CN108802374A - 基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术 - Google Patents
基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108802374A CN108802374A CN201810657985.3A CN201810657985A CN108802374A CN 108802374 A CN108802374 A CN 108802374A CN 201810657985 A CN201810657985 A CN 201810657985A CN 108802374 A CN108802374 A CN 108802374A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- added
- excretion body
- supernatant
- nucleic acid
- bipyridine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
Abstract
本发明公开了基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，步骤包括：样品前处理和外泌体标准品的分离；链霉亲和素磁珠的活化及与生物素抗体活化；免疫磁珠与外泌体结合；外泌体核酸样品制备；电化学发光检测目的核酸序列；本发明的优点有：能对尿液、血清、唾液、细胞培养液等生物样品中的外泌体进行分离和分析；采用生物素与链霉亲和素特异性结合将抗体修饰到磁珠表面，体系稳定，避免了非特异性的干扰；体系可控，通过改变抗体类型分离纯化不同亚型的外泌体，可用于核酸表达谱研究和外泌体分型研究；终浓度可控，磁富集后再稀释或再释放获得所需浓度，便于后续检测；分离速度快，对仪器要求简单，可以同时处理多个样品。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种外泌体分离及核酸检测技术。
背景技术
外泌体含有多种核酸成分(包括dsDNA、ssDNA、mRNA、microRNA、circRNA等)可以作为有效的生物标志物应用于疾病诊断。然而外泌体在体液中的含量较低，传统方法无法直接检出。经典的超速离心分离法耗时费力，依赖于超高速离心机等大型精密设备，且难以去除相同尺度的蛋白聚合物以及其它结构。尽管，基于PEG聚沉法的外泌体快速分离试剂盒已经面市，但是，PEG同时可以聚沉病毒颗粒和大分子蛋白，其在分离外泌体中的应用备受质疑。分离纯化技术的短缺为外泌体的临床应用带来了极大挑战。因此，发展快速、高效、性能可靠的外泌体分离纯化方法对于外泌体的研究和应用具有重要意义。
传统上，外泌体核酸的检测主要通过核酸芯片和PCR技术。这些技术要么设备笨重且昂贵，要么样品处理过程复杂，并不利于临床使用和进一步普及。核酸电化学检测技术是新型的核酸检测手段，广泛运用于免疫诊断、病原微生物筛查及环境监控等领域。得益于电化学发光原理的优越性，该方法具有较宽的检测范围、高灵敏度、反应体系可控及高信噪比等特点。然而，电化学发光技术依然无法直接应用于体液外泌体核酸的检测，具体原因有：(1)生物体液成分相对复杂，游离核酸等可能会对检测造成干扰；(2)临床上可获得的生物体液有限且外泌体含量较低，裂解后目的核酸序列的浓度难以达到检测范围。综上所述，研发新型基于体液外泌体核酸的检测方法具有重要的临床意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术。
通过研究发现，免疫磁珠，如CD63抗体修饰的链霉亲和素磁珠，能够快速、高效、特异性分离纯化外泌体，经过磁富集可以将外泌体浓缩到较高的浓度范围，从而提高后续检测的灵敏度。本发明中构建基于磁富集的电化学发光检测技术，可以进一步提高灵敏度和检测效率。
为了达到上述目的本发明采用如下步骤：
基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，包括如下步骤：
步骤一：样品收集：包括动物或人细胞培养液收集、动物或人血液样品收集、动物或人尿液样品收集、动物或人唾液样品收集；
步骤二：外泌体标准品的分离
1)样品的前处理；
2)超速离心分离外泌体标准品；
步骤三：免疫磁珠的合成：
(1)把链霉亲和素磁珠进行活化：
1)制备反应液Ⅰ分装备用；
2)将链霉亲和素磁珠母液混匀后，磁分离去除保护试剂，往EP管加入PBS混匀；
3)将EP管置于磁分离架，静置，将液体去除保留链霉亲和素磁珠；
4)重复一次步骤2-3，去除链霉亲和素磁珠的保护试剂，并将链霉亲和素磁珠溶解于1ml反应液Ⅰ获得活化的链霉亲和素磁珠。
(2)链霉亲和素磁珠与抗体结合：
1)制备反应液Ⅱ；
2)将反应液Ⅱ、活化后的链霉亲和素磁珠混合物、10ul生物素标记的抗体混合，将混合液置于恒温摇床反应；
3)将混合液置于磁分离架，静置；
4)去除上清，保留与抗体结合的链霉亲和素磁珠即免疫磁珠备用；
步骤四：免疫磁珠与外泌体结合即捕获与富集外泌体：
1)将样品与免疫磁珠混合；
2)孵育：室温摇床放置10-30min；
3)将孵育好的样品置于磁分离架，静置，去除液体保留磁珠；
4)将3)中获得的磁珠用PBS洗涤2-3次，去除样品残留，吹打过程要轻柔，避免外泌体脱落；
5)磁分离获得纯化的磁珠外泌体复合物；
步骤五：外泌体核酸样品制备，根据不同获取对象，有以下三种不同的方法：
A.外泌体DNA的分离
1)在制得的磁珠外泌体复合物即吸附外泌体中加入extractionbuffer 500μl以裂解外泌体，混匀于37℃水溶1h；
2)置于磁分离架，液体转移到EP管A，去除磁珠；
3)每管加入蛋白酶K，颠倒混匀，37℃放置3小时；取溶液下层；
4)每管加入饱和酚，缓慢摇晃，离心；
5)取上清，每管加入饱和酚和氯仿－异戊醇，摇匀，离心；
6)取上清，每管加入氯仿－异戊醇，摇匀，离心；
7)取上清，每管加NaAc，适量预冷的无水乙醇至满，摇匀放入-20℃保存2h以上；
8)离心，去上清，加入70％乙醇，离心5min，去上清，干燥；
9)加入灭菌去离子水，转弹，混匀；
B.外泌体总RNA的分离
1)将磁珠外泌体复合物加入1体积的trizol，吹打混匀至液体浑浊；
2)置于磁分离架静置，将上清转移到EP管B1；
3)加1/5体积的氯仿颠倒混匀，室温静置；
4)4℃离心，将上层液相转移到EP管B2中，不要吸出蛋白；
9)加入1/2体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置；
10)4℃离心，白色胶状沉淀为RNA；
11)弃上清，用1体积质量分数为75％乙醇洗涤沉淀；
12)离心，弃上清，室温干燥，DEPC水重悬；
C.总核酸的分离
往磁珠外泌体复合物加入细胞裂解液，振荡混匀，离心取上清；
步骤六：电化学发光检测目的核酸序列：
(1)三联吡啶钌的合成：
1)电子天平称取：二氯二联吡啶Ru(bpy)2Cl2，NaHCO3，2,2’－联吡啶－4，4’二羧酸dcbpy，于50ml圆底烧瓶中；
2)加入甲醇，混合液在硅油浴80℃下回流加热10h；
3)所得溶液在冰浴中冷却2h；
4)同时将pH值调到4.4；
5)形成的沉淀用滤纸过滤，再用纯MeOH少量多次洗涤沉淀；
6)所得滤液中加入3.125ml NaPF6溶液，搅拌后置于低温环境中挥发滤液，观察晶体产生；期间可反复加入纯MeOH，使其重结晶，收集所得结晶即为紫红色的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2；
(2)三联吡啶钌的活化：
1)电子天平称取：
二环乙基碳二亚胺，N－羟基琥珀酰亚胺；
2)搅拌条件下溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后冰浴冷却；
3)加入上述合成的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2，混合物冰浴搅拌混匀；
4)室温下密封振荡，静置；
5)所得沉淀通过吸滤装置除去，滤液中含有活性的钌配合物即活化后的三联吡啶钌，可用于标记DNA、蛋白或抗体；
(3)DNA探针标记三联吡啶钌：
该反应体系中，活化后的三联吡啶钌、DNA探针及EDC按照比例混匀，调整pH值至6呈弱酸性；用锡箔纸避光孵育；最后，用超滤管离心除去小分子化合物；并用纯水低温保存；
