CN114845957A - 用于按尺寸富集和分离核酸的设备系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开的实施例涉及用于按尺寸富集和分离核酸的设备、系统和方法。样本可以包含各种尺寸的核酸的混合物，并且所述感兴趣的核酸可以低于特定尺寸阈值。一种示范性富集方法可以包含将所述样本与第一底物(例如，磁珠)混合。所述方法可以包含使用所述第一底物将高于第一尺寸阈值的核酸与所述样本的其余部分分离。所述方法可以包含将所述样本的所述其余部分中的所述核酸(例如，低于所述尺寸阈值的核酸)与第二底物混合，并从所述第二底物回收低于所述第一尺寸阈值的所述核酸。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年9月18日提交的美国临时申请第62/902,155号和2019年11月7日提交的美国临时申请第62/932,229号的申请权益。这些申请通过引用整体并出于所有目的并入本文。
背景技术
可能存在从溶液分离目标生物分子或富集溶液内的目标生物分子群是有用的许多应用。许多生物溶液(例如，患者样本、实验室混合物等)可能包含目标生物分子和其它非目标组分(非靶向生物分子、盐、缓冲液组分、细胞等)的混合物。出于提取和/或富集目标生物分子的目的，已经开发了不同的程序，例如以去除原始溶液的不期望组分和/或增加目标产物相较于非目标产物的比例。可能期望的是，基于目标生物分子的尺寸将目标生物分子与溶液的其它组分(例如，非靶向生物分子)分离。
发明内容
在至少一个方面，本公开涉及一种方法。所述方法包含将包含核酸的样本与第一底物混合。所述方法包含用所述第一底物将高于第一尺寸阈值的核酸与所述样本的其余部分分离。所述方法包含将所述样本的所述其余部分中的所述核酸与第二底物混合。所述方法包含从所述第二底物回收低于所述第一尺寸阈值的核酸。
所述方法还可以包含回收高于所述第一尺寸阈值的所述核酸。所述方法还可以包含将高于所述第一尺寸阈值的所述核酸结合到包含磁珠的第一底物，并且回收高于所述第一尺寸阈值的所述核酸包含从所述磁珠洗脱高于所述第一尺寸阈值的所述核酸。
所述第一底物可以包含第一磁珠群，并且所述第二底物可以包含第二磁珠群。所述第一磁珠群和所述第二磁珠群可以包含核-壳-壳磁珠。分离所结合的高于所述第一尺寸阈值的核酸可以包含向所述样本施加磁场并去除包含所述样本的所述其余部分的上清液。所述第一磁珠群可以包含羧基的表面化学，所述羧基可以选择性地结合到高于所述第一尺寸阈值的所述核酸。所述第二磁珠群可以包含羟基的表面化学。所述方法还可以包含通过将所述样本的所述其余部分与包含至少一种醇的核酸沉淀试剂混合来将所述样本的所述其余部分中的所述核酸结合到所述第二磁珠群。
所述方法还可以包含用所述第二底物将高于第二尺寸阈值的核酸与所述样本的所述其余部分分离。所述第二尺寸阈值可以小于所述第一尺寸阈值，并且所回收的核酸可以高于所述第二尺寸阈值且低于所述第一尺寸阈值。
所述方法还可以包含在存在第一核酸沉淀试剂的情况下将高于所述第一尺寸阈值的所述核酸结合到所述第一底物，和在存在第二核酸沉淀试剂的情况下将所述样本的所述其余部分中的所述核酸结合到所述第二底物。所述第一核酸沉淀试剂和所述第二核酸沉淀试剂中的至少一个可以包含脱水剂、盐桥、缓冲剂、载体分子、表面活性剂及其组合。
所述方法还可以包含用洗涤缓冲液洗涤所述第二底物。从所述第二底物回收低于所述第一尺寸阈值的所述核酸可以包含用洗脱缓冲液从所述第二底物洗脱所述核酸。所述核酸可以包含DNA、RNA、寡核苷酸、用放射性磷酸盐、荧光团标记的核酸、用生物素或地高辛修饰的核苷酸或其组合。所述第一尺寸阈值可以是100bp、110bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp或200bp。所述第一底物可以包含磁珠、非磁珠、凝胶、毛细管或离心柱，并且所述第二底物可以包含磁珠、非磁珠、凝胶、毛细管或离心柱。分离高于所述第一尺寸阈值的所述核酸可以包含施加磁场、施加加速度、离心所述样本或向所述第一底物施加电势。
在至少一个方面，本公开涉及一种试剂盒，其包含第一底物、第一核酸沉淀试剂、第二底物和第二核酸沉淀试剂。所述第一底物可以在存在所述第一核酸沉淀试剂的情况下结合高于第一尺寸阈值的核酸，并且所述第二底物可以在存在所述第二核酸沉淀试剂的情况下结合核酸。
所述第一底物可以是第一磁珠群，并且所述第二底物可以是第二磁珠群。所述第一磁珠群和所述第二磁珠群可以包含核-壳-壳磁珠。所述第二底物可以在存在所述第二核酸沉淀试剂的情况下结合高于第二尺寸阈值的核酸。
所述第一核酸沉淀试剂或所述第二核酸沉淀试剂中的至少一个可以包含脱水剂、盐桥、缓冲剂、载体分子、表面活性剂及其组合。所述脱水剂可以包含分子量介于1000到10,000之间且重量/体积浓度介于10％到25％之间的聚亚烷基二醇。所述盐桥可以包含浓度为0.5M到5M的NaCl、KCl、CaCl2或其组合。所述缓冲剂可以包含浓度为0-10mM的Tris、浓度为0-1mM的EDTA、浓度为0-10mM的Tris-HCl及其组合。所述载体分子可以包含浓度为0.3-1M的乙酸钠、浓度为0.1-1M的氯化锂、浓度为0.1-2uM的糖原、浓度为0.5-2M的乙酸铵、浓度为10-20ug/mL的线性聚丙烯酰胺及其组合。所述表面活性剂可以包含浓度为0.01％-0.5％的Tween-20、浓度为0.01％-0.5％的Triton X-100、浓度为0.1％-1％的SDS及其组合。
所述试剂盒还可以包含醇，所述醇包括浓度为45-85％的乙醇、浓度为33％-70％的异丙醇及其组合。所述试剂盒还可以包含洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液包含至少一种醇。所述试剂盒还可以包含洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液包含浓度为0-10mM的Tris、浓度为0-1mM的EDTA、浓度为0-10mM的Tris-HCl及其组合。
在至少一个方面，本公开可以涉及一种方法。所述方法包含收集包含核酸的样本。所述方法包含从所述样本分离所述核酸。所述方法包含使用第一底物和第二底物过滤所述核酸以保留所述核酸中的低于尺寸阈值的选定核酸，所述第一底物可以选择性地将高于所述尺寸阈值的核酸与所述核酸中的所述选定核酸分离，并且所述第二底物可以将所述核酸中的所述选定核酸与杂质分离。所述方法包含基于所分离的核酸制备文库。所述方法包含对所制备的文库进行测序。
所述过滤可以发生在分离所述核酸之后且制备所述文库之前。制备所述文库可以包含延长所分离的核酸。过滤所述核酸可以发生在延长所分离的核酸之后。所述尺寸阈值可以基于核酸的目标长度和延长量。
所述核酸可以是无细胞DNA(cfDNA)、DNA、RNA、寡核苷酸、经标记的核酸、经修饰的核酸或其组合。低于所述尺寸阈值的所述核酸可以包含胎儿DNA。低于所述尺寸阈值的所述核酸可以包含肿瘤DNA。
