えば糖鎖の非還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ(α１→３)Ｇａｌ残基、ＧａｌＮＡｃ(β１→４)Ｇａｌ残基、およびＧａｌＮＡｃ(β１→４)ＧｌｃＮＡｃ残基に結合することができる。また、ＳＢＡは、ガラクトースに対しても比較的弱い親和性も有する。
　ＶＶＬは、ＶＶＡ（Vicia villosa Agglutinin）と表記されることもある、ヘアリーベッチに由来するレクチン（凝集素）である。ＶＶＬも、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃ）、すなわちα－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン残基（α－ＧａｌＮＡｃ）およびβ－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン残基（β－ＧａｌＮＡｃ）の両方に対する親和性を有し、例えば糖鎖の非還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ(α１→３)Ｇａｌ残基、ＧａｌＮＡｃ(β１→４)Ｇａｌ残基、およびＧａｌＮＡｃ(β１→４)ＧｌｃＮＡｃ残基に結合することができる。
　・ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの定量方法の実施形態
　ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子をＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡに結合させる工程を含む、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの定量方法の代表的な実施形態（第１実施形態）としては、ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子と共に、これとは別のＰＳＡに特異的に結合する分子をＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡに結合させ、これら３分子からなるサンドイッチ型複合体を形成させることを含む方法が挙げられる。このサンドイッチ型複合体の具体例としては、支持体に担持された（固相化された）ＰＳＡタンパク質をエピトープとする抗ＰＳＡ抗体と、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡと、蛍光標識されたＧａｌＮＡｃ親和性レクチンまたは抗ＧａｌＮＡｃ抗体とからなるサンドイッチ型複合体が挙げられる。
　「抗ＰＳＡ抗体」は、一般的な手法により作製することも可能であり、市販されているものを購入することも可能である。測定の安定性からポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体を用いることが好ましい。また、糖鎖中の特定の糖残基（本発明においてはＧａｌＮＡｃ）を蛍光標識レクチンが認識して結合することを妨げないよう、ＰＳＡの糖鎖ではなくタンパク質の部分をエピトープとする抗体が好ましい。そのようなＰＳＡタンパク質をエピトープとする抗ＰＳＡモノクローナル抗体としては、例えば、ＰＳ２、ＰＳ３、ＰＳ４、ＰＳ５、ＰＳ６、ＰＳ１５、２Ｈ９、３Ｂ４、５Ａ６、５Ｇ６、８Ｇ４、９Ａ８、９Ｇ２、ＰＳ１、８Ａ６、２Ｈ９、１Ｈ１２、Ｎｏ．７９などのクローンが公知であり、市販もされている。抗ＧａｌＮＡｃ抗体、好ましくは抗β－ＧａｌＮＡｃ抗体も同様にして作製することができ、例えば、１００－２Ｈ５－Ａ、１１４－２Ｈ１２－Ｃ、２５９－２Ａ１、２７３－３Ｆ２、９９－２Ａ５－Ｂ、ＳＭＬＤＮ１．１などのクローンが公知である。
　蛍光標識されたＧａｌＮＡｃ親和性レクチンは、前述したようなＧａｌＮＡｃ親和性レクチンに一般的な手法を用いて所望の蛍光物質を結合させることにより作製することができ、その際には市販されている蛍光物質ラベリングキットなどを用いることもできる。蛍光物質は特に限定されるものではなく、ＳＰＦＳによって適切な蛍光を発することのできる蛍光色素などを用いることができる。蛍光標識された抗ＧａｌＮＡｃ抗体も同様にして作製することができる。
　上記のようなＧａｌＮＡｃ残基親和性分子を含むサンドイッチ型複合体の形成量、すなわち検体中のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの含有量を定量するための方法としては、測定対象を高感度かつ高精度で定量することができる方法として知られている、ＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）が好適である。ＳＰＦＳによって測定される、サンドイッチ型複合体に含まれる蛍光物質から発せられる蛍光強度に基づいて、検体中のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡを定量することができる。
　ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子をＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡに結合させる工程を含む、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの定量方法の別の実施形態（第２実施形態）としては、ＧａｌＮＡｃ残基に対して親和性を有するレクチンが結合した担体を充填したカラム（レクチンアフィニティーカラム）を利用する方法が挙げられる。すなわち、上記レクチンアフィニティーカラムに検体をアプライしてＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡをそのレクチンに結合させ、次いでハプテン糖を含有する溶出用緩衝液をアプライしてＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡを解離させ、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡを含有する画分を回収した後、その画分のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの含有量を免疫測定法によって測定することができる。第２実施形態において、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ含有画分中のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡを定量する際には、当該画分中のＰＳＡは実質的に全てＧａｌＮＡｃ残基を有するものになっているため、標識化されたＧａｌＮＡｃ残基親和性分子（レクチン）を用いる必要は無く、ＰＳＡタンパク質をエピトープとする標識化された抗ＰＳＡ抗体を用いることができる。例えば、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子／ＰＳＡ／アルカリフォスファターゼ標識抗ＰＳＡ抗体からなる免疫複合体を形成したのち、化学発光基質を添加して発光強度を測定する化学発光酵素免疫測定法や、固相化抗ＰＳＡ抗体／ＰＳＡ／蛍光標識抗ＰＳＡ抗体からなる免疫複合体を形成したのち、ＳＰＦＳにより蛍光強度を測定するＳＰＦＳ法により、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ含有画分中のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡを定量することができる。
　・ＳＰＦＳ測定法
　ＳＰＦＳは、誘電体部材の上面に形成された金属薄膜に裏面（誘電体部材と接触している側）から、全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で入射光を照射したときに、金属薄膜を透過して表面（測定領域が形成されている側）に生じるエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍～数百倍に増強されることを利用し、その増強されたエバネッセント波を励起光として、測定領域に捕捉された測定対象物を標識している蛍光物質から効率的に蛍光を発生させる方法である。その蛍光の強度を測定することによって検体中の測定対象物を定量することができ、各検体についての測定値を、濃度が既知の標準試料を用いて測定したときの蛍光の強度の測定値と対比することにより、検体中の測定対象物の含有量（濃度）に換算することができる。このようにして行われるＳＰＦＳは、ＥＬＩＳＡのような従来の蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、検体中の測定対象物の濃度が極めて低い場合の定量法として好適である。
　なお、本発明では、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの検体中の含有量（濃度）に基づいてグリーソンスコアを推定するが、ＳＰＦＳ等の定量方法によって所定の測定プロトコールに従って得られた「測定値」を、ｎｇ／ｍＬ、Ｕ（ユニット）／ｍＬ等の所定の単位で表される「濃度」に換算しないまま、分析に用いることも可能である。たとえば、ＳＰＦＳでは通常、蛍光強度の測定値を任意単位（arbitrary unit: a.u.）で表すが、同一条件下において各検体について測定された任意単位で表される測定値に基づいて当該単位の閾値を設定し、同一条件下で測定された検体の測定値からグリーソンスコアの推定を行うようにしてもよい。
　抗ＰＳＡ抗体／ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ／蛍光標識ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子からなるサンドイッチ型複合体を形成させたのち、その複合体（蛍光物質）から発せられる蛍光の強度をＳＰＦＳによって測定する際の一般的な実施形態を、図１に基づいて説明する。
　ＳＰＦＳを実施する際に行われる工程は、「測定前段階」の工程と「測定段階」の工程に大別することができる。測定前段階の工程は、抗ＰＳＡ抗体／ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ／蛍光標識ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子からなるサンドイッチ型複合体を形成するまでの段階の工程であって、典型的には、図１［Ａ］に示されているような、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１００を抗ＰＳＡ抗体６４に結合させて測定領域３８内に捕捉する工程（捕捉工程）、および図１［Ｂ］に示されているような、蛍光標識ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子８０をＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１００に結合させて蛍光標識化する工程（標識工程）などを含む。一方、測定段階の工程は、金属薄膜１４の裏面に入射光を照射し、測定領域３８に形成された所定のサンドイッチ型複合体から発生する蛍光の強度を測定する工程（測定工程）などを含む。