(4)聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的制备：
1)取聚赖氨酸固体粉末于离心管中离心，使粘在管壁上的聚赖氨酸固体粉末落入管底；
2)轻轻的打开管盖，并迅速加入75μL 0.1M硼酸钠，立即盖上管盖；
3)上下振荡以充分混匀，离心收集；
4)加入DNA探针标记的三联吡啶钌；
5)离心管外缠上黑胶布，置离心管架上避光孵育；
6)用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
7)离心；
8)倒去橙色上清液，加入预冷无水乙醇洗涤，放入超低温冰箱中,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
9)离心；
10)倒去浅黄色上清液，加入1ml预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
11)离心，12000rpm，4℃，20min；
12)倒去上清液，加入1ml预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
13)离心，得到聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物，作为电化学发光探针；
14)加水稀释，放入冰箱保存；
(5)磁捕捉检测目标DNA序列：
构建一种以聚赖氨酸-三联吡啶钌为信号放大基团的核酸检测方法:
1)取生物素探针、靶序列即外泌体核酸样品分别溶解于水中；
2)构建磁捕捉核酸检测体系：把生物素探针溶液、靶序列溶液、聚赖氨酸三联吡啶钌复合物、链霉亲和素磁珠、浓度为1X的PBS缓冲液混合，加水补充至目标体积；
3)信号检测：将步骤2)构建的磁捕捉核酸检测体系放入罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并记录数据。
进一步地，所述动物或人细胞培养液收集详细操作：
细胞培养液为DMEM，添加体积分数为10％小牛血清(FCS)，细胞用胰蛋白酶消化，转至细胞培养皿，在37℃、5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24h，使细胞汇合50％-60％，然后换用无血清DMEM培养液培养24-48h，回收该无血清DMEM细胞培养液，短期内4℃保存，长期放-80℃保存；
所述动物或人血液样品收集的操作过程：
动物或人静脉抽血，加入抗凝剂，离心去除血液中的细胞成分，得到血浆；或待血液凝固后取血清亦可，得到的血样样品-80℃保存或立即使用；
所述动物或人尿液样品收集的操作过程：
把动物或人的尿液收集到集尿器，得到尿液样品，尽量避免外界对尿液样品的污染，立即使用或存于-80℃备用。
进一步地，所述外泌体标准品的分离过程：
1)样品的前处理
血液样品需先用PBS稀释20倍，经1000g低速离心10min去除较大的细胞碎片，然后用0.22nm滤膜过滤去除细胞大囊泡；尿液及细胞培养液经1000g低速离心10min去除较大的细胞碎片，然后用0.22nm滤膜过滤去除细胞大囊泡；
2)超速离心分离外泌体标准品
经处理后的样品分装到离心管，配平后，100000g离心70分钟，小心去除上清，沉淀用PBS缓冲液重悬，再次配平后100000g离心90分钟，回收沉淀即为外泌体标准品，用适量PBS重悬，存于-80℃。
进一步地，所述链霉亲和素磁珠的活化过程如下：
1)电子天平称取：0.292gEDTA，29.22gNaCl，2.423gTRIS于1L烧杯中；
2)加入水定容到800ml，在磁力搅拌器下搅拌混匀；
3)所得溶液转移到1L容量瓶中用水定容到1L；
4)然后用1mol/L的HCl将pH值调到7.5；
5)得到的溶液用滤纸过滤，获得反应液Ⅰ分装备用；
6)将链霉亲和素磁珠母液混匀后取500ug置于1.5mlEP管，磁分离去除保护试剂，往EP管加入1mlPBS混匀；
7)将EP管置于磁分离架，静置30秒，将液体去除保留链霉亲和素磁珠；
8)重复一次步骤6-7，去除链霉亲和素磁珠的保护试剂，并将链霉亲和素磁珠溶解于1ml反应液Ⅰ获得活化的链霉亲和素磁珠。
进一步地，所述把链霉亲和素磁珠与抗体结合的操作过程：
1)制备反应液Ⅱ，电子天平称取0.05M NaCl、20mM Tris-HCl、7.51mM EDTA于烧杯中，在磁力搅拌器下搅拌混匀；
2)将500ul反应液Ⅱ、活化后的链霉亲和素磁珠、10ul生物素标记的抗体混合，将混合液置于恒温摇床，恒温摇床60r/s，室温反应30分钟；
3)将混合液置于磁分离架，静置30秒；
4)去除上清，保留与抗体结合的链霉亲和素磁珠即免疫磁珠备用。
进一步地，所述生物素标记的抗体包括CD63抗体、CD81抗体、CD9抗体、EpCAM抗体中任一种。
进一步地，所述免疫磁珠与外泌体结合即捕获与富集外泌体的过程是：
1)将样品与免疫磁珠混合，样品与免疫磁珠的混合比例是：血清1ml：免疫磁珠50ug或尿液1L:免疫磁珠30ug；
2)孵育：室温摇床放置10-30min；
3)将孵育好的样品置于磁分离架，静置30秒，去除液体保留磁珠；
4)将3)中获得的磁珠用PBS洗涤一次，去除样品残留，吹打过程要轻柔，避免外泌体脱落；
5)磁分离获得纯化的磁珠外泌体复合物。
进一步地，所述外泌体核酸样品制备，根据不同获取对象，有以下三种不同的方法，详细步骤如下：
A.外泌体DNA的分离
1)在制得的磁珠外泌体复合物即吸附外泌体中加入extractionbuffer 500μl以裂解细胞，混匀于37℃水溶1h；
2)置于磁分离架30秒，液体转移到EP管A，去除磁珠；
3)每管加入8μl的蛋白酶K，颠倒混匀，37℃放置3小时；取溶液下层；
4)每管加入450μl碱性Tris饱和酚，缓慢摇晃10分钟，以5500rpm，离心15分钟；
5)取上清，每管加入250μl酸性水饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15分钟；
6)取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10分钟，以5500rpm，离心15分钟；
7)取上清，每管加50μl的3M的NaAc，适量预冷的无水乙醇至满，摇匀放入-20℃保存2h以上；
8)以12000rpm，离心20min，去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥；
9)加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀；
B.外泌体总RNA的分离
1)将磁珠外泌体复合物加入1体积的trizol，吹打混匀至液体浑浊；
2)置于磁分离架静置30秒，将上清转移到EP管B1；
3)加1/5体积的氯仿颠倒混匀，室温静置3分钟；
4)4℃10000rpm离心10分钟，将上层液相转移到EP管B2中，不要吸出蛋白；
5)加入1/2体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；
6)4℃12000g离心10分钟，白色胶状沉淀为RNA；
7)弃上清，用1体积质量分数为75％乙醇洗涤沉淀；
8)7500g离心5分钟，弃上清，室温干燥5分钟，DEPC水重悬；
C.总核酸的分离
往磁珠外泌体复合物加入细胞裂解液，振荡混匀，10000g离心十分钟取上清。
进一步地，所述电化学发光检测目的核酸序列过程：
(1)三联吡啶钌的合成：
1)电子天平称取：0.05g二氯二联吡啶Ru(bpy)2Cl2，0.05g NaHCO3,0.0375g 2,2’－联吡啶－4，4’二羧酸dcbpy于50ml圆底烧瓶中；
2)加入10mL80％甲醇(MeOH)，混合液在硅油浴80℃下回流加热10h；
3)所得溶液在冰浴中冷却2h；
4)同时用1mol/L的H2SO4将pH值调到4.4；
5)形成的沉淀用滤纸过滤，再用纯MeOH少量多次洗涤沉淀，可以每次2-3ml；
6)所得滤液中加入3.125ml NaPF6溶液，其制备是2.5g NaPF6溶于12.5ml水中；搅拌后置于冰箱4℃环境中挥发滤液，观察晶体产生；期间反复加入纯MeOH，使其重结晶，收集所得结晶即为紫红色的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2；
(2)三联吡啶钌的活化：
1)电子天平称取：
1.1635g二环乙基碳二亚胺DCC，0.5947gN－羟基琥珀酰亚胺，