所述方法还可以包含回收高于所述尺寸阈值的所述核酸。过滤所述核酸可以包含将所述核酸中的所述未选定核酸结合到所述第一底物，并施加外力以将所述第一底物和所述核酸中的所结合的未选定核酸与所述核酸中的未结合核酸分离。所述第一底物可以包含磁珠，并且所述外力可以是磁场。所述过滤还可以包含将所述核酸中的所述选定核酸结合到所述第二底物，施加外力以将所述第二底物和所述核酸中的所结合的选定核酸与所述杂质分离，并从所述第二底物回收所述核酸中的所述选定核酸。
附图说明
图1是根据本公开的一些实施例的基于尺寸过滤核酸的方法的流程图。
图2是根据本公开的一些实施例的富集和纯化短DNA片段的方法的示意图。
图3是根据本公开的一些实施例的核-壳-壳磁珠的截面图。
图4A-4B是描绘了根据本公开的一些实施例的按尺寸分离核酸的图。
图5A-5C是描绘了根据本公开的一些实施例的从无细胞DNA(cfDNA)样本富集小DNA片段的图。
图6A-6C是根据本公开的一些实施例的从人无细胞DNA(cfDNA)样本富集小DNA片段的图。
图7A-7D是示出了根据本公开的一些实施例的通过Y染色体的量化评估的胎儿DNA分数的富集的图。
具体实施方式
以下对某些实施例的描述在本质上仅是示范性的，且决不旨在限制本公开或其应用或用途的范围。在以下对本系统和方法的实施例的详细描述中，参考了形成本文的一部分的附图，所述附图以说明方式示出了可以实践所描述的系统和方法的具体实施例。足够详细地描述了这些实施例，以使所属领域的技术人员能够实践当前公开的系统和方法，并且应理解，可以利用其它实施例，且可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下进行结构和逻辑改变。此外，为清晰起见，某些特征的详细描述在其对于所属领域的技术人员来说将显而易见时将不予以讨论，以免使本公开的实施例的描述混淆不清。因此，以下详细描述不应在限制性意义上理解，并且本公开的范围仅由所附权利要求书限定。
越来越多的生物测定基于样本中(例如，生物体液、实验室测定的输出、扩增子等)的核酸。样本可以包含感兴趣的核酸和其它核酸的混合物。在一些应用中，感兴趣的核酸可以基于其尺寸与其它核酸区分开来。因此，可能是有用的，处理样本以便基于核酸的尺寸分离核酸，以便将目标核酸与其它核酸分离。在一些示范性应用中，目标核酸通常可以是低于尺寸截止值的那些。
一个此类示范性应用是短核酸片段(例如，小于150bp的DNA)的富集和分离，以将胎儿DNA、肿瘤来源的无细胞DNA(cfDNA)或其它感兴趣的短核酸与各种尺寸的背景核酸进行区分或从各种尺寸的背景核酸富集胎儿DNA、肿瘤来源的无细胞DNA(cfDNA)或其它感兴趣的短核酸。这可能有助于改善后续分子生物学过程技术和诊断平台的灵敏度。例如，在非侵入性产前检测(NIPT)中，对于常见染色体异常的准确诊断，可能期望至少4％的胎儿cfDNA分数，并且对于单基因疾病的检测，可能期望甚至更高的胎儿分数。来自母亲(例如，抽血)的样本可以包含胎儿来源的无细胞DNA(cffDNA)和母体cfDNA的混合物，但是cffDNA通常可能比样本中的母体cfDNA更短。通过增加短DNA片段分数(例如，通过从母体DNA分离cffDNA和/或选择性地富集cffDNA的浓度)，胎儿分数可能会增加，这可能有利于NIPT准确性。
在另一个示范性应用中，按尺寸富集和/或分离核酸可以有助于肿瘤的检测和/或标识(例如，癌症诊断)。肿瘤来源的DNA分子或无细胞肿瘤DNA(ctDNA)可能具有经改变的片段化图谱，并且癌症患者的短(100-150bp)与长(151-220bp)cfDNA的比率可能有助于标识癌症和起源组织以用于液体活检目的。在一些应用中，可能进行患者中的疾病的检测/标识。例如，外来体中定位的短核酸或尿液中的小DNA片段可以用作疾病诊断的指标。增加感兴趣的核酸的百分比可以降低背景噪音并促进全基因组和突变图谱的测序深度。因此可能需要允许对样本中的核酸进行尺寸选择性富集/分离的测定平台。
本公开涉及用于按尺寸富集和分离核酸的设备、系统和方法。一种示范性方法可以包含将包含各种尺寸的核酸的样本(例如，患者样本，例如生物流体、培养细胞、如PCR等实验室测定的产物等)与第一底物混合。然后可以使用第一底物将高于第一尺寸阈值的核酸与样本的其余部分分离。然后可以将包含低于第一尺寸阈值的核酸的样本的其余部分与第二底物混合。第二底物可以允许从经过滤的短核酸分离杂质(例如，通过洗涤)和/或通过聚集短核酸来富集样本。然后可以回收低于第一尺寸阈值的核酸。例如，如果核酸结合到第二底物，可以对其进行洗脱，并将其与第二底物分离。在一些实施例中，第二底物还可以对高于第二尺寸阈值的核酸具有尺寸选择性，并且所回收的核酸可以介于第一和第二尺寸阈值之间。两个底物的使用可以允许有效的尺寸选择性分离/富集，因为第一底物可以针对其尺寸选择性质(例如，对于低于尺寸阈值的核酸的强结合亲和力)而选择，而第二底物可以针对有利的效果而选择，例如对所有核酸的高结合亲和力、二级尺寸选择等。
图1是根据本公开的一些实施例基于尺寸过滤核酸的方法的流程图。
方法100通常可以从框110开始，其描述了将包含核酸的样本与第一底物混合。样本可以是包含核酸的任何溶液或混合物。在一些实施例中，核酸可以包含DNA、RNA、寡核苷酸、经标记的核酸(例如用放射性磷酸盐和/或荧光团标记的核酸)、经修饰的核酸(例如包含用生物素或地高辛修饰的核苷酸的核酸)、或其组合。在一些实施例中，样本可以是生物样本，例如获自患者的流体，例如血液、组织、血清、血浆、淋巴液、尿液、精液、唾液、乳汁、培养细胞及其组合。在一些实施例中，生物样本可以获自非人类受试者，例如植物或动物，或可以获自人工来源，例如实验室中培养的细胞系。在一些实施例中，样本可以是先前反应或测定的产物。例如，样本可以是分子生物学测定的产物，例如基因测序、扩增反应(例如，qPCR、ddPCR、等温扩增等)和/或其它过程。
在一些实施例中，在框110之前，方法100可以另外包含制备样本。例如，如果样本是包含细胞的生物流体，则制备可以包含裂解细胞和/或将细胞(或细胞碎片)从样本中滤出。制备样本的另一个实例可以是进行扩增反应以增加样本中的核酸的拷贝数。
框110之后通常可以是框120，其描述了用第一底物将高于第一尺寸阈值的核酸与样本的其余部分分离。第一底物可以是能够按尺寸分离核酸的底物。在一些实例中，第一底物可以将高于尺寸阈值的核酸与低于尺寸阈值的核酸分离。第一底物可以固有地按尺寸分离核酸和/或可以在存在一或多种其它试剂、外力等的情况下选择性地按尺寸过滤。框120的细节(以及框110中描述的混合)可以取决于用作第一底物的底物的类型。下面给出了一些示范性底物和分离方法。
在一些实施例中，第一底物可以是磁珠群，其可以在存在核酸沉淀试剂的情况下结合到核酸。表面化学和核酸沉淀试剂可以导致高于尺寸截止值的核酸优先结合到磁珠。表面化学和核酸沉淀试剂的类型可以决定尺寸截止值。在一些实施例中，尺寸截止值可以基于所选择的表面化学和核酸沉淀试剂进行调整。在图2中更详细地描述了使用磁珠的一个示范性实施例。
在第一底物包含磁珠的一些实施例中，框110可以包含将样本与磁珠和核酸沉淀试剂混合，并且在存在核酸沉淀试剂的情况下将高于第一尺寸阈值的核酸结合到磁珠。框120可以包含向样本施加磁场以将磁珠(和所结合的高于尺寸阈值的核酸)与样本的液相(其可以包含未结合的低于尺寸阈值的核酸)分离。然后可以去除上清液并转移到另一个容器。