　ＳＰＦＳには、誘電体部材１２と、その上面に形成された金属薄膜１４と、その表面に形成された測定領域３８とを備えたプラズモン励起センサ１６ａが用いられる。測定領域３８は、所定のサンドイッチ型複合体を形成するための反応が行われる場であって、金属薄膜１４の表面に形成されたＳＡＭ６０と、そのＳＡＭ６０の表面に結合した支持体６２と、その支持体６２に結合（担持）された抗ＰＳＡ抗体６４とによって構成されることが好ましい。このようなプラズモン励起センサ１６ａは、捕捉工程に先だってあらかじめ作製しておくようにする。
　ＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer：自己組織化単分子膜）６０は、支持体６２を金属薄膜１４の表面側に連結させる足場を提供するとともに、蛍光物質８４が金属薄膜１４と接触することにより励起光が照射されても蛍光を発しなくなる、金属消光を防止するために形成される。ＳＡＭ６０は、金属薄膜１４と直接的または間接的に反応可能な官能基、および支持体６２を構成する分子と直接的または間接的に反応可能な官能基を、両末端に有するシランカップリング剤で形成することが好ましい。
　支持体６２は、測定領域３８内に抗ＰＳＡ抗体６４がより高密度で含まれるようにするために形成される。すなわち、ＳＡＭ６０に抗ＰＳＡ抗体６４を直接結合させる場合よりも、ＳＡＭ６０に支持体６２を結合させ、その支持体６２に抗ＰＳＡ抗体６４を結合させる場合の方が、支持体６２が高さ方向への空間的な広がりを持っているため、単位面積当たりの抗ＰＳＡ抗体６４の個数（つまり密度）を高めることができる。このような支持体６２としては、疎水結合が一因となっている非特異的吸着を抑制するとともに、抗ＰＳＡ抗体６４と反応可能な官能基を多数有する親水性高分子、例えばデキストランからなる主鎖にカルボキシル基が多数導入されたカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）が好ましい。
　例えば、シランカップリング剤である１０－カルボキシ－１－デカンチオールを含有する溶液を、金属薄膜１４の表面に接触させることにより、当該分子からなるＳＡＭ６０を形成することができる。続いて、１０－カルボキシ－１－デカンチオールから形成されたＳＡＭ６０に、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）および水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を反応させることにより、ＳＡＭ６０の表面側に配向しているカルボキシル基を活性エステル化した後、ＣＭＤを含有する溶液を接触させることで、ＣＭＤからなる支持体６２を固相化することができる。さらに、ＣＭＤにＮＨＳおよびＷＳＣを反応させ、ＣＭＤが有するカルボキシル基を活性エステル化した後、抗ＰＳＡ抗体６４を含有する溶液を接触させることで、ＣＭＤからなる支持体６２に多数の抗ＰＳＡ抗体６４を担持させることができる。
　捕捉工程では、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１００および非ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１１０を含有する検体を、流路３６に導入して測定領域３８に接触させるようにする。図１に示す実施形態においては、前述したようなレクチンアフィニティーカラムを用いた分画は事前に行われていないため、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１００とともに非ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１１０が検体中に含まれている。したがって、測定領域３８の抗ＰＳＡ抗体６４には、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１００だけでなく非ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１１０も結合して捕捉されることになる。
　標識工程では、蛍光標識ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０を含有する溶液を、流路３６に導入して測定領域３８に接触させるようにする。蛍光標識ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０は、測定領域３８に捕捉されているＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１０に結合して、所定のサンドイッチ型複合体が形成されるが、ＧａｌＮＡｃ残基を有さない非ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１１０には（非特異的吸着によるやむを得ない結合を除いて）結合しない。
　捕捉工程と標識工程の間、および標識工程の後には、流路３６に洗浄液（例えば界面活性剤を含有する緩衝液）を導入し、測定領域３８（支持体６２、抗ＰＳＡ抗体６４、ＳＡＭ６０など）に非特異的に吸着している、非ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ１１０や蛍光標識ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０を除去するようにすることが好ましい。測定工程では、流路３６を洗浄液または緩衝液で満たした状態で、蛍光の強度を測定することが好ましい。