2)搅拌条件下溶解于7.7568ml-8ml二甲基甲酰胺DMF中，然后冰浴冷却；
3)加入0.1616g上述合成的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2，混合物冰浴搅拌混匀；
4)室温下密封振荡5h，静置；
5)所得沉淀通过吸滤装置除去，滤液中含有活性的钌配合物即活化后的三联吡啶钌，可用于标记DNA、蛋白或抗体；
(3)DNA探针标记三联吡啶钌：
活化后的三联吡啶钌、DNA探针及EDC按照1：10：2000的比例混匀，调整pH值至6呈弱酸性；用锡箔纸避光37℃孵育12小时；最后，用超滤管离心除去小分子化合物；得到DNA探针标记的三联吡啶钌，并用纯水保存在-20℃冰箱；
(4)聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的制备：
1)取5mg聚赖氨酸固体粉末于离心管中离心5分钟，使粘在管壁上的聚赖氨酸固体粉末落入管底。
2)轻轻的打开管盖，并迅速加入75μL 0.1M硼酸钠，调整pH值至8.5，立即盖上管盖。
3)上下振荡5min以充分混匀，离心收集。
4)加入30μL 11.2mM的DNA探针标记的三联吡啶钌。
5)离心管外缠上黑胶布，置离心管架上避光孵育12小时。
6)用超滤管分离除去体系中的小分子化合物。
7)12000rpm，4℃，离心20min。
8)倒去橙色上清液，加入0.5mL预冷无水乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物。
9)12000rpm，4℃，离心20min。
10)倒去浅黄色上清液，加入1ml预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物。
11)12000rpm，4℃，离心20min。
12)倒去上清液，加入1ml预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物。
13)12000rpm，4℃，离心20min，得到聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物，作为电化学发光探针。
14)加100μL水稀释，放入-20℃冰箱保存；
(5)磁捕捉检测目标DNA序列：
本部分以磁捕捉及“sandwich”模型为基础，构建了一种以聚赖氨酸-三联吡啶钌为信号放大基团的核酸检测方法：
1)取生物素探针、靶序列即外泌体核酸样品分别溶解于水中，终浓度均为10uM。
2)构建磁捕捉核酸检测体系：体系总体积为100uL，具体操作：把生物素探针溶液、靶序列溶液、聚赖氨酸三联吡啶钌复合物、20ug链霉亲和素磁珠、浓度为1X的PBS缓冲液混合，加水补充至100uL，生物素探针及聚赖氨酸三联吡啶钌复合物的终浓度均为100nM。
3)信号检测：将步骤2)构建的磁捕捉核酸检测体系放入罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并记录数据。
本发明优点在于：(1)本发明采用链霉亲和素磁珠与生物素抗体结合构建功能化免疫磁珠，生物素与链霉亲和素特异性结合，体系稳定，操作简单，避免了非特异性的干扰。
(2)本发明可以通过改变抗体类型分离纯化不同亚型的外泌体，体系可控，可以用于核酸表达谱研究和外泌体分型研究。
(3)终浓度可控，磁富集后再稀释或再释放获得所需浓度，便于后续检测。
(4)分离速度快，同时由于对仪器要求简单，可以同时处理多个样品，从而节省了人力。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是本发明技术原理示意图；
图2是抗体修饰后磁珠电位变化图；
图3是抗体修饰后磁珠粒径变化图；
图4是磁珠捕获外泌体后的荧光显微镜观察；
图5是磁珠吸附外泌体效率示意图；
图6是磁珠吸附外泌体扫描电镜表征图；
图7是电化学发光检测的信号情况图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
本说明书中若无特殊说明，试剂的浓度百分数指的是质量百分数。
如图1所示，各实施例技术原理如下：
实施例1样品前处理与外泌体标准品的分离
(1)样品收集
1)动物或人细胞培养液收集
细胞培养液为DMEM，添加体积分数为10％小牛血清(FCS)。细胞用胰蛋白酶消化，转至细胞培养皿，在37℃、5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24h，使细胞汇合50％-60％，然后换用无血清DMEM培养液培养24-48h。回收该无血清DMEM细胞培养液，短期内4℃保存，长期放-80℃保存。
2)动物或人血液样品收集
动物或人静脉抽血，加入抗凝剂，离心去除血液中的细胞成分，得到血浆；或待血液凝固后取血清亦可，得到的血样样品-80℃保存或立即使用。
3)动物或人尿液样品收集
把动物或人的尿液收集到集尿器，得到尿液样品，尽量避免外界对尿液样品的污染，立即使用或存于-80℃备用。
(2)外泌体标准品的分离
1)样品的前处理
血液样品需先用PBS稀释20倍，经1000g低速离心10min去除较大的细胞碎片，然后用0.22nm滤膜过滤去除细胞大囊泡。尿液及细胞培养液经1000g低速离心10min去除较大的细胞碎片，然后用0.22nm滤膜过滤去除细胞大囊泡。
2)超速离心分离外泌体标准品
经处理后的样品分装到离心管，配平后，100000g离心70分钟，小心去除上清，沉淀用PBS缓冲液重悬，再次配平后100000g离心90分钟，回收沉淀即为外泌体标准品，用适量PBS重悬，存于-80℃。
以血液样品为例，进行下列实验操作：
实施例2免疫磁珠的合成
(1)活化链霉亲和素磁珠，过程如下：
1)电子天平称取：EDTA(0.292g)(CAS:60-00-4),NaCl(29.22g)(CAS:7647-14-5),TRIS(2.423g)(CAS:77-86-1)于1L烧杯中。
2)加入水定容到800ml，在磁力搅拌器下搅拌混匀。
3)所得溶液转移到1L容量瓶中用水定容到1L。
4)然后用1mol/L的HCl将pH值调到7.5，用精密pH试纸定标。
5)得到的溶液用滤纸过滤，获得反应液Ⅰ分装备用。
6)将链霉亲和素磁珠母液混匀后取500ug置于1.5mlEP管，磁分离去除保护试剂，往EP管加入1mlPBS混匀。
7)将EP管置于磁分离架，静置30秒，将液体去除保留链霉亲和素磁珠。
8)重复一次步骤6-7，去除链霉亲和素磁珠的保护试剂，并将链霉亲和素磁珠溶解于1ml反应液Ⅰ获得活化的链霉亲和素磁珠。
(2)链霉亲和素磁珠与抗体结合(抗体修饰到链霉亲和素磁珠表面)，过程如下：
1)制备反应液Ⅱ，电子天平称取0.05M NaCl、20mM Tris-HCl、7.51mM EDTA于烧杯中，在磁力搅拌器下搅拌混匀。
2)将500ul反应液Ⅱ、活化后的链霉亲和素磁珠、10ul生物素标记的CD63抗体(克隆号：MEM-259)混合，将混合液置于恒温摇床，恒温摇床60r/s，室温反应30分钟。
3)将混合液置于磁分离架，静置30秒。
4)去除上清，保留与抗体结合的链霉亲和素磁珠即免疫磁珠备用。结果如图2和图3所示。
实施例3免疫磁珠与外泌体结合(外泌体的捕获与富集)，过程如下：
1)将样品与实施例2中获得的免疫磁珠混合，样品与免疫磁珠的混合比例是：血清1ml：免疫磁珠50ug或尿液1L:免疫磁珠30ug。
2)孵育：室温摇床放置10-30min，时间根据室温和样品中外泌体浓度适当调整。
3)将孵育好的样品置于磁分离架，静置30秒，去除液体保留磁珠。
4)将3)中获得的磁珠用PBS洗涤2-3次，去除样品残留，吹打过程要轻柔，避免外泌体脱落。
5)磁分离获得纯化的磁珠外泌体复合物。结果如图4-图6所示。
实施例4外泌体核酸样品制备，根据不同获取对象，有以下三种不同的方法：
A.外泌体DNA的分离
1)在实施例3制得的磁珠外泌体复合物即吸附外泌体中加入extraction buffer500μl以裂解细胞，混匀于37℃水溶1h。
2)置于磁分离架30秒，液体转移到EP管A，去除磁珠。
3)每管加入8μl的蛋白酶K，颠倒混匀，37℃放置3小时；取溶液下层。
4)每管加入450μl碱性Tris饱和酚，缓慢摇晃10分钟，以5500rpm，离心15分钟。
5)取上清，每管加入250μl酸性水饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15分钟。