在一些实施例中，第一底物可以是珠群，并且可以使用离心来分离珠(和它们所结合的核酸)。珠可以是磁性的或非磁性的。针对珠的进行离心的框110通常可以类似于针对磁珠所描述的框110(例如，基于珠的表面化学和沉淀试剂将高于尺寸阈值的核酸结合到珠)。框120可以包含对样本施加加速度以将珠和结合到珠的核酸与样本的其余部分分离。例如，可以将样本离心以将珠(和所结合的核酸)从溶液中拉出，使得可以去除上清液(包含较短的核酸)。
在一些实施例中，第一底物可以是凝胶，其可以用于电泳。框110可以包含将样本加载到凝胶上。框120可以包含向凝胶施加电势(例如，通过在凝胶上施加电压差)。样本中的核酸可以以与其尺寸成比例的速率迁移通过凝胶。可以运行尺寸标准品(例如，梯状条带)以提供不同尺寸的核酸迁移通过凝胶的远近程度的比较。框120还可以涉及从凝胶去除低于尺寸阈值的核酸，例如通过切掉含有那些核酸的凝胶的一部分，然后从凝胶释放核酸。在其它实施例中也可以使用其它类型的电泳，例如毛细管电泳。
在一些实施例中，第一底物可以是基于柱的分离介质。例如，可以使用如二氧化硅膜柱等离心柱。可以将样本加载到离心柱中，然后可以对柱施加加速度(例如，通过离心)以按尺寸分离核酸。
应理解，方法100还可以包含取决于为第一底物选择的底物的类型的附加步骤。例如，如果使用凝胶电泳，则方法100可以包含如倾倒凝胶和制备运行缓冲液等步骤。
在框120的分离期间，样本中的核酸群被分离成通常低于尺寸截止值的核酸群的第一部分和高于尺寸截止值的核酸群的第二部分。由于核酸的尺寸通常以碱基对数(bp)或核苷酸数(nt)表征，因此尺寸截止值可以由碱基对数或核苷酸数表示。尺寸截止值可能取决于感兴趣的核酸的类型。在一些实施例中，尺寸截止值可以是被选为第一底物的底物的类型所固有的。在一些实施例中，尺寸截止值可以是可调整的并且可以基于与第一底物一起使用的反应条件(例如，核酸加载缓冲液的类型)来选择。在一些实施例中，底物可以按尺寸分离核酸，并且用户可以基于他们选择了经分离的核酸的哪些部分(例如，通过切掉凝胶的某些条带)来选择尺寸截止值。
在一些实施例中，示范性尺寸截止值可以是150bp。在其它实施例中可以使用更大或更小的尺寸截止值。例如，尺寸截止值可以是100bp、110bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、260bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp或320bp。在一些实例中，可以使用小于100bp或大于320bp的截止值尺寸。在一些实施例中，截止值尺寸可以表示核酸在其天然条件下的尺寸差异(例如，胎儿相对于母体cfDNA)。在一些实施例中，方法100可以包含分切核酸的附加步骤。这可能导致相对较长的核酸序列(例如，基因组DNA)被切成许多相对较小的片(例如，片段)。尺寸截止值可以表示较长片段和较短片段之间的截止值。在某些应用中，较短片段的量和/或较短片段与较长片段的比率可能是有用的量度(例如，肿瘤可能具有与非肿瘤不同的比率)。
框120之后通常可以是框130，其描述了将样本的其余部分中的核酸与第二底物混合。在框110-120之后，样本的其余部分通常可以含有低于截止值尺寸的核酸。然而，其余的样本也可能充满各种杂质，所述杂质可能是从第一底物和/或原始样本遗留下来的。框130(和140)描述了可以用于纯化和/或富集经尺寸过滤的样本的步骤。除了富集/纯化经尺寸过滤的样本外，框130-140可以用于施加额外的尺寸选择性过滤。
框130可以包含第二底物的使用。在一些实施例中，第二底物可以是与第一类型底物相同类型的底物。在一些实施例中，第二底物可以是与用作第一类型底物的底物的类型不同类型的底物。第二底物可以具有与在框110-120中由第一底物施加的第一尺寸阈值不同的尺寸阈值(或没有尺寸阈值)。在第二底物是与第一底物相同类型的底物的实施例中，则可以使用不同的条件来改变尺寸截止值。例如，如果将磁珠用作第一和第二底物，则可以使用不同的珠表面化学和/或核酸沉淀试剂来控制尺寸截止值(或缺乏)。也可以使用其它反应条件(例如，物理条件，例如温度或时机)来改变相同类型的不同底物的行为。
框130之后通常可以是框140，其描述了从第二底物回收低于第一尺寸阈值的核酸。框130-140通常可以类似于框110到120，并且可以基于被选为第二底物的底物类型。
在一些实施例中，可以使用第二底物将高于第二尺寸阈值的核酸与低于第一尺寸阈值的核酸分离。第二尺寸阈值可以小于第一尺寸阈值。因此，框140中的所回收的核酸可以高于第二尺寸阈值且低于第一尺寸阈值。
在一些实施例中，框140可以包含通过增加低于第一尺寸阈值的核酸的浓度来富集低于第一尺寸阈值的核酸。例如，框130-140可以包含将低于第一尺寸阈值的核酸与液相分离，然后将核酸重悬在较小体积的流体中。
在方法100中一起使用第一底物和第二底物可以导致协同效应，其允许有效回收和/或富集相对较小的核酸片段。例如，被选为第一底物的底物可能能够有效地按尺寸分离核酸(例如，具有强尺寸选择性)，但在回收较小的核酸方面可能不是有效的。类似地，被选为第二底物的底物在回收核酸方面可能是有效的，但可能表现出较差的尺寸选择能力。通过使用两种底物作为方法100的一部分，可以实现强尺寸选择性过滤以及低于尺寸阈值的核酸的有效回收。此外，通过使用两种不同的底物，可以分别“调整”每一种底物(例如，基于底物的化学、各种缓冲液的化学、各种物理反应条件等)以分别最大化尺寸选择性分离和回收率。
图2是根据本公开的一些实施例的富集和纯化短DNA片段的方法的示意图。在一些实施例中，方法200可以是图1的方法100的一个实施方案。方法200是使用DNA作为核酸并且使用磁珠作为第一和第二底物(例如，图1的第一和第二底物)的方法。应理解，可以使用类似于方法200的方法，其中第一和/或第二底物不是磁珠，并且核酸包含除DNA之外的核酸。方法200示出了多个框205-260，表示为反应管，每个框可以表示方法200的一部分。尽管方法200被示出为发生在微量离心管中，但应理解，这仅出于说明目的，并且可以使用任何类型的容器来涵盖反应的步骤，并且在一些实施例中，可以将反应转移到反应的不同步骤中的不同容器中。
方法200可以包含框205，其示出了DNA混合物。DNA混合物包含长DNA片段(例如，高于尺寸截止值的DNA)、短DNA片段(例如，低于尺寸截止值的DNA)和杂质。DNA混合物可以是可能已经通过一或多个过程处理(例如，片段化)的患者样本。DNA混合物可以是先前反应(例如，扩增反应)的输出。尽管框205的样本被示出为DNA的混合物，但应理解，也可以使用其它类型的核酸的混合物，例如DNA、RNA、寡核苷酸、其组合等。
框205之后通常可以是框210，其包含将第一底物(例如，第一磁珠群)和第一DNA沉淀试剂与DNA混合物混合(例如，如图1的框110中)。框210还可以包含将长DNA片段结合到第一磁珠群。长DNA片段可以基于磁珠的表面化学和DNA沉淀试剂的组成特异性地结合到第一磁珠群。
第一磁珠群可以包含表面化学，其在一些实施例中可以例如用具有表位羧基的小分子、聚合物和树枝状聚合物进行官能化。第一磁珠群的表面上的羧基可以在存在第一DNA沉淀试剂的情况下结合长DNA片段(但不结合短DNA片段)。珠和核酸沉淀试剂可以基于固相可逆固定机制结合长核酸片段。