　・ＳＰＦＳシステム
　続いて、上記のようなＳＰＦＳを行うために好適なＳＰＦＳシステムの一実施形態を、図２に基づいて説明する。
　ＳＰＦＳシステム１は、ＳＰＦＳ測定部材１６、ＳＰＦＳ測定装置１０、および制御演算装置４０によって構成されている。
　図２［Ａ］は、誘電体部材１２の上面１２ａに直接金属薄膜１４が形成されている実施形態を表しており、プラズモン励起センサ１６ａは、誘電体部材１２、金属薄膜１４および測定領域３８からなる。図２［Ｂ］は、誘電体部材１２と分離可能な透明平面基板１３の上面に金属薄膜１４が形成されている実施形態を表しており、プラズモン励起センサ１６ａは、透明平面基板１３、金属薄膜１４および測定領域３８からなる。
　ＳＰＦＳ測定部材１６はプラズモン励起センサ１６ａおよび流路部材１６ｂで構成されている。プラズモン励起センサ１６ａの上面の一部または全部、すなわち流路３６の底面の一部または全部において、支持体６２および抗ＰＳＡ抗体６４からなる層が形成されている領域が測定領域３８となる。測定領域３８の面積は通常、一般的にレーザー光として照射される入射光２２の照射面積と等しいかそれより広くなるよう調整され、たとえば、入射光２２のスポット径が１ｍｍφ程度であれば、測定領域３８は通常、少なくとも数ｍｍ四方の面積を有する。
　流路部材１６ｂは、プラズモン励起センサ１６ａの上部に、両末端に開口を有する流路３６を形成するための部材であり、流路部材１６ｂの上部に設けられる蛍光検出手段３２によって蛍光３２の強度の測定が正確に行えるよう、無色透明な素材、例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）で作製されている。流路部材１６ｂは、プラズモン励起センサ１６ａ（図２［Ａ］では誘電体部材１２、図２［Ｂ］では透明平面基板１３）と圧着されており、必要に応じて接着剤、マッチングオイル、透明粘着シートなどを用いて、隙間からの溶液の漏出を防止するようにしてもよい。また、流路部材１６ｂは、側壁部（スペーサー）と天板部とを組みあわせることによって構成されていてもよい。この場合、側壁部としては、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製で、流路となる貫通穴を中央部に有するシート状の部材を用いることができる。天板部としては、例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）製の無色透明で、側壁部の貫通穴（流路）の両端に相当する位置に２つの貫通穴を有するプレート状の部材を用いることができる。
　このような「流路型」のＳＰＦＳ測定部材１６では、検体、蛍光標識ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０の溶液、洗浄液等の各種の溶液は、送液手段（図示せず）によって、両端に設けられている開口から流路３６に導入され、往復送液または循環送液される。
　なお、溶液を往復送液または循環送液する必要がない場合、ＳＰＦＳ測定部材１６は溶液を貯留する「ウェル型」とすることができる。その場合、流路部材１６ｂの代わりに、プラズモン励起センサ１６ａの上面に流路よりも容積の大きいウェルを形成することのできる、ウェル部材を用いればよい。ウェルの上部は開放されていてよく、たとえばピペット状の器具を用いることにより、各種の液体をウェルに添加し、除去することができる。
　ＳＰＦＳ測定装置１０は、基本的に、測定部材装填部１８、照射手段２０、受光手段２６および蛍光検出手段３２を備え、必要に応じてさらに、送液手段（図示せず）を備えていてもよい。
　測定部材装填部（ステージ）１８には、ＳＰＦＳ測定部材１６が着脱可能になっている。図２［Ａ］に示すような、誘電体部材１２を含むプラズモン励起センサ１６ａの使用が想定される場合、測定部材装填部１８はプリズム形状の誘電体部材１２を設置できるようになっている。図２［Ｂ］に示すような、透明平面基板１３を含むプラズモン励起センサ１６ａの使用が想定される場合、測定部材装填部１８にはあらかじめプリズム形状の誘電体部材１２が設置されており、その上面１２ａに透明平面基板１３を密着して載置できるようになっている。
　送液手段（図示せず）は、例えば、移動手段を備えたピペット状の器具によって構成することができる。試料、試薬等の各種の溶液の収容部（図示せず）においてそれらの溶液を吸引した後、流路型のＳＰＦＳ測定部材１６の流路３６の末端に設けられている開口において吸引されていた溶液を吐出することで、その溶液を流路３６に導入することができる。必要に応じて、その場で吸引および吐出を繰り返すことにより、溶液を流路３６内で往復送液させ、測定領域３８における反応を促進させることができる。ＳＰＦＳ測定部材１６がウェル型の場合は、そのウェル内に吸引されていた溶液を吐出すればよい。また、ＳＰＦＳ測定部材１６が流路型の場合は、送液手段は、外部流路およびポンプによって構成することもできる。外部流路は、ＳＰＦＳ測定部材１６の流路３６の両末端に設けられた開口とポンプとを連通させる部材である。ポンプは、この外部流路を介して、試料、試薬等の各種の溶液を流路３６に導入し、往復送液または循環送液させることができる。