6)取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10分钟，以5500rpm，离心15分钟。
7)取上清，每管加50μl的3M的NaAc，适量预冷的无水乙醇至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。
8)以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。
9)加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。
B.外泌体总RNA的分离
1)将实施例3获得的磁珠外泌体复合物加入1体积的trizol，吹打混匀至液体浑浊。
2)置于磁分离架静置30秒，将上清转移到EP管B1。
3)加1/5体积的氯仿颠倒混匀，室温静置3分钟。
4)4℃10000rpm离心10分钟，将上层液相转移到EP管B2中，不要吸出蛋白。
5)加入1/2体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。
6)4℃12000g离心10分钟，白色胶状沉淀为RNA。
7)弃上清，用1体积质量分数为75％乙醇洗涤沉淀。
8)7500g离心5分钟，弃上清，室温干燥5分钟，DEPC水重悬。
C.总核酸的分离
实施例3制得的磁珠外泌体复合物中加入一定量的细胞裂解液，振荡混匀，10000g离心十分钟取上清。
实施案例5电化学发光检测目的核酸序列过程：
(1)三联吡啶钌的合成：
1)电子天平称取：二氯二联吡啶Ru(bpy)2Cl2，0.05g，(CAS:15746-57-3)；NaHCO3，0.05g；2,2’－联吡啶－4，4’二羧酸dcbpy，0.0375g，(CAS:6813-38-3)于50ml圆底烧瓶中。
2)加入10mL80％甲醇(MeOH)，混合液在硅油浴80℃下回流加热10h。
3)所得溶液在冰浴(冰水混合物)中冷却2h。
4)同时用1mol/L的H2SO4将pH值调到4.4，以精密pH试纸定标。
5)形成的沉淀用滤纸过滤，再用纯MeOH少量多次洗涤沉淀，可以每次2-3ml。
6)所得滤液中加入3.125ml NaPF6(2.5g NaPF6溶于12.5ml水中)(CAS:21324-39-0)溶液，搅拌后置于冰箱4℃环境中挥发滤液，观察晶体产生。期间可反复加入纯MeOH，使其重结晶，收集所得结晶即为紫红色的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2。
(2)三联吡啶钌的活化：
1)电子天平称取：
二环乙基碳二亚胺(DCC，1.1635g)(CAS:538-75-0)，(称量量根据晶体量调整)，N－羟基琥珀酰亚胺(0.5947g)(CAS:6066-82-6)，
2)搅拌条件下溶解于7.7568ml-8ml二甲基甲酰胺(DMF)中，然后冰浴冷却。
3)加入0.1616g上述合成的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2，混合物冰浴搅拌混匀。
4)室温下密封振荡5h，静置。
5)所得沉淀通过吸滤装置除去，滤液中含有活性的钌配合物即活化后的三联吡啶钌，可用于标记DNA、蛋白或抗体。
(3)DNA探针标记三联吡啶钌：
该反应体系中，活化后的三联吡啶钌、DNA探针及EDC按照1：10：2000的比例混匀，调整pH值至6呈弱酸性。用锡箔纸避光孵育12小时(37℃)。最后，用超滤管离心除去小分子化合物，得到DNA探针标记的三联吡啶钌，并用纯水保存在-20℃冰箱。
(4)聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的制备：
1)取5mg聚赖氨酸固体粉末于离心管中离心5分钟，使粘在管壁上的聚赖氨酸固体粉末落入管底。
2)轻轻的打开管盖，并迅速加入75μL 0.1M硼酸钠，调整pH值至8.5，立即盖上管盖。
3)上下振荡5min以充分混匀，离心收集。
4)加入30μL 11.2mM的DNA探针标记的三联吡啶钌。
5)离心管外缠上黑胶布，置离心管架上避光孵育12小时。
6)用超滤管(100KDa)分离除去体系中的小分子化合物。
7)12000rpm，4℃，离心20min。
8)倒去橙色上清液，加入0.5mL预冷无水乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管(100KDa)分离除去体系中的小分子化合物。
9)12000rpm，4℃，离心20min。
10)倒去浅黄色上清液，加入1ml预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管(100KDa)分离除去体系中的小分子化合物。
11)12000rpm，4℃，离心20min。
12)倒去上清液，加入1ml预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管(100KDa)分离除去体系中的小分子化合物。
13)12000rpm，4℃，离心20min，得到聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物，作为电化学发光探针。
14)加100μL水稀释，放入-20℃冰箱保存。
(5)磁捕捉检测目标核酸序列：
本部分以传统的磁捕捉及“sandwich”模型为基础，构建了一种以聚赖氨酸-三联吡啶钌为信号放大基团的核酸检测方法：
1)取生物素探针、靶序列即外泌体核酸样品分别溶解于水中，终浓度均为10uM。
2)构建磁捕捉核酸检测体系：体系总体积为100uL，具体操作：把生物素探针溶液、靶序列溶液、聚赖氨酸三联吡啶钌复合物、20ug链霉亲和素磁珠、浓度为1X的PBS缓冲液混合，加水补充至100uL，生物素探针及聚赖氨酸三联吡啶钌复合物的终浓度均为100nM。
3)信号检测：用外泌体标准品校准罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免疫分析仪，将步骤2)构建的磁捕捉核酸检测体系放入该仪器中检测电化学发光信号，并记录数据，结果如图7所示。
由上述可知，本发明具有以下优点：
(1)外泌体捕获类型可控，可根据实际需求，选择合适的抗体，以控制结合的外泌体类型；
(2)外泌体浓度可控，通过磁分离方式可以富集外泌体，然后通过重悬或洗脱可以得到对应浓度的外泌体，操作简单；
(3)通过抗原抗体免疫亲和的方式将外泌体吸附到磁珠表面，分离速度快，同时对仪器要求简单，可以同时处理多组样品，从而节省了人力。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (9)
1.基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，其特征在于：
包括如下步骤：
步骤一：样品收集：包括动物或人细胞培养液收集、动物或人血液样品收集、动物或人尿液样品收集、动物或人唾液样品收集；
步骤二：外泌体标准品的分离
1)样品的前处理；
2)超速离心分离外泌体标准品；
步骤三：免疫磁珠的合成：
(1)把链霉亲和素磁珠进行活化：
1)制备反应液Ⅰ分装备用；
2)将链霉亲和素磁珠母液混匀后，磁分离去除保护试剂，往EP管加入PBS混匀；
3)将EP管置于磁分离架，静置，将液体去除保留链霉亲和素磁珠；
4)重复一次步骤2-3，去除链霉亲和素磁珠的保护试剂，并将链霉亲和素磁珠溶解于1ml反应液Ⅰ获得活化的链霉亲和素磁珠。
(2)链霉亲和素磁珠与抗体结合：
1)制备反应液Ⅱ；
2)将反应液Ⅱ、活化后的链霉亲和素磁珠混合物、10ul生物素标记的抗体混合，将混合液置于恒温摇床反应；
3)将混合液置于磁分离架，静置；
4)去除上清，保留与抗体结合的链霉亲和素磁珠即免疫磁珠备用；
步骤四：免疫磁珠与外泌体结合即捕获与富集外泌体：
1)将样品与免疫磁珠混合；
2)孵育：室温摇床放置10-30min；
3)将孵育好的样品置于磁分离架，静置，去除液体保留磁珠；
4)将3)中获得的磁珠用PBS洗涤2-3次，去除样品残留，吹打过程要轻柔，避免外泌体脱落；
5)磁分离获得纯化的磁珠外泌体复合物；
步骤五：外泌体核酸样品制备，根据不同获取对象，有以下三种不同的方法：
A.外泌体DNA的分离
1)在制得的磁珠外泌体复合物即吸附外泌体中加入extractionbuffer 500μl以裂解外泌体，混匀于37℃水溶1h；