核酸沉淀缓冲液可以包含脱水剂、盐桥、缓冲剂及其组合。脱水剂可以提供疏水溶液以迫使亲水核酸分子离开溶液，这又可以促进长核酸沉淀到磁珠上。脱水剂可以包含聚亚烷基二醇(例如，聚乙二醇、聚丙二醇等)，其在一些实施例中可以具有1000到10,000Da之间的分子量和10％到25％之间的重量/体积浓度。
盐桥可以帮助最小化长核酸分子的负电荷排斥。盐桥可以包含盐，例如NaCl、KCl、CaCl2及其组合。在一些实施例中，盐桥的盐可以具有0.5M到5M之间的浓度。
缓冲剂可以为结合在磁珠表面上的长核酸提供合适的pH。缓冲剂可以包含Tris、Tris-HCl、EDTA及其组合。核酸沉淀试剂中包含的一组示范性缓冲剂可以包含浓度为0-10mM的Tris、浓度为0-1mM的EDTA、浓度为0-10mM的Tris-HCl及其组合。
核酸沉淀试剂还可以包含另外的组分。在一些实施例中，将表面活性剂加入到核酸沉淀试剂中，以减少非特异性核酸结合。例如，可以使用表面活性剂，例如Tween-20、Triton X-100、SDS及其组合。一组示范性表面活性剂可以包含浓度为0.01％-0.5％的Tween-20、浓度为0.01％-0.5％的Triton X-100、浓度为0.1％-1％的SDS及其组合。
在一些实施例中，核酸沉淀试剂可以用于帮助确定尺寸截止值。例如，增加核酸沉淀试剂的强度(试剂浓度、体积/样本体积比等)可能会降低长片段与短片段的截止值尺寸。
框210之后通常可以是框215，其示出了将长DNA片段和第一磁珠群与样本的其余部分分离(例如，如图1的框120中)。作为框215的一部分，可以对样本施加磁场。例如，外部磁体可以定位在容纳样本的容器附近。响应于磁场的施加，第一磁珠群(以及其所结合的长DNA片段)可以被吸引到容器的最靠近磁体的区域。这可能导致磁珠(和长DNA片段)形成团粒，从而将磁珠与样本的液体上清液分离。这可以允许从容器去除上清液，从而将上清液(包含短DNA片段)与团粒(包含长DNA片段)分离。在不使用磁珠的实施例中，可以使用不同的方法作为框215的一部分来分离核酸，例如可以使用非磁珠或离心柱进行离心，并且可以向电泳底物施加电压。
框215之后通常可以是框220，其示出了上清液。上清液可以包含短DNA片段和来自原始样本的至少一些杂质以及第一核酸沉淀试剂的一或多种组分。应理解，在一些实施例中，由于分离不完全，上清液还可以包含第一磁珠和长DNA片段中的一或多种，但是为了清楚起见，图2的图示示出了一个实例，其中去除了基本上所有的第一磁珠和长DNA片段。
框220之后通常可以是框225，其描述了在存在第二核酸沉淀试剂的情况下将短DNA片段结合到第二磁珠群(例如，如图1的框130中)。这可以包含将第二磁珠群和第二核酸沉淀试剂与来自框220的上清液混合。在一些实施例中，上清液中的高于第二尺寸阈值的核酸可以选择性地结合到第二磁珠群。在一些实施例中，核酸与第二磁珠群的结合可以是非尺寸选择性的。
类似于第一磁珠和第一核酸沉淀试剂，结合到第二磁珠群的核酸的长度可以基于第二磁珠群的表面化学和第二核酸沉淀试剂的组成。在一些实施例中，第二磁珠群和第二核酸沉淀试剂可以是非尺寸选择性的，并且可以结合上清液中的所有DNA片段而不管尺寸如何。
在此类实施例中，第二磁珠群可以包含表面基团，例如羟基表面基团。羟基表面基团可以在存在第二核酸沉淀剂的情况下结合到短核酸(例如，通过以非尺寸选择性的方式结合到核酸)。第二核酸沉淀试剂可以包含醇，其促进核酸的小片段沉淀到第二磁珠群的表面上的羟基上。在一些实施例中，醇可以包含乙醇、异丙醇或其组合。在一个示范性实施例中，第二核酸沉淀试剂可以包含浓度为45-85％的乙醇和/或组合为33％-70％的异丙醇。
在一些实施例中，第二核酸沉淀试剂还可以包含载体分子，其可以增强核酸的沉淀。载体分子可能可溶于水溶液，但当介电常数因加入的醇而降低时可能聚集。在一些实施例中，载体分子可以包含乙酸钠、氯化锂、糖原、铵、乙酸盐、线性聚丙烯酰胺及其组合。在一些实施例中，第二核酸沉淀试剂可以包含浓度为0.3-1M的乙酸钠、浓度为0.1-1M的氯化锂、浓度为0.1-2uM的糖原、浓度为0.5-2M的乙酸铵、浓度为10-20ug/mL的线性聚丙烯酰胺及其组合。
第二核酸沉淀试剂还可以包含其它组分，例如与第一核酸沉淀试剂的组分类似的组分。在一些实施例中，第二核酸沉淀试剂可以包含载体分子、脱水剂、盐桥、缓冲剂、表面活性剂及其组合。类似地，在一些实施例中，第一核酸沉淀试剂可以包含关于第二核酸沉淀试剂描述的组分，例如醇和载体分子。
另外地和/或可替代地，方法200可以包含在框225之后的洗涤(在操作230)。洗涤可以帮助去除第二(和/或第一)核酸沉淀试剂的组分以及其余的杂质。洗涤框230可以包含施加磁场(例如，类似于框215)以形成团粒，然后去除上清液。然后可以用洗涤缓冲液替换上清液。在一些实施例中，洗涤缓冲液可以包含至少一种醇(例如，类似于第二核酸沉淀试剂中的醇)。在一些实施例中，洗涤框230可以重复多次。
框230之后通常可以是框235，其描述了从第二磁珠群洗脱短DNA片段。在最后的洗涤框230之后，可以将团粒重悬在样本的洗脱缓冲液中。洗脱缓冲液可以包含使短DNA片段从磁珠释放并进入洗脱缓冲液的组分。在一些实施例中，洗脱缓冲液可以包含相对低的盐浓度以引起短DNA片段的释放。在一些实施例中，洗脱缓冲液可以包含某一pH(例如，pH 6到10)。在一些实施例中，洗脱框235可以用于通过使用比原始样本的体积小的洗脱缓冲液的体积来聚集(例如，富集)短DNA片段。
框235之后可以是框240，其示出了所富集的短DNA片段与第二磁珠群分离。这可以包含施加磁场以形成团粒，所述团粒包含第二磁珠群，但不包含通常可能保留在上清液中的所洗脱的短DNA片段。然后可以去除包含短DNA片段的上清液以进行随后的下游测定。在一些实施例中，可以选择洗脱缓冲液的化学，使得洗脱缓冲液与下游测定兼容。
此外，方法200还可以包含框245到260，其示出了在框215中分离的长DNA片段的回收。框245可以包含第一磁珠群和其所结合的长DNA片段的团粒。框245之后可以是框250，其描述了洗涤第一磁珠和长DNA片段。这通常可以类似于洗涤框230，并且可以包含类似的洗涤缓冲液的使用。框250之后通常可以是框255，其包含从第一磁珠群洗脱长DNA片段。这通常可以类似于洗脱框235并且可以涉及类似的洗脱缓冲液的使用。框255之后通常可以是框260，其涉及将所洗脱的长DNA片段与第二磁珠分离。框255通常可以类似于框240。在一些实施例中，所回收的长DNA片段可以用于期望比较原始样本中长和短DNA片段的浓度的应用。在一些实施例中，所回收的长DNA片段可以用于优选纯化/富集长片段的各种应用。
在一些实施例中，在图1的方法100和/或图2的方法200的特定实施方案中使用的各种试剂可以一起包装成试剂盒。在一些实施例中，试剂盒可以包含化学试剂，例如第一和第二底物以及与那些底物一起使用的试剂(例如，第一和第二核酸沉淀试剂)。试剂盒还可以包含其它组分，例如洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。在一些实施例中，试剂盒可以包含物理组件，例如磁体和用于混合试剂的各种(可重复使用和/或一次性)容器。在一些实施例中，试剂盒可以包含预先分配用于单一反应的试剂。在一些实施例中，试剂盒可以包含由用户针对每个单独反应测量出的试剂储备。