　照射手段２０は、光源および光源可動手段を備え、必要に応じてさらに、光源と誘電体部材１２との間に偏光フィルタおよび減光フィルタを備えていてもよい。光源は、蛍光標識レクチン８０が有する蛍光物質８４を励起させるのに適した波長および強度を有する入射光２２を照射するものであり、一般的にはレーザーダイオードである（つまり入射光２２はレーザー光である）。光源可動手段は、入射光２２が誘電体部材１２の入射側面１２ｂから金属薄膜１４の裏面に、所定の入射角α１で照射されるよう、光源を移動させる。偏光フィルタは、光源から照射される入射光２２を、金属薄膜１４が表面プラズモン共鳴を効率的に発生させることができるＰ偏光にするために用いられる。減光フィルタは、蛍光検出手段３２が適切な強度の信号値を取得できるよう、光源から照射される入射光２２の強度（フォトン量）を調整するために用いられる。
　受光手段２６は、受光器および受光器可動手段を備える。受光器は、入射光２２が金属薄膜１４の裏面で反射された光である、反射光２４を受光し、その強度を測定することができる。受光器可動手段は、光源可動手段による入射光２２の入射角α１の変化と同期して、反射角が変化した反射光２４を確実に受光できるよう、受光器を移動させることができる。入射光２２の強度に対する反射光２４の強度の比率、すなわち反射率が最も低いときに、表面プラズモン共鳴による電場増強効果が最も高くなり、そのような入射角α１において蛍光３２の強度を測定する測定工程を行うことが好ましい。
　蛍光検出手段３２は、検出器、集光レンズおよびフィルタを備える。検出器は、プラズモン励起センサ１６ａの表面から発せられる、すなわち測定領域３８に捕捉された蛍光標識レクチン８０が有する蛍光物質８４から発せられる蛍光３０を受光し、その強度を測定するためのものであり、例えば光電子倍増管（ＰＭＴ）を用いることができる。集光レンズは、蛍光３０を検出器に集中させてその強度を正確に測定できるようにするためのものであり、例えば顕微鏡と同様の対物レンズを用いることができる。フィルタは、蛍光３０を含む所定の範囲の波長の光のみを透過させて検出器に到達させるためのものであり、その範囲を外れる波長を有する、散乱光等のノイズとなる光を除去することができる。
　なお、ＳＰＦＳ測定部材１６（プラズモン励起センサ１６ａ）、照射手段２０および受光手段２６からなる構成は、ＳＰＲ測定部２８と称されることがある。ＳＰＲ測定部２８は、蛍光３０を測定するのではなく、測定領域３８に目的物質が捕捉されることで反射光２４の強度が減衰することによって目的物質を定量する、ＳＰＲ法（表面プラズモン共鳴法）のための装置と基本的に共通する構成を有するためである。一方で、ＳＰＦＳ測定部材１６（プラズモン励起センサ１６ａ）、照射手段２０および蛍光検出手段３２からなる構成は、ＳＰＦＳ測定部３４と称されることがある。
　制御演算装置４０は、照射手段２０、受光手段２６、蛍光検出手段３２、および必要に応じて備えられる送液手段（図示せず）と接続されており、各手段が備える部材の動作を制御することができるとともに、各手段で測定された情報を記録ないし記憶し演算することができるよう、信号が送受信される。制御演算装置４０は、所定の制御演算用のプログラムおよび情報を記憶することのできる、パーソナルコンピュータを用いて構成することができる。
　制御演算装置４０は、たとえば、送液手段が所定の手順で、所定の量の試料や試薬等の溶液を送液し、測定領域３８に所定の複合体を形成させた後、照射手段２０が所定のタイミングおよび入射角で入射光２２を照射し、蛍光検出手段３２が測定領域３８で発生する蛍光３０の強度を測定するよう、プログラムに従って自動的にそれらの各手段を作動させることができる。また、制御演算装置４０は、検体ごとに測定される蛍光３０の強度のデータを蛍光検出手段３２から受信して記憶し、好ましくは直ちに、その測定値をあらかじめ記憶させておいた所定の閾値と対比して、グリーソンスコアの推定結果をさらに記憶するようにしてもよい。
　［推定方法］
　測定された検体中のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの含有量（濃度）から、グリーソンスコアが７以上であると判定するための閾値、およびグリーソンスコアが６以下であると推定するための閾値はそれぞれ、他の診断マーカーまたは腫瘍マーカーについての閾値に準じた一般的な手法によって設定することができる。
　たとえば、前立腺癌と確定診断され、グリーソンスコアも検査されている複数の患者に由来する検体について、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの濃度を測定したときに、測定値がある濃度以上の集団において実際のグリーソンスコアが７以上である検体が所望の割合以上を占めるようになる濃度を求めることができ、この濃度をグリーソンスコアが７以上であると推定するための閾値とすることができる。前記「所望の比率」が、グリーソンスコアが７以上であるとの推定に関する信頼性、即ち、推定が正しい確率に相当する。測定データの母集団であるサンプル数を多くするほど、信頼性の高い閾値を設定することが可能となる。ある検体中のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの含有量（濃度）の測定値を、そのようにして設定された閾値と比較し、測定値が閾値よりも大きければその検体を採取した前立腺癌患者はグリーソンスコアが７以上であると、所定の確率でもって推定することができる。グリーソンスコアが７以上であるという推定をなるべく高い精度で行うことができる閾値を設定し、測定値の濃度が閾値よりも大きいことをもって、侵襲性の高い針生検を行うことなく、グリーソンスコアが７以上であると推定（診断）することができるようになることが望ましい。