2)置于磁分离架，液体转移到EP管A，去除磁珠；
3)每管加入蛋白酶K，颠倒混匀，37℃放置3小时；取溶液下层；
4)每管加入饱和酚，缓慢摇晃，离心；
5)取上清，每管加入饱和酚和氯仿－异戊醇，摇匀，离心；
6)取上清，每管加入氯仿－异戊醇，摇匀，离心；
7)取上清，每管加NaAC，适量预冷的无水乙醇至满，摇匀放入-20℃保存2h以上；
8)离心，去上清，加入70％乙醇，离心5min，去上清，干燥；
9)加入灭菌去离子水，转弹，混匀；
B.外泌体总RNA的分离
1)将磁珠外泌体复合物加入1体积的trizol，吹打混匀至液体浑浊；
2)置于磁分离架静置，将上清转移到EP管B1；
3)加1/5体积的氯仿颠倒混匀，室温静置；
4)4℃离心，将上层液相转移到EP管B2中，不要吸出蛋白；
5)加入1/2体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置；
6)4℃离心，白色胶状沉淀为RNA；
7)弃上清，用1体积质量分数为75％乙醇洗涤沉淀；
8)离心，弃上清，室温干燥，DEPC水重悬；
C.总核酸的分离
往磁珠外泌体复合物加入细胞裂解液，振荡混匀，离心取上清；
步骤六：电化学发光检测目的核酸序列：
(1)三联吡啶钌的合成：
1)电子天平称取：二氯二联吡啶Ru(bpy)2Cl2，NaHCO3,2,2’－联吡啶－4，4’二羧酸dcbpy，于50ml圆底烧瓶中；
2)加入甲醇，混合液在硅油浴80℃下回流加热10h；
3)所得溶液在冰浴中冷却2h；
4)同时将pH值调到4.4；
5)形成的沉淀用滤纸过滤，再用纯MeOH少量多次洗涤沉淀；
6)所得滤液中加入3.125ml NaPF6溶液，搅拌后置于低温环境中挥发滤液，观察晶体产生；期间可反复加入纯MeOH，使其重结晶，收集所得结晶即为紫红色的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2；
(2)三联吡啶钌的活化：
1)电子天平称取：
二环乙基碳二亚胺，N－羟基琥珀酰亚胺；
2)搅拌条件下溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后冰浴冷却；
3)加入上述合成的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2，混合物冰浴搅拌混匀；
4)室温下密封振荡，静置；
5)所得沉淀通过吸滤装置除去，滤液中含有活性的钌配合物即活化后的三联吡啶钌，可用于标记DNA、蛋白或抗体；
(3)DNA探针标记三联吡啶钌：
该反应体系中，活化后的三联吡啶钌、DNA探针及EDC按照比例混匀，调整pH值至6呈弱酸性；用锡箔纸避光孵育；最后，用超滤管离心除去小分子化合物；并用纯水低温保存；
(4)聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的制备：
1)取聚赖氨酸固体粉末于离心管中离心，使粘在管壁上的聚赖氨酸固体粉末落入管底；
2)轻轻的打开管盖，并迅速加入75μL 0.1M硼酸钠，立即盖上管盖；
3)上下振荡以充分混匀，离心收集；
4)加入DNA探针标记的三联吡啶钌；
5)离心管外缠上黑胶布，置离心管架上避光孵育；
6)用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
7)离心；
8)倒去橙色上清液，加入预冷无水乙醇洗涤，放入超低温冰箱中,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
9)离心；
10)倒去浅黄色上清液，加入1ml预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
11)离心，12000rpm，4℃，20min；
12)倒去上清液，加入1ml预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
13)离心，得到聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物，作为电化学发光探针；
14)加水稀释，放入冰箱保存；
(5)磁捕捉检测目标DNA序列：
构建一种以聚赖氨酸-三联吡啶钌为信号放大基团的核酸检测方法:
1)取生物素探针、靶序列即外泌体核酸样品分别溶解于水中；
2)构建磁捕捉核酸检测体系：把生物素探针溶液、靶序列溶液、聚赖氨酸三联吡啶钌复合物、链霉亲和素磁珠、浓度为1X的PBS缓冲液混合，加水补充至目标体积；
3)信号检测：将步骤2)构建的磁捕捉核酸检测体系放入罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并记录数据。
2.根据权利要求1所述的基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，其特征在于：
所述动物或人细胞培养液收集详细操作：
细胞培养液为DMEM，添加体积分数为10％小牛血清(FCS)，细胞用胰蛋白酶消化，转至细胞培养皿，在37℃、5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24h，使细胞汇合50％-60％，然后换用无血清DMEM培养液培养24-48h，回收该无血清DMEM细胞培养液，短期内4℃保存，长期放-80℃保存；
所述动物或人血液样品收集的操作过程：
动物或人静脉抽血，加入抗凝剂，离心去除血液中的细胞成分，得到血浆；或待血液凝固后取血清亦可，得到的血样样品-80℃保存或立即使用；
所述动物或人尿液样品收集的操作过程：
把动物或人的尿液收集到集尿器，得到尿液样品，尽量避免外界对尿液样品的污染，立即使用或存于-80℃备用。
3.根据权利要求1所述的基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，其特征在于：
所述外泌体标准品的分离过程：
1)样品的前处理
血液样品需先用PBS稀释20倍，经1000g低速离心10min去除较大的细胞碎片，然后用0.22nm滤膜过滤去除细胞大囊泡；尿液及细胞培养液经1000g低速离心10min去除较大的细胞碎片，然后用0.22nm滤膜过滤去除细胞大囊泡；
2)超速离心分离外泌体标准品
经处理后的样品分装到离心管，配平后，100000g离心70分钟，小心去除上清，沉淀用PBS缓冲液重悬，再次配平后100000g离心90分钟，回收沉淀即为外泌体标准品，用适量PBS重悬，存于-80℃。
4.根据权利要求1所述的基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，其特征在于：
所述链霉亲和素磁珠的活化过程如下：
1)电子天平称取：0.292gEDTA，29.22gNaCl，2.423gTRIS于1L烧杯中；
2)加入水定容到800ml，在磁力搅拌器下搅拌混匀；
3)所得溶液转移到1L容量瓶中用水定容到1L；
4)然后用1mol/L的HCl将pH值调到7.5；
5)得到的溶液用滤纸过滤，获得反应液Ⅰ分装备用；
6)将链霉亲和素磁珠母液混匀后取500ug置于1.5mlEP管，磁分离去除保护试剂，往EP管加入1mlPBS混匀；
7)将EP管置于磁分离架，静置30秒，将液体去除保留链霉亲和素磁珠；
8)重复一次步骤6-7，去除链霉亲和素磁珠的保护试剂，并将链霉亲和素磁珠溶解于1ml反应液Ⅰ获得活化的链霉亲和素磁珠。
5.根据权利要求1所述的基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，其特征在于：
所述把链霉亲和素磁珠与抗体结合的操作过程：
1)制备反应液Ⅱ，电子天平称取0.05M NaCl、20mM Tris-HCl、7.51mM EDTA于烧杯中，在磁力搅拌器下搅拌混匀；
2)将500ul反应液Ⅱ、活化后的链霉亲和素磁珠、10ul生物素标记的抗体混合，将混合液置于恒温摇床，恒温摇床60r/s，室温反应30分钟；
3)将混合液置于磁分离架，静置30秒；
4)去除上清，保留与抗体结合的链霉亲和素磁珠即免疫磁珠备用。
6.根据权利要求1或5所述的基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，其特征在于：
所述生物素标记的抗体包括CD63抗体、CD81抗体、CD9抗体、EpCAM抗体中任一种。