例如，试剂盒可以包含可以用于进行图2的方法200的试剂混合物。试剂盒可以包含第一磁珠群、第二磁珠群、第一核酸沉淀试剂和第二核酸沉淀试剂。第一和第二磁珠群可以各自作为干试剂提供，或者可以悬浮在溶液中提供。在一些实施例中，磁珠可以悬浮在核酸沉淀试剂中。在一些实施例中，磁珠可以悬浮在不同的液相中，并且核酸沉淀试剂可以与磁珠和样本混合，作为方法200的一部分。在一些实施例中，试剂盒还可以包含洗涤和洗脱缓冲液。在一些实施例中，试剂盒中包含的各种试剂(例如，第一和第二磁珠群、第一和第二核酸沉淀缓冲液、洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液)通常可以包含与关于图2的方法200讨论的那些类似的组分和化学。
在一些实施例中，试剂盒可以具有被设计成用于特定第一尺寸截止值(并且在一些实施例中为第二尺寸截止值)的组件。在一些实施例中，试剂盒可以包含允许用户调整一种尺寸截止值(或两种尺寸截止值)的说明。例如，试剂盒可以包含核酸沉淀缓冲液以及关于核酸沉淀缓冲液与样本的何种比率导致何种尺寸截止值的说明。然后，用户可以确定在特定应用中使用哪种比率/尺寸截止值。
图2的方法200的一个示范性应用可以是从母体DNA富集胎儿DNA。平均而言，胎儿cfDNA通常可能比母体cfDNA短。cfDNA的分析通常可以包含样本收集(例如，抽血)、从样本分离cfDNA、由所分离的cfDNA制备文库。文库制备可以包含将DNA标签(例如，“条形码”)加入到cfDNA的一个或两个末端。文库制备通常可以延长cfDNA，例如延长120bp。cfDNA的分析还可以包含下一代测序(NGS)和来自NGS的数据的分析。
在一些实施例中，胎儿DNA可以在已从样本分离cfDNA之后但在文库制备之前通过cfDNA的尺寸选择性过滤(例如，方法框205到240)来富集。胎儿cfDNA和母体cfDNA之间的截止值通常被称为“X”。值X可以用作方法200的短和长DNA之间的截止值。在一些实施例中，X可以是150bp(例如，正常母体cfDNA可能在165bp处具有峰值，并且胎儿DNA可能低于150bp)。在其它示范性实施例中可以使用其它尺寸截止值(例如，X的值)。
在一些实施例中，DNA的尺寸选择性富集可以在文库制备期间进行。文库的制备通常可以包含cfDNA的端修复和纯化、cfDNA的连接，其可以包含加入可以被称为“Y”(例如，120bp)的一段长度的DNA标签、所连接的cfDNA的纯化、基因组套富集、全外显子组富集、DNA的扩增(例如，使用PCR)和经扩增的DNA的纯化。
在一些实施例中，尺寸选择性富集(例如，框205-240)可以在cfDNA端修复之后进行，并且第一尺寸截止值可以是X。在一些实施例中，尺寸选择性富集可以在连接之后进行，并且尺寸截止值可以是X+Y。在一些实施例中，尺寸选择性富集可以在富集之后进行，并且可以使用X+Y作为截止值。在一些实施例中，尺寸选择性富集可以在扩增之后进行，并且可以使用X+Y作为截止值。尽管通常使用磁珠作为底物来描述胎儿DNA的富集，但也可以使用关于图1的方法100讨论的其它底物(例如，离心柱、电泳等)。
在一些实施例中，类似于上述用于胎儿富集的工作流程可以用于肿瘤DNA的富集。肿瘤DNA的富集还可以包含框245-260，其可以允许将长DNA(例如，高于X或高于X+Y的DNA)与短DNA进行比较。
图3是根据本公开的一些实施例的核-壳-壳磁珠的截面图。核-壳-壳磁珠(CSS-MB)300包含磁芯302、第一壳304和外壳306。在一些实施例中，CSS-MB 300的群体可以用作图1的第一底物和/或第二底物。例如，来自图2的方法200的第一磁珠群可以包含CSS-MB300，并且来自图2的方法200的第二磁珠群可以包含CSS-MB 300。在一些实施例中，第一和第二磁珠群可以是相同的，它们的表面化学除外。
在一些实施例中，CSS-MB 300可以具有通常球形的形状，其尺寸由直径d珠定义。CSS-MB 300可以具有直径d珠，其可以是1μm或更小。例如，CSS-MB 300的直径d珠可以介于200nm和1000nm之间。在其它示范性实施例中，可以使用更大和更小的直径。应理解，尽管为了便于讨论，CSS-MB 300通常可以被示出为球形，但这可能代表CSS-MB 300的理想化视图，并且CSS-MB 300可能偏离完美球形。例如，CSS-MB 300的群体可以包含单独的CSS-MB 300，它们是球形的、扁圆形的、扁长形的、椭圆形的，具有与完美球形的一或多个其它偏差(例如，表面上的凹形或凸形“块”)或其组合。
磁芯302可以具有100nm和300nm之间的直径d芯。磁芯302可以是实心材料。在一些实施例中，磁芯302可以是实心晶体簇，例如超顺磁性晶体簇。在一些实施例中，磁芯302可以是单个超顺磁性晶体。在一些实施例中，磁芯可以由金属合金形成，例如金属合金氧化物晶体。在一些实施例中，磁芯302可以包含选定比例的金属混合物。例如，磁芯302可以包含如Fe、Co和Ni等金属的混合物。在一些实施例中，磁芯302通常可以具有组成Fex-Coy-NiOz，其中x、y和z都是整数值。
第一壳304通常可以是沉积在磁芯302的外表面上的球形层。第一壳304可以具有厚度t1，其在一些实施例中可以介于10nm到50nm之间。第一壳304可以是防止CSS-MB 300的外部环境的组分和磁芯302之间的化学相互作用的保护壳。第一壳304可以是无孔的。第一壳304可以由惰性材料形成。例如，第一壳304可以包含石墨碳。在一些实施例中，第一壳304可以具有包含一或多个化学基团的外表面，所述化学基团促进第一壳304和第二壳306之间的结合。例如，在第一壳304包含石墨碳的一些实施例中，第一壳304的表面可以包含相对丰富的羟基和/或环氧基，它们可以为第二壳306提供锚定位点。
第二壳306通常可以是沉积在第一壳304的外表面上的球形层。第二壳306可以具有厚度t2，其在一些实施例中可以介于20nm到100nm之间。因此，CSS-MB 300的总半径可以是磁芯302的半径加上第一壳304和第二壳306分别的厚度t1和厚度t2。
第二壳306可以是CSS-MP 300的外壳。第二壳306可以进一步保护磁芯302(例如，除了由第一壳304提供的保护之外)，可以提供对一个或多个反应有用的表面化学，和/或提供可以用另外的化学基团官能化的活性位点以提供这种表面化学。在一些实施例中，第二外壳306可以是无孔的。在一些实施例中，第二外壳306可以是多孔的。例如，第二壳306可以包含可以均匀分布在整个第二壳306中的中孔。在一些实施例中，第二壳可以由氧化硅形成，例如缩合氧化硅。
在一些实施例中，第二壳306的外表面可以由一层化学基团307围绕。这些化学基团307可以是第二壳306的化学所固有的和/或可能是由于第二壳的表面化学的改性。例如，化学基团307可以包含结合到第二壳306的外表面的化学物质。表面化学基团307可以用于改善溶液中的CSS-MB 300(例如，其分散在溶液中)的化学性质和/或促进CSS-MB 300和如核酸等一或多个生物分子之间的结合。