　上記と同様にして、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの濃度を測定したときに、測定値がある濃度以下の集団において実際のグリーソンスコアが６以下である検体が所望の割合以上を占めるようになる濃度を求めることができ、この濃度をグリーソンスコアが６以下であると推定するための閾値とすることができる。グリーソンスコアが７以上と推定するための閾値と、６以下であると推定するための閾値は、異なる値となる可能性が高い。
　以上のような、ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡのように特定の糖残基を含む糖鎖を有する糖タンパク質の定量方法、特にＳＰＦＳ法に基づく定量方法や、そのような含有量を所定の閾値を比較して診断等に用いることのできる特定の情報を得る方法に関して、本明細書に記載されている事項以外の一般的な事項や実施形態のバリエーションについては、例えば、国際公開２０１０／０９０２６４号公報（特許文献４）、特開２０１３－０７６６６６号公報（特許文献５）などを参照することができる。
　（１）ＳＰＦＳ測定装置の構築
　図２［Ｂ］に示す実施形態に準じたＳＰＦＳ測定装置を自作し、以下の実施例に使用した。照射手段２０の光源としては、波長６３５ｎｍの光を照射することができるレーザーダイオード（ＬＤ）を用い、光源と誘電体部材１２との間には、減光フィルタ（中性濃度フィルタ）を設けてフォトン量を調整できるようにした。誘電体部材１２としては、６０度のプリズム（シグマ光機(株)）を用いた。この誘電体部材１２の上面１２ａに、次に述べるようにして作製した、透明平面基板１３を含むプラズモン励起センサ１６ａと流路部材１６ｂとからなる部材（センサーチップ）を固定することによって、測定部材１６を構成した。蛍光検出手段３２の光検出器としては、光電子倍増管（ＰＭＴ）を用い、集光レンズとして対物レンズを設けた。
　（２）流路型ＳＰＦＳ測定部材の作製
　屈折率１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（(株)オハラ「Ｓ－ＬＡＬ　１０」）をプラズマ洗浄し、この基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法によって形成した。その後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法によって形成した。クロム薄膜の厚さは１～３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４～５２ｎｍであった。
　このようにして金薄膜が形成された基板を、１０－カルボキシ－１－デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の表面に当該分子からなるＳＡＭを形成した。基板をこの溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンを用いて乾燥した。
　この基板に、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．５ｍＭ、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）０．５ｍＭおよびカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）（名糖産業(株)「ＣＭＤ－５００－０６Ｉ４」，平均分子量５０万，置換度０．５１）１ｍｇ／ｍＬを含む２５ｍＭのＭＥＳ緩衝生理食塩水と、１０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）とを、それぞれ０．８ｍＬずつ滴下し、２０分間反応させてＳＡＭにＣＭＤを結合させることで、プラズモン励起センサの表面にＣＭＤ膜を形成した。
　ＣＭＤ膜が形成されたプラズモン励起センサ上に、幅２ｍｍ、長さ１４ｍｍの貫通穴を有する、厚さ０．５ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のスペーサーを積載した。さらにその上に、スペーサーの貫通穴の両端に対応する位置に貫通穴を有する、厚さ２ｍｍのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の天板を積載した。プラズモン励起センサ、スペーサーおよび天板を圧着し、ビスで固定することで、天板の貫通穴を通じて試料、試薬等を送液することのできるスペーサーの貫通穴からなる流路を備えた、流路型ＳＰＦＳ測定部材を作製した。
　（３）抗体固相化基板の調製
　［調製例１］抗ＰＳＡモノクローナル抗体固相化基板
　上記のように作製した流路型ＳＰＦＳ測定部材に外部流路およびペリスタポンプを接続し、超純水を１０分間、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２０分間、室温（２５℃）、流量５００μＬ／分の条件で循環送液させ、プラズモン励起センサの表面を平衡化した。
　続いて、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５ｍＬを、２０分間循環送液した後、抗ＰＳＡモノクローナル抗体溶液２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＣＭＤに当該抗体を結合させ、抗ＰＳＡモノクローナル抗体固相化ＣＭＤ膜（測定領域）を調製した。
　その後、１重量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３０分間循環送液することによって、流路内の非特異吸着防止処理を行った。