7.根据权利要求1所述的基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，其特征在于：
所述免疫磁珠与外泌体结合即捕获与富集外泌体的过程是：
1)将样品与免疫磁珠混合，样品与免疫磁珠的混合比例是：血清1ml：免疫磁珠50ug或尿液1L:免疫磁珠30ug；
2)孵育：室温摇床放置10-30min；
3)将孵育好的样品置于磁分离架，静置30秒，去除液体保留磁珠；
4)将3)中获得的磁珠用PBS洗涤一次，去除样品残留，吹打过程要轻柔，避免外泌体脱落；
5)磁分离获得纯化的磁珠外泌体复合物。
8.根据权利要求1所述的基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，其特征在于：
所述外泌体核酸样品制备，根据不同获取对象，有以下三种不同的方法，详细步骤如下：
A.外泌体DNA的分离
1)在制得的磁珠外泌体复合物即吸附外泌体中加入extraction buffer 500μl以裂解细胞，混匀于37℃水溶1h；
2)置于磁分离架30秒，液体转移到EP管A，去除磁珠；
3)每管加入8μl的蛋白酶K，颠倒混匀，37℃放置3小时；取溶液下层；
4)每管加入450μl碱性Tris饱和酚，缓慢摇晃10分钟，以5500rpm，离心15分钟；
5)取上清，每管加入250μl酸性水饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15分钟；
6)取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10分钟，以5500rpm，离心15分钟；
7)取上清，每管加50μl的3M的NaAc，适量预冷的无水乙醇至满，摇匀放入-20℃保存2h以上；
8)以12000rpm，离心20min，去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥；
9)加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀；
B.外泌体总RNA的分离
1)将磁珠外泌体复合物加入1体积的trizol，吹打混匀至液体浑浊；
2)置于磁分离架静置30秒，将上清转移到EP管B1；
3)加1/5体积的氯仿颠倒混匀，室温静置3分钟；
4)4℃10000rpm离心10分钟，将上层液相转移到EP管B2中，不要吸出蛋白；
5)加入1/2体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；
6)4℃12000g离心10分钟，白色胶状沉淀为RNA；
7)弃上清，用1体积质量分数为75％乙醇洗涤沉淀；
8)7500g离心5分钟，弃上清，室温干燥5分钟，DEPC水重悬；
C.总核酸的分离
往磁珠外泌体复合物加入细胞裂解液，振荡混匀，10000g离心十分钟取上清。
9.根据权利要求1所述的基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，其特征在于：
所述电化学发光检测目的核酸序列过程：
(1)三联吡啶钌的合成：
1)电子天平称取：0.05g二氯二联吡啶Ru(bpy)2Cl2，0.05g NaHCO3,0.0375g 2,2’－联吡啶－4，4’二羧酸dcbpy于50ml圆底烧瓶中；
2)加入10mL80％甲醇(MeOH)，混合液在硅油浴80℃下回流加热10h；
3)所得溶液在冰浴中冷却2h；
4)同时用1mol/L的H2SO4将pH值调到4.4；
5)形成的沉淀用滤纸过滤，再用纯MeOH少量多次洗涤沉淀，可以每次2-3ml；
6)所得滤液中加入3.125ml NaPF6溶液，其制备是2.5g NaPF6溶于12.5ml水中；搅拌后置于冰箱4℃环境中挥发滤液，观察晶体产生；期间反复加入纯MeOH，使其重结晶，收集所得结晶即为紫红色的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2；
(2)三联吡啶钌的活化：
1)电子天平称取：
1.1635g二环乙基碳二亚胺DCC，0.5947gN－羟基琥珀酰亚胺，
2)搅拌条件下溶解于7.7568ml-8ml二甲基甲酰胺DMF中，然后冰浴冷却；
3)加入0.1616g上述合成的Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2，混合物冰浴搅拌混匀；
4)室温下密封振荡5h，静置；
5)所得沉淀通过吸滤装置除去，滤液中含有活性的钌配合物即活化后的三联吡啶钌，可用于标记DNA、蛋白或抗体；
(3)DNA探针标记三联吡啶钌：
活化后的三联吡啶钌、DNA探针及EDC按照1：10：2000的比例混匀，调整pH值至6呈弱酸性；用锡箔纸避光37℃孵育12小时；最后，用超滤管离心除去小分子化合物；得到DNA探针标记的三联吡啶钌，并用纯水保存在-20℃冰箱；
(4)聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的制备：
1)取5mg聚赖氨酸固体粉末于离心管中离心5分钟，使粘在管壁上的聚赖氨酸固体粉末落入管底；
2)轻轻的打开管盖，并迅速加入75μL 0.1M硼酸钠，调整pH值至8.5，立即盖上管盖；
3)上下振荡5min以充分混匀，离心收集；
4)加入30μL 11.2mM的DNA探针标记的三联吡啶钌；
5)离心管外缠上黑胶布，置离心管架上避光孵育12小时；
6)用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
7)12000rpm，4℃，离心20min；
8)倒去橙色上清液，加入0.5mL预冷无水乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
9)12000rpm，4℃，离心20min；
10)倒去浅黄色上清液，加入1ml预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
11)12000rpm，4℃，离心20min；
12)倒去上清液，加入1ml预冷80％乙醇洗涤，放入超低温冰箱中1小时,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
13)12000rpm，4℃，离心20min，得到聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物，作为电化学发光探针；
14)加100μL水稀释，放入-20℃冰箱保存；
(5)磁捕捉检测目标DNA序列：
本部分以磁捕捉及“sandwich”模型为基础，构建了一种以聚赖氨酸-三联吡啶钌为信号放大基团的核酸检测方法：
1)取生物素探针、靶序列即外泌体核酸样品分别溶解于水中，终浓度均为10uM。
2)构建磁捕捉核酸检测体系：体系总体积为100uL，具体操作：把生物素探针溶液、靶序列溶液、聚赖氨酸三联吡啶钌复合物、20ug链霉亲和素磁珠、浓度为1X的PBS缓冲液混合，加水补充至100uL，生物素探针及聚赖氨酸三联吡啶钌复合物的终浓度均为100nM。
3)信号检测：将步骤2)构建的磁捕捉核酸检测体系放入罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并记录数据。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810657985.3A CN108802374A (zh) | 2018-06-25 | 2018-06-25 | 基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810657985.3A CN108802374A (zh) | 2018-06-25 | 2018-06-25 | 基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108802374A true CN108802374A (zh) | 2018-11-13 |
Family