在一些实施例中，各个官能团可以作为化学基团307的一部分结合到CSS-MB的表面。第二壳306可以包含和/或可以被修饰以包含多个活性位点，所述活性位点可以用于将官能团结合到第二壳306的外表面。例如，在第二壳306由二氧化硅形成的实施例中，第二壳306可以包含多个表面羟基。这些表面羟基可以被修饰成羧基，其可以形成结合一或多个官能团的活性位点。
化学基团307的一个实例可以包含促进生物分子之间的结合的化学物质。例如，CSS-MB 300的表面羟基可以通过将呈现羧基的化学物质共价结合到羟基而用这些化学物质进行改性，所述化学物质例如含有羧基表位的小分子、聚合物、树枝状聚合物。例如，羟基可以用化学物质转化为羧基，所述化学物质例如琥珀酸酐、聚丙烯酸、氨基酸、藻酸、碳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、水杨酸、没食子酸、唾液酸及其组合。基于在某些缓冲条件下的固相反向固定机制，羧基可以用于实现某些目标生物分子的结合。
化学基团307还可以包含可以改变CSS-MB 300的整体表面化学的亲水组分(例如，亲水部分)。例如，亲水组分可以是小分子(例如，两性离子分子、糖分子)或聚合物(例如，聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯亚胺)。亲水组分可以增加磁珠在水溶液中的分散性，这可能有利于靶向生物分子和CSS-MB 300之间的相互作用。化学基团307中的亲水组分也可以帮助避免其它生物分子在样本中的非特异性结合，这又可以增强所富集的靶向生物分子的纯度。例如，亲水组分可以包含聚乙二醇、聚丙烯酸、聚乙烯醇、葡萄糖、蔗糖、半胱氨酸、麦芽糖、壳聚糖、藻酸盐、纤维素、甲壳质、淀粉及其组合。
实例1—不同尺寸的DNA片段的去除和回收
图4A-4B是描绘了根据本公开的一些实施例的按尺寸分离核酸的图。图4A的图400a和图4B的图400b分别示出了从DNA群去除的DNA和去除DNA后剩余的DNA。图400a-b示出了沿横轴的DNA片段尺寸(以bp为单位)和沿纵轴的所述尺寸的DNA的浓度(通过荧光强度测量)。图400a-b示出了作为“输入”的第一迹线，即一组DNA片段。图400a示出了“所去除的”DNA的迹线，其可以表示高于截止值尺寸的DNA(例如，图2的长DNA片段)。图400b示出了“所回收的”DNA的迹线，其可以表示低于截止值尺寸的DNA(例如，图2的短DNA片段)。
使用20-1000bp的DNA片段的输入作为一个实例来演示使用图2的方法200的长片段的去除和短片段的回收。输入的DNA按以下处理：1)与一种类型的磁珠(第一磁珠群)混合；2)将第一磁珠群与其余溶液分离；3)将上清液与不同种类的磁珠(第二磁珠群)混合；4)用70％乙醇溶液洗涤经分离的每个容器中的第一和第二磁珠群；5)用洗脱缓冲液从每个磁珠群洗脱DNA。使用商业系统，例如Agilent生物分析仪2100，将洗脱液与输入进行比较。来自第一磁珠群的洗脱液含有长片段，并且信号与输入在200-1000bp范围内重叠，从而指示在工作流程期间从输入去除了长片段。来自第二磁珠群的洗脱液含有短片段，并且信号通常与输入的DNA片段在20-200bp范围内重叠，从而表明短至20bp的小片段的有效回收。洗脱液的信号和输入在200-1000bp以及20-200bp范围内的重叠表明了从各种尺寸的DNA优先选择短片段的工作流程。
实例2—从cfDNA标准品富集小DNA片段
图5A-5C是描绘了根据本公开的一些实施例从无细胞DNA(cfDNA)样本富集小DNA片段的图。实例2的实验示出了如何通过改变核酸沉淀缓冲液与样本的比率来调整截止值尺寸的一个实例。图5A示出了图500a，其示出了沿横轴的DNA片段尺寸和沿纵轴的浓度(类似于图4A-B的图400a-b)。图500a示出了不同的迹线，每个迹线表示使用各种核酸沉淀缓冲条件后的输入和输出。图5B-C分别示出了条形图500b-c，每个条形图示出了输入和不同条件的不同条形。图500b的纵轴示出了所回收的DNA片段或输入中的低于150bp的DNA片段的百分比。图500c的纵轴示出了相较于输入的所回收的DNA片段中的平均片段尺寸。
处理商业cfDNA标准品(35-500bp)样本以富集短DNA片段(例如，使用图2的方法200)。通过调整试剂体积/样本体积比(1.2倍、1.4倍、1.6倍和1.8倍)来使用四种核酸沉淀试剂条件来富集小于150bp的DNA片段，以实现不同的富集效果。一般来说，所述过程包含：1)将输入的cfDNA标准品分别与第一类型的磁珠和1.2、1.4、1.6和1.8倍体积的相对应核酸沉淀试剂混合，以以基于体积比的经调整的截止值值选择性地将长DNA结合到第一类型的磁珠；2)在外部磁场下从溶液分离磁珠；3)收集包含未结合的短DNA片段的上清液溶液；4)将上清液与第二类型的磁珠、至少一种醇和核酸沉淀试剂混合以结合其余的短DNA；5)在外部磁场下从溶液分离第二类型的磁珠，并弃去上清液；6)用70％乙醇溶液洗涤磁珠；7)用洗脱缓冲液从第二类型的磁珠洗脱选定DNA。对所富集的DNA进行表征，并计算片段分数和平均尺寸，例如使用商业仪器和软件，例如Agilent2100生物分析仪软件。与原始输入相比，四个富集样本的<150bp的DNA的分数分别从45％(原始输入)增加到68％、80％、90％和92％。四个富集样本的平均长度分别从176bp(原始输入)减少到130bp、116bp、101bp和96bp。因此，与输入相比，富集了短(例如，低于截止值的)DNA的量。
实例3—从人cfDNA样本富集小DNA片段
图6A-6C是根据本公开的一些实施例的从人无细胞DNA(cfDNA)样本富集小DNA片段的图。图6A示出了沿横轴的DNA片段尺寸和沿纵轴的浓度的图600a(例如，类似于图4A-4B的图400a-b和图5A的图500a)。图600a示出了作为富集之前的DNA片段的第一迹线和富集之后的第二迹线(例如，使用图2的方法200进行的富集)。图600a包含示出了DNA片段的主峰的插入图。图600b和600c类似于图5B-5C的图500b和500c，并且分别示出了<150bp的DNA片段的百分比和主峰中的DNA片段的平均长度。
与母体cfDNA相比，胎儿特异性cffDNA的片段尺寸可能相对较短。因此，短片段(例如，小于150bp)的富集可能会增加胎儿分数(例如，来自胎儿的样本中的DNA的百分比)。在知情同意的情况下，从怀有男性胎儿的孕妇收集了总共21份母体血浆，并且分离了cfDNA以进行处理以富集样本中的短片段(例如，小于150bp)。图6A-6C的示范性实验可以包含类似于图1的方法100和/或图2的方法200的富集过程。简而言之，富集过程可以包含：1)将输入的cfDNA样本与第一类型的磁珠和相对应的第一核酸沉淀试剂混合，以选择性地将长DNA结合到第一类型的磁珠；2)在外部磁场下从溶液分离磁珠；3)收集含有未结合的短DNA片段的上清液溶液；4)将上清液与第二类型的磁珠和包含醇的第二核酸沉淀试剂混合以结合其余的短DNA；5)在外部磁场下从溶液分离第二类型的磁珠，并弃去上清液；6)用70％乙醇溶液洗涤磁珠；7)用洗脱缓冲液从第二类型的磁珠洗脱选定DNA。
作为一个实例，使用商业仪器，例如Agilent生物分析仪2100，对案例0中的富集之前和之后的cfDNA进行表征。与原始cfDNA输入相比，富集了<150bp的DNA片段。所述方法还去除了基因组DNA污染以及cfDNA在350和525bp处的第二和第三峰，其主要是母体基因组材料并且对于NIPT来说是不期望的。富集样本的量化分析指示，富集样本中的<150bp的DNA的分数从7.1％增加到36.4％，并且cfDNA主峰的平均长度从174bp(原始输入)减少到151bp。短DNA分数的富集表现为平均长度的减少以及基因组DNA污染的去除。
图7A-7D是示出了根据本公开的一些实施例的通过Y染色体的量化评估的胎儿DNA分数的富集的图。可以使用类似于图1的方法100和/或图2的方法200的方法来进行富集。对从怀有男性胎儿的母亲抽取的血液分离的cfDNA进行胎儿分数的富集。因此，只有胎儿DNA可以包含Y染色体，因此Y染色体可以用作胎儿DNA的代替物。图7A示出了图700a，其是胎儿分数富集的表征的示意图。图7B示出了图700b，其示出了富集之前和之后的X和Y和染色体的群体。图7C示出了Y染色体的比例的图700c。图7D示出了Y染色体的浓度的变化百分比的图7D。
胎儿分数通过Y染色体的量化来评估。X和Y染色体的拷贝数使用ddPCR方法进行量化。ddPCR的探针被设计成靶向X染色体上的XIST(Xq13)基因或Y染色体上的SRY(Yp11)基因。XIST和SRY分别位于X和Y染色体的保守区中。如在富集工作流程之前和之后的样本的代表性2-D ddPCR荧光幅度图(例如，图700b)所示，使用chrX(FAM荧光标签)、chrY(VIC荧光标签)、chrX+chrY(FAM+VIC荧光标签)的阳性孔以及未扩增和未确定的孔来使用ProFlexTM2xFlat PCR系统计算chrX和chrY的拷贝数。chrX阳性孔的数量在富集工作流程之后显著减少，而chrY阳性孔保持在相似水平，从而表明Y染色体分数在富集工作流程之后增加。Y比例(例如，Y％)可以使用以下公式1计算：
Y％＝chrY的拷贝数/(chrX的拷贝数+chrY的拷贝数) 公式1
对21个母体样本进行富集。富集之前和之后的母体样本的结果在以下表1中总结：
表1.母体样本的汇总
所测试的21个样本(例如，如表1所示)在工作流程之后均具有富集效果，但Y％的倍数变化在不同样本之间有所不同。富集之前和之后的Y比例的倍数变化为1.1到7.4，中位数为3.2。通过优先富集cfDNA样本的短片段，Y％可以显著增加，从而指示胎儿分数富集可能导致NIPT应用中的灵敏度和特异性的潜在改善。
因此，通过使用第一和第二底物，可以回收低于截止值尺寸的核酸，并且可以对其进行洗涤以去除杂质和/或对其进行富集以增加目标生物分子的浓度。两种不同的底物的使用还可以提高过滤效率，以及允许另外的尺寸选择性过滤，例如以保留第一和第二尺寸阈值之间的核酸。两种不同的底物的使用还可以允许回收经过滤的核酸(例如，长核酸)，这在涉及比较高于和低于截止值的核酸的比率的应用中可能是有用的。
应了解，本文描述的实例、实施例或过程中的任一个可以与一或多个其它实例、实施例和/或过程组合或分开，和/或在根据本系统、装置和方法的单独装置或装置部分当中进行。
应了解，尽管已经给出了某些数值，但这些只是示范性的。作为此类实例给出的数值应被认为是近似的，并且也可以使用大于或小于示范性数值的值。类似地，当给出数值范围(例如，X和Y之间)时，其应被理解为包含边界(例如，X和Y)。
应了解，本公开的任何方法可以包含另外的步骤，可以省略某些步骤，并且可以以任何顺序进行所述步骤。例如，将第一步描述为通常接着第二步的方法可以包含在第一步和第二步之间的另外的步骤。在一些实施例中，第二步可以在第一步之前。
最后，上述讨论旨在仅说明本系统，并且不应被解释为将所附权利要求限制为任何特定实施例或实施例组。因此，尽管已参考示范性实施例特别详细地描述了本系统，但还应了解，在不脱离如在所附权利要求书中所阐述的本系统的更广和既定精神和范围的情况下，所属领域的普通技术人员可以设计众多修改和替代实施例。因此，说明书和附图应以说明性方式看待，并且不旨在限制所附权利要求书的范围。
Claims (41)
1.一种方法，其包括：
将包含核酸的样本与第一底物混合；
用所述第一底物将高于第一尺寸阈值的核酸与所述样本的其余部分分离；
将所述样本的所述其余部分中的所述核酸与第二底物混合；和
从所述第二底物回收低于所述第一尺寸阈值的核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括回收高于所述第一尺寸阈值的所述核酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括将高于所述第一尺寸阈值的所述核酸结合到包括磁珠的第一底物，并且其中回收高于所述第一尺寸阈值的所述核酸包含从所述磁珠洗脱高于所述第一尺寸阈值的所述核酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一底物包括第一磁珠群，并且其中所述第二底物包括第二磁珠群。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一磁珠群和所述第二磁珠群包含核-壳-壳磁珠。
6.根据权利要求4所述的方法，其中分离所结合的高于所述第一尺寸阈值的核酸包含向所述样本施加磁场并去除包括所述样本的所述其余部分的上清液。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一磁珠群包含羧基的表面化学，所述羧基被配置成选择性地结合到高于所述第一尺寸阈值的所述核酸。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述第二磁珠群包含羟基的表面化学。
9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括通过将所述样本的所述其余部分与包含至少一种醇的核酸沉淀试剂混合来将所述样本的所述其余部分中的所述核酸结合到所述第二磁珠群。
10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括用所述第二底物将高于第二尺寸阈值的核酸与所述样本的所述其余部分分离，其中所述第二尺寸阈值小于所述第一尺寸阈值，并且其中所回收的核酸高于所述第二尺寸阈值且低于所述第一尺寸阈值。
11.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在存在第一核酸沉淀试剂的情况下将高于所述第一尺寸阈值的所述核酸结合到所述第一底物；和在存在第二核酸沉淀试剂的情况下将所述样本的所述其余部分中的所述核酸结合到所述第二底物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一核酸沉淀试剂和所述第二核酸沉淀试剂中的至少一个包括脱水剂、盐桥、缓冲剂、载体分子、表面活性剂及其组合。
13.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述第二底物。
14.根据权利要求1所述的方法，其中从所述第二底物回收低于所述第一尺寸阈值的所述核酸包含用洗脱缓冲液从所述第二底物洗脱所述核酸。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸、用放射性磷酸盐、荧光团标记的核酸、用生物素或地高辛修饰的核苷酸或其组合。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一底物包括磁珠、非磁珠、凝胶、毛细管或离心柱，并且其中所述第二底物包括磁珠、非磁珠、凝胶、毛细管或离心柱。
17.根据权利要求1所述的方法，其中分离高于所述第一尺寸阈值的所述核酸包括施加磁场、施加加速度、离心所述样本或向所述第一底物施加电势。
18.一种试剂盒，其包括：
第一底物；
第一核酸沉淀试剂；
第二底物；和
第二种核酸沉淀试剂，
其中所述第一底物被配置成在存在所述第一核酸沉淀试剂的情况下结合高于第一尺寸阈值的核酸，并且其中所述第二底物被配置成在存在所述第二核酸沉淀试剂的情况下结合核酸。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述第一底物是第一磁珠群，并且其中所述第二底物是第二磁珠群。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述第一磁珠群和所述第二磁珠群包含核-壳-壳磁珠。
21.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述第二底物被配置成在存在所述第二核酸沉淀试剂的情况下结合高于第二尺寸阈值的核酸。
22.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述第一核酸沉淀试剂或所述第二核酸沉淀试剂中的至少一个包括脱水剂、盐桥、缓冲剂、载体分子、表面活性剂及其组合。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述脱水剂包括分子量介于1000到10,000之间且重量/体积浓度介于10％到25％之间的聚亚烷基二醇。
24.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述盐桥包括浓度为0.5M到5M的NaCl、KCl、CaCl2或其组合。
25.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述缓冲剂包括浓度为0-10mM的Tris、浓度为0-1mM的EDTA、浓度为0-10mM的Tris-HCl及其组合。
26.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述载体分子包括浓度为0.3-1M的乙酸钠、浓度为0.1-1M的氯化锂、浓度为0.1-2uM的糖原、浓度为0.5-2M的乙酸铵、浓度为10-20ug/mL的线性聚丙烯酰胺及其组合。
27.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述表面活性剂包括浓度为0.01％-0.5％的Tween-20、浓度为0.01％-0.5％的Triton X-100、浓度为0.1％-1％的SDS及其组合。
28.根据权利要求18所述的试剂盒，其进一步包括醇，所述醇包括浓度为45-85％的乙醇、浓度为33％-70％的异丙醇及其组合。
29.根据权利要求18所述的试剂盒，其进一步包括洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液包括至少一种醇。
30.根据权利要求18所述的试剂盒，其进一步包括洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液包括浓度为0-10mM的Tris、浓度为0-1mM的EDTA、浓度为0-10mM的Tris-HCl及其组合。
31.一种方法，其包括：
收集包含核酸的样本；
从所述样本分离所述核酸；
使用第一底物和第二底物过滤所述核酸以保留所述核酸中的低于尺寸阈值的选定核酸，所述第一底物被配置成选择性地将高于所述尺寸阈值的核酸与所述核酸中的所述选定核酸分离，并且所述第二底物被配置成将所述核酸中的所述选定核酸与杂质分离；
基于所分离的核酸制备文库；和
对所制备的文库进行测序。
32.根据权利要求31所述的方法，其中过滤发生在分离所述核酸之后且制备所述文库之前。
33.根据权利要求31所述的方法，其中制备所述文库包括延长所分离的核酸。
34.根据权利要求33所述的方法，其中过滤所述核酸发生在延长所分离的核酸之后，并且其中所述尺寸阈值基于核酸的目标长度和延长量。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述核酸是无细胞DNA(cfDNA)、DNA、RNA、寡核苷酸、经标记的核酸、经修饰的核酸或其组合。
36.根据权利要求31所述的方法，其中低于所述尺寸阈值的所述核酸包括胎儿DNA。
37.根据权利要求31所述的方法，其中低于所述尺寸阈值的所述核酸包括肿瘤DNA。
38.根据权利要求31所述的方法，其进一步包括回收高于所述尺寸阈值的所述核酸。
39.根据权利要求31所述的方法，其中过滤所述核酸包括：
将所述核酸中的未选定核酸结合到所述第一底物；和
施加外力以将所述第一底物和所述核酸中的所结合的未选定核酸与所述核酸中的未结合核酸分离。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述第一底物包括磁珠，并且其中所述外力包含磁场。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述过滤进一步包括：
将所述核酸中的所述选定核酸结合到所述第二底物；
施加外力以将所述第二底物和所述核酸中的所结合的选定核酸与所述杂质分离；和
从所述第二底物回收所述核酸中的所述选定核酸。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Ge Dongliang Inventor after: Zhao Shuting Inventor after: Wan Hao Inventor after: Zhang Bo Inventor after: Guo Xin Inventor after: Zeng Wenqi Inventor before: D.Ge Inventor before: Zhao Shuting Inventor before: Wan Hao Inventor before: Zhang Bo Inventor before: Guo Xin Inventor before: W.Zeng |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information |