　（４）蛍光標識レクチンの作製
　［作製例１］Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ
　標記の蛍光標識レクチンを、蛍光物質ラベリングキット「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ タンパク質ラベリングキット」（インビトロジェン社）を利用して作製した。ＷＦＡ（ＶＥＣＴＯＲ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社「Ｌ－１３５０」）１００μｇ相当と、上記キットに含まれる０．１Ｍ重炭酸ナトリウムと、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄｙｅとを混合し、室温で１時間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を行い、標識に利用されなかったＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｄｙｅを取り除いて、蛍光標識ＷＦＡレクチンを得た。その後、吸光度を測定して標記の蛍光標識レクチンの濃度を定量した。
　［作製例２］Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＳＢＡ
　ＷＦＡの代わりにＳＢＡ（ＶＥＣＴＯＲ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社「Ｌ-１０１０」）を用いたこと以外は作製例１と同様にして、標記の蛍光標識ＳＢＡを作製し、その濃度を定量した。
　［作製例３］Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＶＶＬ
　ＷＦＡの代わりにＶＶＬ（ＶＥＣＴＯＲ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社「Ｌ-１２３０」）を用いたこと以外は作製例１と同様にして、標記の蛍光標識ＳＢＡを作製し、その濃度を定量した。
　（５）血清検体中のＮ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有する前立腺特異抗原（ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ）の定量
　［実施例１］Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡを用いたＳＰＦＳ測定
　表１に示す各被験試料に含まれるＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡを、抗ＰＳＡモノクローナル抗体固相化基板を備えた流路型ＳＰＦＳ測定部材（調製例１）および蛍光標識ＷＦＡ（作製例１）を用いて、ＳＰＦＳにより定量した。詳しくは以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　被験試料（血清）２０μＬに希釈溶液１００μＬを添加し、チューブ内でよく撹拌して混合液を調製した。この混合液１００μＬを流路に循環送液し、測定領域と６０分間反応させた。その後、「Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０」を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ－Ｔ）を送液して、３分間洗浄した。続いて、作製例１で得られたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ溶液（ＷＦＡ濃度：１０μｇ／ｍＬ）１００μＬを流路に循環送液し、測定領域と１０分間反応させた。その後再び、ＴＢＳ－Ｔを送液して、５分間洗浄した。そして、ＴＢＳ－Ｔで流路を満たした状態で励起光を照射し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度（シグナル）をＳＰＦＳにより測定した。
　各被験試料の蛍光強度の測定値と、濃度が既知の調製試料を用いて作成した検量線に基づいて、各被験試料のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの濃度（分画量）を算出した。結果を図３に示す。前立腺癌患者に由来する被験試料のうち、グリーソンスコア（ＧＳ）が７以上の群と６未満の群との間には統計学的に有意な差（Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、Ｐ=０．０００３１）があることが明らかとなった。
　上記の結果に基づいて設定した、グリーソンスコアが７以上であること、およびグリーソンスコアが６以下であることについての、被験試料中のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの濃度に関するカットオフ値と的中率（予測性能）を、それぞれ表２および表３にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　［実施例２］Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＳＢＡを用いたＳＰＦＳ測定
　表１に示した被験試料から、グリーソンスコアが７以上の前立腺癌患者由来の４検体およびグリーソンスコアが６未満の前立腺癌患者由来の４検体の合計８検体をランダムに選択して測定の対象とし、またＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ溶液（ＷＦＡ濃度：１０μｇ／ｍＬ）の代わりに、作製例２で得られたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＳＢＡ（ＳＢＡ濃度：１０μｇ／ｍＬ）を用い、それ以外は実施例１と同様にして、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度（シグナル）をＳＰＦＳにより測定し、各被験試料のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの濃度（分画量）を算出した。
　結果を図４に示す。レクチンとしてＳＢＡを用いた場合も、ＷＦＡを用いた場合と同様の傾向を示すことが確認された（Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、Ｐ＝０．００４２８）。
　［実施例３］Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＶＶＬを用いたＳＰＦＳ測定
　表１に示した被験試料のうち、グリーソンスコアが７以上の前立腺癌患者由来の４検体およびグリーソンスコアが６未満の前立腺癌患者由来の４検体の合計８検体をランダムに選択して測定の対象とし、またＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ溶液（ＷＦＡ濃度：１０μｇ／ｍＬ）の代わりに、作製例３で得られたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＶＶＬ（ＳＢＡ濃度：１０μｇ／ｍＬ）を用い、それ以外は実施例１と同様にして、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度（シグナル）をＳＰＦＳにより測定し、各被験試料のＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡの濃度（分画量）を算出した。
　結果を図５に示す。レクチンとしてＶＶＬを用いた場合も、ＷＦＡを用いた場合と同様の傾向を示すことが確認された（Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、Ｐ＝０．００１４１）。
１　　　　　　ＳＰＦＳシステム
１０　　　　　ＳＰＦＳ測定装置
１２　　　　　誘電体部材
　１２ａ　　　上面
　１２ｂ　　　入射側面
　１２ｃ　　　反射側面
１３　　　　　透明平面基板
１４　　　　　金属薄膜
１６　　　　　ＳＰＦＳ測定部材（流路型）
　１６ａ　　　プラズモン励起センサ
　１６ｂ　　　流路部材
１８　　　　　測定部材装填部
２０　　　　　照射手段
２２　　　　　入射光
２４　　　　　反射光
２６　　　　　受光手段
２８　　　　　ＳＰＲ測定部
３０　　　　　蛍光
３２　　　　　蛍光検出手段
３４　　　　　ＳＰＦＳ測定部
３６　　　　　流路
３８　　　　　測定領域
４０　　　　　制御演算手段
６０　　　　　ＳＡＭ
６２　　　　　支持体
６４　　　　　抗ＰＳＡ抗体
８０　　　　　蛍光標識ＧａｌＮＡｃ親和性分子
８２　　　　　ＧａｌＮＡｃ親和性分子
８４　　　　　蛍光物質
１００　　　　ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ
１０２　　　　ＰＳＡタンパク質
１０４　　　　非還元末端にＧａｌＮＡｃを有する糖鎖
　１０４ａ　　ＧａｌＮＡｃ
１１０　　　　非ＧａｌＮＡｃ－ＰＳＡ
１１４　　　　非還元末端にＧａｌＮＡｃを有さない糖鎖

Claims (4)

  1. 　前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコアを推定する方法であって、
    　検体中の、Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（Prostate Specific Antigen：前立腺特異抗原）の含有量を測定し、その測定値が閾値よりも大きいことをもってグリーソンスコアが７以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってグリーソンスコアが６以下であると推定する、グリーソンスコアの推定方法。
  2. 　前記ＰＳＡの定量を、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子を前記ＰＳＡに結合させる工程を含む方法によって行う、請求項１に記載のグリーソンスコアの推定方法。
  3. 　前記β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子が、ノダフジレクチン（Westeria floribunda Lectin：ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（Soybean Agglutinin：ＳＢＡ）またはカラスノエンドウレクチン（Vicia Villosa Lectin：ＶＶＬ）、あるいは抗β－Ｎ－アセチルガラクトサミン抗体である、請求項２に記載のグリーソンスコアの推定方法。
  4. 　前記ＰＳＡの定量を表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いて行う、請求項１～３のいずれか一項に記載のグリーソンスコアの推定方法。
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