ID=64084770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810657985.3A Pending CN108802374A (zh) | 2018-06-25 | 2018-06-25 | 基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108802374A (zh) |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109628277A (zh) * | 2019-01-23 | 2019-04-16 | 东南大学 | 一种外泌体内肿瘤标志miRNA的分离和检测系统及方法 |
| CN109946531A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-06-28 | 温州大学 | 一种λ-DNA中和后剩余电量的测量装置及其测量方法 |
| CN110540961A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-12-06 | 郑州大学 | Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法 |
| CN110747158A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-02-04 | 赵凯 | 一种基于沉淀试剂法的细胞上清液外泌体提取工艺 |
| CN111521782A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-08-11 | 上海市中医医院 | 一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法 |
| CN111575228A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-08-25 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法 |
| JP2020201202A (ja) * | 2019-06-12 | 2020-12-17 | 株式会社堀場製作所 | エクソソームの表面分子および内包分子を検出する方法 |
| CN113000038A (zh) * | 2019-12-04 | 2021-06-22 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种生物样品溶液中外泌体富集方法 |
| CN113667721A (zh) * | 2021-07-29 | 2021-11-19 | 南昌大学 | 一种高灵敏即时检测miRNA的分析方法 |
| CN114214316A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-22 | 安龄(上海)生物科技有限公司 | 一种脂肪间充质干细胞的外泌体rna提取方法 |
| CN114276992A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-04-05 | 南通举健生物科技有限公司 | 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法 |
| CN114350855A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-04-15 | 重庆医科大学 | 一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒 |
| CN114845957A (zh) * | 2019-09-18 | 2022-08-02 | 南科征途有限公司 | 用于按尺寸富集和分离核酸的设备系统和方法 |
| NL2034093B1 (en) * | 2022-03-17 | 2023-09-29 | Inst Oceanology Cas | Method for separating exosomes from apostichopus japonicus body fluid sample |
| CN117625362A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-01 | 北京尔瑞鑫悦科技有限公司 | 一种血液来源的神经源性外泌体富集装置 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103695551A (zh) * | 2013-12-24 | 2014-04-02 | 华南师范大学 | 基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法 |
| CN105779586A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-07-20 | 四川农业大学 | 一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法 |
| CN106841613A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-06-13 | 上海良润生物医药科技有限公司 | 一种检测外泌体的方法及体系 |
| CN107475454A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-12-15 | 中山大学 | 基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法 |
| CN107764803A (zh) * | 2017-09-21 | 2018-03-06 | 中山大学 | 一种运用电化学发光成像识别技术的生物标志物检测方法 |
| CN107828779A (zh) * | 2017-10-25 | 2018-03-23 | 武汉大学 | 前列腺癌特异性外泌体、lncRNA及其制备方法和应用 |
-
2018
- 2018-06-25 CN CN201810657985.3A patent/CN108802374A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103695551A (zh) * | 2013-12-24 | 2014-04-02 | 华南师范大学 | 基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法 |
| CN105779586A (zh) * | 2015-12-28 | 2016-07-20 | 四川农业大学 | 一种从动物血浆中分离外泌体并进行纯度检测的方法 |
| CN106841613A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-06-13 | 上海良润生物医药科技有限公司 | 一种检测外泌体的方法及体系 |
| CN107475454A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-12-15 | 中山大学 | 基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法 |
| CN107764803A (zh) * | 2017-09-21 | 2018-03-06 | 中山大学 | 一种运用电化学发光成像识别技术的生物标志物检测方法 |
| CN107828779A (zh) * | 2017-10-25 | 2018-03-23 | 武汉大学 | 前列腺癌特异性外泌体、lncRNA及其制备方法和应用 |
Cited By (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109628277A (zh) * | 2019-01-23 | 2019-04-16 | 东南大学 | 一种外泌体内肿瘤标志miRNA的分离和检测系统及方法 |
| CN109628277B (zh) * | 2019-01-23 | 2022-02-01 | 东南大学 | 一种外泌体内肿瘤标志miRNA的分离和检测系统及方法 |
| CN109946531A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-06-28 | 温州大学 | 一种λ-DNA中和后剩余电量的测量装置及其测量方法 |
| CN109946531B (zh) * | 2019-04-19 | 2024-02-23 | 温州大学 | 一种λ-DNA中和后剩余电量的测量装置及其测量方法 |
| JP2020201202A (ja) * | 2019-06-12 | 2020-12-17 | 株式会社堀場製作所 | エクソソームの表面分子および内包分子を検出する方法 |
| CN110540961A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-12-06 | 郑州大学 | Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法 |
| CN110540961B (zh) * | 2019-08-21 | 2023-04-07 | 郑州大学 | Annexin V-FITC外泌体捕获亲和磁珠、其制备方法及利用其提取外泌体的方法 |
| CN114845957A (zh) * | 2019-09-18 | 2022-08-02 | 南科征途有限公司 | 用于按尺寸富集和分离核酸的设备系统和方法 |
| CN110747158A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-02-04 | 赵凯 | 一种基于沉淀试剂法的细胞上清液外泌体提取工艺 |
| CN113000038B (zh) * | 2019-12-04 | 2022-05-31 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种生物样品溶液中外泌体富集方法 |
| CN113000038A (zh) * | 2019-12-04 | 2021-06-22 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种生物样品溶液中外泌体富集方法 |
| CN111521782A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-08-11 | 上海市中医医院 | 一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法 |
| CN111521782B (zh) * | 2020-03-03 | 2023-04-04 | 上海市中医医院 | 一种高特异性的外泌体分离、检测及富集方法 |
| CN111575228A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-08-25 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法 |
| CN113667721B (zh) * | 2021-07-29 | 2024-02-09 | 南昌大学 | 一种高灵敏即时检测miRNA的分析方法 |
| CN113667721A (zh) * | 2021-07-29 | 2021-11-19 | 南昌大学 | 一种高灵敏即时检测miRNA的分析方法 |
| CN114276992A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-04-05 | 南通举健生物科技有限公司 | 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法 |
| CN114214316A (zh) * | 2021-12-27 | 2022-03-22 | 安龄(上海)生物科技有限公司 | 一种脂肪间充质干细胞的外泌体rna提取方法 |
| CN114350855A (zh) * | 2022-01-11 | 2022-04-15 | 重庆医科大学 | 一种免疫分子病毒颗粒检测试剂盒 |
| NL2034093B1 (en) * | 2022-03-17 | 2023-09-29 | Inst Oceanology Cas | Method for separating exosomes from apostichopus japonicus body fluid sample |
| CN117625362A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-01 | 北京尔瑞鑫悦科技有限公司 | 一种血液来源的神经源性外泌体富集装置 |
| CN117625362B (zh) * | 2024-01-26 | 2024-04-16 | 北京尔瑞鑫悦科技有限公司 | 一种血液来源的神经源性外泌体富集装置 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108802374A (zh) | 基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术 | |
| CN107238699A (zh) | 一种基于适配体修饰磁珠和金纳米颗粒模拟酶活性检测卡那霉素的比色分析方法 | |
| CN103173212B (zh) | 一种检测生物硫化氢的荧光探针及其制备与应用 | |
| CN105308458A (zh) | 用于进行过敏症和自身免疫性疾病的诊断测定的自动化免疫分析系统 | |
| CN102901726B (zh) | 血液细菌内毒素检测试剂盒的制备和应用 | |
| CN103992788B (zh) | 六苯并苯衍生物探针、制备方法及基于六苯并苯衍生物探针与核酸适配体的蛋白质检测方法 | |
| CN103575891A (zh) | 一种综合检测he4、ca125的试剂盒及其应用 | |
| CN101514991A (zh) | 甲胎蛋白磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 | |
| EP3243076B1 (en) | Methods for detecting a marker for active tuberculosis | |
| CN100501370C (zh) | 一种单胺氧化酶活性的荧光检测方法 | |
| CN105505877B (zh) | 恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法 | |
| CN101892290A (zh) | 苯丙氨酸定量检测试剂盒(酶定量法) | |
| CN101315379B (zh) | 一种用于检测莱克多巴胺的试剂盒及其应用 | |
| CN105334325A (zh) | 基于生物素和链霉亲和素系统的微流控免疫芯片分析方法 | |
| CN103149359A (zh) | 一种时间分辨荧光法综合检测胰腺癌试剂盒及其应用 | |
| CN102585007B (zh) | 用于检测β-胡萝卜素类色素的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒 | |
| CN107014993A (zh) | 一种检测动物源性食品中头孢类抗生素的间接竞争elisa试剂盒及其应用 | |
| CN103105384A (zh) | 一种时间分辨荧光法综合检测乳腺癌试剂盒及其应用 | |
| CN207007817U (zh) | 哌拉西林诱导溶血检测试剂盒 | |
| CN102295698B (zh) | 环孢霉素a免疫原、特异性抗体、检测试剂及检测试剂盒 | |
| CN113138271A (zh) | 基于血糖仪信号读出的多种毒品快速检测方法 | |
| CN106483298B (zh) | 用于检测细胞角蛋白19片段的化学发光免疫试剂盒 | |
| CN103772437B (zh) | pH值依赖的三联吡啶钌重复结晶合成法及其应用 | |
| CN114105874B (zh) | 一种丙烯醛荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN111518780B (zh) | 脱辅基辣根过氧化物酶的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181113 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |